CN116042911A - CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法 - Google Patents

CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法 Download PDF

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Abstract

一种CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法，基于CRISPR/Cas13a***和杂交链反应(HCR)的流感H1N1病毒检测比色生物传感器提供了概念验证。流感H1N1病毒的靶RNA激活了Cas13a的反式裂解活性，它裂解了探针的特殊RNA序列(‑UUU‑)，进一步启动HCR，大量生成富含g的DNA。在血红素的存在下形成了丰富的g‑四联体/血红素，从而催化比色反应。比色生物传感器在10pM‑100nM之间呈线性关系，检出限为0.152pM。该生物传感器的特异性极好。

Description

CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法
技术领域
本发明属于病毒检验检测技术领域，涉及一种CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法。
背景技术
流感病毒是一种包膜、分段、负链、单链RNA病毒。大多数温血动物都可以成为流感病毒的宿主，历史上曾引起许多大流行，在世界范围内有相当高的发病率和死亡率。目前，流感病毒包括A、B、C、D型。甲型流感病毒是最严重和最致命的病毒。在一年内，这种病毒传播到214个国家，造成全球超过18000人死亡，并已成为一个主要的国际公共卫生问题。
病毒的分离和培养是诊断流感病毒的金标准。但目前由于逆转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)的优越的分析性和敏感性，其取代病毒分离培养成为新一代的金标准。同时，几种传统的检测方法被广泛应用于流感病毒的检测，包括ELISA和蛋白质鉴定。随着时间的推移，流感病毒的传统检测技术有所改进。然而，该方法也有一些固有的缺点。它的操作很复杂，需要经过专业训练的人员或复杂的实验室仪器。因此，该技术不适用于常规医疗保健和资源贫乏地区。已经发展了许多检测流感病毒的新方法，包括电化学免疫传感器，表面增强拉曼散射成像适应传感器平台，荧光，比色和微流控芯片方法。其中，比色法是一种快速、方便的选择，不需要先进的仪器。
有规律间隔短回文重复序列(Clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats，CRISPR)是大多数古细菌(约87％)和细菌(约47％)源于防御病毒DNA或RNA的需要，已经进化出的一个免疫反应***。完整的CRISPR基因组中包含一系列CRISPR阵列、CRISPR相关(Cas)蛋白基因和由不同间隔区隔开的直接重复序列。随着病毒的出现，CRISPR-Cas位点会触发“适应-表达-干扰”的三阶段免疫反应，破坏宿主细胞内的噬菌体入侵。目前CRISPR/Cas9研究得最为清楚，其防御过程主要为三阶段：CRISPR捕获序列间隔序列、合成成熟的CRISPR RNA、靶标干扰后定向切割。CRISPR/Cas13a(C2c2)是张锋小组在2016年首次描述了一种靶向RNA的CRISPR相关酶，与II类中的其他Cas蛋白相比，Cas13a对单链RNA(ssRNA)具有顺式和反式切割活性，Cas13a能够切割和修剪pre-crRNA以产生成熟的crRNA。CRISPR/Cas***因识别精确性，高效性和简便性等优点，目前已广泛应用于农业、生物、化学等各种领域。
