CN116042677A - 编码抗原蛋白的核酸序列、引物、利用基因工程浮萍表达虾白斑综合症疫苗的方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种编码抗原蛋白的核酸序列、引物、利用基因工程浮萍表达虾白斑综合症疫苗的方法和应用，涉及基因工程技术领域。所述抗原蛋白能保护虾免受虾白斑综合症WSSV感染，核酸序列命名为TCTP‑VP28，具有如SEQ ID NO：2所示的序列。本发明针对浮萍基因组密码子频率对虾白斑综合症抗原基因进行密码子优化，采用浮萍内源泛素启动子、Bip前导肽和内质网驻留信号肽，介导重组抗原蛋白在浮萍中大量积累，最终达到较高水平，还创新性地将TCTP蛋白转导域与VP28抗原蛋白融合表达，可以有效延长重组疫苗的口服免疫保护时效，并且具有更高的安全性和稳定性。利用浮萍作为生物反应器底盘生产虾白斑综合症疫苗具有蛋白表达量高、生产成本低、可口服免疫、易于扩展等优势。

Description

编码抗原蛋白的核酸序列、引物、利用基因工程浮萍表达虾白斑综合症疫苗的方法和应用
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种编码抗原蛋白的核酸序列、引物、利用基因工程浮萍表达虾白斑综合症疫苗的方法和应用。
背景技术
近年来，我国虾产业发展迅速，养殖面积和产量均保持着较快的增长。随着虾养殖规模的快速扩张，高密度集约化的养殖增加了虾疾病爆发的风险，其中危害最严重的是虾白斑综合症病毒，通常在5-7月份引起虾主产区的大规模爆发性死亡，毒力极强，感染宿主后致死率高达90-100％。一般感染后48小时出现白斑，3 -10天内累计死亡率达100％，给养殖户造成巨大的经济损失，然而目前针对该疾病还没有安全有效的治疗方法。
白斑综合症病毒(WSSV)是虾类养殖业最具威胁的感染性病原体，由WSSV引起的白斑病在全球甲壳类养殖业中每年都会造成巨大的经济损失。在中国，WSSV导致养殖虾产量损失了80％。WSSV是一种具有双层囊膜结构的杆状病毒，属于线头病毒科白斑综合症病毒属。WSSV含有约300kb的双链环状DNA，预测表达的蛋白质约有181种，其中结构蛋白超过58种，主要参与病毒粒子的组装、构成病毒的囊膜和核衣壳。VP28、VP39B、VP41A、VP41B、VP51A、VP51B、VP68、VP124、VP150、VP187、VP281、VP292和胶原样蛋白定位于包膜内，而VP35、VP466、VP15、VP51、VP76等蛋白位于核衣壳内。病毒侵染宿主主要依靠细胞表面的受体或类受体分子介导的内化途径，网格蛋白介导的内吞作用是WSSV进入小龙虾造血组织细胞的主要内化途径。通过使用针对不同结构蛋白的抗体进行体内中和试验表明，VP28、VP24、VP68、VP281、VP466等蛋白可能在病毒穿透中发挥着重要作用，这些结构蛋白的体内中和可显著降低虾的死亡率。研究发现一种来自虾血细胞的25kDA膜蛋白可与WSSV病毒粒子或重组VP28结合，该蛋白与GTP结合蛋白Rab7具有高度同源性，且体内中和实验表明，抗Rab7抗体抑制了病毒粒子与细胞的结合，显著降低WSSV病毒的致死率。在小龙虾中，含有RGD基序的结构蛋白VP36A、VP36B和VP31的抗体中和实验表明，多种包膜蛋白参与了小龙虾的WSSV感染，并且抗体中和可以显著延迟小龙虾的初始感染。不同地区的WSSV毒株基因组在不同区域有着明显的序列变异，在中国WSSV基因组中存在9.6kbp的不稳定区域，并且似乎会根据宿主种类变化而发生不同大小的自发性缺失，这些缺失现象可能与WSSV毒力有着重要关联。对中国、印度、泰国、韩国和美国的小龙虾WSSV毒株比较发现，它们的蛋白谱十分相似，都显示出至少三种主要结构蛋白(VP28、VP24和VP19)。通过使用VP28抗原的单克隆抗体对来自中国、美国、巴拿马、印度尼西亚、泰国、日本、马来西亚和印度的WSSV分离株进行鉴定，发现VP28的抗原变异性较低。一些研究表明，WSSV复制的原发部位是前肠上皮细胞、鳃细胞以及触角腺细胞，后通过进一步感染小龙虾的血细胞穿过身体到达远处的靶器官。ISH、IHC和IIF等研究发现，淡水对虾和虾的循环血细胞对WSSV感染具有抵抗力，暗示WSSV可能以无细胞形式通过血淋巴循环到达其他靶器官。
