CN116034114A - 环状rna组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本文描述了环状RNA，以及相关的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明的环状RNA包含剪接后I组内含子片段、间隔区、IRES、任选的双链体形成区和多于一个表达序列。在一些实施方案中，表达序列通过编码裂解位点的一个或多个多核苷酸序列隔开。在一些实施方案中，与线性RNA相比，本发明的环状RNA具有改进的表达、功能稳定性、免疫原性、制造容易性和/或半衰期。在一些实施方案中，与现有RNA环化方法相比，本发明的方法和构建体产生改进的环化效率、剪接效率和/或纯度。

Description

环状RNA组合物和方法
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年3月20日提交的美国临时申请第62/992,518号的权益和优先权，所述临时申请的内容特此出于所有目的以引用的方式整体并入。
背景技术
常规基因疗法涉及使用DNA来将所需遗传信息***宿主细胞中。引入细胞中的DNA通常在一定程度上整合至一个或多个转染细胞的基因组中，从而允许所引入的遗传物质在宿主中的长效作用。虽然这类持续作用可具有实质益处，但是外源性DNA整合至宿主基因组中也可具有许多有害效应。举例来说，可能所引入的DNA将***完整基因中，导致阻碍或甚至完全消除内源性基因的功能的突变。因此，使用DNA的基因疗法可导致损害所治疗宿主的重要遗传功能，如例如，消除或有害减少必需酶的产生或干扰对于细胞生长的调控起关键作用的基因，从而导致未经调控的或癌性的细胞增殖。另外，使用常规基于DNA的基因疗法，为了有效表达所需基因产物，必需包括强启动子序列，这也可导致细胞中的正常基因表达的调控的不良变化。也可能基于DNA的遗传物质将导致诱导不需要的抗DNA抗体，其进而可触发可能致命的免疫应答。使用病毒载体的基因治疗方法也可导致不良免疫应答。在一些情况下，病毒载体甚至可整合至宿主基因组中。另外，临床级病毒载体的产生也昂贵并且费时。所引入的遗传物质使用病毒载体的靶向递送还可能难以控制。因此，虽然已经评估了基于DNA的基因疗法使用病毒载体递送分泌的蛋白(美国专利第6,066,626号；美国公布号US2004/0110709)，但这些方法可能因这些各种原因而受到限制。
与DNA相比，使用RNA作为基因治疗剂大致上更安全，因为RNA不涉及稳定整合至转染细胞的基因组中的风险，由此消除了所引入的遗传物质将干扰必需基因的正常运作或导致引起有害或致癌效应的突变的顾虑，并且外来的启动子序列不为有效翻译所编码蛋白质所需要，再次避免了可能有害的副作用。此外，mRNA不需要进入细胞核来执行其功能，而DNA必须克服这一主要障碍。
环状RNA可用于设计和产生稳定形式的RNA。RNA分子的环化为RNA结构和功能的研究提供了优点，特别是在分子易于以无活性构象折叠的情况下(Wang和Ruffner，1998)。环状RNA对体内应用也可特别令人感兴趣和有用，尤其是在基于RNA的基因表达控制和治疗学的研究领域，包括蛋白质替代疗法和疫苗接种。
在本发明之前，存在用于体外制备环化RNA的三种主要技术：夹板介导法、内含子-外显子置换法(permuted intron-exon method)和RNA连接酶介导法。然而，现有方法受到可环化的RNA的大小限制，从而限制了它们的治疗应用。
发明内容
本文描述了环状RNA，以及相关的组合物和方法。在一些实施方案中，本发明的环状RNA包含剪接后I组内含子片段、间隔区、IRES、任选的双链体形成区和多于一个表达序列。在一些实施方案中，本发明的环状RNA包含双链体形成区。在一些实施方案中，表达序列通过编码裂解位点的一个或多个多核苷酸序列隔开。在一些实施方案中，裂解位点是自裂解肽。在一些实施方案中，自裂解肽是2A自裂解肽。在一些实施方案中，第一和第二表达序列通过核糖体跳跃元件隔开。在一些实施方案中，每个表达序列编码治疗性蛋白质。在一些实施方案中，第一表达序列编码细胞因子或其功能片段。在一些实施方案中，第一表达序列编码转录因子。在一些实施方案中，第一表达编码免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，第一表达序列编码嵌合抗原受体。在一些实施方案中，第一表达序列编码第一T细胞受体(TCR)链，并且第二表达编码第二TCR链。在一些实施方案中，与线性RNA相比，本发明的环状RNA具有改进的表达、功能稳定性、免制造容易性和/或半衰期。在一些实施方案中，本发明的环状RNA具有降低的免疫原性。在一些实施方案中，与现有RNA环化方法相比，本发明的方法和构建体产生改进的环化效率、剪接效率和/或纯度。
在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸包含一个或多个微小RNA结合位点。所述微小RNA结合位点由肝中表达的微小RNA识别。在一些实施方案中，微小RNA结合位点由miR-122识别。
本申请的一个方面提供了一种环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸按以下顺序包含剪接后3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、第一表达序列、第二表达序列和剪接后5'I组内含子片段。
在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸包含编码位于所述第一表达序列与所述第二表达序列之间的裂解位点的多核苷酸序列。在一些实施方案中，裂解位点是自裂解间隔区。在一些实施方案中，自裂解间隔区是2A自裂解肽。
在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸包含位于所述第一表达序列与所述第二表达序列之间的第二IRES。在一些实施方案中，第一IRES由根据SEQ ID NO:1-72中任一个的序列组成或包含所述序列。在一些实施方案中，第二IRES由根据SEQ ID NO:1-72中任一个的序列组成或包含所述序列。
在一些实施方案中，第一表达序列编码第一治疗性蛋白质，并且第二表达序列编码第二治疗性蛋白质。在一些实施方案中，第一表达序列或所述第二表达序列编码抗体。在一些实施方案中，第一表达序列或所述第二表达序列编码嵌合抗原受体。在一些实施方案中，第一表达序列或所述第二表达序列编码转录因子。在一些实施方案中，其中所述第一表达序列或所述第二表达序列编码细胞因子。在一些实施方案中，其中所述第一表达序列或所述第二表达序列编码免疫抑制性分子。在一些实施方案中，第一表达序列或所述第二表达序列编码共刺激分子的激动剂。在一些实施方案中，其中所述第一表达序列或所述第二表达序列编码免疫检查点分子的抑制剂。在一些实施方案中，其中所述第一表达序列编码T细胞受体(TCR)的α链，并且第二表达序列编码T细胞受体(TCR)的β链。
在一些实施方案中，第一表达序列编码T细胞受体(TCR)的β链，并且第二表达序列编码T细胞受体(TCR)的α链。在一些实施方案中，第一表达序列编码T细胞受体(TCR)的γ链，并且第二表达序列编码T细胞受体(TCR)的δ链。在一些实施方案中，第一表达序列编码T细胞受体(TCR)的δ链，并且第二表达序列编码T细胞受体(TCR)的γ链。在一些实施方案中，第一表达序列编码T细胞受体(TCR)，并且第二表达序列编码趋化因子。在一些实施方案中，第一表达序列编码趋化因子，并且第二表达序列编码T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，第一表达序列编码嵌合抗原受体(CAR)，并且第二表达序列编码PD1或PDL1拮抗剂。在一些实施方案中，第一表达序列编码PD1或PDL1拮抗剂，并且第二表达序列编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，第一表达序列编码嵌合抗原受体(CAR)，并且第二表达序列编码趋化因子。在一些实施方案中，第一表达序列编码趋化因子，并且第二表达序列编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，第一表达序列编码转录因子，并且第二表达序列编码细胞因子。
在一些实施方案中，第一表达序列编码T细胞受体(TCR)，并且第二表达序列编码细胞因子。在一些实施方案中，第一表达序列编码细胞因子，并且第二表达序列编码T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，细胞因子选自IL-2、IL-7、IL-12和IL-15。
在一些实施方案中，第一表达序列编码T细胞受体(TCR)，并且第二表达序列编码转录因子。在一些实施方案中，第一表达序列编码转录因子，并且第二表达序列编码T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，转录因子选自FOXP3、STAT5B、HELIOS、Tbet、GATA3、RORgt和cd25。
在一些实施方案中，第一表达序列编码嵌合抗原受体(CAR)，并且第二表达编码细胞因子。在一些实施方案中，第一表达序列编码细胞因子，并且第二表达序列编码嵌合抗原受体(CAR)。在一些实施方案中，细胞因子选自IL-2、IL-7、IL-12和IL-15。
在一些实施方案中，第一表达序列编码细胞因子，并且第二表达序列编码转录因子。在一些实施方案中，转录因子选自FOXP3、STAT5B、HELIOS、Tbet、GATA3、RORgt和cd25。在一些实施方案中，细胞因子选自IL-10、IL-12和TGFβ。
在一些实施方案中，第一表达序列编码转录因子，并且第二表达序列编码趋化因子。在一些实施方案中，第一表达序列编码趋化因子，并且第二表达序列编码转录因子。在一些实施方案中，转录因子选自FOXP3、STAT5B和HELIOS。在一些实施方案中，趋化因子是CC趋化因子、CXC趋化因子、C趋化因子或CX3C趋化因子。在一些实施方案中，趋化因子选自CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXLC6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、XCL1、XCL2和CX3CL1。
在一些实施方案中，第一表达序列编码肿瘤抗原，并且第二表达序列编码细胞因子。在一些实施方案中，第一表达序列编码细胞因子，并且第二表达序列编码肿瘤抗原。在一些实施方案中，抗原是新抗原。在一些实施方案中，细胞因子是IFNγ。
在一些实施方案中，第一表达序列编码CAR，并且第二表达序列编码CAR。
在一些实施方案中，第一表达序列编码细胞因子，并且第二表达序列编码细胞因子。在一些实施方案中，第一或第二表达序列编码选自IL-10、TGFβ和IL-35的细胞因子。在一些实施方案中，第一或第二表达序列编码选自IFNγ、IL-2、IL-7、IL-15和IL-18的细胞因子。
在一些实施方案中，第一表达序列编码T细胞受体(TCR)，并且第二表达序列编码T细胞受体(TCR)。在一些实施方案中，第一表达序列编码趋化因子，并且第二表达序列编码趋化因子。在一些实施方案中，第一或第二表达序列编码免疫抑制酶。在一些实施方案中，第一表达序列编码限速酶，并且第二表达序列编码通量限制酶。在一些实施方案中，第一表达序列编码通量限制酶，并且第二表达序列编码限速酶。
在一些实施方案中，第一表达序列编码转录因子，并且第二表达序列编码存活因子。在一些实施方案中，第一表达序列编码存活因子，并且第二表达序列编码转录因子。在一些实施方案中，转录因子选自FOXP3、STAT5B、HELIOS、Tbet、GATA3、RORgt和cd25。在一些实施方案中，存活因子选自BCL-XL。
在一些实施方案中，第一或第二表达序列编码伴侣蛋白或复合物。在一些实施方案中，第一表达序列编码转录因子，并且第二表达序列编码伴侣蛋白或复合物。在一些实施方案中，第一表达序列编码伴侣蛋白或复合物，并且第二表达序列编码转录因子。在一些实施方案中，伴侣蛋白或复合物选自Skp、Spy、FkpA、SurA、Hsp60、Hsp70、GroEL、GroES、Hsp90、HtpG、Hsp100、ClpA、ClpX、ClpP和Hsp104。在一些实施方案中，转录因子选自FOXP3、STAT5B、HELIOS、Tbet、GATA3、RORgt和cd25。
在一些实施方案中，一个或两个表达序列编码信号传导蛋白。
在一些实施方案中，第一表达序列编码酶，并且第二表达序列编码所述第一表达序列的负调控抑制因子。在一些实施方案中，第一表达序列编码在所述第二表达序列中编码的酶的负调控抑制蛋白。在一些实施方案中，负调控抑制因子选自p57kip2、BAX抑制因子和TIPE2。
在一些实施方案中，第一表达序列编码显性负性蛋白，并且第二表达序列编码免疫蛋白。在一些实施方案中，第一表达序列编码免疫蛋白，并且第二表达序列编码显性负性蛋白。在一些实施方案中，第一或第二表达序列编码抗炎蛋白。
在一些实施方案中，第一表达序列编码转录因子，并且第二表达序列能够将5-氟胞嘧啶(5-FC)转化为5-氟尿嘧啶(5-FU)。在一些实施方案中，第一表达序列能够将5-氟胞嘧啶(5-FC)转化为5-氟尿嘧啶(5-FU)，并且第二表达序列是转录因子。在一些实施方案中，其中能够将5-氟胞嘧啶(5-FC)转化为5-氟尿嘧啶(5-FU)的表达序列是胞嘧啶脱氨酶。
在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸包含位于所述5'双链体形成区与所述剪接后3'I组内含子片段之间的第一间隔区，以及位于所述剪接后5'I组内含子片段与所述3'双链体形成区之间的第二间隔区。在一些实施方案中，第一和第二间隔区各自具有约10至约60个核苷酸的长度。在一些实施方案中，第一和第二双链体形成区各自具有约9至约19个核苷酸的长度。在一些实施方案中，第一和第二双链体形成区各自具有约30个核苷酸的长度。在一些实施方案中，IRES具有来自以下的IRES的序列：桃拉综合征病毒、锥蝽病毒、蒂勒脑脊髓炎病毒(Theiler's encephalomyelitis virus)、猿猴病毒40、红火蚁病毒1、禾谷缢管蚜病毒、网状内皮增生病病毒、人脊髓灰质炎病毒1、斯氏珀蝽(Plautia stali)肠病毒、克什米尔蜜蜂病毒、人鼻病毒2、琉璃叶蝉病毒-1、人免疫缺陷病毒1型、琉璃叶蝉病毒-1、Himetobi P病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、***病毒、人肠道病毒71、马鼻炎病毒、茶尺蠖微小RNA病毒样病毒(Ectropis obliqua picorna-like virus)、脑心肌炎病毒、果萧C病毒、人柯萨奇病毒B3、十字花科植物烟草花叶病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1、黑蜂王台病毒、蚜虫致死性麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒、急性蜜蜂麻痹病毒、木槿褪绿环斑病毒、猪瘟病毒、人FGF2、人SFTPA1、人AML1/RUNX1、果萧触角足、人AQP4、人AT1R、人BAG-1、人BCL2、人BiP、人c-IAPl、人c-myc、人eIF4G、小鼠NDST4L、人LEF1、小鼠HIF1α、人n.myc、小鼠Gtx、人p27kipl、人PDGF2/c-sis、人p53、人Pim-1、小鼠Rbm3、果萧reaper、犬Scamper、果萧Ubx、人UNR、小鼠UtrA、人VEGF-A、人XIAP、果萧无毛、酿酒酵母TFIID、酿酒酵母YAP1、烟草蚀纹病毒、芜菁皱缩病毒、EMCV-A、EMCV-B、EMCV-Bf、EMCV-Cf、EMCV pEC9、小双节RNA病毒(Picoirnavirus)、HCV QC64、人寇沙病毒(Human Cosavirus)E/D、人寇沙病毒F、人寇沙病毒JMY、鼻病毒NAT001、HRV14、HRV89、HRVC-02、HRV-A21、萨力病毒(Salivirus)A SH1、萨力病毒FHB、萨力病毒NG-J1、人副肠孤病毒1、Crohivirus B、Yc-3、Rosavirus M-7、Shanbavirus A、Pasivirus A、Pasivirus A 2、艾柯病毒E14、人副肠孤病毒5、爱知病毒(Aichi Virus)、甲型肝炎病毒HA16、Phopivirus、CVA10、肠道病毒C、肠道病毒D、肠道病毒J、人趋肝性病毒(Pegivirus)2、GBV-C GT110、GBV-C K1737、GBV-C Iowa、趋肝性病毒A 1220、Pasivirus A 3、萨佩洛病毒(Sapelovirus)、Rosavirus B、Bakunsa病毒、震颤病毒(Tremovirus)A、猪Pasivirus1、PLV-CHN、Pasivirus A、Sicinivirus、肝炎病毒K、肝炎病毒A、BVDV1、边界病病毒、BVDV2、CSFV-PK15C、SF573双顺反子病毒、湖北微小RNA病毒样病毒、CRPV、萨力病毒A BN5、萨力病毒A BN2、萨力病毒A 02394、萨力病毒A GUT、萨力病毒A CH、萨力病毒A SZ1、萨力病毒FHB、CVB3、CVB1、艾柯病毒7、CVB5、EVA71、CVA3、CVA12、EV24或eIF4G的适体。
在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸包含天然核苷酸。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸由天然核苷酸组成。在一些实施方案中，表达序列是密码子优化的。
在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸被优化为缺乏存在于等效的预先优化的多核苷酸中的至少一个微小RNA结合位点。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸被优化为缺乏存在于等效的预先优化的多核苷酸中的至少一个核酸内切酶敏感位点。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸被优化为缺乏存在于等效的预先优化的多核苷酸中的至少一个RNA编辑敏感位点。
在一些实施方案中，前述权利要求中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述环状RNA多核苷酸的长度是约100个核苷酸至约15千碱基。
在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸在人类中具有至少约20小时的体内治疗效果持续时间。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸具有至少约20小时的功能性半衰期。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸在人细胞中的治疗效果持续时间大于或等于包含相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的治疗效果持续时间。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸在人细胞中的功能性半衰期大于或等于包含相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的功能性半衰期。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸在人类中的体内治疗效果持续时间大于具有相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的体内治疗效果持续时间。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸在人类中的体内功能性半衰期大于具有相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的体内功能性半衰期。
在另一个方面，本申请提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含如本文所述的环状RNA多核苷酸、纳米颗粒和任选的与所述纳米颗粒可操作地连接的靶向部分。在一些实施方案中，纳米颗粒是脂质纳米颗粒、核-壳纳米颗粒、生物可降解纳米颗粒、生物可降解脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒或生物可降解聚合物纳米颗粒。
在一些实施方案中，药物组合物包含靶向部分，其中在没有细胞分离或纯化的情况下，所述靶向部分介导经受体介导的胞吞作用或直接融合至选定细胞群或组织的选定细胞中。在一些实施方案中，药物组合物包含可操作地连接至所述纳米颗粒的靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分是scFv、纳米抗体、肽、微型抗体、多核苷酸适体、重链可变区、轻链可变区或其片段。
在一些实施方案中，药物组合物在所述组合物中包含少于1重量％的为双链RNA、DNA夹板或三磷酸化RNA的多核苷酸。在一些实施方案中，药物组合物在所述药物组合物中包含少于1重量％的为双链RNA、DNA夹板、三磷酸化RNA、磷酸酶蛋白质、蛋白质连接酶和加帽酶的多核苷酸和蛋白质。
在另一个方面，本申请提供了一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含本文所述的环状RNA多核苷酸、纳米颗粒和任选的与所述纳米颗粒可操作地连接的靶向部分。
在一些实施方案中，组合物包含靶向部分，其中在没有细胞选择或纯化的情况下，所述靶向部分选择性地介导经受体介导的胞吞作用进入选定细胞群的细胞中。在一些实施方案中，靶向部分是scFv、纳米抗体、肽、微型抗体、重链可变区、轻链可变区或其片段。在一些实施方案中，纳米颗粒是脂质纳米颗粒、核-壳纳米颗粒或生物可降解纳米颗粒。
在一些实施方案中，纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、可电离脂质或聚β-氨基酯。在一些实施方案中，纳米颗粒包含一种或多种非阳离子脂质。在一些实施方案中，纳米颗粒包含一种或多种PEG修饰的脂质、聚谷氨酸脂质或透明质酸脂质。在一些实施方案中，纳米颗粒包含胆固醇。在一些实施方案中，纳米颗粒包含花生四烯酸或油酸。在一些实施方案中，纳米颗粒包含多于一种环状RNA多核苷酸。
在一些实施方案中，受试者患有选自由以下组成的组的癌症：急性淋巴细胞白血病；急性骨髓性白血病(AML)；肺泡横纹肌肉瘤；B细胞恶性肿瘤；膀胱癌(例如，膀胱癌)；骨癌；脑癌(例如，成神经管细胞瘤)；乳腺癌；***癌、肛管癌或***直肠癌；眼癌；肝内胆管癌；关节癌；颈癌；胆囊癌；胸膜癌；鼻癌、鼻腔癌或中耳癌；口腔癌；外阴癌；慢性淋巴细胞性白血病；慢性骨髓性癌症；结肠癌；食道癌；***；纤维肉瘤；胃肠类癌肿瘤；头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)；霍奇金淋巴瘤；下咽癌；肾癌；喉癌；白血病；液体肿瘤；肝癌；肺癌(例如，非小细胞肺癌和肺腺癌)；淋巴瘤；间皮瘤；肥大细胞瘤；黑素瘤；多发性骨髓瘤；鼻咽癌；非霍奇金淋巴瘤；B-慢性淋巴细胞性白血病；毛细胞白血病；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；伯基特淋巴瘤；卵巢癌；胰腺癌；腹膜癌；网膜癌；肠系膜癌；咽癌；***癌；直肠癌；肾癌；皮肤癌；小肠癌；软组织癌；实体瘤；滑膜肉瘤；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；和输尿管癌。在一些实施方案中，受试者患有选自以下的自身免疫性病症：硬皮病、格雷夫斯病、克罗恩氏病、薛格连氏综合征(Sjorgen's disease)、多发性硬化症、桥本氏病(Hashimoto's disease)、银屑病、重症肌无力、自身免疫性多内分泌病综合征、I型糖尿病(TIDM)、自身免疫性胃炎、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、多发性肌炎、结肠炎、甲状腺炎和以人类狼疮为代表的广泛性自身免疫性疾病。