为了进一步提高分析性能，Cas13a***已与多种信号扩增技术相结合，如滚动环扩增(RCA)、重组酶聚合酶扩增(RPA)和环介导等温扩增(LAMP)，其中一些等温核酸扩增技术采用昂贵的酶，有些由于需要逆转录，操作繁琐，杂交链反应(HCR)是由Dirks和Pierce介导的链置换反应，HCR是一种无酶、熵驱动、等温的自发DNA组装过程。一个普通的HCR需要三个成分，包括一个DNA启动子和两个DNA发夹，特别是两个稳定的DNA发夹在溶液中共存，直到一个启动子链被引入后第一个发夹被打开。二级结构的丢失导致了第二个类似的发夹的打开。这个过程是一系列的DNA组装事件。最终，HCR形成了一个具有许多重复单元的缺口双螺旋结构。与PCR相比，HCR用于等温核酸扩增，不需要繁琐的温度变化。与RCA和LAMP相比，HCR不需要酶和复杂的引物设计。
辣根过氧化物酶模拟DNAzyme(HRP-DNAzyme)来结合Cas13a和HCR。HRP-DNAzyme是生物传感器和生物识别技术中最常用的催化DNAzymes之一。单链富含鸟嘌呤的核酸和血红素复合物成分相互作用，催化过氧化氢(H2O2)和2,2‘-叠氮-双(3-乙基-苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS2-)之间的氧化还原反应，并伴随颜色变化。这种方法不需要繁琐的仪器和昂贵的改良探针(如荧光团、猝灭剂、亚甲基蓝等)。以实现分析物识别事件的转导到一个光学检测模式。该比色生物传感器放大信号，降低实验条件，以达到视觉检测流感H1N1的目的。我们观察到比色生物传感器在10pM到100nM之间存在良好的线性关系，检测限为0.152pM。由于Cas13a具有突出的选择性，因此在扩增反应中可以排除其它靶标外的甲型流感病毒亚型。本文提供的数据表明，这种基于Cas13a的比色生物传感器是一种很有前途的生物分析的分析方法。
发明内容
本发明提供了一种CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法，该方法不需要改变温度环境，快速高效，对病毒的生物学检测具有重要的应用价值。
本发明的CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法，步骤如下：
通过比色生物传感器识别H1N1，并通过CRISPR/Cas13a蛋白***保证反应的特异性。从H1N1流感病毒中提取的靶RNA进入CRISPR/Cas13a蛋白内部后，通过碱基互补配对与crRNA结合。这改变了蛋白质的结构，并激活了CRISPR/Cas13a蛋白的反式切割能力。设计了一个含有三个尿苷单磷酸的DNA核苷酸链(探针I)。该探针被设计为Cas13a/crRNA反式裂解的底物。DNA探针I由5′端的I1链、中间的一个特殊的RNA序列(-UUU-)和3′端的I2链组成。用生物素修饰I1链，使该链能够启动HCR反应。该特殊的RNA序列(-UUU-)被CRISPR/Cas13a***识别和切割。Cas13a被激活并裂解探针I的RNA序列，探针I分离成I1和I2链。加入SA-MBs，生物素与SA相互作用。含有生物素的未裂解探针I和I1链被SA-MBs吸附，然后通过磁分离将其从溶液中去除。加入发夹H1和H2后，I2链与H1结合，通过趾点介导的链置换打开H1发夹。I2-H1复合物的杂交打开了H2的发夹结构。打开的H2链与发夹H1链互补，导致H1链的发夹结构打开，从而引发HCR反应。由于H1和H2发夹结构不断地打开和组装，H1的g-四联体片段暴露出来。
随后，在血红素的存在下，g-四联体结构折叠，血红素***到该结构中，形成一个DNAzyme。g-四联体DNAzyme可以催化ABTS2-和H2O2之间的氧化还原反应。ABTS溶液的颜色由浅绿色变成深绿色。由此开始的比色反应，产生肉眼可见的反应溶液的颜色变化，形成超灵敏的H1N1流感病毒视觉检测。
进一步特征，分别对CRISPR/Cas13a蛋白浓度、CRISPR/Cas13a酶切温度、CRISPR/Cas13a酶切时间、探针I浓度、HCR反应时间以及Hemin浓度进行了优化。
进一步特征，CRISPR/Cas13a蛋白浓度：选择0.2、0.4、0.6、0.8及1.0μM的Cas13a蛋白，按照具体步骤进行优化。分析如图2-4A，随着Cas13a蛋白加入量的增加，比色度变化强度(I/I0)也随之增加，当Cas13a蛋白浓度达到0.8μM时，I/I0值的变化强度逐渐趋于稳定。所以选择0.8μM作为最佳CRISPR/Cas13a蛋白浓度加入量，不但能达到最佳实验条件，同时可以降低成本。