目前，国内外关于WSSV疫苗的研究取得了较大进展。已有研究结果表明基于WSSV囊膜蛋白的重组疫苗可以诱导虾产生抗病保护效应。Jeroen Witteveldt等通过在大肠杆菌中表达VP28和VP19重组蛋白，通过纯化注射和混合口服等方式对健康虾接种，攻毒试验后发现VP28和VP19亚单位疫苗都具有一定的免疫保护效果，其中VP28免疫保护率可达到70％，并且在不同给药方式下，其免疫保护率是不同的。口服条件下，VP28的免疫保护率高于VP19，而在注射条件下，VP19的免疫保护率高于VP28，两个共同使用时免疫保护效果要低于单独使用。Xu等利用家蚕作为生物反应器生产VP28和VP19，口服免疫小龙虾后存活率分别可达94.7％和89.5％。Du等利用昆虫杆状病毒作为载体在昆虫细胞中表达VP28蛋白，对小龙虾注射免疫保护效果可达92％。宁德刚等通过Cot***将VP28表达在枯草芽孢杆菌表面，口服免疫小龙虾后，免疫保护率达到80％。zhang等通过将蛋白转导结构域多肽TAT与VP28融合表达并口服免疫小龙虾，发现融合表达的TAT-VP28亚单位疫苗可以迅速穿过虾肠壁组织到达血淋巴，从而激活虾的酚氧化酶原***。攻毒实验结果表明，TAT-VP28亚单位疫苗比VP28具有更高的保护效果。VP28是WSSV包膜上含量最高的一种蛋白，并且参与病毒吸附和侵入虾细胞的过程。基于前人研究结果，本发明选择使用的抗原蛋白是VP28。
蛋白转导域(PTD)是一类短肽(通常小于20个氨基酸)，可以跨过活细胞的生物膜转运，并在体外和体内携带异源货物。PTD适合于大分子治疗药物的递送，有许多PTD在临床上被证明用来递送蛋白质和肽的有效性。TAT-PTD是第一个发现也是研究最多的PTD，并且已有研究表明TAT-PTD可诱导融合蛋白穿过虾肠壁细胞进入血淋巴，从而产生较好的免疫效果。与TAT-PTD相比，TCTP-PTD可以在较长时间段以相对较高的剂量有效地内化到细胞中，更适合长效免疫。TCTP-PTD还具有更高的安全性和稳定性，TCTP的非核定位可以避免与核酸发生不良离子相互作用，降低干扰正常基因表达的潜在风险。由于TCTP-PTD不定位于细胞核和溶酶体，可以避免融合蛋白被溶酶体降解，更有效地介导治疗性药物进入细胞质。同时，TCTP-PTD的疏水性可以使其轻松穿透体内多层细胞组织。为了更加稳定长效的口服免疫效果，本发明使用TCTP-VP28作为重组亚单位疫苗。
虽然目前WSSV疫苗已有不同表达平台，但受制于成本、免疫原性、安全性等诸多因素，可以真正达到商用水平的依旧很少。基于植物平台生产的重组亚单位疫苗与传统生产***(细菌、酵母、昆虫和动物细胞)相比，在安全、规模、成本效益、配送和存储方便等方面具有较大优势。大量植物制造的人和动物重组药用蛋白的临床前和临床研究证明了植物工厂生产疫苗的可行性、有效性和安全性。植物底盘疫苗制作成本低，接种方便，免疫原性强，是口服给药的理想选择。
浮萍作为一种水生植物，是一种理想的合成生物学底盘，具有很多其他植物表达***不具备的优势。如：体积小，生长速度快，适应能力强，无性繁殖限制转基因逃逸的风险，不占耕地不争粮等。同时由于浮萍具有良好的适口性，在自然环境下浮萍也会被虾摄食，通过拌入饵料进行口服免疫也是一种理想的接种方式。
综上所述，本发明的目的在于提供一种编码抗原蛋白的核酸序列、引物、利用基因工程浮萍表达虾白斑综合症疫苗的方法和应用，该疫苗由浮萍经基因工程改造而获得，其中以浮萍作为生物反应器制备白斑综合症病毒TCTP-VP28的重组疫苗迄今尚未见任何类似的报道或发明专利。
发明内容
本发明提供的一种编码抗原蛋白的核酸序列、引物、利用基因工程浮萍表达虾白斑综合症疫苗的方法和应用，旨在解决上述背景技术中存在的问题。
为了实现上述技术目的，本发明主要采用如下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种编码抗原蛋白的核酸序列，所述抗原蛋白能保护虾免受虾白斑综合症WSSV感染，所述核酸序列命名为TCTP-VP28，具有如SEQ ID NO：2所示的序列。
第二方面，本发明提供了一种扩增如第一方面所述的编码抗原蛋白的核酸序列的引物对，所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物具有如SEQ ID NO：3所示的序列，所述反向引物具有如SEQ ID NO：4所示的序列。