在另一个方面，本申请提供了一种用于制备环状RNA多核苷酸的载体，所述载体按以下顺序包含5'双链体形成区、3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、第一表达序列、第二表达序列、5'I组内含子片段和3'双链体形成区。
在一些实施方案中，载体包含编码位于所述第一表达序列与所述第二表达序列之间的裂解位点的多核苷酸序列。在一些实施方案中，裂解位点是自裂解间隔区。在一些实施方案中，自裂解间隔区是2A自裂解肽。
在一些实施方案中，载体包含位于所述5'双链体形成区与所述3'I组内含子片段之间的第一间隔区，以及位于所述5'I组内含子片段与所述3'双链体形成区之间的第二间隔区。在一些实施方案中，第一和第二间隔区各自具有约5至约60个核苷酸的长度。在一些实施方案中，第一和第二间隔区各自包含至少5个核苷酸长的非结构化区域。在一些实施方案中，第一和第二间隔区各自包含至少7个核苷酸长的结构化区域。在一些实施方案中，第一和第二双链体形成区各自具有约9至50个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，载体是密码子优化的。在一些实施方案中，载体缺少存在于等效的预先优化多核苷酸中的至少一个微小RNA结合位点。
在另一个方面，本申请提供了一种包含如本文所述的环状RNA多核苷酸的真核细胞。在一些实施方案中，真核细胞是人细胞。在一些实施方案中，真核细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，真核细胞是T细胞。
在一个方面，本文提供了一种环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸按以下顺序包含剪接后3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、第一表达序列、编码裂解位点的多核苷酸序列、第二表达序列和剪接后5'I组内含子片段。在一个方面，本文提供了一种环状RNA多核苷酸，所述环状RNA多核苷酸按以下顺序包含剪接后3'I组内含子片段、第一内部核糖体进入位点(IRES)、第一表达序列、第二IRES、第二表达序列和剪接后5'I组内含子片段。在一些实施方案中，第一表达序列和所述第二表达序列编码不同的治疗性蛋白质。在一些实施方案中，第一表达序列和所述第二表达序列编码同一治疗性蛋白质。
在一个方面，本文提供了一种由载体的转录产生的环状RNA多核苷酸，所述载体按以下顺序包含任选的5'双链体形成区、剪接后3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、表达序列、编码裂解位点的多核苷酸序列、第二表达序列、5'I组内含子片段和任选的3'双链体形成区。在一个方面，本文提供了一种由载体的转录产生的环状RNA多核苷酸，所述载体按以下顺序包含任选的5'双链体形成区、3'I组内含子片段、第一内部核糖体进入位点(IRES)、表达序列、第二IRES、第二表达序列、5'I组内含子片段和任选的3'双链体形成区。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸或载体包含3'和5'双链体形成区。
在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸包含位于所述5'双链体形成区与所述剪接后3'I组内含子片段之间的第一间隔区，以及位于所述剪接后5'I组内含子片段与所述3'双链体形成区之间的第二间隔区。在一些实施方案中，第一和第二间隔区各自具有约10至约60个核苷酸的长度。在某些实施方案中，第一和第二双链体形成区各自具有约9至约19个核苷酸的长度。在某些其它实施方案中，第一和第二双链体形成区各自具有约30个核苷酸的长度。
在某些实施方案中，IRES选自表17，具有IRES的序列，或者是其功能片段或变体。在一些实施方案中，IRES具有来自以下的IRES的序列：桃拉综合征病毒、锥蝽病毒、蒂勒脑脊髓炎病毒、猿猴病毒40、红火蚁病毒1、禾谷缢管蚜病毒、网状内皮增生病病毒、人脊髓灰质炎病毒1、斯氏珀蝽肠病毒、克什米尔蜜蜂病毒、人鼻病毒2、琉璃叶蝉病毒-1、人免疫缺陷病毒1型、琉璃叶蝉病毒-1、Himetobi P病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、***病毒、人肠道病毒71、马鼻炎病毒、茶尺蠖微小RNA病毒样病毒、脑心肌炎病毒、果萧C病毒、人柯萨奇病毒B3、十字花科植物烟草花叶病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1、黑蜂王台病毒、蚜虫致死性麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒、急性蜜蜂麻痹病毒、木槿褪绿环斑病毒、猪瘟病毒、人FGF2、人SFTPA1、人AML1/RUNX1、果萧触角足、人AQP4、人AT1R、人BAG-1、人BCL2、人BiP、人c-IAPl、人c-myc、人eIF4G、小鼠NDST4L、人LEF1、小鼠HIF1α、人n.myc、小鼠Gtx、人p27kipl、人PDGF2/c-sis、人p53、人Pim-1、小鼠Rbm3、果萧reaper、犬Scamper、果萧Ubx、人UNR、小鼠UtrA、人VEGF-A、人XIAP、果萧无毛、酿酒酵母TFIID、酿酒酵母YAP1、烟草蚀纹病毒、芜菁皱缩病毒、EMCV-A、EMCV-B、EMCV-Bf、EMCV-Cf、EMCV pEC9、小双节RNA病毒、HCV QC64、人寇沙病毒E/D、人寇沙病毒F、人寇沙病毒JMY、鼻病毒NAT001、HRV14、HRV89、HRVC-02、HRV-A21、萨力病毒A SH1、萨力病毒FHB、萨力病毒NG-J1、人副肠孤病毒1、Crohivirus B、Yc-3、Rosavirus M-7、Shanbavirus A、Pasivirus A、Pasivirus A 2、艾柯病毒E14、人副肠孤病毒5、爱知病毒、甲型肝炎病毒HA16、Phopivirus、CVA10、肠道病毒C、肠道病毒D、肠道病毒J、人趋肝性病毒2、GBV-C GT110、GBV-C K1737、GBV-C Iowa、趋肝性病毒A 1220、Pasivirus A 3、萨佩洛病毒、Rosavirus B、Bakunsa病毒、震颤病毒A、猪Pasivirus1、PLV-CHN、Pasivirus A、Sicinivirus、肝炎病毒K、肝炎病毒A、BVDV1、边界病病毒、BVDV2、CSFV-PK15C、SF573双顺反子病毒、湖北微小RNA病毒样病毒、CRPV、萨力病毒ABN5、萨力病毒A BN2、萨力病毒A 02394、萨力病毒A GUT、萨力病毒A CH、萨力病毒A SZ1、萨力病毒FHB、CVB3、CVB1、艾柯病毒7、CVB5、EVA71、CVA3、CVA12、EV24或eIF4G的适体。
在一些实施方案中，第一和第二多聚A序列各自具有15-50nt的长度。在一些实施方案中，第一和第二多聚A序列各自具有约20-25nt的长度。
在某些实施方案中，环状RNA多核苷酸由天然存在的核苷酸组成。在一些实施方案中，环状RNA含有至少80％、至少90％、至少95％或至少99％的天然存在的核苷酸。在某些实施方案中，表达序列是密码子优化的。在某些实施方案中，环状RNA多核苷酸被优化为缺乏存在于等效的预先优化的多核苷酸中的至少一个微小RNA结合位点。在某些实施方案中，环状RNA多核苷酸被优化为缺乏存在于等效的预先优化的多核苷酸中的至少一个核酸内切酶敏感位点。在某些实施方案中，环状RNA多核苷酸被优化为缺乏存在于等效的预先优化的多核苷酸中的至少一个RNA编辑敏感位点。
在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸的长度是约100个核苷酸至约15千碱基。在某些实施方案中，本公开的环状RNA多核苷酸在人类中具有至少约20小时的体内治疗效果持续时间。在某些实施方案中，环状RNA多核苷酸具有至少约20小时的功能性半衰期。在某些实施方案中，环状RNA多核苷酸在人细胞中的治疗效果持续时间大于或等于包含相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的治疗效果持续时间。在某些实施方案中，环状RNA多核苷酸在人细胞中的功能性半衰期大于或等于包含相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的功能性半衰期。在某些实施方案中，环状RNA多核苷酸在人类中的体内功能性半衰期大于具有相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的体内功能性半衰期。在一些实施方案中，参考线性RNA多核苷酸是包含cap1结构和长度为至少80nt的多聚A尾的线性的、未修饰的或核苷修饰的、完全加工的mRNA。
在一些实施方案中，药物组合物在人细胞中的功能性半衰期大于或等于预定阈值的功能性半衰期。在一些实施方案中，药物组合物在人类中的体内功能性半衰期大于预定阈值的功能性半衰期。在一些实施方案中，功能性蛋白质测定是体外萦光素酶测定。在一些实施方案中，功能性蛋白质测定包括测量患者血清或组织样品中由所述环状RNA多核苷酸的表达序列编码的蛋白质的水平。在一些实施方案中，其中所述预定阈值是与所述环状RNA多核苷酸包含相同表达序列的参考线性RNA多核苷酸的功能性半衰期。在一些实施方案中，药物组合物具有至少约20小时的功能性半衰期。
在一个方面，本文提供了一种药物组合物，所述药物组合物包含环状RNA多核苷酸、纳米颗粒和任选的与所述纳米颗粒可操作地连接的靶向部分。在一些实施方案中，纳米颗粒是脂质纳米颗粒、核-壳纳米颗粒、生物可降解纳米颗粒、生物可降解脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒或生物可降解聚合物纳米颗粒。在某些实施方案中，纳米颗粒包含选自下组的一种或多种阳离子脂质：C12-200、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK-E12、ICE(基于咪唑的)、HGT5000、HGT5001、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA和DMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、HGT4003或它们的组合。
在某些实施方案中，药物组合物包含靶向部分，其中在没有细胞分离或纯化的情况下，所述靶向部分介导经受体介导的胞吞作用或直接融合至选定细胞群或组织的选定细胞中。在一些实施方案中，靶向部分是scFv、纳米抗体、肽、微型抗体、多核苷酸适体、重链可变区、轻链可变区或其片段。在某些实施方案中，环状RNA多核苷酸处于有效治疗有需要的人受试者中的自身免疫性病症或癌症的量。在某些实施方案中，与包含含有编码相同表达序列的外源性DNA的载体的药物组合物相比，所述药物组合物具有增强的安全性特征。
在某些实施方案中，组合物中少于1重量％的多核苷酸是双链RNA、DNA夹板或三磷酸化RNA。在某些实施方案中，药物组合物中少于1重量％的多核苷酸和蛋白质是双链RNA、DNA夹板、三磷酸化RNA、磷酸酶蛋白质、蛋白质连接酶和加帽酶。
在一个方面，本文提供了一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含环状RNA多核苷酸、纳米颗粒和任选的与所述纳米颗粒可操作地连接的靶向部分。在一些实施方案中，受试者患有自身免疫性病症或癌症。
在一些实施方案中，靶向部分是scFv、纳米抗体、肽、微型抗体、重链可变区、轻链可变区或其片段。在一些实施方案中，组合物包含靶向部分，其中在没有细胞分离或纯化的情况下，所述靶向部分介导经受体介导的胞吞作用进入选定细胞群的选定细胞中。
在一些实施方案中，纳米颗粒是脂质纳米颗粒、核-壳纳米颗粒或生物可降解纳米颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、可电离脂质或聚β-氨基酯。在一些实施方案中，纳米颗粒包含一种或多种非阳离子脂质。在一些实施方案中，纳米颗粒包含一种或多种PEG修饰的脂质、聚谷氨酸脂质、结构脂质或透明质酸脂质。在某些实施方案中，纳米颗粒包含胆固醇。在一些实施方案中，结构脂质是β-谷甾醇。在一些实施方案中，结构脂质不是β-谷甾醇。在一些实施方案中，纳米颗粒包含花生四烯酸或油酸。在一些实施方案中，纳米颗粒包含多于一种环状RNA多核苷酸。
在一些实施方案中，结构脂质结合至C1q和/或与缺乏所述结构脂质的对照转移媒介物相比促进包含所述脂质的所述转移媒介物与C1q的结合，和/或与缺乏所述结构脂质的对照转移媒介物相比增加结合C1q的转移媒介物摄取到免疫细胞中。
在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是DSPE-PEG、DMG-PEG或PEG-1。在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是DSPE-PEG(2000)。
在一些实施方案中，药物组合物还包含辅助脂质。在一些实施方案中，辅助脂质是DSPC或DOPE。
在一些实施方案中，药物组合物包含DOPE、胆固醇和DSPE-PEG。
在一些实施方案中，转移媒介物包含按摩尔比计约0.5％至约4％的PEG修饰的脂质。在一些实施方案中，转移媒介物包含按摩尔比计约1％至约2％的PEG修饰的脂质。
在一些实施方案中，可电离脂质:DSPC:胆固醇:DSPE-PEG(2000)的摩尔比是62:4:33:1。
在一些实施方案中，转移媒介物包含可电离脂质、DOPE、胆固醇和DSPE-PEG(2000)。
在一些实施方案中，可电离脂质:DSPC:胆固醇:DSPE-PEG(2000)的摩尔比是50:10:38.5:1.5。
在一些实施方案中，转移媒介物具有约3至约6的氮:磷酸酯(N:P)比率。
在一些实施方案中，转移媒介物被配制用于所述环状RNA多核苷酸的内体释放。
在一些实施方案中，转移媒介物能够结合至APOE。在一些实施方案中，转移媒介物与载脂蛋白E(APOE)的相互作用少于负载有与所述环状RNA多核苷酸具有相同表达序列的参考线性RNA的等效转移媒介物。在一些实施方案中，转移媒介物的外表面基本上不含APOE结合位点。
在一些实施方案中，转移媒介物具有小于约120nm的直径。在一些实施方案中，转移媒介物不形成直径超过300nm的聚集体。
在一些实施方案中，转移媒介物具有小于约120nm的直径。在一些实施方案中，转移媒介物不形成直径超过300nm的聚集体。
在一些实施方案中，转移媒介物具有小于约30小时的体内半衰期。
在一些实施方案中，转移媒介物能够依赖于低密度脂蛋白受体(LDLR)摄取到细胞中。在一些实施方案中，转移媒介物能够独立于LDLR摄取到细胞中。
在一些实施方案中，药物组合物基本上不含线性RNA。
在一些实施方案中，药物组合物还包含可操作地连接至所述转移媒介物的靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分特异性地或间接地结合免疫细胞抗原。在一些实施方案中，免疫细胞抗原是T细胞抗原。在一些实施方案中，T细胞抗原选自由以下组成的组：CD2、CD3、CD5、CD7、CD8、CD4、β7整联蛋白、β2整联蛋白和C1q。
在一些实施方案中，药物组合物还包含衔接分子，所述衔接分子包含转移媒介物结合部分和细胞结合部分，其中所述靶向部分特异性地结合所述转移媒介物结合部分，并且细胞结合部分特异性地结合靶细胞抗原。在一些实施方案中，靶细胞抗原是免疫细胞抗原。在一些实施方案中，免疫细胞抗原是T细胞抗原、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。在一些实施方案中，T细胞抗原选自由以下组成的组：CD2、CD3、CD5、CD7、CD8、CD4、β7整联蛋白、β2整联蛋白、CD25、CD39、CD73、A2a受体、A2b受体和C1q。在一些实施方案中，免疫细胞抗原是巨噬细胞抗原。在一些实施方案中，巨噬细胞抗原选自由以下组成的组：甘露糖受体、CD206和C1q。
在一些实施方案中，靶向部分是小分子。在一些实施方案中，小分子结合至免疫细胞上的胞外酶，其中所述胞外酶选自由以下组成的组：CD38、CD73、腺苷2a受体和腺苷2b受体。在一些实施方案中，小分子是甘露糖、凝集素、阿西维辛、生物素或地高辛。
在一些实施方案中，靶向部分是单链Fv(scFv)片段、纳米抗体、肽、基于肽的大环、微型抗体、小分子配体如叶酸、精氨酰甘氨酰天冬氨酸(RGD)、或酚溶性调控蛋白α1肽(PSMA1)、重链可变区、轻链可变区或其片段。
在一些实施方案中，可电离脂质在细胞膜中具有小于约2周的半衰期。在一些实施方案中，可电离脂质在细胞膜中具有小于约1周的半衰期。在一些实施方案中，可电离脂质在细胞膜中具有小于约30小时的半衰期。在一些实施方案中，可电离脂质在细胞膜中的半衰期小于所述环状RNA多核苷酸的功能性半衰期。
在另一个方面，本申请提供了一种治疗或预防疾病、病症或疾患的方法，所述方法包括施用有效量的本文公开的药物组合物。在一些实施方案中，疾病、病症或疾患与选自表27或28的多肽的异常表达、活动或定位相关。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸编码治疗性蛋白质。在一些实施方案中，脾中的治疗性蛋白质表达高于肝中的治疗性蛋白质表达。在一些实施方案中，脾中的治疗性蛋白质表达是肝中的治疗性蛋白质表达的至少约2.9倍。在一些实施方案中，治疗性蛋白质不在肝中以功能水平表达。在一些实施方案中，治疗性蛋白质不在肝中以可检出水平表达。在一些实施方案中，脾中的治疗性蛋白质表达是总治疗性蛋白质表达的至少约63％。
在一些实施方案中，线性RNA多核苷酸包含3'鱼腥藻属I组内含子片段和5'鱼腥藻属I组内含子片段。在一些实施方案中，参考RNA多核苷酸包含参考3'鱼腥藻属I组内含子片段和参考5'鱼腥藻属I组内含子片段。在一些实施方案中，参考3'鱼腥藻属I组内含子片段和所述参考5'鱼腥藻属I组内含子片段是使用L6-5置换位点产生的。在一些实施方案中，3'鱼腥藻属I组内含子片段和所述5'鱼腥藻属I组内含子片段不是使用所述L6-5置换位点产生的。在一些实施方案中，3'鱼腥藻属I组内含子片段包含选自SEQ ID NO:112-123和125-150的序列或由所述序列组成。在一些实施方案中，5'鱼腥藻属I组内含子片段包含选自SEQID NO:73-84和86-111的相应序列。在一些实施方案中，5'鱼腥藻属I组内含子片段包含选自SEQ ID NO:73-84和86-111的序列或由所述序列组成。在一些实施方案中，3'鱼腥藻属I组内含子片段包含选自SEQ ID NO:112-124和125-150的相应序列或由所述序列组成。
在一些实施方案中，IRES包含选自SEQ ID NO:348-351的核苷酸序列。在一些实施方案中，参考IRES是CVB3。在一些实施方案中，IRES不是CVB3。在一些实施方案中，IRES包含选自SEQ ID NO:1-64和66-72的序列。
在另一个方面，本申请公开了一种由本文公开的线性RNA产生的环状RNA多核苷酸。
在另一个方面，本申请公开了一种环状RNA，所述环状RNA从5'至3'包含3'I组内含子片段、IRES、表达序列和5'I组内含子片段，其中所述IRES包含选自SEQ ID NO:348-351的核苷酸序列。
在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸还包含在所述3'I组内含子片段与所述IRES之间的间隔区。
在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸还包含能够形成双链体的第一和第二双链体形成区。在一些实施方案中，第一和第二双链体形成区各自具有约9至19个核苷酸的长度。在一些实施方案中，第一和第二双链体形成区各自具有约30个核苷酸的长度。
在一个方面，本文提供了一种用于制备环状RNA多核苷酸的载体，所述载体按以下顺序包含任选的5'双链体形成区、3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、第一表达序列、编码裂解位点的多核苷酸序列、第二表达序列、5'I组内含子片段和任选的3'双链体形成区。在一个方面，本文提供了一种用于制备环状RNA多核苷酸的载体，所述载体按以下顺序包含任选的5'双链体形成区、3'I组内含子片段、第一内部核糖体进入位点(IRES)、第一表达序列、第二IRES、第二表达序列、5'I组内含子片段和任选的3'双链体形成区。在一些实施方案中，多核苷酸含有3'双链体形成区和5'双链体形成区。在某些实施方案中，载体包含位于所述5'双链体形成区与所述3'I组内含子片段之间的第一间隔区，以及位于所述5'I组内含子片段与所述3'双链体形成区之间的第二间隔区。在某些实施方案中，第一和第二间隔区各自具有约5至约60个核苷酸的长度。在某些实施方案中，第一和第二间隔区各自具有约8至约60个核苷酸的长度。在某些实施方案中，第一和第二间隔区各自包含至少5个核苷酸长的非结构化区域。在某些实施方案中，第一和第二间隔区各自包含至少7个核苷酸长的结构化区域。在某些实施方案中，第一和第二双链体形成区各自具有约9至50个核苷酸的长度。在某些实施方案中，载体是密码子优化的。在某些实施方案中，载体缺少存在于等效的预先优化多核苷酸中的至少一个微小RNA结合位点。
在一个方面，本文提供了一种原核细胞，所述原核细胞包含用于制备环状RNA多核苷酸的载体，所述环状RNA多核苷酸按以下顺序包含任选的5'双链体形成区、3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、第一表达序列、编码裂解位点的多核苷酸序列、第二表达序列、5'I组内含子片段和任选的3'双链体形成区。在一些实施方案中，多核苷酸含有3'双链体形成区和5'双链体形成区。在一个方面，本文提供了一种原核细胞，所述原核细胞包含用于制备环状RNA多核苷酸的载体，所述载体按以下顺序包含任选的5'双链体形成区、3'I组内含子片段、第一内部核糖体进入位点(IRES)、第一表达序列、第二IRES、第二表达序列、5'I组内含子片段和任选的3'双链体形成区。在一些实施方案中，多核苷酸含有3'双链体形成区和5'双链体形成区。
在一个方面，本文提供了一种包含本公开的环状RNA多核苷酸的真核细胞。在一些实施方案中，真核细胞是人细胞。在一些实施方案中，真核细胞是免疫细胞。在一些实施方案中，真核细胞是T细胞、NK细胞、NKT细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。
附图说明
图1描绘用包含高斯萦光素酶表达序列和各种IRES序列的环状RNA转染后24小时HEK293细胞(图1A、1D和1E)、HepG2细胞(图1B)或1C1C7(图1C)细胞的上清液中的发光。
图2描绘用包含高斯萦光素酶表达序列和具有不同长度的各种IRES序列的环状RNA转染后24小时HEK293细胞(图2A)、HepG2细胞(图2B)或1C1C7(图2C)细胞的上清液中的发光。
图3描绘如通过发光测量的3天内HepG2(图3A)或1C1C7(图3B)细胞中选定IRES构建体的稳定性。
图4A和4B描绘如通过来自细胞的上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光所测量的来自Jurkat细胞中的选定IRES构建体的蛋白质表达。