进一步特征，CRISPR/Cas13a酶切温度：选择25℃、37℃、45℃、55℃及65℃进行优化，如图2-4B可以分析出，随着CRISPR/Cas13a酶切温度的增加I/I0的值是先增加后减小，当酶切温度达到37℃时比色度变化强度的值达到最大，由此可知，CRISPR/Cas13a酶切温度过低或着过高，对比色度变化强度都有影响，都不利于CRISPR/Cas13a蛋白发挥最佳活性。所以选择37℃作为最佳酶切温度。
进一步特征，探针I浓度：选择了0.25、0.75、1.25、1.75、2.25及2.75μM作为探针I浓度，分别对应I：H1：H2为0.1(0.3，0.5，0.7，0.9，1.1):2:1.5，按照上述实验步骤进行优化。如图2C可以得出，比色度变化强度随着探针I加入量的不断增加，呈现先增大后减小的趋势，当探针I浓度高于1.25μM后，比色度变化强度的值增加平缓，可忽略不计，从成本上考虑选择1.25μM作为最佳引物探针I加入量。
进一步特征，Hemin浓度：选择5、10、15、20、25及30μM的Hemin浓度，按照具体步骤进行优化。分析如图2D，随着Hemin浓度加入量的增加，比色度变化强度也随之增加，当Hemin浓度超过10μM达到时15μM，比色度变化强度有很大程度的下降。所以选择10μM作为最佳Hemin加入量，此条件下能达到最佳实验结果。
进一步特征，CRISPR/Cas13a酶切时间：在酶切时间分别为10、20、30、40、50及60min的情况下，按照上述实验步骤进行优化，分析如图2E可以得出，比色度变化强度随着酶切时间的变化而变化，当酶切时间达到30min时，随着时间的增加，I/I0的值增加平缓且有少许的降低。从时间上考虑选择30min作为最佳酶切时间。
进一步特征，HCR反应时间：选择了10、20、30、40及50min作为HCR反应时间，进行实验条件的优化，分析如图2F可以看出，I/I0值随着HCR反应时间的增加而增加，当HCR反应时间达到40min时，I/I0值的增加逐渐趋于平缓。所以选择40min作最佳HCR反应时间。
本发明的有益效果是：
一种基于CRISPR/cas13a的H1N1流感病毒无标记等温检测方法，设计一条寡核苷酸探针I链作为Cas13a/crRNA的反式裂解底物，并作为裂解后的HCR的引物。该方法采用了双信号放大策略，可以大大提高灵敏度。该检测方法对H1N1流感病毒的检测限为0.152pM，在10pM～100nM之间线性度良好。该检测方法也有很好的特异性。其他甲型流感病毒和只有一个碱基差异的高度同源RNA探针可以清楚地区分。
附图说明
图1-1是CRISPR/Cas13a结合杂交链反应目视检测H1N1流感的示意图
图1(A)是对探针I的Cas13a裂解能力的非变性15％ PAGE分析图。M：20bp的DNAladder。
图1(B)非变性15％PAGE分析磁珠(MBs)的能力和HCR的结果图。M：20bp的DNAladder。
图2(A)Cas13a蛋白浓度图；
图2(B)限制性内切酶切温度图；
图2(C)探针I浓度图；
图2(D)Hemin浓度图；
图2(E)限制性内切酶切时间图；
图2(F)HCR时间的实验条件的优化图。
图3(A)H1N1靶RNA在100nM～10pM之间的浓度，以及比色法变化的强度。
图3(B)H1N1靶RNA与比色变化强度之间的线性关系分析。
图4(A)本发明使用不同的流感病毒RNA靶点。
图4(B)本发明使用不同碱基突变的探针。每个靶RNA的浓度为100nM。误差条表示三个实验的标准偏差。
图5是检测真实样本中H1N1流感病毒总RNA(300ng/μL，30ng/μL)。比色生物传感器对H1N1感染和未感染鸡胚的尿囊液反应的I/I0比值。
具体实施方式