第三方面，本发明提供了一种利用基因工程浮萍表达虾白斑综合症疫苗的方法，包括如下步骤：
(1)浮萍叶状体的预培养
取生长状态良好的浮萍叶状体置于1/2MS培养基上，用于后续遗传转化；
(2)目的基因的合成
使用浮萍偏好的密码子，在VP28的N端引入TCTP-PTD(1-MIIYRDLISH-10)和6×甘氨酸连接臂的编码序列，构建TCTP-VP28融合基因，进行密码子优化后，人工合成；
(3)TCTP-VP28双元表达载体构建
将上述合成的TCTP-VP28融合基因通过无缝克隆组装到改造的植物双元表达载体pCAMBIA1300G上，获得重组表达载体pCAMBIA1300G-VP28；采用化学转化的方法将该载体转化至大肠杆菌感受态TOP10进行扩增，并从大肠杆菌中提取和纯化pCAMBIA1300G-VP28载体，得到pCAMBIA1300G-VP28质粒载体；
(4)农杆菌介导的浮萍叶状体转化
将步骤(3)构建成功的pCAMBIA1300G-VP28质粒载体转化到EHA105农杆菌感受态细胞，PCR鉴定为阳性克隆后，使用叶状体转化法转化步骤(1)培养的浮萍叶状体；
(5)TCTP-VP28转基因浮萍的选择培养及鉴定
对步骤4)得到的浮萍叶状体进行选择培养，并筛选出TCTP-VP28基因表达的浮萍转化植株。
在本发明的较佳实施例方式中，所述步骤(3)中，TCTP-VP28融合基因通过无缝克隆组装到改造的植物双元表达载体pCAMBIA1300G上的具体步骤如下：
S41:以pUC57-VP28质粒为模板，利用如权利要求2所述的引物对进行PCR扩增，获得TCTP-VP28融合基因；
S42:对步骤S41获得的TCTP-VP28融合基因的PCR产物胶回收；
S43:使用Spe I和Kpn I对pCAMBIA1300G载体进行双酶切；
S44:同源重组连接TCTP-VP28融合基因和pCAMBIA1300G双酶切产物；
S45:以重组质粒pCAMBIA1300G-VP28转大肠杆菌感受态细胞TOP10后，铺板后长出的单克隆菌落为模板，利用如SEQ ID NO：5所示的菌落PCR正向引物序列和SEQ ID NO：6所示的菌落PCR反向引物序列，进行PCR扩增，当菌落PCR鉴定为阳性克隆后，再利用如SEQ IDNO：12所示的测序引物进行测序鉴定。
在本发明的较佳实施例方式中，所述步骤(3)中，改造的植物双元表达载体pCAMBIA1300G包含以下表达优化元件：浮萍内源泛素启动子、5’UTR、Bip前导肽、CBD纯化标签和KDEL驻留信号肽，浮萍内源泛素启动子、5’UTR、Bip前导肽、CBD纯化标签和KDEL驻留信号肽，其中，在Pst I和Xba I酶切位点间***浮萍内源启动子序列，在Xba I和BamH I酶切位点间***5'UTR序列，在BamH I和Kpn I酶切位点间***Bip前导肽序列并引入新的Spe I酶切位点，在Kpn I和Acc65 I酶切位点间***CBD标签序列，CBD标签5'端连接有柔性linker(GGGGS)3，在Acc65 I和EcoR I酶切位点间***KDEL信号肽序列。
进一步的，所述浮萍内源泛素启动子序列如SEQ ID NO：7所示；所述5’UTR序列如SEQ ID NO：8所示；所述Bip前导肽序列如SEQ ID NO：9所示；所述CBD纯化标签序列如SEQIDNO：10所示；所述KDEL驻留信号肽序列如SEQ ID NO：11所示。
在本发明的较佳实施例方式中，所述步骤(4)中，浮萍叶状体转化的具体过程如下：
浮萍叶状体预处理：挑选生长状态良好的浮萍并用镊子拔除幼叶暴露分生组织，将处理好的叶状体浸泡于预处理液中，所述预处理液配方如下：1/2MS+蔗糖(30g/L)+乙酰丁香酮(100μmol/L)+silwetl-77(0.02％)；
侵染液制备：挑取阳性单克隆农杆菌接种到5mL含有卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，28℃，220rpm，振荡培养24h后将菌液转接到100mL含有卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，当菌液的OD600值在0.8-1.0之间时，4000rpm室温离心15min，收集菌体，用预处理液重悬菌体至OD600值在0.6-0.8之间；