图5A和5B描绘如通过发光测量的3天内Jurkat细胞中的选定IRES构建体的稳定性。
图6描绘编码高斯萦光素酶的经修饰的线性、未纯化的环状或纯化的环状RNA的24小时发光(图6A)或3天内的相对发光(图6B)的比较。
图7描绘用经修饰的线性、未纯化的环状或纯化的环状RNA对Jurkat细胞进行电穿孔后IFNγ(图7A)、IL-6(图7B)、IL-2(图7C)、RIG-I(图7D)、IFN-β1(图7E)和TNFα(图7F)的转录物诱导。
图8描绘人原代单核细胞(图8A)和巨噬细胞(图8B和图8C)中编码高斯萦光素酶的环状RNA和经修饰的线性RNA的发光比较。
图9描绘用包含高斯萦光素酶表达序列和不同IRES序列的环状RNA转导后原代T细胞的上清液中3天内的相对发光(图9A)或24小时发光(图9B)。
图10描绘用包含高斯萦光素酶表达序列的环状RNA或经修饰的线性RNA转导后原代T细胞的上清液中的24小时发光(图10A)、或3天内的相对发光(图10B)以及PBMC中的24小时发光(图10C)。
图11描绘具有不同置换位点的RNA构建体的HPLC色谱图(图11A)和环化效率(图11B)。
图12描绘具有不同内含子和/或置换位点的RNA构建体的HPLC色谱图(图12A)和环化效率(图12B)。
图13描绘具有或不具有同源臂的3种RNA构建体的HPLC色谱图(图13A)和环化效率(图13B)。
图14描绘没有同源臂或具有不同长度和GC含量的同源臂的3种RNA构建体的环化效率。
图15A和15B描绘HPLC色谱图，其显示强同源臂对提高剪接效率的贡献、选定构建体中环化效率与切口之间的关系、以及假设展示提高的环化效率的置换位点和同源臂的组合。
图16示出模拟电穿孔(左)或用编码CAR的环状RNA(右)电穿孔并与表达GFP和萤火虫萦光素酶的Raji细胞共培养的T细胞的萦光图像。
图17示出模拟电穿孔(顶部)或用编码CAR的环状RNA电穿孔(底部)并与表达GFP和萤火虫萦光素酶的Raji细胞共培养的T细胞的明场(左)、萦光(中)和叠加(右)图像。
图18描绘模拟电穿孔或用编码不同CAR序列的环状RNA电穿孔的T细胞对Raji靶细胞的特异性裂解。
图19描绘用包含高斯萦光素酶表达序列和不同IRES序列的线性或环状RNA转导后24小时Jurkat细胞(左)或静息原代人CD3+T细胞(右)的上清液中的发光(图19A)，以及在3天内的相对发光(图19B)。
图20描绘用经修饰的线性、未纯化的环状或纯化的环状RNA对人CD3+T细胞进行电穿孔后的IFN-β1(图20A)、RIG-I(图20B)、IL-2(图20C)、IL-6(图20D)、IFNγ(图20E)和TNFα(图20F)的转录物诱导。
图21描绘如通过萤火虫发光检测确定的用编码CAR的circRNA电穿孔的人原代CD3+T细胞对Raji靶细胞的特异性裂解(图21A)，和用不同量的编码CAR序列的环状或线性RNA电穿孔后24小时的IFNγ转录物诱导(图21B)。
图22描绘如通过检测萤火虫发光确定的用编码CAR的环状或线性RNA以不同的E:T比率电穿孔的人原代CD3+T细胞对靶细胞或非靶细胞的特异性裂解(图22A和图22B)。
图23描绘在电穿孔后第1、3、5和7天，用编码CAR的RNA电穿孔的人CD3+T细胞对靶细胞的特异性裂解。
图24描绘用编码CD19或BCMA靶向CAR的环状RNA电穿孔的人CD3+T细胞对靶细胞的特异性裂解。
图25描绘从CD-1小鼠收获的器官的总通量，所述小鼠给予了编码FLuc并用50％脂质15(表10b)、10％ DSPC、1.5％ PEG-DMG和38.5％胆固醇配制的环状RNA。
图26示出突出显示从CD-1小鼠收获的器官的发光的图像，所述小鼠给予了编码FLuc并用50％脂质15(表10b)、10％ DSPC、1.5％PEG-DMG和38.5％胆固醇配制的环状RNA。
图27描绘来自表10a的脂质26和27的分子表征。图27A示出脂质26的质子核磁共振(NMR)谱。图27B示出通过液相色谱-质谱(LC-MS)测量的脂质26的保留时间。图27C示出脂质26的质谱。图27D示出脂质27的质子NMR谱。图27E示出通过LC-MS测量的脂质27的保留时间。图27F示出脂质27的质谱。
图28描绘脂质22-S14及其合成中间体的分子表征。图28A描绘2-(十四烷基硫代)乙-1-醇的NMR谱。图28B描绘丙烯酸2-(十四烷基硫代)乙酯的NMR谱。图28C描绘双(2-(十四烷基硫代)乙基)3,3'-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)二丙酸酯(脂质22-S14)的NMR谱。
图29描绘双(2-(十四烷基硫代)乙基)3,3'-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)二丙酸酯(脂质93-S14)的NMR谱。
图30描绘8-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(来自表10a的脂质54)的分子表征。图30A示出脂质54的质子NMR谱。图30B示出通过LC-MS测量的脂质54的保留时间。图30C示出脂质54的质谱。
图31描绘8-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(来自表10a的脂质53)的分子表征。图31A示出脂质53的质子NMR谱。图31B示出通过LC-MS测量的脂质53的保留时间。图31C示出脂质53的质谱。
图32A描绘从CD-1小鼠收获的脾和肝的总通量，所述小鼠给予了编码萤火虫萤光素酶(FLuc)并用16:1:4:1重量比或62:4:33:1摩尔比的目标可电离脂质、DSPC、胆固醇和DSPE-PEG 2000(Avanti Polar Lipids Inc.)配制的环状RNA。图32B描绘蛋白质表达的生物分布的平均辐射度。
图33A描绘突出显示从CD-1小鼠收获的器官的发光的图像，所述小鼠给予了编码FLuc并用16:1:4:1重量比或62:4:33:1摩尔比的可电离脂质22-S14、DSPC、胆固醇和DSPE-PEG 2000(Avanti Polar Lipids Inc.)配制的环状RNA。图33B描绘CD-1小鼠的全身IVIS图像，所述小鼠给予了编码FLuc并用16:1:4:1重量比或62:4:33:1摩尔比的可电离脂质22-S14、DSPC、胆固醇和DSPE-PEG 2000(Avanti Polar Lipids Inc.)配制的环状RNA。
图34A描绘突出显示从CD-1小鼠收获的器官的发光的图像，所述小鼠给予了编码FLuc并用16:1:4:1重量比或62:4:33:1摩尔比的可电离脂质93-S14、DSPC、胆固醇和DSPE-PEG 2000(Avanti Polar Lipids Inc.)配制的环状RNA。图34B描绘CD-1小鼠的全身IVIS图像，所述小鼠给予了编码FLuc并用16:1:4:1重量比或62:4:33:1摩尔比的可电离脂质93-S14、DSPC、胆固醇和DSPE-PEG 2000(Avanti Polar Lipids Inc.)配制的环状RNA。
图35A描绘突出显示从CD-1小鼠收获的器官的发光的图像，所述小鼠给予了编码FLuc并用16:1:4:1重量比或62:4:33:1摩尔比的来自表10a的可电离脂质26、DSPC、胆固醇和DSPE-PEG 2000(Avanti Polar Lipids Inc.)配制的环状RNA。图35B描绘CD-1小鼠的全身IVIS图像，所述小鼠给予了编码FLuc并用16:1:4:1重量比或62:4:33:1摩尔比的可电离脂质26、DSPC、胆固醇和DSPE-PEG 2000(Avanti Polar Lipids Inc.)配制的环状RNA。
图36描绘突出显示从c57BL/6J小鼠收获的器官的发光的图像，所述小鼠给予了编码FLuc并包封在由来自表10b的脂质15(图36A)、来自表10a的脂质53(图36B)或来自表10a的脂质54(图36C)形成的脂质纳米颗粒中的环状RNA。PBS用作对照(图36D)。
图37A和37B描绘在与含有编码萤火虫萦光素酶的环状RNA的测试脂质纳米颗粒一起孵育24小时后，人PBMC的裂解物中的相对发光。
图38示出在与含有编码GFP或CD19 CAR的环状RNA的测试脂质纳米颗粒一起孵育后，人PBMC中GFP(图38A)和CD19 CAR(图38B)的表达。
图39描绘用包含抗鼠CD19 CAR表达序列和不同IRES序列的环状RNA脂转染的1C1C7细胞中抗鼠CD19 CAR的表达。
图40示出抗鼠CD19 CAR对鼠T细胞的细胞毒性。CD19 CAR由环状RNA编码并且从环状RNA表达，所述环状RNA被电穿孔到鼠T细胞中。
图41描绘每隔一天注射测试脂质纳米颗粒的C57BL/6J小鼠的外周血(图40A和40B)或脾(图40C)中的B细胞计数，所述脂质纳米颗粒包封编码抗鼠CD19 CAR的环状RNA。
图42A和42B比较从环状RNA表达的抗人CD19 CAR的表达水平与从线性mRNA表达的抗人CD19 CAR的表达水平。
图43A和43B比较从环状RNA表达的抗人CD19 CAR的细胞毒性作用与从线性mRNA表达的抗人CD19 CAR的细胞毒性作用。
图44描绘从T细胞中的单个环状RNA表达的两种CAR(抗人CD19 CAR和抗人BCMACAR)的细胞毒性。
图45A示出在用由来自表10a的脂质27或26或来自表10b的脂质15形成的LNP处理后，各种脾免疫细胞亚群中tdTomato表达频率的代表性FACS图。图45B示出表达tdTomato的骨髓细胞、B细胞和T细胞的比例的定量(平均值+标准偏差，n＝3)，相当于用Cre环状RNA成功转染的每个细胞群的比例。图45C示出在用脂质27和26处理后表达tdTomato的额外脾免疫细胞群(包括NK细胞、经典单核细胞、非经典单核细胞、嗜中性粒细胞和树突细胞)的比例(平均值+标准差，n＝3)。
图46A描绘在内含子中具有内置多聚A序列的示例性RNA构建体设计。图46B示出未纯化的环状RNA的色谱迹线。图46C示出亲和纯化的环状RNA的色谱迹线。图46D示出用不同IVT条件和纯化方法制备的环状RNA的免疫原性。(商业＝商业IVT混合物；定制＝定制IVT混合物；Aff＝亲和纯化；Enz＝酶纯化；GMP:GTP比率＝8、12.5或13.75)。
图47A描绘具有专用结合序列作为用于杂交纯化的多聚A的替代物的示例性RNA构建体设计。图47B示出未纯化的环状RNA的色谱迹线。图46C示出亲和纯化的环状RNA的色谱迹线。
图48A示出编码肌营养不良蛋白的未纯化的环状RNA的色谱迹线。图48B示出酶纯化的编码肌营养不良蛋白的环状RNA的色谱迹线。
图49比较Jurkat细胞中在3'内含子片段/5'内部双链体区与IRES之间具有不同5'间隔区的纯化circRNA的表达(图49A)和稳定性(图49B)。(AC＝在间隔区序列中仅使用A和C；UC＝在间隔区序列中仅使用U和C。)
图50示出原代T细胞中来自含有所指示的原始或经修饰的IRES元件的环状RNA的发光表达水平和表达稳定性。
图51示出HepG2细胞中来自含有所指示的原始或经修饰的IRES元件的环状RNA的发光表达水平和表达稳定性。
图52示出1C1C7细胞中来自含有所指示的原始或经修饰的IRES元件的环状RNA的发光表达水平和表达稳定性。
图53示出HepG2细胞中来自含有***的非翻译区(UTR)的IRES元件或杂合IRES元件的环状RNA的发光表达水平和表达稳定性。“Scr”表示乱序，其用作对照。
图54示出1C1C7细胞中来自含有可操作地连接至高斯萦光素酶编码序列的IRES和可变终止密码子盒的环状RNA的发光表达水平和表达稳定性。
图55示出1C1C7细胞中来自含有IRES和在高斯萦光素酶编码序列的起始密码子之前***的可变非翻译区(UTR)的环状RNA的发光表达水平和表达稳定性。
图56示出Huh7细胞中来自在hEPO编码序列下游含有两个miR-122靶位点的环状RNA的人***(hEPO)的表达水平。
图57示出当用包封表达抗CD19 CAR的环状RNA的LNP处理后，外周血(图57A)和脾脏(图57B)中CAR的表达水平。抗CD20(aCD20)和编码萦光素酶(oLuc)环状RN用于比较。
图58示出抗CD19 CAR表达的总体频率、细胞表面上抗CD19 CAR表达的频率以及编码抗CD19 CAR的IRES特异性环状RNA的抗肿瘤应答对T细胞的影响。图58A示出抗CD19 CAR几何平均萦光强度，图58B示出抗CD19 CAR表达的百分比，并且图58C示出通过抗CD19 CAR进行的靶细胞裂解百分比。(CK＝山羊嵴病毒；AP＝姬鼠小核糖核酸病毒；CK*＝具有密码子优化的山羊嵴病毒；PV＝Parabovirus；SV＝萨力病毒。)
图59示出用IRES特异性环状RNA构建体处理时，A20 FLuc靶细胞的CAR表达水平。
图60示出原代人T细胞中来自环状RNA的胞质蛋白(图60A)和表面蛋白(图60B)的发光表达水平。
图61示出用IRES特异性环状构建体处理时，人T细胞中的发光表达。将环状RNA构建体中的表达与线性mRNA进行比较。图61A、图61B和图61G提供多种供体细胞中的高斯萦光素酶表达。图61C、图61D、图61E和图61F提供多种供体细胞中的萤火虫萦光素酶表达。
图62示出在用含有编码抗CD19或抗BCMA CAR的环状RNA的脂质纳米颗粒处理表达萤火虫萦光素酶的K562细胞后，人T细胞中抗CD19 CAR(图62A和图62B)和抗BCMA CAR(图62B)的表达。
图63示出通过体外电穿孔以特定抗原依赖性方式递送编码抗CD19 CAR的环状RNA所产生的抗CD19 CAR表达水平。图63A示出用抗CD19 CAR裂解Nalm6细胞。图63B示出用抗CD19 CAR裂解K562细胞。
图64示出通过在含有LNP和表达绿色萦光蛋白(GFP)的环状RNA的溶液中使用ApoE3而介导的LNP转染。图64A示出活-死结果。图64B、图61C、图61D和图64E提供多个供体的表达频率。
具体实施方式
本发明尤其提供了用于基于循环RNA疗法治疗自身免疫性病症或癌症的方法和组合物。特别地，本发明提供了用于治疗自身免疫性病症或癌症的方法，通过以使得自身免疫性病症或癌症的至少一种症状或特征在强度、严重程度或频率方面降低或发病延迟的有效剂量和施用间隔向需要治疗的受试者施用包含编码2种治疗性蛋白质的RNA的组合物。
在某些实施方案中，本文提供了一种用于制备环状RNA的载体，所述载体包含任选的5'双链体形成区、3'I组内含子片段、任选的第一间隔区、内部核糖体进入位点(IRES)、第一表达序列、编码裂解位点的多核苷酸序列、第二表达序列、任选的第二间隔区、5'I组内含子片段和任选的3'双链体形成区。在某些实施方案中，本文提供了一种用于制备环状RNA的载体，所述载体包含任选的5'双链体形成区、3'I组内含子片段、任选的第一间隔区、第一内部核糖体进入位点(IRES)、第一表达序列、第二IRES、第二表达序列、任选的第二间隔区、5'I组内含子片段和任选的3'双链体形成区。在一些实施方案中，这些元件以上述顺序定位在载体中。在一些实施方案中，多核苷酸含有3'双链体形成区和5'双链体形成区。在一些实施方案中，载体还包含位于3'I组内含子片段与IRES之间的内部5'双链体形成区以及表达序列与5'I组内含子片段之间的内部3'双链体形成区。在一些实施方案中，内部双链体形成区能够在彼此之间形成双链体但不能与外部双链体形成区形成双链体。在一些实施方案中，内部双链体形成区是第一和第二间隔区的一部分。另外的实施方案包括环状RNA多核苷酸，包括使用本文提供的载体制备的环状RNA多核苷酸；包含这种环状RNA的组合物；包含这种环状RNA的细胞；使用和制备此类载体、环状RNA、组合物和细胞的方法。
在一些实施方案中，本文提供的方法包括将本文提供的环状RNA多核苷酸施用至细胞中以用于治疗或产生有用的蛋白质。在一些实施方案中，由于环状RNA对核糖核酸酶的抗性，所述方法有利于在真核细胞内产生与线性RNA相比具有更长半衰期的所需多肽。
环状RNA多核苷酸缺乏核酸外切酶介导的降解所需的游离末端，从而使它们与等效线性RNA相比对几种RNA降解机制具有抗性并允许延长的半衰期。环化可允许稳定通常具有短半衰期的RNA多核苷酸，并且可提高外源性mRNA在各种应用中的总体功效。在一个实施方案中，如通过蛋白质合成所评估，本文提供的环状RNA多核苷酸在真核细胞(例如，哺乳动物细胞，如人细胞)中的功能性半衰期是至少20小时(例如，至少80小时)。
1.定义
如本文所用，术语“circRNA”或“环状多核糖核苷酸”或“环状RNA”可互换使用并且是指通过共价键形成环状结构的多核糖核苷酸。
如本文所用，术语“3'I组内含子片段”是指与天然I组内含子的包含剪接位点二核苷酸和任选的一段天然外显子序列的3'-近端具有75％或更高相似性的序列。
如本文所用，术语“5'I组内含子片段”是指与天然I组内含子的包含剪接位点二核苷酸和任选的一段天然外显子序列的5'-近端具有75％或更高相似性的序列。
如本文所用，术语“置换位点”是指I组内含子中的位点，其中在内含子置换之前进行切割。这种切割产生3'和5'I组内含子片段，所述片段被置换为在一段待环化的前体RNA的任一侧上。
如本文所用，术语“剪接位点”是指部分或完全包含在I组内含子中并且在RNA环化期间其之间的磷酸二酯键被裂解的二核苷酸。
多核苷酸构建体中的表达序列可通过“裂解位点”序列隔开，这使得由所述表达序列编码的多肽一旦翻译，就可被细胞单独表达。
“自裂解肽”是指在两个相邻氨基酸之间不存在肽键的情况下翻译的肽，或使得当包含蛋白质和自裂解肽的多肽产生时，它立即被裂解或分离成不同的且离散的第一和第二多肽，而不需要任何外部裂解活性的功能。
如本文所用，术语“治疗性蛋白质”是指当以翻译的核酸的形式直接或间接施用于受试者时具有治疗、诊断和/或预防作用和/或引发所需的生物学和/或药理作用的任何蛋白质。
αβTCR的α链和β链统称被认为各自具有两个结构域或区，即可变结构域/区和恒定结构域/区。可变结构域由可变区和连接区的级联组成。因此，在本说明书和权利要求书中，术语“TCRα可变结构域”是指TRAV和TRAJ区的级联，并且术语TCRα恒定结构域是指细胞外TRAC区，或C末端截短的TRAC序列。同样，术语“TCRβ可变结构域”是指TRBV和TRBD/TRBJ区的级联，并且术语TCRβ恒定结构域是指细胞外TRBC区，或C末端截短的TRBC序列。
如本文所用，术语“免疫原性”是指诱导对物质的免疫应答的潜力。当生物体的免疫***或某种类型的免疫细胞暴露于免疫原性物质时，可诱导免疫应答。术语“非免疫原性”是指缺乏或不存在对物质的高于可检测阈值的免疫应答。当生物体的免疫***或某种类型的免疫细胞暴露于非免疫原性物质时，未检测到免疫应答。在一些实施方案中，当通过免疫原性测定测量时，如本文提供的非免疫原性环状多核糖核苷酸不会诱导高于预定阈值的免疫应答。在一些实施方案中，当生物体的免疫***或某种类型的免疫细胞暴露于如本文提供的非免疫原性环状多核糖核苷酸时，未检测到先天性免疫应答。在一些实施方案中，当生物体的免疫***或某种类型的免疫细胞暴露于如本文提供的非免疫原性环状多核糖核苷酸时，未检测到适应性免疫应答。
如本文所用，术语“环化效率”是指所得环状多核糖核苷酸与其线性起始材料相比的测量值。
如本文所用，术语“翻译效率”是指从核糖核苷酸转录物产生蛋白质或肽的速率或量。在一些实施方案中，翻译效率可表示为每给定量的编码蛋白质或肽的转录物所产生的蛋白质或肽的量。
术语“核苷酸”是指核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、其修饰形式或其类似物。核苷酸包括物质，所述物质包括嘌呤(例如，腺嘌呤、次黄嘌呤、鸟嘌呤及其衍生物和类似物)以及嘧啶(例如，胞嘧啶、尿嘧啶、胸腺嘧啶及其衍生物和类似物)。核苷酸类似物包括在碱基、糖和/或磷酸的化学结构中具有经修饰的核苷酸，包括但不限于，5'-位置嘧啶修饰、8'-位置嘌呤修饰、胞嘧啶环外胺处的修饰和5-溴-尿嘧啶的取代；和2'-位置糖修饰，包括但不限于糖修饰的核糖核苷酸，其中2'-OH被诸如H、OR、R、卤基、SH、SR、NH2、NHR、NR2或CN的基团取代，其中R是如本文所定义的烷基部分。核苷酸类似物还意在包括具有碱基，例如肌苷、辫苷、黄嘌呤；糖类，如2'-甲基核糖；非天然磷酸二酯键联，如甲基膦酸酯、硫代磷酸酯和肽键联的核苷酸。核苷酸类似物包括5-甲氧基尿苷、1-甲基假尿苷和6-甲基腺苷。
术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用以描述任何长度(例如大于约2个碱基、大于约10个碱基、大于约100个碱基、大于约500个碱基、大于1000个碱基或多达约10,000个或更多个碱基)、由核苷酸(例如脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸)组成的聚合物，并且可酶促或合成产生(例如，如美国专利第5,948,902号和其中引用的参考文献中所述)，其可以类似于两种天然存在的核酸的序列特异性方式与天然存在的核酸杂交，例如可参与沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对相互作用。天然存在的核酸由核苷酸组成，所述核苷酸包括鸟嘌呤、胞嘧啶、腺嘌呤、胸腺嘧啶和尿嘧啶(分别为G、C、A、T和U)。
如本文所用术语“核糖核酸”和“RNA”意指由核糖核苷酸组成的聚合物。
如本文所用的术语“脱氧核糖核酸”和“DNA”意指由脱氧核糖核苷酸组成的聚合物。
“分离的”或“纯化的”通常是指物质(例如，在一些实施方案中，化合物、多核苷酸、蛋白质、多肽、多核苷酸组合物或多肽组合物)的分离，使得所述物质占它所存在于其中的样品的显著百分比(例如，大于1％、大于2％、大于5％、大于10％、大于20％、大于50％或更多，通常高达约90％-100％)。在某些实施方案中，基本上纯化的组分占样品的至少50％、80％-85％或90％-95％。用于纯化目标多核苷酸和多肽的技术在本领域中是熟知的，并且包括例如离子交换色谱法、亲和色谱法以及根据密度进行沉降。通常，当物质相对于样品的其他组分以大于其天然存在的量存在于样品中时，则所述物质是纯化的。
如本文所用的术语“双链体的”、“双链的”或“杂交的”是指通过含有互补序列的核酸的两条单链的杂交形成的核酸。在大多数情况下，基因组DNA是双链的。序列可完全互补或部分互补。
如本文所用，关于RNA的“非结构化”是指未被RNAFold软件或类似预测工具预测与自身或同一RNA分子中的其他序列形成结构(例如，发夹环)的RNA序列。在一些实施方案中，可使用核酸酶保护测定来在功能上表征非结构化RNA。
如本文所用，关于RNA的“结构化”是指被RNAFold软件或类似预测工具预测与自身或同一RNA分子中的其他序列形成结构(例如，发夹环)的RNA序列。
如本文所用，当两个“双链体形成区”、“同源臂”或“同源区”与彼此的反向互补序列具有足够水平的序列同一性以充当杂交反应的底物时，所述两个区域彼此互补或是互补的。如本文所用，当多核苷酸序列与反向互补序列或“互补”序列同一或共享序列同一性时，所述多核苷酸序列具有“同源性”。双链体形成区和对应双链体形成区的反向互补序列之间的序列同一性百分比可以是允许杂交发生的任何序列同一性百分比。在一些实施方案中，本发明多核苷酸的内部双链体形成区能够与另一个内部双链体形成区形成双链体并且不与外部双链体形成区形成双链体。
线性核酸分子被称为具有“5'-末端”(5'端)和“3'-末端”(3'端)，因为核酸磷酸二酯键联存在于取代单核苷酸的糖部分的5'碳和3'碳处。多核苷酸的末端核苷酸是其5'末端核苷酸，在所述末端核苷酸处新键联将是与5'碳的键联。多核苷酸的末端核苷酸是其3'末端核苷酸，在所述末端核苷酸处新键联将是与3'碳的键联。如本文所用，末端核苷酸是位于3'-或5'-末端的末端位置处的核苷酸。
“转录”是指使用DNA分子作为模板，通过RNA聚合酶形成或合成RNA分子。本发明关于用于转录的RNA聚合酶没有限制。例如，在一些实施方案中，可使用T7型RNA聚合酶。
“翻译”是指基于RNA模板由核糖体形成多肽分子。