所有DNA序列均由生工生物技术有限公司(上海，中国)合成。所有的寡核苷酸见表1。HiScribeT7高产RNA合成试剂盒和君主RNA纯化柱来自新英格兰生物实验室(Ipswich，MA，USA)。Trizol试剂和DynabeadsM-270链霉亲和素(磁珠[MBs]，直径2.8μm，10mg/mL)由赛默飞世尔科学公司(沃尔瑟姆，MA，USA)提供。纯化的(Lwa)Cas13a蛋白和LwaCas13a缓冲液来自Tolo生物技术公司(上海，中国)。RNase抑制剂来自Promega公司(麦迪逊，威斯康星州，美国)。Hemin和AzBTS-(NH4)2购自Sigma-Aldrich公司(圣路易斯，密苏里州，美国)。无rnase的水和所有化学品都是从生工生物技术公司(上海，中国)购买的，无需进一步纯化即可使用。使用纳米滴ND-1000分光光度计(赛默飞世尔科学公司)进行吸光度测量。
表1.本研究中使用的引物和引物序列
实施例1
体外转录制备crispr(cr)RNA和靶RNA：根据流感病毒H1N1的特异性序列片段设计目标RNA序列。设计了LwaCas13a的crRNA。它包含一个36个核苷酸(nt)的直接重复序列和一个25个nt的间隔序列，与目标RNA完全互补。利用T7 RNA聚合酶和HiSCRibe T7高产RNA合成试剂盒(新英格兰生物实验室)体外转录合成RNA，RNA纯化试剂盒纯化RNA。2μL 100μMT7启动子，2μL 100μM ssDNA模板包含T7启动子序列，和14μL RNase-free水孵化在95℃5min，然后梯度冷却到25℃。转录反应体系如下，2μL T7 RNA聚合酶(50U/μL)，10μL NTP缓冲混合(20mM)在37℃16h。然后加入2μL DNase I(2U/μL)，混合降解溶液中的DNA。使用Nanodrop1000紫外-可见分光光度计测定crRNA和靶RNA的浓度，并存储在-80℃下。
H1N1流感检测：10μL的CRISPR/Cas13a酶切反应***包含1μL不同浓度的目标ssRNA，1μL 0.5μM crRNA，1μL 5U的核糖核酸酶抑制剂，1μL 0.8μM的Cas13蛋白质，2μL 1×Cas13a的缓冲液，和4μL 1.25μM的探针，混合均匀后孵化在37℃30min，然后Cas13a酶活性失活在80℃10min。按照标准方法制备了链霉亲和素包被的MBs(SA-MBs)。用15μL的PBS缓冲液(0.08mM的磷酸氢二钠和0.02mM的磷酸氢二钠，pH 7.4)将5μL的SA-MBs悬浮液(10mg/mL)冲洗3次。SA-MBs在5μL的Tris-HCl缓冲液(20mM的Tris，2mM的氯化镁，200mM的氯化钠，20mM的氯化钾，pH 7.4)中重悬。将得到的Cas13a裂解产物加入SA-MBs悬浮液中，在37℃下孵育10min。随后，用磁铁分离磁珠，并将上清液转移到一个新的离心管中。在溶液中加入10μL 2μM的H1和10μL 1.5μM的H2，然后加热37℃加热40min。加入10μL10μM的血红素，在37℃下反应40min。最后，加入10μL 50mM的ABTS，然后加入10μL 40mM的H2O2。该溶液在室温下孵育5min。用NanoDropND-1000分光光度计测量所得样品在荧光强度为414nm时的吸光度。
天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析：Cas13a/crRNA反式产物和HCR用15％天然PAGE进行分析。将10μL产物和2μL 6×loading buffer均匀混合。在凝胶通道中装载了10μL的混合液体。凝胶在1×TBE(89mM的Tris，89mM的硼酸，2.0mM的EDTA，pH 8.2)中运行，在180V下运行40min。该凝胶用SYBR GreenI染色15min，并使用C600免疫印迹成像***进行成像。
鸡胚尿囊液中病毒RNA的提取：收集了感染H1N1流感病毒的鸡胚的尿囊液。采用Trizol法提取病毒总RNA。将250μL的样品与750μL的Trizol试剂彻底混合，并在室温下静置10min。加入200μL氯仿，并通过剧烈振荡混合30秒，并允许在室温下静置10min。溶液在4℃下以12000rpm离心15min，此时溶液呈分层状。将500μL上清液转移到一个新的无酶管中，加入500μL异丙醇，轻轻倒置数次混合，在室温下静置10min。在4℃下12000rpm离心10min后，弃上清液，在750μL冷75％乙醇中重悬。在4℃下以12000rpm离心5min，同时弃用上清液。最后，将病毒RNA在50μL无酶水中重悬，-80℃保存。