浮萍叶状体侵染：将预处理的浮萍叶状体收集放入一个无菌三角瓶中，倒入侵染液，用封口膜封口，抽真空(-0.08Mpa)10min后取出叶状体，用滤纸吸去多余菌液，接种到共培养培养基上避光培养3天。
在本发明的较佳实施例方式中，所述步骤(5)中选择培养的选择培养基为：1/2MS培养基、3％蔗糖、0.8％琼脂、300mg/L Cefotaxime sodium、30mg/L Hygromycin，且其pH值为5.8；选择培养至少一个月，且选择培养过程中每周更换一次相同的选择培养基。
第四方面，本发明提供了一种如第三方面所述的方法生产的虾白斑综合症疫苗在虾饲料或虾饲料添加剂中的应用。
第五方面，本发明提供了一种提高虾抗白斑综合症的饲料，所述饲料配方按重量组分由以下成分组成：转基因浮萍粉25份、鱼粉20份、磷酸二氢钙8份、中草药提取物8份、复合酶制剂3份、复合维生素3份、脱壳素3份、复合微量元素3份、氯化胆碱3份、诱食剂3份、EM原露2份、沸石粉2份；
所述转基因浮萍粉为表达TCTP-VP28重组亚单位疫苗的转基因浮萍；
所述中草药提取物是金银花、蒲公英、马齿苋、水芹用酒精回流法提取的产物；
所述复合酶制剂是植酸酶、蛋白酶、淀粉酶和果胶酶的混合物，且复合酶制剂中，植酸酶、蛋白酶、淀粉酶和果胶酶的重量比为1:3:2:1；
所述复合维生素包括维生素A、维生素C、维生素D3、维生素E、维生素K，且维生素A、维生素C、维生素D3、维生素E、维生素K的重量比为1:2:1:2:1；
所述复合微量元素包括锰、铁、锌、铜、硒；
所述诱食剂包括鱿鱼膏、甜菜碱、牛磺酸、DMPT、大蒜素，且所述鱿鱼膏、甜菜碱、牛磺酸、DMPT、大蒜素的重量比为3:2:2:1:2。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明提供的这种利用浮萍作为生物反应器表达虾白斑综合症疫苗的方法采用浮萍内源泛素启动子，相对于其他异源强启动子具有驱动表达稳定高效、蛋白折叠错误率低、生物活性高等优势。
(2)本发明提供的这种利用浮萍作为生物反应器表达虾白斑综合症疫苗的方法针对浮萍密码子偏好对VP28基因进行密码子优化并合成、采用Bip前导肽以及内质网驻留信号肽诱导在内质网大量积累、添加5'UTR序列提高翻译效率等方法可有效提高浮萍外源蛋白的表达量。
(3)本发明提供的这种利用浮萍作为生物反应器表达虾白斑综合症疫苗的方法使用CBD作为蛋白纯化标签，具有可增强免疫原性、纯化成本低等优势。
(4)本发明提供的这种利用浮萍作为生物反应器表达虾白斑综合症疫苗的方法采用浮萍叶状体转化法相对于愈伤转化具有转化周期短、操作简单等优势，可较短时间获得转基因植株，转化周期缩短至5-6周左右。
(5)本发明提供的这种利用浮萍作为生物反应器表达虾白斑综合症疫苗的方法使用TCTP蛋白转导域与VP28蛋白融合表达。在口服免疫过程中，TCTP相较于传统的TAT蛋白转导域具有降低干扰正常基因表达的潜在风险、避免被溶酶体降解、免疫时效更长等优势。
(6)本发明提供的这种利用浮萍作为生物反应器表达虾白斑综合症疫苗的方法充分利用了浮萍结构简单，生长繁殖快，生物量大，富含淀粉和蛋白质等优势，相较于微生物生产的目标产物的丰富度和复杂程度更高。在商业化生产中，浮萍的光合自养可以从原料端降低生产成本，具有成本最低的可能性，将其作为生物反应器底盘生产虾白斑综合症疫苗，生产效率高、成本低、可口服，解决了以往虾疫苗接种成本高和免疫困难等问题，也为利用浮萍表达其他水产疫苗奠定了基础。
附图说明
图1为本发明实施例中提供的改造的植物双元表达载体pCAMBIA1300G结构示意图。
具体实施方式
下面对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1、浮萍叶状体的预培养：
取状态良好的浮萍叶状体置于1/2MS培养基上预培养，用于后续基因转化。
本实施例采用混合营养培养的方式对浮萍叶状体进行预培养，具体过程如下：1/2MS培养基中添加有机碳源，在25～28℃、每天14小时光期/10小时暗期、光照强度为5000lux的条件下培养；其中，有机碳源可以选用葡萄糖、半乳糖、果糖、麦芽糖和蔗糖中任一种；更优选的，选用葡萄糖作为有机碳源。