应当理解，本文所用的术语仅出于描述特定实施方案的目的，而并非旨在进行限制。如在本说明书和所附权利要求中所使用，除非内容另外明确指明，否则单数形式“一个/种(a/an)”和“所述(the)”包括复数指代物。因此，例如，提及“一个细胞”包括两个或更多个细胞的组合，或细胞的整个培养物；提及“多核苷酸”实际上包括所述多核苷酸的许多拷贝。除非明确规定或从上下文显而易见，否则如本文所使用，术语“或”被理解为包括在内。除非本文中或和说明书其余部分下文中另有定义，否则本文使用的所有技术性和科学性术语具有与本发明所属领域的技术人员通常所理解的相同的含义。
除非明确规定或从上下文显而易见，否则如本文所用，术语“约”应理解为在本领域的正常公差范围内，例如在平均值的2个标准偏差以内。“约”可理解为在所述值的10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.9％、0.8％、0.7％、0.6％、0.5％、0.4％、0.3％、0.2％、0.1％、0.09％、0.08％、0.07％、0.06％、0.05％、0.04％、0.03％、0.02％或0.01％内。除非另外从上下文显而易见，否则本文提供的所有数值都由术语“约”修饰。
如本文所用，术语“编码”泛指任何过程，其中聚合大分子中的信息用于指导与第一个分子不同的第二个分子的产生。第二分子可具有与第一分子的化学性质不同的化学结构。
“共同施用”是指将本文提供的治疗剂与一种或多种额外治疗剂时间上足够接近地联合施用，使得本文提供的治疗剂可增强一种或多种额外治疗剂的效果，反之亦然。
如本文所用，术语“治疗”和“预防”以及源自其的词不一定意味着100％或完全治疗或预防。而是，存在不同程度的治疗或预防，本领域普通技术人员认为所述治疗或预防具有潜在益处或治疗效果。由本文公开的方法提供的治疗或预防可包括治疗或预防疾病的一种或多种疾患或症状。此外，出于本文的目的，“预防”可包括延迟疾病或其症状或疾患的发作。
如本文所用，“自身免疫”被定义为对非感染性自身抗原的持续和进行性免疫反应，与来自细菌、病毒、真菌或寄生虫生物体的感染性非自身抗原不同，所述非自身抗原侵入并持续存在于哺乳动物和人类体内。自身免疫性疾患包括硬皮病、格雷夫斯病、克罗恩氏病、薛格连氏综合征、多发性硬化症、桥本氏病、银屑病、重症肌无力、自身免疫性多内分泌病综合征、I型糖尿病(TIDM)、自身免疫性胃炎、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、多发性肌炎、结肠炎和甲状腺炎以及以人类狼疮为代表的广泛性自身免疫性疾病。如本文使用的“自身抗原(Autoantigen)”或“自身抗原(self-antigen)”是指哺乳动物本身的并在所述哺乳动物中具有免疫原性的抗原或表位。
如本文所用，术语“表达序列”可指编码产物例如肽或多肽、调控性核酸或非编码核酸的核酸序列。编码肽或多肽的示例性表达序列可包含多个核苷酸三联体，所述核苷酸三联体中的每一者可编码氨基酸并被称为“密码子”。
如本文所用，“间隔区”是指多核苷酸序列的范围从1个核苷酸至数百或数千个核苷酸、沿多核苷酸序列分隔两个其他元件的区域。序列可被限定或者可以是随机的。间隔区通常是非编码的。在一些实施方案中，间隔区包括双链体形成区。
如本文所用，“内部核糖体进入位点”或“IRES”是指大小范围从10nt至1000nt或更大、能够在没有典型RNA帽结构的情况下起始多肽的翻译的RNA序列或结构元件。IRES的长度通常是约500nt至约700nt。
如本文所用，“miRNA位点”是指多核苷酸内的能够与天然miRNA序列的至少8个核苷酸形成双链体的一段核苷酸。
如本文所用，“核酸内切酶位点”是指多核苷酸内能够被核酸内切酶蛋白识别并裂解的一段核苷酸。
如本文所用，“双顺反子RNA”是指包含编码两种不同蛋白质的两个表达序列的多核苷酸。这些表达序列通常被可裂解的肽如2A位点或IRES序列隔开。它们也可通过核糖体跳跃元件或蛋白酶裂解隔开。
如本文所用，术语“核糖体跳跃元件”是指编码能够从一个RNA分子的翻译产生两条肽链的短肽序列的核苷酸序列。虽然不希望受理论束缚，但假设核糖体跳跃元件通过(1)终止第一肽链的翻译和重新起始第二肽链的翻译；或(2)通过编码肽的内在蛋白酶活性或通过环境中的另一种蛋白酶(例如，细胞溶质)裂解由核糖体跳跃元件编码的肽序列中的肽键而起作用。
如本文所用，术语“共配制”是指包含两种或更多种核酸或核酸和其他活性药物物质的纳米颗粒制剂。通常，比率是等摩尔的或定义为两种或更多种核酸或核酸与其他活性药物物质的比率计量的量。
如本文所用，“转移媒介物”包括任何标准药物载体、稀释剂、赋形剂等，其通常旨在与包括核酸在内的生物活性剂的施用结合使用。
如本文所用，短语“脂质纳米颗粒”是指包含一种或多种脂质(例如，在一些实施方案中，阳离子脂质、非阳离子脂质和PEG修饰的脂质)的转移媒介物。
如本文所用，短语“阳离子脂质”是指在选定pH，如生理pH下携带净正电荷的许多脂质种类中的任一种。
如本文所用，短语“非阳离子脂质”是指任何中性、两性离子或阴离子脂质。
如本文所使用，短语“阴离子脂质”是指在选定pH，如生理pH下携带净负电荷的许多脂质种类中的任一种。
如本文所用，短语“可电离脂质”是指在选定pH(如生理pH 4)下携带净正电荷并在其他pH(如生理pH 7)下携带中性电荷的多种脂质种类中的任一种。
在一些实施方案中，本文公开的脂质(例如可电离脂质)包含一个或多个可裂解基团。术语“裂解”和“可裂解的”在本文中用于意指主题官能团中或邻近主题官能团的原子之间的一种或多种化学键(例如，共价键、氢键、范德华力和/或离子相互作用中的一者或多者)被破坏(例如，水解)或在暴露于选定条件时(例如，在暴露于酶促条件时)能够被破坏。在某些实施方案中，可裂解基团是二硫键官能团，并且在特定实施方案中是能够在暴露于选定生物条件(例如，细胞内条件)时被裂解的二硫键基团。在某些实施方案中，可裂解基团是在暴露于选定生物条件时能够被裂解的酯官能团。例如，二硫键基团可通过酶促或通过水解、氧化或还原反应裂解。在裂解这种二硫键官能团时，可释放与其结合的一个或多个官能部分或基团(例如，一个或多个头基和/或尾基)。示例性的可裂解基团可包括但不限于二硫键基团、酯基团、醚基团和它们的任何衍生物(例如，烷基酯和芳基酯)。在某些实施方案中，可裂解基团不是酯基或醚基。在一些实施方案中，可裂解基团键合(例如，通过氢键、范德华力、离子相互作用和共价键中的一者或多者键合)至一个或多个官能部分或基团(例如，至少一个头基和至少一个尾基)。在某些实施方案中，官能部分或基团中的至少一者是亲水性的(例如，包含咪唑、胍、氨基、亚胺、烯胺、任选取代的烷基氨基和吡啶基中的一者或多者的亲水性头基)。
如本文所用，术语“亲水性的”用于定性地表示官能团是水优选的，并且通常此类基团是水溶性的。例如，本文公开了包含与一个或多个亲水性基团(例如，亲水性头基)键合的可裂解二硫键(S—S)官能团的化合物，其中此类亲水性基团包含或选自由以下组成的组：咪唑、胍、氨基、亚胺、烯胺、任选取代的烷基氨基(例如，烷基氨基如二甲氨基)和吡啶基。
在某些实施方案中，构成本文公开的化合物的部分的至少一个官能团本质上是疏水性的(例如，包含天然存在的脂质如胆固醇的疏水性尾基)。如本文所用，术语“疏水性的”用于定性地表示官能团是避水的，并且通常此类基团不溶于水。例如，本文公开了包含与一个或多个疏水性基团键合的可裂解官能团(例如，二硫键(S—S)基团)的化合物，其中此类疏水性基团包含一种或多种天然存在的脂质如胆固醇，和/或任选取代的、可变饱和或不饱和的C6-C20烷基和/或任选取代的、可变饱和或不饱和的C6-C20酰基。
在此描述的化合物还可以包含一种或多种同位素取代。例如，H可处于任何同位素形式，包括1H、2H(D或氘)和3H(或氚)；C可处于任何同位素形式，包括12C、13C和14C；O可处于任何同位素形式，包括16O和18O；F可处于任何同位素形式，包括18F和19F；等。
当描述本发明时，本发明可包括化合物及其药学上可接受的盐、含有此类化合物的药物组合物以及使用此类化合物和组合物的方法，除非另有说明，否则以下术语(如果存在)具有以下含义。还应该理解，当在本文中描述时，下文定义的任何部分可被多种取代基取代，并且各个定义旨在包括在其如下所述的范围内的此类取代部分。除非另有说明，否则术语“取代的”应如下所述定义。应进一步理解，术语“基团(groups)”和“基团(radicals)”在本文中使用时可被认为是可互换的。
当列出值的范围时，意图涵盖所述范围内的每个值和子范围。例如，“C1-6烷基”意图涵盖C1、C2、C3、C4、C5、C6、C1-6、C1-5、C1-4、C1-3、C1-2、C2-6、C2-5、C2-4、C2-3、C3-6、C3-5、C3-4、C4-6、C4-5以及C5-6烷基。
在某些实施方案中，本文公开的化合物包含例如至少一个亲水性头基和至少一个疏水性尾基，各自与至少一个可裂解基团键合，从而使此类化合物具有两亲性。如本文用于描述化合物或组合物，术语“两亲性”是指在极性(例如，水)和非极性(例如，脂质)环境两者中均溶解的能力。例如，在某些实施方案中，本文公开的化合物包含至少一个亲脂性尾基(例如，胆固醇或C6-C20烷基)和至少一个亲水性头基(例如，咪唑)，各自与可裂解基团(例如，二硫键)键合。
应当注意，用于描述本发明的化合物并且特别是构成此类化合物的官能团的术语“头基”和“尾基”为了便于参考用于描述一个或多个官能团相对于其他官能团的取向而使用。例如，在某些实施方案中，亲水性头基(例如胍)键合(例如，通过氢键、范德华力、离子相互作用和共价键中的一者或多者)至可裂解官能团(例如，二硫键基团)，所述可裂解官能团进而与疏水性尾基(例如，胆固醇)键合。
如本文所用，术语“烷基”是指直链和支链C1-C40烃(例如，C6-C20烃)，并且包括饱和和不饱和烃两者。在某些实施方案中，烷基可包含一个或多个环状烷基和/或一个或多个杂原子如氧、氮或硫并且可任选地被取代基(例如，烷基、卤基、烷氧基、羟基、氨基、芳基、醚、酯或酰胺中的一者或多者)取代。在某些实施方案中，考虑的烷基包括(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯。诸如例如“C6-C20”的名称的使用旨在指代具有所述范围碳原子的烷基(例如，直链或支链并且包括烯烃和烷基)。在一些实施方案中，烷基具有1至10个碳原子(“C1-10烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至9个碳原子(“C1-9烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至8个碳原子(“C1-8烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至7个碳原子(“C1-7烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至6个碳原子(“C1-6烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至5个碳原子(“C1-5烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至4个碳原子(“C1-4烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至3个碳原子(“C1-3烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1至2个碳原子(“C1-2烷基”)。在一些实施方案中，烷基具有1个碳原子(“C1烷基”)。C1-6烷基的实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、戊基、己基等。
如本文所用，“烯基”是指具有2至20个碳原子、一个或多个碳-碳双键(例如1、2、3或4个碳-碳双键)以及任选的一个或多个碳-碳三键(例如1、2、3或4个碳-碳三键)的直链或支链烃基(“C2-20烯基”)。在某些实施方案中，烯基不含任何三键。在一些实施方案中，烯基具有2至10个碳原子(“C2-10烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至9个碳原子(“C2-9烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至8个碳原子(“C2-8烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至7个碳原子(“C2-7烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至6个碳原子(“C2-6烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至5个碳原子(“C2-5烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至4个碳原子(“C2-4烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2至3个碳原子(“C2-3烯基”)。在一些实施方案中，烯基具有2个碳原子(“C2烯基”)。所述一个或多个碳-碳双键可以是内部的(如在2-丁烯基中)或末端的(如在1-丁烯基中)。C2-4烯基的实例包括乙烯基(C2)、1-丙烯基(C3)、2-丙烯基(C3)、1-丁烯基(C4)、2-丁烯基(C4)、丁二烯基(C4)等。C2-6烯基的实例包括前面提到的C2-4烯基以及戊烯基(C5)、戊二烯基(C5)、己烯基(C6)等。烯基的另外实例包括庚烯基(C7)、辛烯基(C8)、辛三烯基(C8)等。
如本文所用，“炔基”是指具有2至20个碳原子、一个或多个碳-碳三键(例如1、2、3或4个碳-碳三键)以及任选的一个或多个碳-碳双键(例如1、2、3或4个碳-碳双键)的直链或支链烃基(“C2-20炔基”)。在某些实施方案中，炔基不含任何双键。在一些实施方案中，炔基具有2至10个碳原子(“C2-10炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至9个碳原子(“C2-9炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至8个碳原子(“C2-8炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至7个碳原子(“C2-7炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至6个碳原子(“C2-6炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至5个碳原子(“C2-5炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至4个碳原子(“C2-4炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2至3个碳原子(“C2-3炔基”)。在一些实施方案中，炔基具有2个碳原子(“C2炔基”)。一个或多个碳-碳三键可以是内部的(如在2-丁炔基中)或末端的(如在1-丁炔基中)。C2-4炔基的实例包括但不限于乙炔基(C2)、1-丙炔基(C3)、2-丙炔基(C3)、1-丁炔基(C4)、2-丁炔基(C4)等。C2-6烯基的实例包括前面提到的C2-4炔基以及戊炔基(C5)、己炔基(C6)等。炔基的另外实例包括庚炔基(C7)、辛炔基(C8)等。
如本文所用，“亚烷基”、“亚烯基”和“亚炔基”分别指烷基、烯基和炔基的二价基团。当为特定“亚烷基”、“亚烯基”或“亚炔基”提供碳的范围或数目时，应理解所述范围或数目是指线性碳二价链中的碳的范围或数目。“亚烷基”、“亚烯基”和“亚炔基”可被一个或多个如本文所述的取代基取代或未取代。
如本文所用，术语“芳基”是指环部分中含有六至十个碳的芳族基团(例如，单环、双环和三环结构)。芳基可任选地通过可用碳原子取代，并且在某些实施方案中可包括一个或多个杂原子，如氧、氮或硫。在一些实施方案中，芳基具有6个环碳原子(“C6芳基”；例如，苯基)。在一些实施方案中，芳基具有10个环碳原子(“C10芳基”；例如，萘基，如1-萘基和2-萘基)。
如本文所用，“杂芳基”是指5-10元单环或双环的4n+2芳族环***(例如，具有在环阵列中共享的6或10个电子)的基团，在所述芳族环***中具有环碳原子和1-4个环杂原子，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫(“5-10元杂芳基”)。在含有一个或多个氮原子的杂芳基中，连接点可以是碳或氮原子，只要化合价允许。杂芳基双环环***可在一个或两个环中包含一个或多个杂原子。“杂芳基”包括其中如上文定义的杂芳基环与一个或多个碳环基或杂环基稠合的环***，其中连接点是在杂芳基环上，并且在此类情况下，环成员的数目继续指示杂芳基环***中的环成员的数目。“杂芳基”还包括其中如上文定义的杂芳基环与一个或多个芳基稠合的环***，其中连接点是在芳基或杂芳基环上，并且在此类情况下，环成员的数目指示稠合的(芳基/杂芳基)环***中的环成员的数目。其中一个环不含杂原子的双环杂芳基(例如，吲哚基、喹啉基、咔唑基等)中，连接点可在任一环上，即携带杂原子的环(例如，2-吲哚基)或不含杂原子的环(例如，5-吲哚基)。
术语“环烷基”是指衍生自环烷烃的具有3-12、3-8、4-8或4-6个碳原子的单价饱和环状、双环或桥接环状(例如金刚烷基)烃基，在本文中称为，例如“C4-8环烷基”。示例性环烷基包括但不限于环己烷、环戊烷、环丁烷和环丙烷。
如本文所用，“杂环基”或“杂环”是指具有环碳原子和1至4个环杂原子的3至10元非芳香族环***的基团，其中每个杂原子独立地选自氮、氧、硫、硼、磷和硅(“3-10元杂环基”)。在含有一个或多个氮原子的杂环基中，连接点可以是碳或氮原子，只要化合价允许。杂环基可以是单环(“单环杂环基”)或稠合、桥接或螺环***(如双环***(“双环杂环基”))，并且可以是饱和的或者可以是部分不饱和的。杂环基双环环***可在一个或两个环中包含一个或多个杂原子。“杂环基”还包括其中如上文定义的杂环基环与一个或多个碳环基稠合的环***，其中连接点是在碳环基或杂环基环上，或者其中如上文定义的杂环基环与一个或多个芳基或杂芳基稠合的环***，其中连接点是在杂环基环上，并且在此类情况下，环成员的数目继续指示杂环基环***中环成员的数目。术语“杂环”、“杂环基”、“杂环基环”、“杂环基团”、“杂环部分”和“杂环基团”可互换使用。
如本文所用，“氰基”是指-CN。
如本文所用的术语“卤基”和“卤素”是指选自氟(氟代，F)、氯(氯代，Cl)、溴(溴代，Br)和碘(碘代，I)的原子。在某些实施方案中，卤基是氟代或氯代。
如本文所用，术语“烷氧基”是指通过氧原子(-O(烷基))连接至另一个部分的烷基。非限制性实例包括例如甲氧基、乙氧基、丙氧基和丁氧基。
如本文所用，“氧代基”是指-C＝O。
一般来说，术语“取代的”，无论之前有无术语“任选地”，都意指基团(例如，碳或氮原子)上存在的至少一个氢被可允许的取代基替代，所述可允许的取代基例如是取代后产生稳定化合物的取代基，所述稳定化合物例如是不会自发地如通过重排、环化、消除或其他反应而进行转化的化合物。除非另外说明，否则“取代的”基团在所述基团的一个或多个可取代的位置处具有取代基，并且当任何给定结构中的多于一个位置被取代时，所述取代基在每个位置处是相同或不同的。
如本文所用，“药学上可接受的盐”是指在合理医学判断的范围内，适合用于与人和低等动物的组织接触而无不适当的毒性、刺激、过敏反应等并且与合理的益处/风险比相称的那些盐。药学上可接受的盐是本领域熟知的。例如，Berge等人在J.PharmaceuticalSciences(1977)66:1-19中详细描述了药学上可接受的盐。本发明化合物的药学上可接受的盐包括衍生自合适的无机和有机酸和碱的那些。药学上可接受的无毒酸加成盐的实例是氨基与无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸以及高氯酸)或与有机酸(如乙酸、草酸、马来酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)形成的盐，或通过使用本领域中所用的其它方法(如离子交换法)形成的盐。其他药学上可接受的盐包括己二酸盐、藻酸盐、抗坏血酸盐、天冬氨酸盐、苯磺酸盐、苯甲酸盐、硫酸氢盐、硼酸盐、丁酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、柠檬酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙烷磺酸盐、甲酸盐、富马酸盐、葡庚糖酸盐、甘油磷酸盐、葡糖酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氢碘化物、2-羟基-乙磺酸盐、乳糖醛酸盐、乳酸盐、月桂酸盐、月桂基硫酸盐、苹果酸盐、马来酸盐、丙二酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、硝酸盐、油酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、双羟萘酸盐、果胶酸盐、过硫酸盐、3-苯基丙酸盐、磷酸盐、苦味酸盐、新戊酸盐、丙酸盐、硬脂酸盐、琥珀酸盐、硫酸盐、酒石酸盐、硫氰酸盐、对甲苯磺酸盐、十一烷酸盐、戊酸盐等。衍生自适当的碱的药学上可接受的盐包括碱金属盐、碱土金属盐、铵盐以及N+(C1-4烷基)4盐。代表性碱金属或碱土金属盐包括钠、锂、钾、钙、镁等。其他药学上可接受的盐包括，在适当时，使用抗衡离子如卤离子、氢氧根、羧酸根、硫酸根、磷酸根、硝酸根、低级烷基磺酸根以及芳基磺酸根形成的无毒的铵、季铵和胺阳离子。
在典型实施方案中，本发明旨在涵盖本文公开的化合物，以及此类化合物的药学上可接受的盐、药学上可接受的酯、互变异构形式、多晶型物和前药。在一些实施方案中，本发明包括本文所述的化合物的药学上可接受的加成盐、药学上可接受的酯、加成盐的溶剂合物(例如，水合物)、互变异构形式、多晶型物、对映异构体、对映异构体的混合物、立体异构体或立体异构体的混合物(纯的或作为外消旋或非外消旋混合物)。
本文所述的化合物可包含一个或多个不对称中心，并且因此能够以多种异构体形式(例如对映异构体和/或非对映异构体)存在。例如，本文所述的化合物可呈单独对映异构体、非对映异构体或几何异构体的形式，或者可呈立体异构体混合物(包括外消旋混合物以及富含一种或多种立体异构体的混合物)的形式。异构体可通过本领域的技术人员已知的方法从混合物中分离，所述方法包括手性高压液相色谱法(HPLC)以及手性盐的形成和结晶；或者优选的异构体可通过不对称合成来制备。参见例如，Jacques等人,Enantiomers,Racemates and Resolutions(Wiley Interscience,New York,1981)；Wilen等人,Tetrahedron 33:2725(1977)；Eliel,Stereochemistry of Carbon Compounds(McGraw-Hill,NY,1962)；以及Wilen,Tables of Resolving Agents and Optical Resolutions第268页(E.L.Eliel,编辑,Univ.of Notre Dame Press,Notre Dame,IN 1972)。本发明另外涵盖呈基本上不含有其他异构体的单独异构体形式，以及可替代地呈不同异构体的混合物形式的本文描述的化合物。