实验的可行性分析：
用15％PAGE凝胶对CRISPR/Cas13a酶切产物进行鉴定分析，凝胶成像***结果见图1A。泳道4为条件完整的CRISPR/Cas13a体系，泳道1，2，3分别为仅无CRISPR/Cas13a蛋白的对照组，仅无crRNA的对照组，仅无H1N1靶标RNA的对照组。由图可见，泳道1，2，3条带的亮度是一致的，泳道4在相同位置上几乎看不到条带，而在20bp下方有一条颜色较浅的条带。
此结果说明H1N1靶标RNA，crRNA，Cas13a三个条件中缺少任一条件都无法激活CRISPR/Cas13a体系，无法对I进行切割，当他们同时存在时才能激活CRISPR/Cas13a的酶切活性，对I进行切割，I切割成I1和I2链，I1和I2链由于长度过短，影响染料的嵌入，所以处于下方且颜色较浅。
用15％PAGE凝胶对HCR反应产物进行鉴定分析，凝胶成像***结果见图1B。泳道1和泳道2为同浓度下，仅有H1和H2，泳道3和泳道5分别为纯阴性对照(无CRISPR/Cas13a体系)和阴性对照，泳道4和泳道6分别为纯阳性对照(无CRISPR/Cas13a体系)和阳性对照。由图可见，泳道4和泳道6的加样孔下方都有一条明亮的条带，且泳道3和泳道5未见此条带，由此判断其为HCR产物所形成的条带，且H1和H2条带相较于泳道1和泳道2浅，H2几乎不可见，表明I触发了HCR反应，消耗了H1与H2。
灵敏度分析：
利用优化的实验条件，测量了所开发的H1N1流感检测传感***的线性范围和灵敏度。流感H1N1靶RNA探针浓度与吸收强度方差之间的线性反应关系表明，随着H1N1流感中提取的靶RNA浓度的增加(101、102、103、104、105pM)(图3A)。在101-105pM的范围内，从信号变化和lg(靶RNA浓度)中观察到良好的线性相关性(图3B)。回归方程为I/I0＝1.057log10C-0.1560(R2＝0.912)。根据3σ/斜率(σ为空白样品的标准差值)计算出检测限为0.152pM。与几种CRISPR/Cas检测***相比，在时间和灵敏度方面，我们的检测方法相当甚至优越(表2)。
特异性分析：
为研究本实验方法的特异性，我们使用了H3N2、H5N1、H9N2、H7N9亚型流感病毒特异性核酸序列以及三种碱基突变序列作为靶标RNA进行检测，对该检测方法进行特异性分析。从图4A和4B中可以看出，对照组中的H3N2、H5N1、H9N2、H7N9亚型的流感病毒以及M1、M2、M3的比色度变化强度(I/I0)平均低于2，而H1N1靶标RNA引发的比色度变化强度(I/I0)高于4，从这些数据可以看出，该试验方法对甲型H1N1流感病毒具有良好的特异性。
模拟样品检测：
传统的检测方法是从含有病毒的血清中进行病毒分离和提取，因此，为研究本实验方法在实际应用的可能性，我们设计了此检测方法在适宜病毒繁殖与大量聚集的复杂样本中对流感病毒H1N1的检测方案。结果如表2-5所示,检出率与相对标准偏差(RSD)分别在83.90％-104.77％和0.27％-6.95％，证明了该方法能在复杂样本检测H1N1。
表2-5H1N1模拟样本检测(n＝3)Table2-5Simulation samples of detection ofH1N1(n＝3)
真实样本分析：
进一步研究了比色生物传感器在复杂RNA提取物中检测靶RNA的适用性和特异性。为了验证该传感方法的准确性，采用比色生物传感器检测鸡胚样本尿囊液中的H1N1流感病毒。从感染流感病毒的鸡胚中收集尿囊液。提取流感病毒总RNA并进行检测试验。在相同的实验条件下，比较不同浓度和对照组(用杜尔贝库改良的老鹰培养基溶液代替流感H1N1感染鸡胚)的总RNA提取物信号强度的变化。改变的信号强度在总RNA提取物中显著增加。在对照组中，对照组的信号变化强度与用水代替靶RNA进行检测的阴性组相一致(图5)。研究结果表明，该比色生物传感器***适用于检测真实样本中的流感病毒。