对比本实施例的混合营养培养与传统的光合自养(即1/2MS培养基中不添加有机碳源)、异养(即黑暗条件培养)的培养方式培养浮萍，浮萍在不同营养条件下最大生物量、淀粉和蛋白质产量如表1所示。
结果表明，浮萍在混合营养条件下获得的生物量、淀粉、蛋白质含量显著高于其它两种培养方式，本实施例采用混合营养培养方式对小浮萍进行预培养更有利于后续基因转化。
表1
Figure BDA0004057790720000071
2、TCTP-VP28基因密码子优化及人工合成
为了使VP28在浮萍中较高的表达，需要使用浮萍偏好的密码子。从美国生物技术信息中心(NCBI)基因库里获得VP28(GB:EU414753)开放阅读框所编码的氨基酸序列共204aa，如SEQ ID NO：1所示。
在VP28的N端引入TCTP-PTD(1-MIIYRDLISH-10)和6×甘氨酸连接臂的编码序列构建TCTP-VP28融合基因，浮萍密码子使用频率表可以从kazusa数据库下载，如下:UUU 6.6(20)UCU 3.3(10)UAU 6.0(18)UGU 0.3(1)2UUC 46.5(140)UCC 23.9(72)UAC
26.9(81)UGC 10.6(32)3UUA 1.7(5)UCA 3.0(9)UAA 0.3(1)UGA 1.0(3)4UUG 8.0(24)UCG13.3(40)UAG 0.3(1)UGG 16.3(49)56CUU 8.6(26)CCU 3.7(11)CAU 4.3(13)CGU
3.3(10)7CUC 46.9(141)CCC 21.3(64)CAC 11.3(34)CGC 8.3(25)8CUA 2.7(8)CCA 6.3(19)CAA 3.7(11)CGA 3.7(11)9CUG 36.6(110)CCG 13.6(41)CAG 24.3(73)CGG8.0(24)10
11AUU 5.7(17)ACU 4.3(13)AAU 4.3(13)AGU 6.0(18)12AUC 48.5(146)ACC 26.6(80)AAC37.2(112)AGC 19.6(59)13AUA 5.3(16)ACA 5.0(15)AAA 5.0(15)AGA 7.0(21)14AUG
26.9(81)ACG 16.6(50)AAG 43.9(132)AGG 24.9(75)1516GUU 9.0(27)GCU 11.0(33)GAU7.0(21)GGU 4.3(13)17GUC 36.9(111)GCC 36.9(111)GAC 40.2(121)GGC 28.3(85)18GUA3.7(11)GCA 6.0(18)GAA 5.7(17)GGA 14.0(42)19GUG 34.2(103)GCG 22.6(68)GAG
49.9(150)GGG 28.9(87)
使用OPTIMIZER密码子在线优化工具进行密码子优化，优化后序列由武汉擎科生物有限公司进行合成。优化后序列如SEQ ID NO：2所示的序列。
3、TCTP-VP28双元表达载体构建
将上述合成的TCTP-VP28融合基因通过无缝克隆组装到实验室改造的植物双元表达载体pCAMBIA1300G上，获得重组表达载体pCAMBIA1300G-VP28；采用化学转化的方法将该载体转化至大肠杆菌感受态TOP10进行扩增，并从大肠杆菌中提取和纯化pCAMBIA1300G-VP28载体，得到pCAMBIA1300G-VP28质粒载体。
其中，密码子优化后的TCTP-VP28基因与植物双元表达载体pCAMBIA1300G连接的具体步骤如下：
1)根据目的基因及载体序列设计无缝克隆引物并送至武汉擎科生物有限公司进行合成，引物序列如下：
TCTP-VP28-F：CTGGTGGTGGATCAACTAGTATGATCATCTACAGGGACCTC；如SEQ ID NO：3所示。
TCTP-VP28-R：
CTTAAGGTTACCTGATACTGAACCTCCTCCACCTGAACCTCCTCCACCCTCGGTCTC
GGTCCCGG；如SEQ ID NO：4所示。
2)以pUC57-VP28质粒为模板，使用无缝克隆引物PCR扩增合成的目的基因片段；
PCR反应体系
Figure BDA0004057790720000091
PCR反应条件：