在某些实施方案中，化合物和此类化合物作为其组分的转移媒介物(例如脂质纳米颗粒)表现出增强的(例如增加的)转染一种或多种靶细胞的能力。因此，本文还提供可转染一种或多种靶细胞的方法。此类方法通常包括使一种或多种靶细胞与本文公开的化合物和/或药物组合物接触的步骤，以使得一种或多种靶细胞被包封在其中的环状RNA转染。如本文所用，术语“转染(transfect)”或“转染(transfection)”是指将一种或多种包封材料(例如，核酸和/或多核苷酸)细胞内引入细胞中，或优选引入靶细胞中。术语“转染效率”是指由经受转染的靶细胞吸收、引入经受转染的靶细胞中和/或由经受转染的靶细胞表达的此类包封材料(例如，多核苷酸)的相对量。在一些实施方案中，转染效率可通过转染后由靶细胞产生的报告多核苷酸产物的量来估计。在一些实施方案中，转移媒介物具有高转染效率。在一些实施方案中，转移媒介物具有至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％的转染效率。
如本文所用，术语“脂质体”通常是指由排列在一个或多个球形双层中的脂质(例如，两亲性脂质)构成的囊泡。在某些实施方案中，脂质体是脂质纳米颗粒(例如，包含一种或多种本文公开的可电离脂质化合物的脂质纳米颗粒)。此类脂质体可以是单层或多层囊泡，所述囊泡具有由亲脂性材料形成的膜和含有待递送至一种或多种靶细胞、组织和器官的包封circRNA的水性内部。在某些实施方案中，本文所述的组合物包含一个或多个脂质纳米颗粒。可用于形成所考虑的脂质体和脂质纳米颗粒的合适脂质(例如，可电离脂质)的实例包括一种或多种本文公开的化合物(例如，HGT4001、HGT4002、HGT4003、HGT4004和/或HGT4005)。此类脂质体和脂质纳米颗粒还可包含额外的可电离脂质，如C12-200、DLin-KC2-DMA和/或HGT5001、辅助脂质、结构脂质、PEG修饰的脂质、MC3、DLinDMA、DLinkC2DMA、cKK-E12、ICE、HGT5000、DODAC、DDAB、DMRIE、DOSPA、DOGS、DODAP、DODMA、DMDMA、DODAC、DLenDMA、DMRIE、CLinDMA、CpLinDMA、DMOBA、DOcarbDAP、DLinDAP、DLincarbDAP、DLinCDAP、KLin-K-DMA、DLin-K-XTC2-DMA、HGT4003以及它们的组合。
如本文所用，短语“非阳离子脂质”、“非阳离子辅助脂质”和“辅助脂质”可互换使用并且是指任何中性脂质、两性离子脂质或阴离子脂质。
如本文所使用，短语“阴离子脂质”是指在选定pH，如生理pH下携带净负电荷的许多脂质种类中的任一种。
如本文所用，短语“生物可降解脂质”或“可降解脂质”是指在宿主环境中以几分钟、几小时或几天的数量级分解的多种脂质种类中的任一种，从而理想地使它们毒性较小且不太可能随时间推移在宿主中累积。对脂质的常见修饰包括酯键和二硫键等，以增加脂质的生物降解性。
如本文所用，短语“生物可降解PEG脂质”或“可降解PEG脂质”是指许多脂质种类中的任一种，其中PEG分子以几分钟、几小时或几天的数量级在宿主环境中从脂质裂解，从而理想地使它们的免疫原性降低。对PEG脂质的常见修饰包括酯键和二硫键等，以增加脂质的生物降解性。
在本发明的某些实施方案中，制备转移媒介物(例如脂质纳米颗粒)以包封一种或多种材料或治疗剂(例如circRNA)。将所需治疗剂(例如，circRNA)并入转移媒介物的过程在本文中称为“负载”或“包封”(Lasic等人,FEBS Lett.,312:255-258,1992)。转移媒介物负载或包封的材料(例如，circRNA)可完全或部分位于转移媒介物的内部空间中、转移媒介物的双层膜内或与转移媒介物的外表面缔合。
如本文所用，术语“结构脂质”是指固醇以及含固醇部分的脂质。
如本文所定义，“固醇”是由类固醇组成的类固醇的亚组。
如本文所用，术语“结构脂质”是指固醇以及含固醇部分的脂质。
如本文所用，术语“PEG”是指任何聚乙二醇或其他聚亚烷基醚聚合物。
如本文一般定义的，“PEG-OH脂质”(在本文中也称为“羟基-PEG化脂质”)是在脂质上具有一个或多个羟基(-OH)的PEG化脂质。
如本文所用，“磷脂”是包含磷酸酯部分和一个或多个碳链，如不饱和脂肪酸链的脂质。
本文公开的所有核苷酸序列可表示RNA序列或相应的DNA序列。应当理解，DNA中的脱氧胸苷(dT或T)被转录为RNA中的尿苷(U)。因此，“T”和“U”在本文中在核苷酸序列中可互换使用。
如本文所用，表述“序列同一性”或例如包含“与……50％同一性的序列”是指在比较窗口上序列在逐个核苷酸或逐个氨基酸的基础上同一的程度。因此，“序列同一性百分比”可通过以下方式进行计算：在比较窗口上比较两个最佳比对的序列、确定两个序列中出现同一核酸碱基(例如，A、T、C、G、I)或同一氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数以得到匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100而得到序列同一性百分比。包括与本文所述的任何参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸和多肽，通常其中多肽变体保持参考多肽的至少一种生物活性。
术语“抗体”(Ab)包括但不限于特异性地结合至抗原的糖蛋白免疫球蛋白。一般而言，抗体可包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合分子。每条H链可包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区可包含三个恒定域，CH1、CH2和CH3。每条轻链可包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域，CL。VH和VL区可进一步细分为高变区，称为互补决定区(CDR)，其间散布着较保守的区域，称为框架区(FR)。每个VH和VL可包含三个CDR和四个FR，以下列顺序从氨基末端至羧基末端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。Ab的恒定区可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子的结合，包括免疫***的不同细胞(例如，效应细胞)以及经典补体***的第一组分。抗体可包括例如单克隆抗体、重组产生的抗体、单特异性抗体、多特异性抗体(包括双特异性抗体)、人抗体、工程化抗体、人源化抗体、嵌合抗体、免疫球蛋白、合成抗体、包含两个重链和两个轻链分子的四聚抗体、抗体轻链单体、抗体重链单体、抗体轻链二聚体、抗体重链二聚体、抗体轻链-抗体重链对、胞内抗体、抗体融合物(本文有时称为“抗体缀合物”)、异源缀合物抗体、单结构域抗体、单价抗体、单链抗体或单链可变片段(scFv)、骆驼化抗体、亲和体(affybody)、Fab片段、F(ab')2片段、二硫键连接的可变片段(sdFv)、抗独特型(anti-id)抗体(包括例如抗-抗Id抗体)、微型抗体、结构域抗体、合成抗体(有时在本文中称为“抗体模拟物”)和上述任一者的抗原结合片段。在一些实施方案中，本文所述的抗体是指多克隆抗体群。
免疫球蛋白可源自任何公知的同种型，包括但不限于IgA、分泌型IgA、IgG和IgM。IgG亚类也是本领域技术人员众所周知的，包括但不限于人IgG1、IgG2、IgG3和IgG4。“同种型”是指由重链恒定区基因编码的Ab类或亚类(例如IgM或IgG1)。举例来说，术语“抗体”包括天然存在的和非天然存在的Ab；单克隆和多克隆Ab；嵌合和人源化Ab；人或非人Ab；全合成Ab；和单链Ab。非人Ab可通过重组方法进行人源化以降低其在人中的免疫原性。在没有明确说明的情况下并且除非上下文另有说明，否则术语“抗体”还包括任何上述免疫球蛋白的抗原结合片段或抗原结合部分，并且包括单价和二价片段或部分，以及单链Ab。
“抗原结合分子”、“抗原结合部分”或“抗体片段”是指包含所述分子所来源的抗体的抗原结合部分(例如，CDR)的任何分子。抗原结合分子可包括抗原互补决定区(CDR)。抗体片段的实例包括但不限于Fab、Fab'、F(ab')2、Fv片段、dAb、线性抗体、scFv抗体和由抗原结合分子形成的多特异性抗体。肽体(即包含肽结合结构域的Fc融合分子)是合适的抗原结合分子的另一个实例。在一些实施方案中，抗原结合分子结合至肿瘤细胞上的抗原。在一些实施方案中，抗原结合分子结合至过度增生性疾病中所涉及的细胞上的抗原或结合至病毒或细菌抗原。在一些实施方案中，抗原结合分子结合至BCMA。在其它实施方案中，抗原结合分子是特异性地结合至抗原的抗体片段，包括其一个或多个互补决定区(CDR)。在其他实施方案中，抗原结合分子是单链可变片段(scFv)。在一些实施方案中，抗原结合分子包含avimer或由avimer组成。
如本文所用，术语“可变区”或“可变结构域”可互换使用并且在本领域中是常见的。可变区通常是指抗体的一部分，一般而言是轻链或重链的一部分，通常是成熟重链中的约氨基末端110至120个氨基酸和成熟轻链中的约90至115个氨基酸，其在抗体之间的序列方面广泛不同并且用于特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。序列的变异性集中在称为互补决定区(CDR)的那些区域中，而可变结构域中保守性更高的区域被称为框架区(FR)。不希望受任何特定机制或理论的束缚，据信轻链和重链的CDR主要负责抗体与抗原的相互作用和特异性。在一些实施方案中，可变区是人可变区。在一些实施方案中，可变区包含啮齿动物或鼠CDR和人框架区(FR)。在特定实施方案中，可变区是灵长类动物(例如，非人灵长类动物)可变区。在一些实施方案中，可变区包含啮齿动物或鼠类CDR和灵长类动物(例如，非人灵长类动物)框架区(FR)。
术语“VL”和“VL结构域”可互换使用来指抗体或其抗原结合分子的轻链可变区。
术语“VH”和“VH结构域”可互换使用来指抗体或其抗原结合分子的重链可变区。
CDR的许多定义是常用的：Kabat编号、Chothia编号、AbM编号或contact编号。AbM定义是Oxford Molecular的AbM抗体建模软件所使用的两者之间的折衷。接触定义是基于对可用复杂晶体结构的分析。术语“Kabat编号”和类似术语在本领域中是公认的，并且是指对抗体或其抗原结合分子的重链和轻链可变区中的氨基酸残基进行编号的***。在某些方面，可根据Kabat编号***来确定CDR(参见例如，Kabat EA和Wu TT(1971)Ann NY Acad Sci190:382-391以及Kabat EA等人,(1991)Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest,第五版，美国卫生和公共服务部,NIH出版号91-3242)。使用Kabat编号***，抗体重链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置31至35(其任选地可在35之后包含一个或两个另外氨基酸(在Kabat编号方案中称为35A和35B))(CDR1)、氨基酸位置50至65(CDR2)和氨基酸位置95至102(CDR3)。使用Kabat编号***，抗体轻链分子内的CDR通常存在于氨基酸位置24至34(CDR1)、氨基酸位置50至56(CDR2)和氨基酸位置89至97(CDR3)。在一个具体实施方案中，已经根据Kabat编号方案确定了本文所述的抗体的CDR。在某些方面，可根据Chothia编号方案来确定抗体的CDR，Chothia编号方案是指免疫球蛋白结构环的位置(参见例如，Chothia C和Lesk AM,(1987),J Mol Biol 196:901-917；Al-Lazikani B等人,(1997)JMol Biol 273:927-948；Chothia C等人,(1992)J Mol Biol 227:799-817；Tramontano A等人,(1990)J Mol Biol 215(1):175-82；以及美国专利号7,709,226)。通常，当使用Kabat编号惯例时，Chothia CDR-H1环存在于重链氨基酸26至32、33或34处，Chothia CDR-H2环存在于重链氨基酸52至56处，并且Chothia CDR-H3环存在于重链氨基酸95至102，而ChothiaCDR-L1环存在于轻链氨基酸24至34处，Chothia CDR-L2环存在于轻链氨基酸50至56处，并且Chothia CDR-L3环存在于轻链氨基酸89至97处。当使用Kabat编号惯例编号时，ChothiaCDR-HI环的末端根据环的长度而在H32与H34之间变化(这是由于Kabat编号方案将***放置于H35A和H35B处；如果35A或35B不存在，则环结束于32处；如果仅35A存在，则环结束于33处；如果35A和35B均存在，则环结束于34处)。在一个具体实施方案中，已经根据Chothia编号方案确定了本文所述的抗体的CDR。
如本文所用，术语“恒定区”和“恒定结构域”是可互换的，并且具有它们在本领域中的常见含义。恒定区是不直接参与抗体与抗原的结合、但可表现出多种效应子功能，如与Fc受体的相互作用的抗体部分，例如轻链和/或重链的羧基末端部分。相对于免疫球蛋白可变结构域，免疫球蛋白分子的恒定区通常具有更保守的氨基酸序列。
“结合亲和力”通常是指分子(例如，抗体)的单一结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文中所用，“结合亲和力”是指反映结合对的成员(例如，抗体与抗原)之间的1:1相互作用的固有结合亲和力。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(KD或Kd)表示。亲和力可以本领域中已知的多种方式来测量和/或表示，包括但不限于平衡解离常数(KD)和平衡缔合常数(KA或Ka)。KD是根据koff/kon的商计算的，而KA是根据kon/koff的商计算的。kon是指例如抗体与抗原的缔合速率常数，并且koff是指例如抗体与抗原的解离。kon和koff可通过本领域普通技术人员已知的技术，如
Figure BDA0003951010620000541
或KinExA来确定。
如本文所用，“保守性氨基酸取代”是其中氨基酸残基被具有相似侧链的氨基酸残基替代的一种氨基酸取代。在本领域中已经定义了具有侧链的氨基酸残基家族。这些家族包括具有碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电荷的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸、色氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸)、β-分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)以及芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)的氨基酸。在一些实施方案中，抗体或其抗原结合分子的CDR内或框架区内的一个或多个氨基酸残基可被具有相似侧链的氨基酸残基置换。
如本文所用，术语“异源的”是指来自除天然存在的序列以外的任何来源。
如本文所用，“表位”是本领域中的术语，并且是指抗体可与其特异性地结合的抗原的局部区域。表位可以是例如多肽的连续氨基酸(线性或连续表位)，或者表位可例如来自一种或多种多肽的两个或更多个非连续区域(构象性、非线性、不连续或非连续的表位)。在一些实施方案中，抗体所特异性地结合的表位可通过例如NMR光谱法、X射线衍射晶体学研究、ELISA测定、结合质谱法的氢/氘交换(例如，液相色谱电喷雾质谱法)、基于阵列的寡肽扫描测定和/或诱变作图(例如，定点诱变作图)来确定。对于X射线晶体学，可使用本领域中任何已知的方法来完成结晶(例如，Giege R等人,(1994)Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 50(Pt 4):339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189:1-23；ChayenNE(1997)Structure 5:1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251:6300-6303)。抗体:抗原晶体可使用众所周知的X射线衍射技术进行研究，并且可使用计算机软件如X-PLOR(Yale University,1992,由Molecular Simulations,Inc.分售；参见例如，Meth Enzymol(1985)第114和115卷,Wyckoff HW等人编辑；美国专利公布号2004/0014194)和BUSTER(Bricogne G(1993)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 49(Pt 1):37-60；BricogneG(1997)Meth Enzymol 276A:361-423,Carter CW编辑；Roversi P等人,(2000)ActaCrystallogr D Biol Crystallogr 56(Pt 10):1316-1323)进行改善。
如本文所用，如果抗原与第一结合分子、抗体或其抗原结合分子之间的相互作用阻断、限制、抑制或以其他方式降低参考结合分子、参考抗体或其抗原结合分子与抗原相互作用的能力，则所述抗原结合分子、抗体或其抗原结合分子与参考抗体或其抗原结合分子“交叉竞争”。交叉竞争可以是完全的，例如结合分子与抗原的结合完全阻断参考结合分子结合抗原的能力，或者它可以是部分的，例如结合分子与抗原的结合降低参考结合分子结合抗原的能力。在一些实施方案中，与参考抗原结合分子交叉竞争的抗原结合分子与参考抗原结合分子结合相同或重叠的表位。在其他实施方案中，与参考抗原结合分子交叉竞争的抗原结合分子与参考抗原结合分子结合不同的表位。众多类型的竞争性结合测定可用于确定一种抗原结合蛋白是否与另一抗原结合蛋白竞争，例如：固相直接或间接放射免疫测定(RIA)；固相直接或间接酶免疫测定(EIA)；夹心式竞争测定(Stahli等人,1983,Methodsin Enzymology 9:242-253)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Kirkland等人,1986,J.Immunol.137:3614-3619)；固相直接标记测定；固相直接标记夹心式测定(Harlow和Lane,1988,Antibodies,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press)；使用1-125标记进行的固相直接标记RIA(Morel等人,1988,Molec.Immunol.25:7-15)；固相直接生物素-抗生物素蛋白EIA(Cheung等人,1990,Virology 176:546-552)；以及直接标记RIA(Moldenhauer等人,1990,Scand.J.Immunol.32:77-82)。
如本文所用，术语“免疫特异性地结合”、“免疫特异性地识别”、“特异性地结合”和“特异性地识别”是抗体上下文中的类似术语，并且是指结合至抗原(例如表位或免疫复合物)的分子，因此本领域技术人员可理解这种结合。例如，特异性地结合至抗原的分子可结合至其他肽或多肽，通常具有较低的亲和力，如通过例如免疫测定、
Figure BDA0003951010620000561
KinExA3000仪器(Sapidyne Instruments,Boise,ID)或本领域中已知的其他测定所确定的。在一个具体实施方案中，特异性地结合至抗原的分子以与所述分子结合至另一抗原时的KA相比至少2log、2.5log、3log、4log或更大的KA结合至抗原。
“抗原”是指激发免疫应答或能够被抗体或抗原结合分子结合的任何分子。免疫应答可涉及抗体产生或特定免疫活性细胞的激活或两者。本领域技术人员将容易地理解任何大分子(包括几乎所有的蛋白质或肽)都可用作抗原。抗原可内源性表达，即由基因组DNA表达，或者可重组表达。抗原可对某种组织(如癌细胞)具有特异性，或者它可被广泛表达。此外，较大分子的片段可充当抗原。在一些实施方案中，抗原是肿瘤抗原。
术语“自体的”是指源自同一个体的任何材料，所述材料之后将被重新引入所述个体。例如，本文所述的工程化自体细胞疗法(eACTTM)方法涉及从患者收集淋巴细胞，然后将其工程化以表达例如CAR构建体，然后施用回至同一患者。
术语“同种异体”是指源自一个个体的任何材料，所述材料然后引入同一物种的另一个个体，例如同种异体T细胞移植。
“癌症”是指广泛的各种疾病，其特征在于体内异常细胞的不受控制的生长。不受调控的细胞***和生长导致恶性肿瘤的形成，所述恶性肿瘤侵入邻近组织并且还可通过淋巴***或血流转移至身体的远端部分。“癌症”或“癌组织”可包括肿瘤。可通过本文公开的方法治疗的癌症的实例包括但不限于免疫***的癌症，包括淋巴瘤、白血病、骨髓瘤和其他白细胞恶性肿瘤。在一些实施方案中，本文公开的方法可用于减小源自例如以下的肿瘤的肿瘤大小：骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头颈癌、皮肤或眼内恶性黑素瘤、子宫癌、卵巢癌、直肠癌、***癌、胃癌、睾丸癌、子宫癌、多发性骨髓瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(NHL)、原发性纵隔大B细胞淋巴瘤(PMBC)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、滤泡性淋巴瘤(FL)、转化滤泡性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤(SMZL)、食道癌、小肠癌、内分泌***癌症、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、尿道癌、***癌、慢性或急性白血病、急性骨髓性白血病、慢性骨髓性白血病、急性成淋巴细胞性白血病(ALL)(包括非T细胞ALL)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、儿童实体瘤、淋巴细胞性淋巴瘤、膀胱癌、肾癌或输尿管癌、中枢神经***(CNS)肿瘤、原发性CNS淋巴瘤、肿瘤血管生成、脊髓轴肿瘤、脑干胶质瘤、垂体腺瘤、表皮样癌、鳞状细胞癌、T细胞淋巴瘤、环境诱导的癌症包括石棉诱导的那些癌症、其他B细胞恶性肿瘤和所述癌症的组合。在一些实施方案中，本文公开的方法可用于减小源自例如以下的肿瘤的肿瘤大小：肉瘤和癌、纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、成骨肉瘤、卡波济氏肉瘤、软组织肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤文氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、胰腺癌、乳腺癌、卵巢癌、***癌、肝细胞癌、肺癌、结肠直肠癌、鳞状细胞癌、基底细胞癌、腺癌(例如胰腺、结肠、卵巢、肺、乳腺、胃、***、子宫颈或食道的腺癌)、汗腺癌、皮脂腺癌、***状癌、***状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、韦尔姆斯氏瘤、***、睾丸肿瘤、膀胱癌、输卵管癌、子宫内膜癌、子***、***癌、外阴癌、肾盂癌、CNS肿瘤(如胶质瘤、星形细胞瘤、髓母细胞瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突神经胶质瘤、脑膜瘤、黑素瘤、神经母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)。特定癌症可对化学疗法或放射疗法有反应，或者癌症可能是难治的。难治性癌症是指不适合手术干预的癌症，并且所述癌症最初对化学疗法或放射疗法没有反应，或者随时间推移癌症变得没有反应。