Claims (7)

1.一种CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法，其特征在于步骤如下：
通过比色生物传感器识别H1N1，并通过CRISPR/Cas13a蛋白***保证反应的特异性；从H1N1流感病毒中提取的靶RNA进入CRISPR/Cas13a蛋白内部后，通过碱基互补配对与crRNA结合；这改变了蛋白质的结构，并激活了CRISPR/Cas13a蛋白的反式切割能力；创建了一个含有三个尿苷单磷酸的DNA核苷酸链(探针I)；该探针被设计为Cas13a/crRNA反式裂解的底物；DNA探针I由5′端的I1链、中间的一个特殊的RNA序列(-UUU-)和3′端的I2链组成；用生物素修饰I1链，使该链能够启动HCR反应；该特殊的RNA序列(-UUU-)被CRISPR/Cas13a***识别和切割；Cas13a被激活并裂解探针I的RNA序列，探针I分离成I1和I2链；加入SA-MBs，生物素与SA相互作用；含有生物素的未裂解探针I和I1链被SA-MBs吸附，然后通过磁分离将其从溶液中去除；加入发夹H1和H2后，I2链与H1结合，通过趾点介导的链置换打开H1发夹；I2-H1复合物的杂交打开了H2的发夹结构；打开的H2链与发夹H1链互补，导致H1链的发夹结构打开，从而引发HCR反应；由于H1和H2发夹结构不断地打开和组装，H1的g-四联体片段暴露出来；随后，在血红素的存在下，g-四联体结构折叠，血红素***到该结构中，形成一个DNAzyme；g-四联体DNAzyme可以催化ABTS2-和H2O2之间的氧化还原反应；ABTS溶液的颜色由浅绿色变成深绿色；由此开始的比色反应，产生肉眼可见的反应溶液的颜色变化，形成超灵敏的H1N1流感病毒视觉检测。
2.根据权利要求1所述的一种CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法，其特征在于：CRISPR/Cas13a蛋白浓度：选择0.2、0.4、0.6、0.8及1.0μM的Cas13a蛋白，按照具体步骤进行优化。
3.根据权利要求1所述的一种CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法，其特征在于：CRISPR/Cas13a酶切温度：选择25℃、37℃、45℃、55℃及65℃进行优化。
4.根据权利要求1所述的一种CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法，其特征在于：探针I浓度：选择了0.25、0.75、1.25、1.75、2.25及2.75μM作为探针I浓度，分别对应I：H1：H2为0.1(0.3，0.5，0.7，0.9，1.1):2:1.5。
5.根据权利要求1所述的一种CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法，其特征在于：Hemin浓度：选择5、10、15、20、25及30μM的Hemin浓度。
6.根据权利要求1所述的一种CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法，其特征在于：CRISPR/Cas13a酶切时间：在酶切时间分别为10、20、30、40、50及60min。
7.根据权利要求1所述的一种CRISPR/Cas13a结合杂交链式反应用于流感病毒H1N1可视化检测的方法，其特征在于：HCR反应时间：选择了10、20、30、40及50min作为HCR反应时间。
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CN116732211B (zh) * 2023-08-09 2023-10-27 湖南工程学院 基于8-17脱氧核酶与CRISPR-Cas13a反式切割检测牛结核分枝杆菌的探针组及方法

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