98℃预变性5min；98℃变性20s，58℃退火20s，72℃延伸40s，30个循环；72℃延伸5min。
3)TCTP-VP28 PCR产物胶回收
TCTP-VP28 PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳，分离目的片段条带，当目的条带清晰分离时，在紫外灯下切下目的条带(720bp左右)。切胶后用胶回收试剂盒回收目的片段。
4)载体pCAMBIA1300G双酶切
使用Spe I和Kpn I对pCAMBIA1300G载体进行双酶切
酶切体系
Figure BDA0004057790720000092
37℃温育30min，电泳分离后切胶回收线性化载体。
5)同源重组连接TCTP-VP28和pCAMBIA1300G双酶切产物
Figure BDA0004057790720000093
Figure BDA0004057790720000101
50℃温育15min，反应结束后取5μl转化到TOP10大肠杆菌感受态。
6)以重组质粒pCAMBIA1300G-VP28转大肠杆菌感受态细胞TOP10后，铺板(LB+kan)后长出的单克隆菌落为模板，菌落PCR鉴定阳性克隆后送至武汉擎科生物有限公司测序鉴定。
菌落PCR引物：
M-F：TGCACAAACAATGAGGTGC；如SEQ ID NO：5所示；
VP-R：GACCTTGAAGGTCCCCTCG；如SEQ ID NO：6所示；
测序引物：
CBM3-R：AGACAAATCGATCGCAGAGC；如SEQ ID NO：12所示。
所述改造植物双元表达载体pCAMBIA1300G包含以下表达优化元件：
浮萍内源泛素启动子序列：如SEQ ID NO：7所示；
5’UTR序列：如SEQ ID NO：8所示；
Bip前导肽序列：如SEQ ID NO：9所示；
CBD纯化标签序列：如SEQ ID NO：10所示；
KDEL驻留信号肽序列：如SEQ ID NO：11所示。
其中，在Pst I和Xba I酶切位点间***浮萍内源启动子序列，在Xba I和BamH I酶切位点间***5'UTR序列，在BamH I和Kpn I酶切位点间***Bip前导肽序列并引入新的SpeI酶切位点，在Kpn I和Acc65 I酶切位点间***CBD标签序列，CBD标签5'端连接有柔性linker(GGGGS)3，在Acc65 I和EcoR I酶切位点间***KDEL信号肽序列，如图1所示。
4、农杆菌介导的浮萍叶状体转化
将构建成功的pCAMBIA1300G-VP28重组质粒转化到EHA105农杆菌感受态细胞，PCR鉴定为阳性克隆后，使用叶状体转化法转化浮萍叶状体；
浮萍叶状体预处理：挑选生长状态良好的浮萍并用镊子拔除幼叶暴露分生组织，将处理好的叶状体浸泡于预处理液中。预处理液配方如下：1/2MS+蔗糖(30g/L)+乙酰丁香酮(100μmol/L)+silwetl-77(0.02％)
侵染液制备：挑取阳性单克隆农杆菌接种到5mL含有卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，28℃，220rpm，振荡培养24h后将菌液转接到100mL含有卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，当菌液的OD600值在0.8-1.0之间时，4000rpm室温离心15min，收集菌体。用预处理液重悬菌体至OD600值在0.6-0.8之间。
浮萍叶状体侵染：将预处理的浮萍叶状体收集放入一个无菌三角瓶中，倒入侵染液，用封口膜封口，抽真空(-0.08Mpa)10min后取出叶状体，用滤纸吸去多余菌液，接种到共培养培养基上避光培养3天。
5、TCTP-VP28转基因浮萍的选择培养及鉴定
选择培养基：1/2MS培养基、3％蔗糖、0.8％琼脂、300mg/L Cefotaxime sodium、30mg/LHygromycin，且其pH值为5.8；选择培养至少一个月，且选择培养过程中每周更换一次相同的选择培养基。
提取浮萍转化株系的基因组DNA，PCR验证TCTP-VP28基因的***，来筛选浮萍转化植株；
提取浮萍转化株系的总RNA，以总RNA为模板，进行RT-PCR鉴定TCTP-VP28基因正确转录。
实施例2
一种提高虾抗白斑综合症的饲料配方，所述饲料配方按重量组分由以下成分组成：