如本文所用，“抗肿瘤效应”是指可呈现为肿瘤体积减小、肿瘤细胞数量减少、肿瘤细胞增殖减少、转移的数量减少、总体或无进展存活增加、预期寿命增加或与肿瘤相关的各种生理症状的改善的生物效应。抗肿瘤效应也可指预防肿瘤的发生，例如疫苗。
如本文所用，“细胞因子”是指由一个细胞响应于与特定抗原接触而释放的非抗体蛋白，其中细胞因子与第二细胞相互作用以介导第二细胞中的反应。如本文所用的“细胞因子”是指由一个细胞群释放的作为细胞间介质作用于另一细胞的蛋白质。细胞因子可由细胞内源性表达或施用于受试者。细胞因子可由免疫细胞(包括巨噬细胞、B细胞、T细胞、嗜中性粒细胞、树突细胞、嗜酸性粒细胞和肥大细胞)释放以传播免疫应答。细胞因子可在受体细胞中诱导各种反应。细胞因子可包括稳态细胞因子、趋化因子、促炎性细胞因子、效应物和急性期蛋白。例如，稳态细胞因子，包括白细胞介素(IL)7和IL-15促进免疫细胞存活和增殖，并且促炎性细胞因子可促进炎性应答。稳态细胞因子的实例包括但不限于IL-2、IL-4、IL-5、IL-7、IL-10、IL-12p40、IL-12p70、IL-15和干扰素(IFN)γ。促炎性细胞因子的实例包括但不限于IL-la、IL-lb、IL-6、IL-13、IL-17a、IL-23、IL-27、肿瘤坏死因子(TNF)-α、TNF-β、成纤维细胞生长因子(FGF)2、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)、可溶性细胞间粘附分子1(sICAM-1)、可溶性血管粘附分子1(sVCAM-1)、血管内皮生长因子(VEGF)、VEGF-C、VEGF-D和胎盘生长因子(PLGF)。效应物的实例包括但不限于颗粒酶A、颗粒酶B、可溶性Fas配体(sFasL)、TGF-β、IL-35和穿孔素。急性期蛋白的实例包括但不限于C反应蛋白(CRP)和血清淀粉样蛋白A(SAA)。
如本文所用的术语“淋巴细胞”包括自然杀伤(NK)细胞、T细胞或B细胞。NK细胞是一种类型的细胞毒性(细胞毒性)淋巴细胞，其代表先天免疫***的主要组分。NK细胞排斥肿瘤和被病毒感染的细胞。它通过细胞凋亡或程序性细胞死亡的过程起作用。它们被称为“自然杀手”，因为它们不需要激活即可杀死细胞。T细胞在细胞介导的免疫(无抗体参与)中起主要作用。T细胞受体(TCR)区分T细胞与其它淋巴细胞类型。胸腺是免疫***的专门器官，是T细胞成熟的主要位点。存在许多种类型的T细胞，包括：辅助T细胞(例如CD4+细胞)、细胞毒性T细胞(也称为TC、细胞毒性T淋巴细胞、CTL、T杀伤细胞、溶细胞性T细胞、CD8+T细胞或杀伤T细胞)、记忆T细胞((i)干记忆细胞(TSCM)，如初始细胞，是CD45RO-、CCR7+、CD45RA+、CD62L+(L-选择素)、CD27+、CD28+和IL-7Ra+，但也表达大量CD95、IL-2R、CXCR3和LFA-1，并显示出记忆细胞所特有的许多功能属性)；(ii)中心记忆细胞(TCM)表达L-选择素和CCR7，它们分泌IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4，和(iii)效应记忆细胞(TEM)，然而，不表达L-选择素或CCR7，但产生效应细胞因子，如IFNγ和IL-4)、调控性T细胞(Treg、抑制性T细胞或CD4+CD25+或CD4+FoxP3+调控性T细胞)、自然杀伤T细胞(NKT)和γδT细胞。另一方面，B细胞在体液免疫(有抗体参与)中起主要作用。B细胞制造抗体，能够充当抗原呈递细胞(APC)，并且在通过抗原相互作用激活后转变为短寿命和长寿命的记忆B细胞和浆细胞。在哺乳动物中，未成熟的B细胞在骨髓中形成。
术语“遗传工程化”或“工程化”是指修饰细胞的基因组的方法，包括但不限于缺失编码或非编码区或其一部分或***编码区或其一部分。在一些实施方案中，经修饰的细胞是淋巴细胞，例如T细胞，其可从患者或供体获得。可修饰细胞以表达掺入细胞基因组中的外源构建体，例如嵌合抗原受体(CAR)或T细胞受体(TCR)。
“免疫应答”是指免疫***的细胞(例如，T淋巴细胞、B淋巴细胞、自然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、树突细胞和嗜中性粒细胞)以及由任何这些细胞或肝脏产生的可溶性大分子(包括抗体、细胞因子和补体)的作用，所述作用导致侵入病原体、感染病原体的细胞或组织、癌细胞或其他异常细胞、或者在自身免疫性或病理性炎症的情况下正常人细胞或组织的选择性靶向、结合、损伤、破坏和/或从脊椎动物体内清除。
如本文所用，“共刺激信号”是指与初级信号(如TCR/CD3连接)组合导致T细胞反应(如但不限于增殖和/或关键分子的上调或下调)的信号。
如本文所用，“共刺激配体”包括抗原呈递细胞上的分子，所述分子特异性地结合T细胞上的同源共刺激分子。共刺激配体的结合提供介导T细胞反应(包括但不限于增殖、激活、分化等)的信号。例如，通过使T细胞受体(TCR)/CD3复合物与负载有肽的主要组织相容性复合物(MHC)分子结合，共刺激配体诱导除刺激分子提供的主要信号以外的信号。共刺激配体可包括但不限于3/TR6、4-IBB配体、激动剂或结合Toll样受体的抗体、B7-1(CD80)、B7-2(CD86)、CD30配体、CD40、CD7、CD70、CD83、疱疹病毒进入介质(HVEM)、人白细胞抗原G(HLA-G)、ILT4、免疫球蛋白样转录物(ILT)3、诱导型共刺激配体(ICOS-L)、细胞间粘附分子(ICAM)、与B7-H3、淋巴毒素β受体特异性地结合的配体、MHC I类链相关蛋白A(MICA)、MHC I类链相关蛋白B(MICB)、OX40配体、PD-L2或程序性死亡(PD)LI。共刺激配体包括但不限于与T细胞上存在的共刺激分子特异性地结合的抗体，所述共刺激分子如但不限于4-1BB、B7-H3、CD2、CD27、CD28、CD30、CD40、CD7、ICOS、与CD83特异性地结合的配体、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、自然杀伤细胞受体C(NKG2C)、OX40、PD-1或肿瘤坏死因子超家族成员14(TNFSF14或LIGHT)。
“共刺激分子”是T细胞上与共刺激配体特异性地结合、从而介导T细胞的共刺激应答(如但不限于增殖)的同源结合配偶体。共刺激分子包括但不限于4-1BB/CD137、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD 33、CD 45、CD100(SEMA4D)、CD103、CD134、CD137、CD154、CD16、CD160(BY55)、CD 18、CD19、CD19a、CD2、CD22、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3(α；β；δ；ε；γ；δ)、CD30、CD37、CD4、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD5、CD64、CD69、CD7、CD80、CD83配体、CD84、CD86、CD8α、CD8β、CD9、CD96(Tactile)、CD1-la、CDl-lb、CDl-lc、CDl-ld、CDS、CEACAM1、CRT AM、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、ICOS、Igα(CD79a)、IL2Rβ、IL2Rγ、IL7Rα、整联蛋白、ITGA4、ITGA4、ITGA6、IT GAD、ITGAE、ITGAL、ITGAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、LIGHT、LIGHT(肿瘤坏死因子超家族成员14；TNFSF14)、LTBR、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1(CD1 la/CD18)、MHC I类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX40、PAG/Cbp、PD-1、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞激活分子、SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4(CD244；2B4)、SLAMF6(NTB-A；Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF、TNFr、TNFR2、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6，或它们的片段、截短或组合。
如本文所用，表述“序列同一性”或例如包含“与……50％同一性的序列”是指在比较窗口上序列在逐个核苷酸或逐个氨基酸的基础上同一的程度。因此，“序列同一性百分比”可通过以下方式进行计算：在比较窗口上比较两个最佳比对的序列、确定两个序列中出现同一核酸碱基(例如，A、T、C、G、U)或同一氨基酸残基(例如，Ala、Pro、Ser、Thr、Gly、Val、Leu、Ile、Phe、Tyr、Trp、Lys、Arg、His、Asp、Glu、Asn、Gln、Cys和Met)的位置数以得到匹配位置数，用匹配位置数除以比较窗口中的位置总数(即窗口大小)，并将结果乘以100而得到序列同一性百分比。包括与本文所述的任何参考序列具有至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸和多肽，通常其中在多肽的情况下，多肽变体保持参考多肽的至少一种生物活性。
如本文所用，“疫苗”是指用于产生用于预防和/或治疗疾病的免疫性的组合物。相应地，疫苗是包含抗原的药剂并且旨在在人类或动物中使用以在施用于人或动物之后产生特异性防御和保护物质。
如本文所用，“新抗原”是指一类肿瘤抗原，其由所表达蛋白中的肿瘤特异性突变产生。
2.载体、前体RNA和环状RNA
本文还提供了环状RNA、可环化成环状RNA的前体RNA和可转录成前体RNA或环状RNA的载体(例如DNA载体)。
在某些方面，本文提供了包含剪接后3'I组内含子片段、任选的第一间隔区、内部核糖体进入位点(IRES)、表达序列、任选的第二间隔区和剪接后5'I组内含子片段的环状RNA多核苷酸。在一些实施方案中，这些区域按所述顺序排列。在一些实施方案中，环状RNA通过本文提供的方法或由本文提供的载体制备。
在某些实施方案中，本文提供的载体(例如，包含5'双链体形成区、3'I组内含子片段、任选的第一间隔区、内部核糖体进入位点(IRES)、第一表达序列、编码裂解位点的多核苷酸序列、第二表达序列、任选的第二间隔区、5'I组内含子片段和3'双链体形成区)的转录导致形成能够环化的前体线性RNA多核苷酸。在一些实施方案中，当在鸟苷核苷酸或核苷(例如，GTP)和二价阳离子(例如，Mg2+)存在下孵育时，此前体线性RNA多核苷酸环化。
在一些实施方案中，本文提供的载体和前体RNA多核苷酸包含第一(5')双链体形成区和第二(3')双链体形成区。在某些实施方案中，第一和第二双链体形成区可形成完美或不完美的双链体。因此，在某些实施方案中，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的第一双链体形成区和第二双链体形成区可彼此碱基配对。在一些实施方案中，预测双链体形成区与RNA中的非预期序列(例如，非双链体形成区序列)的碱基配对小于50％(例如，小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％)。在一些实施方案中，在前体RNA链的末端包括此类双链体形成区并且邻近或非常靠近I组内含子片段使I组内含子片段彼此靠近，从而增加剪接效率。在一些实施方案中，双链体形成区的长度是3至100个核苷酸(例如，长度为3-75个核苷酸、长度为3-50个核苷酸、长度为20-50个核苷酸、长度为35-50个核苷酸、长度为5-25个核苷酸、长度为9-19个核苷酸)。在一些实施方案中，双链体形成区的长度是约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，双链体形成区具有约9至约50个核苷酸的长度。在一个实施方案中，双链体形成区具有约9至约19个核苷酸的长度。在一些实施方案中，双链体形成区具有约20至约40个核苷酸的长度。在某些实施方案中，双链体形成区具有约30个核苷酸的长度。
两种类型的间隔区已被设计用于改进前体RNA环化和/或来自环状RNA的基因表达。第一类型的间隔区是外部间隔区，即存在于前体RNA中但在环化后被除去。尽管不希望受理论束缚，但预期外部间隔区可通过维持核酶本身的结构并防止其他相邻序列元件干扰其折叠和功能来改进核酶介导的环化。第二类型的间隔区是内部间隔区，即存在于前体RNA中并保留在所得的环状RNA中。尽管不希望受理论束缚，但预期内部间隔区可通过维持核酶本身的结构并防止其他相邻序列元件、特别是相邻IRES和编码区干扰其折叠和功能来改进核酶介导的环化。还预期内部间隔区可通过防止相邻序列元件、特别是内含子元件与IRES内的序列杂交并抑制其折叠成其最优选和活性构象的能力来改进来自IRES的蛋白质表达。
在某些实施方案中，本文提供的载体、前体RNA和环状RNA包含第一(5')和/或第二(3')间隔区。在一些实施方案中，在3'I组内含子片段与IRES之间包括间隔区可通过防止它们相互作用来保护那些区域中的二级结构，从而提高剪接效率。在一些实施方案中，第一间隔区(在3'I组内含子片段与IRES之间)和第二间隔区(在表达序列与5'I组内含子片段之间)包含额外的碱基配对区，所述碱基配对区被预测为与彼此碱基配对而不是与第一和第二双链体形成区碱基配对。在一些实施方案中，这种间隔区碱基配对使I组内含子片段彼此靠近，从而进一步提高剪接效率。此外，在一些实施方案中，第一双链体形成区和第二双链体形成区之间的碱基配对的组合，以及单独地第一间隔区和第二间隔区之间的碱基配对的组合，促进剪接泡的形成，所述剪接泡含有侧接相邻碱基配对区域的I组内含子片段。典型的间隔区是具有一种或多种以下特性的连续序列：1)预计可避免干扰近端结构，例如IRES、表达序列或内含子；2)长度是至少7nt且不超过100nt；3)位于3'内含子片段之后且与其相邻和/或位于5'内含子片段之前且与其相邻；和4)含有以下中的一者或多者：a)至少5nt长的非结构化区域，b)至少5nt长的与远端序列(包括另一个间隔区)碱基配对的区域，和c)范围限制于间隔区序列的至少7nt长的结构化区域。间隔区可具有若干区域，包括非结构化区域、碱基配对区域、发夹/结构化区域以及它们的组合。在一个实施方案中，间隔区具有结构化区域，所述结构化区域具有高GC含量。在一个实施方案中，间隔区内的区域与同一间隔区内的另一区域碱基配对。在一个实施方案中，间隔区内的区域与另一个间隔区内的区域碱基配对。在一个实施方案中，间隔区包含一个或多个发夹结构。在一个实施方案中，间隔区包含一个或多个发夹结构，所述发夹结构具有4至12个核苷酸的茎和2至10个核苷酸的环。在一个实施方案中，在3'I组内含子片段与IRES之间存在额外的间隔区。在一个实施方案中，这个额外的间隔区防止IRES的结构化区域干扰3'I组内含子片段的折叠或降低这种情况发生的程度。在一些实施方案中，5’间隔区序列的长度是至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个核苷酸。在一些实施方案中，5’间隔区序列的长度不超过100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸。在一些实施方案中，5'间隔区序列的长度介于5与50、10与50、20与50、20与40、和/或25与35个核苷酸之间。在某些实施方案中，5'间隔区序列的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一个实施方案中，5'间隔区序列是多聚A序列。在另一个实施方案中，5'间隔区序列是多聚AC序列。在一个实施方案中，间隔区包含约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的多聚AC含量。在一个实施方案中，间隔区包含约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的多聚嘧啶(C/T或C/U)含量。
在某些实施方案中，3'I组内含子片段是与天然I组内含子的3'近端片段，包括3'剪接位点二核苷酸和任选的长度至少1nt(例如，长度至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30nt)和至多外显子的长度的相邻外显子序列至少75％同源(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源)的连续序列。通常，5'I组内含子片段是与天然I组内含子的5'近端片段，包括5'剪接位点二核苷酸和任选的长度至少1nt(例如，长度至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30nt)和至多外显子的长度的相邻外显子序列至少75％同源(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同源)的连续序列。如Umekage等人(2012)所描述，3'I组内含子片段和5'I组内含子片段的外部部分在环化中被除去，从而导致本文提供的环状RNA仅包含由长度至少1nt的任选外显子序列形成的3'I组内含子片段的部分和由长度至少1nt的任选外显子序列形成的5'I组内含子片段，如果此类序列存在于非环化前体RNA上。由环状RNA所保留的3'I组内含子片段的部分在本文中称为“剪接后3'I组内含子片段”。由环状RNA所保留的5'I组内含子片段的部分在本文中称为“剪接后5'I组内含子片段”。
在某些实施方案中，本文提供的载体、前体RNA和环状RNA包含内部核糖体进入位点(IRES)。包含IRES允许从环状RNA翻译一个或多个开放阅读框(例如，形成表达序列的开放阅读框)。IRES元件吸引真核核糖体翻译起始复合物并促进翻译起始。参见例如，Kaufman等人,Nuc.Acids Res.(1991)19:4485-4490；Gurtu等人,Biochem.Biophys.Res.Comm.(1996)229:295-298；Rees等人,BioTechniques(1996)20:102-110；Kobayashi等人,BioTechniques(1996)21:399-402；和Mosser et al.,BioTechniques 1997 22 150-161。
多种IRES序列可获得并且包括源自多种病毒的序列，如源自诸如脑心肌炎病毒(EMCV)UTR的小核糖核酸病毒的前导序列(Jang等人J.Virol.(1989)63:1651-1660)、脊髓灰质炎前导序列、甲型肝炎病毒前导序列、丙型肝炎病毒IRES、人鼻病毒2型IRES(Dobrikova等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(2003)100(25):15125-15130)、来自***病毒的IRES元件(Ramesh等人,Nucl.Acid Res.(1996)24:2697-2700)、贾第虫病毒IRES(Garlapati等人,J.Biol.Chem.(2004)279(5):3389-3397)等。
在一些实施方案中，IRES是以下病毒的IRES序列：桃拉综合征病毒、锥椿病毒、蒂勒脑脊髓炎病毒、猿猴病毒40、红火蚁病毒1、禾谷缢管蚜病毒、网状内皮增生病病毒、人脊髓灰质炎病毒1、斯氏珀蝽肠病毒、克什米尔蜜蜂病毒、人鼻病毒2、琉璃叶蝉病毒-1、人免疫缺陷病毒1型、Himetobi P病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、***病毒、人肠道病毒71、马鼻炎病毒、茶尺蠖微小RNA病毒样病毒、脑心肌炎病毒、果萧C病毒、人柯萨奇病毒B3、十字花科植物烟草花叶病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1、黑蜂王台病毒、蚜虫致死性麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒、急性蜜蜂麻痹病毒、木槿褪绿环斑病毒、猪瘟病毒、人FGF2、人SFTPA1、人AML1/RUNX1、果萧触角足、人AQP4、人AT1R、人BAG-1、人BCL2、人BiP、人c-IAPl、人c-myc、人eIF4G、小鼠NDST4L、人LEF1、小鼠HIF1α、人n.myc、小鼠Gtx、人p27kipl、人PDGF2/c-sis、人p53、人Pim-1、小鼠Rbm3、果萧reaper、犬Scamper、果萧Ubx、人UNR、小鼠UtrA、人VEGF-A、人XIAP、果萧无毛、酿酒酵母TFIID、酿酒酵母YAP1、烟草蚀纹病毒、芜菁皱缩病毒、EMCV-A、EMCV-B、EMCV-Bf、EMCV-Cf、EMCV pEC9、小双节RNA病毒、HCVQC64、人寇沙病毒E/D、人寇沙病毒F、人寇沙病毒JMY、鼻病毒NAT001、HRV14、HRV89、HRVC-02、HRV-A21、萨力病毒A SH1、萨力病毒FHB、萨力病毒NG-J1、人副肠孤病毒1、CrohivirusB、Yc-3、Rosavirus M-7、Shanbavirus A、Pasivirus A、Pasivirus A 2、艾柯病毒E14、人副肠孤病毒5、爱知病毒、甲型肝炎病毒HA16、Phopivirus、CVA10、肠道病毒C、肠道病毒D、肠道病毒J、人趋肝性病毒2、GBV-C GT110、GBV-C K1737、GBV-C Iowa、趋肝性病毒A 1220、PasivirusA 3、萨佩洛病毒、Rosavirus B、Bakunsa病毒、震颤病毒A、猪Pasivirus1、PLV-CHN、Pasivirus A、Sicinivirus、肝炎病毒K、肝炎病毒A、BVDV1、边界病病毒、BVDV2、CSFV-PK15C、SF573双顺反子病毒、湖北微小RNA病毒样病毒、CRPV、萨力病毒A BN5、萨力病毒ABN2、萨力病毒A 02394、萨力病毒A GUT、萨力病毒A CH、萨力病毒A SZ1、萨力病毒FHB、CVB3、CVB1、艾柯病毒7、CVB5、EVA71、CVA3、CVA12、EV24或eIF4G的适体。
为了驱动蛋白质表达，环状RNA包含可操作地连接至蛋白质编码序列的IRES。示例性IRES序列在以下表17中提供。在一些实施方案中，本文公开的环状RNA包含与表17中的IRES序列至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一的IRES序列。在一些实施方案中，本文公开的环状RNA包含表17中的IRES序列。本文公开了IRES和辅助序列的修饰以例如通过截短IRES的5'和/或3'端、向IRES的5'添加间隔区、对翻译起始位点5'的6个核苷酸(Kozak序列)进行修饰、替代翻译起始位点的修饰以及创建嵌合/杂合IRES序列增加或减少IRES活性。在一些实施方案中，本文公开的环状RNA中的IRES序列相对于天然IRES(例如，表17中公开的天然IRES)包含这些修饰中的一者或多者。
多种IRES序列可获得并且包括源自多种病毒的序列，如源自诸如脑心肌炎病毒(EMCV)UTR的小核糖核酸病毒的前导序列(Jang等人J.Virol.(1989)63:1651-1660)、脊髓灰质炎前导序列、甲型肝炎病毒前导序列、丙型肝炎病毒IRES、人鼻病毒2型IRES(Dobrikova等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(2003)100(25):15125-15130)、来自***病毒的IRES元件(Ramesh等人,Nucl.Acid Res.(1996)24:2697-2700)、贾第虫病毒IRES(Garlapati等人,J.Biol.Chem.(2004)279(5):3389-3397)等。