转基因浮萍粉25份、鱼粉20份、磷酸二氢钙8份、中草药提取物8份、复合酶制剂3份、复合维生素3份、脱壳素3份、复合微量元素3份、氯化胆碱3份、诱食剂3份、EM原露2份、沸石粉2份
所述转基因浮萍粉为表达TCTP-VP28重组亚单位疫苗的转基因浮萍。可有效提高虾对白斑综合症的抵抗力，同时浮萍也是优质的植物源蛋白，可替代豆粕的使用。浮萍还具有一些药用成分，其中木犀草素、木犀草苷、大波斯菊苷、牡荆素、荭草素等黄酮类成分具有抑菌消炎、抗氧化等生物活性，能够提高动物的免疫力。
所述中草药提取物是金银花、蒲公英、马齿苋、水芹用酒精回流法提取的产物。添加该产物有利于提高虾免疫力和抗病力。
所述复合酶制剂是植酸酶、蛋白酶、淀粉酶和果胶酶的混合物。配比为1:3:2:1，有助于提高虾对饲料的消化率。
所述复合维生素包括维生素A、维生素C、维生素D3、维生素E、维生素K。配比为1:2:1:2:1所述复合微量元素包括锰、铁、锌、铜、硒。
所述诱食剂包括鱿鱼膏、甜菜碱、牛磺酸、DMPT、大蒜素。配比为3:2:2:1:2，可显著增强饲料诱食效果，提高虾的采食量。
所述EM原露是一种新型复合微生物菌剂，可消除氧化物质，消除腐败，抑制病原菌，提高动物免疫力。
本实施例饲料配方可显著提高虾对白斑综合症病毒的免疫力，减少抗生素的使用，降低养殖成本。
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种编码抗原蛋白的核酸序列，所述抗原蛋白能保护虾免受虾白斑综合症WSSV感染，其特征在于，所述核酸序列命名为TCTP-VP28，具有如SEQ ID NO：2所示的序列。
2.一种扩增如权利要求1所述的编码抗原蛋白的核酸序列的引物对，其特征在于：所述引物对包括正向引物和反向引物，所述正向引物具有如SEQ ID NO：3所示的序列，所述反向引物具有如SEQ ID NO：4所示的序列。
3.一种利用基因工程浮萍表达虾白斑综合症疫苗的方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)浮萍叶状体的预培养
取生长状态良好的浮萍叶状体置于1/2MS培养基上，用于后续遗传转化；
(2)目的基因的合成
使用浮萍偏好的密码子，在VP28的N端引入TCTP-PTD(1-MIIYRDLISH-10)和6×甘氨酸连接臂的编码序列，构建TCTP-VP28融合基因，进行密码子优化后，人工合成；
(3)TCTP-VP28双元表达载体构建
将上述合成的TCTP-VP28融合基因通过无缝克隆组装到改造的植物双元表达载体pCAMBIA1300G上，获得重组表达载体pCAMBIA1300G-VP28；采用化学转化的方法将该载体转化至大肠杆菌感受态TOP10进行扩增，并从大肠杆菌中提取和纯化pCAMBIA1300G-VP28载体，得到pCAMBIA1300G-VP28质粒载体；
(4)农杆菌介导的浮萍叶状体转化
将步骤(3)构建成功的pCAMBIA1300G-VP28质粒载体转化到EHA105农杆菌感受态细胞，PCR鉴定为阳性克隆后，使用叶状体转化法转化步骤(1)培养的浮萍叶状体；
(5)TCTP-VP28转基因浮萍的选择培养及鉴定
对步骤4)得到的浮萍叶状体进行选择培养，并筛选出TCTP-VP28基因表达的浮萍转化植株。
4.根据权利要求3所述的利用基因工程浮萍表达虾白斑综合症疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，TCTP-VP28融合基因通过无缝克隆组装到改造的植物双元表达载体pCAMBIA1300G上的具体步骤如下：
S41:以pUC57-VP28质粒为模板，利用如权利要求2所述的引物对进行PCR扩增，获得TCTP-VP28融合基因；
S42:对步骤S41获得的TCTP-VP28融合基因的PCR产物胶回收；
S43:使用Spe I和Kpn I对pCAMBIA1300G载体进行双酶切；
S44:同源重组连接TCTP-VP28融合基因和pCAMBIA1300G双酶切产物；
S45:以重组质粒pCAMBIA1300G-VP28转大肠杆菌感受态细胞TOP10后，铺板后长出的单克隆菌落为模板，利用如SEQ ID NO：5所示的菌落PCR正向引物序列和SEQ ID NO：6所示的菌落PCR反向引物序列，进行PCR扩增，当菌落PCR鉴定为阳性克隆后，再利用如SEQ ID NO：12所示的测序引物进行测序鉴定。