在一些实施方案中，IRES是以下病毒的IRES序列：桃拉综合征病毒、锥椿病毒、蒂勒脑脊髓炎病毒、猿猴病毒40、红火蚁病毒1、禾谷缢管蚜病毒、网状内皮增生病病毒、人脊髓灰质炎病毒1、斯氏珀蝽肠病毒、克什米尔蜜蜂病毒、人鼻病毒2、琉璃叶蝉病毒-1、人免疫缺陷病毒1型、Himetobi P病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、***病毒、人肠道病毒71、马鼻炎病毒、茶尺蠖微小RNA病毒样病毒、脑心肌炎病毒、果萧C病毒、人柯萨奇病毒B3、十字花科植物烟草花叶病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1、黑蜂王台病毒、蚜虫致死性麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒、急性蜜蜂麻痹病毒、木槿褪绿环斑病毒、猪瘟病毒、人FGF2、人SFTPA1、人AML1/RUNX1、果萧触角足、人AQP4、人AT1R、人BAG-1、人BCL2、人BiP、人c-IAPl、人c-myc、人eIF4G、小鼠NDST4L、人LEF1、小鼠HIF1α、人n.myc、小鼠Gtx、人p27kipl、人PDGF2/c-sis、人p53、人Pim-1、小鼠Rbm3、果萧reaper、犬Scamper、果萧Ubx、人UNR、小鼠UtrA、人VEGF-A、人XIAP、果萧无毛、酿酒酵母TFIID、酿酒酵母YAP1、烟草蚀纹病毒、芜菁皱缩病毒、EMCV-A、EMCV-B、EMCV-Bf、EMCV-Cf、EMCV pEC9、小双节RNA病毒、HCVQC64、人寇沙病毒E/D、人寇沙病毒F、人寇沙病毒JMY、鼻病毒NAT001、HRV14、HRV89、HRVC-02、HRV-A21、萨力病毒A SH1、萨力病毒FHB、萨力病毒NG-J1、人副肠孤病毒1、CrohivirusB、Yc-3、Rosavirus M-7、Shanbavirus A、Pasivirus A、Pasivirus A 2、艾柯病毒E14、人副肠孤病毒5、爱知病毒、甲型肝炎病毒HA16、Phopivirus、CVA10、肠道病毒C、肠道病毒D、肠道病毒J、人趋肝性病毒2、GBV-C GT110、GBV-C K1737、GBV-C Iowa、趋肝性病毒A 1220、PasivirusA 3、萨佩洛病毒、Rosavirus B、Bakunsa病毒、震颤病毒A、猪Pasivirus1、PLV-CHN、Pasivirus A、Sicinivirus、肝炎病毒K、肝炎病毒A、BVDV1、边界病病毒、BVDV2、CSFV-PK15C、SF573双顺反子病毒、湖北微小RNA病毒样病毒、CRPV、萨力病毒A BN5、萨力病毒ABN2、萨力病毒A 02394、萨力病毒A GUT、萨力病毒A CH、萨力病毒A SZ1、萨力病毒FHB、CVB3、CVB1、艾柯病毒7、CVB5、EVA71、CVA3、CVA12、EV24或eIF4G的适体。
在一些实施方案中，本文的多核苷酸包含多于一个表达序列。在一些实施方案中，环状RNA是双顺反子RNA。编码两种或更多种多肽的序列可通过核糖体跳跃元件或编码蛋白酶裂解位点的核苷酸序列隔开。在某些实施方案中，核糖体跳跃元件编码明脉扁刺蛾β四体病毒(thosea-asigna virus)2A肽(T2A)、猪捷申病毒-1 2A肽(P2A)、***病毒2A肽(F2A)、马鼻炎A病毒2A肽(E2A)、胞质型多角体病毒2A肽(BmCPV 2A)或家蚕软化病病毒2A肽(BmIFV 2A)。
在某些实施方案中，本文提供的载体包含3'UTR。在一些实施方案中，3'UTR来自人β珠蛋白、人α珠蛋白爪蟾β珠蛋白、爪蟾α珠蛋白、人催乳素、人GAP-43、人eEFlal、人Tau、人TNFα、登革热病毒、汉坦病毒小mRNA、布尼亚病毒小mRNA、芜菁黄花叶病毒、丙型肝炎病毒、风疹病毒、烟草花叶病毒、人IL-8、人肌动蛋白、人GAPDH、人微管蛋白、木槿褪绿环斑病毒(hibiscus chlorotic rinsgspot virus)、土拨鼠肝炎病毒翻译后调控元件、辛德毕斯病毒、芜菁皱缩病毒、烟草蚀纹病毒或委内瑞拉马脑炎病毒。
在一些实施方案中，本文提供的载体包含5'UTR。在一些实施方案中，5'UTR来自人β珠蛋白、非洲爪蟾β珠蛋白、人α珠蛋白、非洲爪蟾α珠蛋白、风疹病毒、烟草花叶病毒、小鼠Gtx、登革热病毒、热休克蛋白70kDa蛋白1A、烟草醇脱氢酶、烟草蚀纹病毒、芜菁皱缩病毒或腺病毒三联前导序列。
在一些实施方案中，本文提供的载体包含3'和/或5'I组内含子片段外部的多聚A区。在一些实施方案中，多聚A区是至少15、30或60个核苷酸长。在一些实施方案中，一个或两个多聚A区是15-50个核苷酸长。在一些实施方案中，一个或两个多聚A区是20-25个核苷酸长。多聚A序列在环化后被除去。因此，与多聚A序列杂交的寡核苷酸，如与固体表面(例如树脂)缀合的脱氧胸腺嘧啶寡核苷酸(oligo(dT))可用于使环状RNA与其前体RNA分离。其他序列也可设置在3'I组内含子片段的5'或5'I组内含子片段的3'，并且互补序列可类似地用于环状RNA纯化。
在一些实施方案中，本文提供的DNA(例如，载体)、线性RNA(例如，前体RNA)和/或环状RNA多核苷酸的长度介于300与15000、300与14000、300与13000、300与12000、300与11000、300与10000、400与9000、500与8000、600与7000、700与6000、800与5000、900与5000、1000与5000、1100与5000、1200与5000、1300与5000、1400与5000和/或1500与5000个核苷酸之间。在一些实施方案中，多核苷酸的长度是至少300nt、400nt、500nt、600nt、700nt、800nt、900nt、1000nt、1100nt、1200nt、1300nt、1400nt、1500nt、2000nt、2500nt、3000nt、3500nt、4000nt、4500nt、5000nt、6000nt、7000nt、8000nt、9000nt、10000nt、11000nt、12000nt、13000nt、14000nt或15000nt。在一些实施方案中，多核苷酸的长度不超过3000nt、3500nt、4000nt、4500nt、5000nt、6000nt、7000nt、8000nt、9000nt、10000nt、11000nt、12000nt、13000nt、14000nt、15000nt或16000nt。在一些实施方案中，本文提供的DNA、线性RNA和/或环状RNA多核苷酸的长度是约300nt、400nt、500nt、600nt、700nt、800nt、900nt、1000nt、1100nt、1200nt、1300nt、1400nt、1500nt、2000nt、2500nt、3000nt、3500nt、4000nt、4500nt、5000nt、6000nt、7000nt、8000nt、9000nt、10000nt、11000nt、12000nt、13000nt、14000nt或15000nt。
在一些实施方案中，本文提供了载体。在某些实施方案中，载体按以下顺序包含a)5'双链体形成区，b)3'I组内含子片段，c)任选的第一间隔区序列，d)IRES，e)第一表达序列，f)编码裂解位点的多核苷酸序列，g)第二表达序列，h)任选的第二间隔区序列，i)5'I组内含子片段，和g)3'双链体形成区。在一些实施方案中，载体包含位于5'双链体形成区上游的转录启动子。
在一些实施方案中，本文提供了载体。在某些实施方案中，载体按以下顺序包含a)5'双链体形成区，b)3'I组内含子片段，c)任选的第一间隔区序列，d)第一IRES，e)第一表达序列，f)第二IRES，g)第二表达序列，h)任选的第二间隔区序列，i)5'I组内含子片段，和g)3'双链体形成区。在一些实施方案中，载体包含位于5'双链体形成区上游的转录启动子。
在一些实施方案中，本文提供了前体RNA。在某些实施方案中，前体RNA是通过本文提供的载体的体外转录产生的线性RNA。在一些实施方案中，前体RNA按以下顺序包含a)任选的5'双链体形成区，b)3'I组内含子片段，c)任选的第一间隔区序列，d)IRES，e)第一表达序列，f)编码裂解位点的多核苷酸序列，g)第二表达序列，h)任选的第二间隔区序列，i)5'I组内含子片段，和j)任选的3'双链体形成区。在一些实施方案中，前体RNA按以下顺序包含a)5'双链体形成区，b)3'I组内含子片段，c)任选的第一间隔区序列，d)第一IRES，e)第一表达序列，f)第二IRES，g)第二表达序列，h)任选的第二间隔区序列，i)5'I组内含子片段，和j)3'双链体形成区。前体RNA可以是未经修饰的、部分经修饰的或完全经修饰的。
在某些实施方案中，本文提供了环状RNA。在某些实施方案中，环状RNA是由本文提供的载体产生的环状RNA。在一些实施方案中，环状RNA是通过本文提供的前体RNA的环化产生的环状RNA。在某些实施方案中，本文提供的载体的转录导致形成能够环化的前体线性RNA。在一些实施方案中，当在鸟苷核苷酸或核苷(例如，GTP)和二价阳离子(例如，Mg2+)存在下孵育时，此前体线性RNA多核苷酸环化。在一些实施方案中，环状RNA按以下顺序包含a)第一间隔区序列，b)IRES，c)第一表达序列，d)编码裂解位点的多核苷酸序列，e)第二表达序列，和f)第二间隔区序列。在一些实施方案中，环状RNA按以下顺序包含a)剪接后3'I组内含子片段，b)第一间隔区序列，c)IRES,d)第一表达序列，e)编码裂解位点的多核苷酸序列，f)第二表达序列，和g)第二间隔区序列，h)剪接后5'I组内含子片段。在一些实施方案中，环状RNA按以下顺序包含a)第一间隔区序列，b)第一IRES,c)第一表达序列，d)第二IRES，e)第二表达序列，和f)第二间隔区序列。在一些实施方案中，环状RNA还包含3'I组内含子片段的位于3'剪接位点的3'的部分。在一些实施方案中，环状RNA还包含5'I组内含子片段的位于5'剪接位点的5'的部分。在一些实施方案中，环状RNA的大小是至少500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、6000、7000、8000、9000、10000、11000、12000、13000、14000或15000个核苷酸。环状RNA可以是未经修饰的、部分经修饰的或完全经修饰的。
在一些实施方案中，本文提供的载体和前体RNA多核苷酸包含第一(5')双链体形成区和第二(3')双链体形成区。在某些实施方案中，第一同源区和第二同源区可形成完美或不完美的双链体。因此，在某些实施方案中，至少75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％的第一双链体形成区和第二双链体形成区可彼此碱基配对。在一些实施方案中，预测双链体形成区与RNA中的非预期序列(例如，非双链体形成区序列)的碱基配对小于50％(例如，小于45％、小于40％、小于35％、小于30％、小于25％)。在一些实施方案中，在前体RNA链的末端包括此类双链体形成区并且邻近或非常靠近I组内含子片段使I组内含子片段彼此靠近，从而增加剪接效率。在一些实施方案中，双链体形成区的长度是3至100个核苷酸(例如，长度为3-75个核苷酸、长度为3-50个核苷酸、长度为20-50个核苷酸、长度为35-50个核苷酸、长度为5-25个核苷酸、长度为9-19个核苷酸)。在一些实施方案中，双链体形成区的长度是约3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，双链体形成区具有约9至约50个核苷酸的长度。在一个实施方案中，双链体形成区具有约9至约19个核苷酸的长度。在一些实施方案中，双链体形成区具有约20至约40个核苷酸的长度。在某些实施方案中，双链体形成区具有约30个核苷酸的长度。
在一些实施方案中，与包含相同表达序列的mRNA相比，本文提供的环状RNA具有更高的功能稳定性。在一些实施方案中，与包含相同表达序列、5moU修饰、优化的UTR、帽和/或多聚A尾的mRNA相比，本文提供的环状RNA具有更高的功能稳定性。
在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸具有至少5小时、10小时、15小时、20小时、30小时、40小时、50小时、60小时、70小时或80小时的功能性半衰期。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸具有5-80、10-70、15-60和/或20-50小时的功能性半衰期。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸的功能性半衰期大于(例如，至少1.5倍，至少2倍)编码相同蛋白质的等效线性RNA多核苷酸的功能性半衰期。在一些实施方案中，功能性半衰期可通过检测功能性蛋白质合成来评估。
在某些实施方案中，本文提供的载体、前体RNA和环状RNA包含第一(5')和/或第二(3')间隔区。在一些实施方案中，在3'I组内含子片段与IRES之间包括间隔区可通过防止它们相互作用来保护那些区域中的二级结构，从而提高剪接效率。在一些实施方案中，第一间隔区(在3'I组内含子片段与IRES之间)和第二间隔区(在两个表达序列与5'I组内含子片段之间)包含额外的碱基配对区，所述碱基配对区被预测为与彼此碱基配对而不是与第一和第二双链体形成区碱基配对。在其它实施方案中，第一间隔区(在3'I组内含子片段与IRES之间)和第二间隔区(在表达序列中的一个与5'I组内含子片段之间)包含额外的碱基配对区，所述碱基配对区被预测为与彼此碱基配对而不是与第一和第二双链体形成区碱基配对。在一些实施方案中，这种间隔区碱基配对使I组内含子片段彼此靠近，从而进一步提高剪接效率。此外，在一些实施方案中，第一双链体形成区和第二双链体形成区之间的碱基配对的组合，以及单独地第一间隔区和第二间隔区之间的碱基配对的组合，促进剪接泡的形成，所述剪接泡含有侧接相邻碱基配对区域的I组内含子片段。典型的间隔区是具有一种或多种以下特性的连续序列：1)预计可避免干扰近端结构，例如IRES、表达序列或内含子；2)长度是至少7nt且不超过100nt；3)位于3'内含子片段之后且与其相邻和/或位于5'内含子片段之前且与其相邻；和4)含有以下中的一者或多者：a)至少5nt长的非结构化区域，b)至少5nt长的与远端序列(包括另一个间隔区)碱基配对的区域，和c)范围限制于间隔区序列的至少7nt长的结构化区域。间隔区可具有若干区域，包括非结构化区域、碱基配对区域、发夹/结构化区域以及它们的组合。在一个实施方案中，间隔区具有结构化区域，所述结构化区域具有高GC含量。在一个实施方案中，间隔区内的区域与同一间隔区内的另一区域碱基配对。在一个实施方案中，间隔区内的区域与另一个间隔区内的区域碱基配对。在一个实施方案中，间隔区包含一个或多个发夹结构。在一个实施方案中，间隔区包含一个或多个发夹结构，所述发夹结构具有4至12个核苷酸的茎和2至10个核苷酸的环。在一个实施方案中，在3'I组内含子片段与IRES之间存在额外的间隔区。在一个实施方案中，这个额外的间隔区防止IRES的结构化区域干扰3'I组内含子片段的折叠或降低这种情况发生的程度。在一些实施方案中，5’间隔区序列的长度是至少7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25或30个核苷酸。在一些实施方案中，5’间隔区序列的长度不超过100、90、80、70、60、50、45、40、35或30个核苷酸。在一些实施方案中，5'间隔区序列的长度介于5与50、10与50、20与50、20与40、和/或25与35个核苷酸之间。在某些实施方案中，5'间隔区序列的长度是10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一个实施方案中，5'间隔区序列是多聚A序列。在另一个实施方案中，5'间隔区序列是多聚AC序列。在一个实施方案中，间隔区包含约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的多聚AC含量。在一个实施方案中，间隔区包含约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％的多聚嘧啶(C/T或C/U)含量。
在某些实施方案中，3'I组内含子片段是与天然I组内含子的3'近端片段，包括3'剪接位点二核苷酸和任选的长度至少1nt(例如，长度至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30nt)和至多外显子的长度的相邻外显子序列至少75％同一(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一)的连续序列。通常，5'I组内含子片段是与天然I组内含子的5'近端片段，包括5'剪接位点二核苷酸和任选的长度至少1nt(例如，长度至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25或30nt)和至多外显子的长度的相邻外显子序列至少75％同一(例如，至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一)的连续序列。如Umekage等人(2012)所描述，3'I组内含子片段和5'I组内含子片段的外部部分在环化中被除去，从而导致本文提供的环状RNA仅包含由长度至少1nt的任选外显子序列形成的3'I组内含子片段的部分和由长度至少1nt的任选外显子序列形成的5'I组内含子片段，如果此类序列存在于非环化前体RNA上。由环状RNA所保留的3'I组内含子片段的部分在本文中称为剪接后3'I组内含子片段。由环状RNA所保留的5'I组内含子片段的部分在本文中称为剪接后5'I组内含子片段。
在一些实施方案中，本文提供的环状RNA可具有比等效线性mRNA更高的表达量值，例如，在向细胞施用RNA后24小时具有更高的表达量值。在一些实施方案中，与包含相同表达序列、5moU修饰、优化的UTR、帽和/或多聚A尾的mRNA相比，本文提供的环状RNA具有更高的表达量值。
在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸具有至少5小时、10小时、15小时、20小时、30小时、40小时、50小时、60小时、70小时或80小时的功能性半衰期。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸具有5-80、10-70、15-60和/或20-50小时的功能性半衰期。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸的功能性半衰期大于(例如，至少1.5倍，至少2倍)编码相同蛋白质的等效线性RNA多核苷酸的功能性半衰期。在一些实施方案中，功能性半衰期可通过检测功能性蛋白质合成来评估。
在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸具有至少5小时、10小时、15小时、20小时、30小时、40小时、50小时、60小时、70小时或80小时的半衰期。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸具有5-80、10-70、15-60和/或20-50小时的半衰期。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸的半衰期大于(例如，至少1.5倍，至少2倍)编码相同蛋白质的等效线性RNA多核苷酸的半衰期。在一些实施方案中，环状RNA多核苷酸或其药物组合物在人细胞中的功能性半衰期大于或等于预定阈值的功能性半衰期。在一些实施方案中，功能性半衰期由功能性蛋白质测定确定。例如，在一些实施方案中，功能性半衰期通过体外萦光素酶测定来确定，其中在1、2、3、4、5、6、7或14天内每1、2、6、12或24小时在表达环状RNA多核苷酸的人细胞(例如HepG2)的培养基中测量高斯萦光素酶(GLuc)的活性。在其他实施方案中，功能性半衰期通过体内测定来确定，其中在1、2、3、4、5、6、7或14天内每1、2、6、12或24小时在患者血清或组织样品中测量由环状RNA多核苷酸的表达序列编码的蛋白质的水平。在一些实施方案中，预定阈值是与环状RNA多核苷酸包含相同表达序列的参考线性RNA多核苷酸的功能性半衰期。
在一些实施方案中，本文提供的环状RNA可具有比等效线性mRNA更高的表达量值，例如，在向细胞施用RNA后24小时具有更高的表达量值。在一些实施方案中，与包含相同表达序列、5moU修饰、优化的UTR、帽和/或多聚A尾的mRNA相比，本文提供的环状RNA具有更高的表达量值。
在一些实施方案中，当暴露于生物体的免疫***或某种类型的免疫细胞时，本文提供的环状RNA的免疫原性可低于等效mRNA。在一些实施方案中，当暴露于生物体的免疫***或某种类型的免疫细胞时，本文提供的环状RNA与细胞因子的调节产生相关。例如，在一些实施方案中，与包含相同表达序列的mRNA相比，当暴露于生物体的免疫***或某种类型的免疫细胞时，本文提供的环状RNA与TNFα、RIG-I、IL-2、IL-6、IFNγ和/或1型干扰素，例如IFN-β1的产生减少相关。在一些实施方案中，与包含相同表达序列的mRNA相比，当暴露于生物体的免疫***或某种类型的免疫细胞时，本文提供的环状RNA与更少TNFα、RIG-I、IL-2、IL-6、IFNγ和/或1型干扰素，例如IFN-β1转录诱导相关。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA的免疫原性低于包含相同表达序列的mRNA。在一些实施方案中，本文提供的环状RNA的免疫原性低于包含相同表达序列、5moU修饰、优化的UTR、帽和/或多聚A尾的mRNA。
在一些实施方案中，在不需要核苷修饰的情况下，本文所述的组合物和方法为RNA(例如circRNA)提供比等效线性RNA更高的稳定性或功能稳定性。在一些实施方案中，由于败育转录减少，与用于产生含有核苷修饰的RNA的方法相比，用于产生缺乏核苷修饰的RNA的方法产生更高百分比的全长转录物。在一些实施方案中，本文所述的组合物和方法能够产生大型(例如5kb、6kb、7kb、8kb、9kb、10kb、11kb、12kb、13kb、14kb或15kb)RNA构建体，而不添加与含有核苷修饰的RNA相关的败育转录。
在某些实施方案中，本文提供的环状RNA可按原样转染到细胞中，或者可以DNA载体形式转染并在细胞中转录。从转染的DNA载体转录环状RNA可通过添加的聚合酶或由转染到细胞中的核酸编码的聚合酶、或优选通过内源性聚合酶进行。