5.根据权利要求3所述的利用基因工程浮萍表达虾白斑综合症疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，改造的植物双元表达载体pCAMBIA1300G包含以下表达优化元件：浮萍内源泛素启动子、5’UTR、Bip前导肽、CBD纯化标签和KDEL驻留信号肽，其中，在Pst I和XbaI酶切位点间***浮萍内源启动子序列，在Xba I和BamH I酶切位点间***5'UTR序列，在BamH I和Kpn I酶切位点间***Bip前导肽序列并引入新的Spe I酶切位点，在Kpn I和Acc65I酶切位点间***CBD标签序列，CBD标签5'端连接有柔性linker3，在Acc65 I和EcoRI酶切位点间***KDEL信号肽序列。
6.根据权利要求5所述的利用基因工程浮萍表达虾白斑综合症疫苗的方法，其特征在于，所述浮萍内源泛素启动子序列如SEQ ID NO：7所示；所述5’UTR序列如SEQ ID NO：8所示；所述Bip前导肽序列如SEQ ID NO：9所示；所述CBD纯化标签序列如SEQ ID NO：10所示；所述KDEL驻留信号肽序列如SEQ ID NO：11所示。
7.根据权利要求3所述的利用基因工程浮萍表达虾白斑综合症疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，浮萍叶状体转化的具体过程如下：
浮萍叶状体预处理：挑选生长状态良好的浮萍并用镊子拔除幼叶暴露分生组织，将处理好的叶状体浸泡于预处理液中，所述预处理液配方如下：1/2MS+蔗糖(30g/L)+乙酰丁香酮(100μmol/L)+silwetl-77(0.02％)；
侵染液制备：挑取阳性单克隆农杆菌接种到5mL含有卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，28℃，220rpm，振荡培养24h后将菌液转接到100mL含有卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，当菌液的OD600值在0.8-1.0之间时，4000rpm室温离心15min，收集菌体，用预处理液重悬菌体至OD600值在0.6-0.8之间；
浮萍叶状体侵染：将预处理的浮萍叶状体收集放入一个无菌三角瓶中，倒入侵染液，用封口膜封口，抽真空(-0.08Mpa)10min后取出叶状体，用滤纸吸去多余菌液，接种到共培养培养基上避光培养3天。
8.根据权利要求3所述的利用基因工程浮萍表达虾白斑综合症疫苗的方法，其特征在于，所述步骤(5)中选择培养的选择培养基为：1/2MS培养基、3％蔗糖、0.8％琼脂、300mg/LCefotaxime sodium、30mg/L Hygromycin，且其pH值为5.8；选择培养至少一个月，且选择培养过程中每周更换一次相同的选择培养基。
9.如权利要求3-8任一项所述的方法生产的虾白斑综合症疫苗在虾饲料或虾饲料添加剂中的应用。
10.一种提高虾抗白斑综合症的饲料，其特征在于：所述饲料配方按重量组分由以下成分组成：转基因浮萍粉25份、鱼粉20份、磷酸二氢钙8份、中草药提取物8份、复合酶制剂3份、复合维生素3份、脱壳素3份、复合微量元素3份、氯化胆碱3份、诱食剂3份、EM原露2份、沸石粉2份；
所述转基因浮萍粉为表达TCTP-VP28重组亚单位疫苗的转基因浮萍；
所述中草药提取物是金银花、蒲公英、马齿苋、水芹用酒精回流法提取的产物；
所述复合酶制剂是植酸酶、蛋白酶、淀粉酶和果胶酶的混合物，且复合酶制剂中，植酸酶、蛋白酶、淀粉酶和果胶酶的重量比为1:3:2:1；
所述复合维生素包括维生素A、维生素C、维生素D3、维生素E、维生素K，且维生素A、维生素C、维生素D3、维生素E、维生素K的重量比为1:2:1:2:1；
所述复合微量元素包括锰、铁、锌、铜、硒；
所述诱食剂包括鱿鱼膏、甜菜碱、牛磺酸、DMPT、大蒜素，且所述鱿鱼膏、甜菜碱、牛磺酸、DMPT、大蒜素的重量比为3:2:2:1:2。
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