在某些实施方案中，本文提供的环状RNA多核苷酸包含经修饰的RNA核苷酸和/或经修饰的核苷。在一些实施方案中，经修饰的核苷是m5C(5-甲基胞苷)。在另一个实施方案中，经修饰的核苷是m5U(5-甲基尿苷)。在另一个实施方案中，经修饰的核苷是m6A(N6-甲基腺苷)。在另一个实施方案中，经修饰的核苷是s2U(2-硫代尿苷)。在另一个实施方案中，经修饰的核苷是Ψ(假尿苷)。在另一个实施方案中，经修饰的核苷是Um(2'-O-甲基尿苷)。在其他实施方案中，经修饰的核苷是m1A(1-甲基腺苷)；m2A(2-甲基腺苷)；Am(2’-O-甲基腺苷)；ms2m6A(2-甲硫基-N6-甲基腺苷)；i6A(N6-异戊烯基腺苷)；ms2i6A(2-甲硫基-N6异戊烯基腺苷)；io6A(N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷)；ms2io6A(2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷)；g6A(N6-甘氨酰氨基甲酰基腺苷)；t6A(N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷)；ms2t6A(2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷)；m6t6A(N6-甲基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷)；hn6A(N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰基腺苷)；ms2hn6A(2-甲硫基-N6-羟基正缬氨酰氨基甲酰基腺苷)；Ar(p)(2’-O-核糖基腺苷(磷酸))；I(肌苷)；m1I(1-甲基肌苷)；m1Im(1,2’-O-二甲基肌苷)；m3C(3-甲基胞苷)；Cm(2’-O-甲基胞苷)；s2C(2-硫代胞苷)；ac4C(N4-乙酰基胞苷)；f5C(5-甲酰基胞苷)；m5Cm(5,2′-O-二甲基胞苷)；ac4Cm(N4-乙酰基-2'-O-甲基胞苷)；k2C(赖氨酸)；m1G(1-甲基鸟苷)；m2G(N2-甲基鸟苷)；m7G(7-甲基鸟苷)；Gm(2′-O-甲基鸟苷)；m2 2G(N2,N2-二甲基鸟苷)；m2Gm(N2,2’-二甲基鸟苷)；m2 2Gm(N2,N2,2’-O-三甲基鸟苷)；Gr(p)(2’-O-核糖基鸟苷(磷酸))；yW(怀丁苷)；o2yW(过氧怀丁苷)；OHyW(羟基怀丁苷)；OHyW*(修饰不足的羟基怀丁苷)；imG(怀俄苷)；mimG(甲基怀俄苷)；Q(辫苷)；oQ(环氧辫苷)；galQ(半乳糖基-辫苷)；manQ(甘露糖基-辫苷)；preQ0(7-氰基-7-脱氮鸟苷)；preQ1(7-氨基甲基-7-脱氮鸟苷)；G+(古嘌苷)；D(二氢尿苷)；m5Um(5,2’-O-二甲基尿苷)；s4U(4-硫代尿苷)；m5s2U(5-甲基-2-硫代尿苷)；s2Um(2-硫代-2'-O-甲基尿苷)；acp3U(3-(3-氨基-3-羧丙基)尿苷)；ho5U(5-羟基尿苷)；mo5U(5-甲氧基尿苷)；cmo5U(尿苷5-羟乙酸)；mcmo5U(尿苷5-羟乙酸甲酯)；chm5U(5-(羧基羟甲基)尿苷))；mchm5U(5-(羧基羟甲基)尿苷甲酯)；mcm5U(5-甲氧基羰基甲基尿苷)；mcm5Um(5-甲氧基羰基甲基-2'-O-甲基尿苷)；mcm5s2U(5-甲氧基羰基甲基-2-硫代尿苷)；nm5S2U(5-氨基甲基-2-硫代尿苷)；mnm5U(5-甲基氨基甲基尿苷)；mnm5s2U(5-甲基氨基甲基-2-硫代尿苷)；mnm5se2U(5-甲基氨基甲基-2-硒代尿苷)；ncm5U(5-氨基甲酰基甲基尿苷)；ncm5Um(5-氨基甲酰基甲基-2'-O-甲基尿苷)；cmnm5U(5-羧甲基氨基甲基尿苷)；cmnm5Um(5-羧甲基氨基甲基-2'-O-甲基尿苷)；cmnm5s2U(5-羧甲基氨基甲基-2-硫代尿苷)；m6 2A(N6,N6-二甲基腺苷)；Im(2'-O-甲基肌苷)；m4C(N4-甲基胞苷)；m4Cm(N4,2’-O-二甲基胞苷)；hm5C(5-羟甲基胞苷)；m3U(3-甲基尿苷)；cm5U(5-羧甲基尿苷)；m6Am(N6,2’-O-二甲基腺苷)；m6 2Am(N6,N6,O-2’-三甲基腺苷)；m2,7G(N2,7-二甲基鸟苷)；m2,2,7G(N2,N2,7-三甲基鸟苷)；m3Um(3,2’-O-二甲基尿苷)；m5D(5-甲基二氢尿苷)；f5Cm(5-甲酰基-2'-O-甲基胞苷)；m1Gm(1,2’-O-二甲基鸟苷)；m1Am(1,2’-O-二甲基腺苷)；τm 5U(5-牛磺酸甲基尿苷)；τm5s2U(5-牛磺酸甲基-2-硫代尿苷))；imG-14(4-脱甲基怀俄苷)；imG2(异怀俄苷)；或ac6A(N6-乙酰基腺苷)。
在一些实施方案中，经修饰的核苷可包括选自下组的化合物：吡啶-4-酮核糖核苷、5-氮杂-尿苷、2-硫代-5-氮杂-尿苷、2-硫代尿苷、4-硫代假尿苷、2-硫代-假尿苷、5-羟基尿苷、3-甲基尿苷、5-羧甲基-尿苷、1-羧甲基-假尿苷、5-丙炔基-尿苷、1-丙炔基-假尿苷、5-牛磺酸甲基尿苷、1-牛磺酸甲基-假尿苷、5-牛磺酸甲基-2-硫代-尿苷、1-牛磺酸甲基-4-硫代-尿苷、5-甲基-尿苷、1-甲基假尿苷、4-硫代-1-甲基-假尿苷、2-硫代-1-甲基-假尿苷、1-甲基-1-脱氮-假尿苷、2-硫代-1-甲基-1-脱氮-假尿苷、二氢尿苷、二氢假尿苷、2-硫代-二氢尿苷、2-硫代-二氢假尿苷、2-甲氧基尿苷、2-甲氧基-4-硫代-尿苷、4-甲氧基-假尿苷、4-甲氧基-2-硫代-假尿苷、5-氮杂-胞苷、假异胞苷、3-甲基-胞苷、N4-乙酰基胞苷、5-甲酰基胞苷、N4-甲基胞苷、5-羟甲基胞苷、1-甲基假异胞苷、吡咯并-胞苷、吡咯并-假异胞苷、2-硫代-胞苷、2-硫代-5-甲基-胞苷、4-硫代-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-假异胞苷、4-硫代-1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、1-甲基-1-脱氮-假异胞苷、泽布拉恩、5-氮杂-泽布拉恩、5-甲基-泽布拉恩、5-氮杂-2-硫代-泽布拉恩、2-硫代-泽布拉恩、2-甲氧基-胞苷、2-甲氧基-5-甲基-胞苷、4-甲氧基-假异胞苷、4-甲氧基-1-甲基-假异胞苷、2-氨基嘌呤、2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-腺嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-腺嘌呤、7-脱氮-2-氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2-氨基嘌呤、7-脱氮-2,6-二氨基嘌呤、7-脱氮-8-氮杂-2,6-二氨基嘌呤、1-甲基腺苷、N6-甲基腺苷、N6-异戊烯基腺苷、N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、2-甲硫基-N6-(顺式-羟基异戊烯基)腺苷、N6-甘氨酰氨基甲酰基腺苷、N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、2-甲硫基-N6-苏氨酰氨基甲酰基腺苷、N6,N6-二甲基腺苷、7-甲基腺嘌呤、2-甲硫基-腺嘌呤、2-甲氧基-腺嘌呤、肌苷、1-甲基-肌苷、怀俄苷、怀丁苷、7-脱氮-鸟苷、7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、6-硫代-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-鸟苷、6-硫代-7-脱氮-8-氮杂-鸟苷、7-甲基-鸟苷、6-硫代-7-甲基-鸟苷、7-甲基肌苷、6-甲氧基-鸟苷、1-甲基鸟苷、N2-甲基鸟苷、N2,N2-二甲基鸟苷、8-氧代-鸟苷、7-甲基-8-氧代-鸟苷、1-甲基-6-硫代-鸟苷、N2-甲基-6-硫代-鸟苷和N2,N2-二甲基-6-硫代-鸟苷。在另一个实施方案中，修饰独立地选自由以下组成的组：5-甲基胞嘧啶、假尿苷和1-甲基假尿苷。
在一些实施方案中，经修饰的核糖核苷包括5-甲基胞苷、5-甲氧基尿苷、1-甲基-假尿苷、N6-甲基腺苷和/或假尿苷。在一些实施方案中，此类经修饰的核苷提供额外的稳定性和对免疫激活的抗性。
在特定实施方案中，多核苷酸可以是密码子优化的。密码子优化的序列可以是这样的序列，其中编码多肽的多核苷酸中的密码子已被取代以增加多肽的表达、稳定性和/或活性。影响密码子优化的因素包括但不限于以下中的一者或多者：(i)两个或更多个生物体或基因或合成构建的偏倚表之间的密码子偏倚的变化，(ii)生物体内、基因或一组基因内的密码子偏倚程度的变化，(iii)密码子(包括背景)的***变异，(iv)根据其解码tRNA的密码子变异，(v)根据GC％的密码子变异，无论是整体还是在三联体的一个位置中，(vi)与参考序列(例如天然存在的序列)相似度的变化，(vii)密码子频率截止的变化，(viii)从DNA序列转录的mRNA的结构性质，(ix)关于密码子取代组的设计所基于的DNA序列的功能的先前了解，和/或(x)每个氨基酸的密码子组的***变异。在一些实施方案中，密码子优化的多核苷酸可最小化核酶碰撞和/或限制表达序列与IRES之间的结构干扰。
在某些实施方案中，本文提供的环状RNA在细胞内部产生。在一些实施方案中，前体RNA在细胞质中由噬菌体RNA聚合酶或在细胞核中由宿主RNA聚合酶II使用DNA模板(例如，在一些实施方案中，使用本文提供的载体)转录、然后环化。
在某些实施方案中，将本文提供的环状RNA注射到动物(例如，人)中，以使得由环状RNA分子编码的多肽在动物体内表达。
3.有效负载
在一些实施方案中，第一表达序列编码治疗性蛋白质。在一些实施方案中，第二表达序列编码治疗性蛋白质。在一些实施方案中，治疗性蛋白质中的一者或两者选自以下表中所列的蛋白质。
Figure BDA0003951010620000811
Figure BDA0003951010620000821
Figure BDA0003951010620000831
Figure BDA0003951010620000841
Figure BDA0003951010620000851
Figure BDA0003951010620000861
Figure BDA0003951010620000871
Figure BDA0003951010620000881
Figure BDA0003951010620000891
Figure BDA0003951010620000901
Figure BDA0003951010620000911
Figure BDA0003951010620000921
在一些实施方案中，表达序列中的至少一个编码治疗性蛋白质。在一些实施方案中，第一或第二表达序列编码细胞因子，例如，IL-12p70、IL-15、IL-2、IL-18、IL-21、IFN-α、IFN-β、IL-10、TGF-β、IL-4或IL-35，或其功能片段。在一些实施方案中，第一或第二表达序列编码免疫检查点抑制剂。在一些实施方案中，第一或第二表达序列编码激动剂(例如，TNFR家族成员，如CD137L、OX40L、ICOSL、LIGHT或CD70)。在一些实施方案中，第一或第二表达序列编码嵌合抗原受体。在一些实施方案中，第一或第二表达序列编码抑制性受体激动剂(例如，PDL1、PDL2、半乳糖凝集素-9、VISTA、B7H4或MHCII)或抑制性受体(例如，PD1、CTLA4、TIGIT、LAG3或TIM3)。在一些实施方案中，第一或第二表达序列编码抑制性受体拮抗剂。在一些实施方案中，第一或第二表达序列编码一个或多个TCR链(α和β链或γ和δ链)。在一些实施方案中，第一或第二表达序列编码分泌的T细胞或免疫细胞衔接器(例如，靶向例如CD3、CD137或CD28和肿瘤表达的蛋白质例如CD19、CD20或BCMA等的双特异性抗体如BiTE)。在一些实施方案中，第一或第二表达序列编码转录因子(例如，FOXP3、HELIOS、TOX1或TOX2)。在一些实施方案中，第一或第二表达序列编码免疫抑制酶(例如，IDO或CD39/CD73)。在一些实施方案中，第一或第二表达序列编码GvHD(例如，抗HLA-A2 CAR-Treg)。
在一些实施方案中，第一和第二表达序列编码T细胞受体(TCR)的α链和β链。在一些实施方案中，第一和第二表达序列编码TCR的γ链和δ链。本发明包括治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包含编码TCRα链和TCRβ链或TCRγ链和TCRδ链的环状RNA多核苷酸的组合物。
在一些实施方案中，第一和第二表达序列编码嵌合抗原受体(CAR)和PD1或PDL1的拮抗剂。在一些实施方案中，第一和第二表达序列编码嵌合抗原受体(CAR)和细胞因子。在一些实施方案中，细胞因子是IL-12p70、IL-15、IL-2、IL-18、IL-21、IFN-α、IFN-β、IL-10、TGF-β、IL-4或IL-35，或其功能片段。本发明包括治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包含编码CAR和PD1或PDL1的拮抗剂的环状RNA多核苷酸的组合物。本发明包括治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包含编码CAR和细胞因子的环状RNA多核苷酸的组合物。
在一些实施方案中，第一和第二表达序列编码转录因子和细胞因子。在一些实施方案中，转录因子是FOXP3、STAT5B或HELIOS，并且细胞因子是IL10、IL12或TGFβ。本发明包括治疗患有自身免疫性病症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包含编码转录因子(例如，FOXP3)和细胞因子的环状RNA多核苷酸的组合物。
在一些实施方案中，第一和第二表达序列编码转录因子和CAR。在一些实施方案中，转录因子是FOXP3、STAT5B或HELIOS。本发明包括治疗患有自身免疫性病症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包含编码转录因子(例如，FOXP3)和CAR的环状RNA多核苷酸的组合物。
在一些实施方案中，第一和第二表达序列编码细胞因子和抗原。在一些实施方案中，细胞因子是IFNγ。在一些实施方案中，抗原是新抗原。本发明包括治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包含编码细胞因子(例如，IFNγ)和肿瘤抗原或其片段的环状RNA多核苷酸的组合物。
在一些实施方案中，第一表达序列编码第一嵌合抗原受体(CAR)，并且第二表达序列编码第二CAR。在一些实施方案中，第一CAR对第一抗原具有特异性并含有共刺激结构域和细胞内信号传导结构域，并且第二CAR对第二抗原具有特异性并含有共刺激结构域和细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，表达靶向多种肿瘤抗原的CAR提供针对具有异质抗原表达的肿瘤的更有效的治疗。本发明包括治疗患有癌症的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的包含编码第一CAR和第二CAR的环状RNA多核苷酸的组合物。
在一些实施方案中，第一表达序列编码第一细胞因子，并且第二表达序列编码第二细胞因子。在一些实施方案中，第一和第二细胞因子属于组IL-10、TGFβ和IL-35。在一些实施方案中，第一和第二细胞因子属于组IFNγ、IL-2、IL-7、IL-15和IL-18。
在一些实施方案中，多核苷酸编码由亚基组成的蛋白质，所述亚基由多于一个基因编码。例如，蛋白质可以是异二聚体，其中蛋白质的每个链或亚基由单独基因编码。有可能在转移媒介物中递送多于一个circRNA分子，并且每个circRNA编码蛋白质的单独亚基。可替代地，单一circRNA可被工程化以编码多于一个亚基。在某些实施方案中，可在单独转移媒介物中施用编码单独亚基的单独circRNA分子。
3.1细胞因子
IL-2、IL-7、IL-10、IL-12、IL-15、IL-18、IL-27β、IFNγ和/或TGFβ1的描述和/或氨基酸序列在本文和www.uniprot.org数据库在以下登录号下提供：P60568(IL-2)、P29459(IL-12A)、P29460(IL-12B)、P13232(IL-7)、P22301(IL-10)、P40933(IL-15)、Q14116(IL-18)、Q14213(IL-27β)、P01579(IFNγ)和/或P01137(TGFβ1)。
3.2PD-1和PD-L1拮抗剂
在一些实施方案中，PD-1抑制剂是派姆单抗、匹地利珠单抗或纳武单抗。在一些实施方案中，纳武单抗描述于国际专利公布号WO2006/121168中。在一些实施方案中，派姆单抗描述于W02009/114335中。在一些实施方案中，匹地利珠单抗描述于国际专利公布号WO2009/101611中。另外的抗PD1抗体描述于美国专利号8,609,089、美国专利公布号US2010028330和US 20120114649以及国际专利公布号WO2010/027827和WO2011/066342中。
在一些实施方案中，PD-L1抑制剂是阿特珠单抗、阿维鲁单抗、德瓦鲁单抗、BMS-936559或CK-301。
PD-1和/或PD-L1抗体的重链和轻链的描述和/或氨基酸序列在本文和www.drugbank.ca数据库中在以下登录号下提供：DB09037(派姆单抗)、DB09035(纳武单抗)、DB15383(匹地利珠单抗)、DB11595(阿特珠单抗)、DB11945(阿维鲁单抗)和DB11714(德瓦鲁单抗)。
3.3嵌合抗原受体
嵌合抗原受体(CAR或CAR-T)是遗传工程化受体。这些工程化受体可通过如本文所述的环状RNA***免疫细胞(包括T细胞)中并由所述免疫细胞表达。对于CAR，可对单个受体进行编程以识别特定抗原，并在与所述抗原结合时激活免疫细胞以攻击并破坏带有所述抗原的细胞。当这些抗原存在于肿瘤细胞上时，表达CAR的免疫细胞可靶向并杀死肿瘤细胞。在一些实施方案中，由多核苷酸编码的CAR包含(i)特异性地结合至靶抗原的抗原结合分子，(ii)铰链结构域、跨膜结构域和细胞内结构域，和(iii)激活结构域。
在一些实施方案中，根据本公开的CAR的取向包含与共刺激结构域和激活结构域串联的抗原结合结构域(如scFv)。共刺激结构域可包含细胞外部分、跨膜部分和细胞内部分中的一者或多者。在其他实施方案中，可串联使用多个共刺激结构域。
抗原结合结构域
通过并入与所述靶向抗原相互作用的抗原结合分子，可将CAR工程化为与抗原(例如细胞表面抗原)结合。在一些实施方案中，抗原结合分子是其抗体片段，例如一个或多个单链抗体片段(scFv)。scFv是具有连接在一起的抗体重链和轻链的可变区的单链抗体片段。参见例如，美国专利第7,741,465号和第6,319,494号以及Eshhar等人,Cancer ImmunolImmunotherapy(1997)45:131-136。scFv保留亲本抗体与靶抗原特异性相互作用的能力。scFv可用于嵌合抗原受体中，因为它们可工程化为与其他CAR组分一起作为单链的一部分表达。同上。还参见Krause等人,J.Exp.Med.,第188卷,第4期,1998(619-626)；Finney等人,Journal of Immunology,1998,161:2791-2797。应当理解，抗原结合分子通常包含在CAR的细胞外部分内，使得它能够识别并结合至目标抗原。双特异性和多特异性CAR涵盖在本发明的范围内，对多于一个目标靶标具有特异性。
在一些实施方案中，抗原结合分子包含单链，其中重链可变区和轻链可变区通过接头连接。在一些实施方案中，VH位于接头的N端，并且VL位于接头的C端。在其他实施方案中，VL位于接头的N端，并且VH位于接头的C端。在一些实施方案中，接头包含至少约5、至少约8、至少约10、至少约13、至少约15、至少约18、至少约20、至少约25、至少约30、至少约35、至少约40、至少约45、至少约50、至少约60、至少约70、至少约80、至少约90或至少约100个氨基酸。
在一些实施方案中，抗原结合分子包含纳米抗体。在一些实施方案中，抗原结合分子包含DARPin。在一些实施方案中，抗原结合分子包含能够特异性结合至靶蛋白的抗运载蛋白或其他合成蛋白。
在一些实施方案中，CAR包含对选自下组的抗原具有特异性的抗原结合结构域：CD19、CD123、CD22、CD30、CD171、CS-1、C-型凝集素样分子-1、CD33、表皮生长因子受体变体III(EGFRvIII)、神经节苷脂G2(GD2)、神经节苷脂GD3、TNF受体家族成员B细胞成熟(BCMA)、Tn抗原((Tn Ag)或(GaINAca-Ser/Thr))、***特异性膜抗原(PSMA)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、Fms样酪氨酸激酶3(FLT3)、肿瘤相关糖蛋白72(TAG72)、CD38、CD44v6、癌胚抗原(CEA)、上皮细胞粘附分子(EPCAM)、B7H3(CD276)、KIT(CD117)、白细胞介素-13受体亚基α-2、间皮素、白细胞介素11受体α(IL-11Ra)、***干细胞抗原(PSCA)、蛋白酶丝氨酸21、血管内皮生长因子受体2(VEGFR2)、Lewis(Y)抗原、CD24、血小板源性生长因子受体β(PDGFR-β)、阶段特异性胚胎抗原4(SSEA-4)、CD20、叶酸受体α、HER2、HER3、粘蛋白1、细胞表面相关(MUC1)、表皮生长因子受体(EGFR)、神经细胞粘附分子(NCAM)、***酶、***酸性磷酸酶(PAP)、延伸因子2突变型(ELF2M)、肝配蛋白B2、成纤维细胞活化蛋白α(FAP)、***1受体(IGF-I受体)、碳酸酐酶IX(CAIX)、蛋白酶体(前体，巨蛋白因子)亚基β型9(LMP2)、糖蛋白100(gp100)、由断裂点簇区(BCR)和艾贝尔森鼠白血病病毒致癌基因同系物1(Ab1)组成的致癌基因融合蛋白(bcr-ab1)、酪氨酸酶、肝配蛋白A型受体2(EphA2)、岩藻糖基GM1、唾液酸化路易斯粘附分子(sLe)、神经节苷脂GM3、转谷氨酰胺酶5(TGS5)、高分子量黑素瘤相关抗原(HMWMAA)、o-乙酰基-GD2神经节苷脂(OAcGD2)、叶酸受体β、肿瘤内皮标志物1(TEM1/CD248)、肿瘤内皮标志物7相关(TEM7R)、紧密连接蛋白6(CLDN6)、促甲状腺激素受体(TSHR)、G蛋白偶联受体C类5组成员D(GPRC5D)、染色体X开放阅读框61(CXORF61)、CD97、CD179a、间变性淋巴瘤激酶(ALK)、聚唾液酸、胎盘特异性1(PLAC1)、globoH甘神经酰胺(GloboH)的六糖部分、乳腺分化抗原(NY-BR-1)、尿溶蛋白2(UPK2)、甲型肝炎病毒细胞受体1(HAVCR1)、肾上腺素受体β3(ADRB3)、泛连接蛋白3(PANX3)、G蛋白偶联受体20(GPR20)、淋巴细胞抗原6复合物、基因座K9(LY6K)、嗅觉受体51E2(OR51E2)、TCRγ交替阅读框蛋白(TARP)、维尔姆斯肿瘤蛋白(WT1)、癌症/睾丸抗原1(NY-ESO-1)、癌症/睾丸抗原2(LAGE-1a)、MAGE家族成员(包括MAGE-A1、MAGE-A3和MAGE-A4)、位于染色体12p上的ETS易位变体基因6(ETV6-AML)、***蛋白17(SPA17)、X抗原家族成员1A(XAGE1)、血管生成素结合细胞表面受体2(Tie 2)、黑素瘤癌症睾丸抗原-1(MAD-CT-1)、黑素瘤癌症睾丸抗原-2(MAD-CT-2)、Fos相关抗原1、肿瘤蛋白p53(p53)、p53突变体、***素、存活、端粒酶、***癌肿瘤抗原-1、由T细胞识别的黑素瘤抗原1、大鼠肉瘤(Ras)突变体、人端粒酶逆转录酶(hTERT)、肉瘤易位断裂点、黑素瘤细胞凋亡抑制剂(ML-IAP)、ERG(跨膜蛋白酶丝氨酸2(TMPRSS2)ETS融合基因)、N-乙酰基葡糖胺基-转移酶V(NA17)、配对盒蛋白Pax-3(PAX3)、雄激素受体、细胞周期蛋白B1、v-myc禽类骨髓细胞瘤病病毒致癌基因神经母细胞瘤源性同源物(MYCN)、Ras同源物家族成员C(RhoC)、酪氨酸酶相关蛋白2(TRP-2)、细胞色素P450 1B1(CYP1B1)、CCCTC结合因子(锌指蛋白)样、由T细胞识别的鳞状细胞癌抗原3(SART3)、配对盒蛋白Pax-5(PAX5)、前顶体蛋白结合蛋白sp32(OY-TES1)、淋巴细胞特异性蛋白质酪氨酸激酶(LCK)、A激酶锚定蛋白4(AKAP-4)、滑膜肉瘤、X断裂点2(SSX2)、高级糖化终末产物的受体(RAGE-1)、肾遍在1(RU1)、肾遍在2(RU2)、豆荚蛋白酶、人***瘤病毒E6(HPV E6)、人***瘤病毒E7(HPV E7)、肠羧基酯酶、热休克蛋白70-2突变型(mut hsp70-2)、CD79a、CD79b、CD72、白细胞相关免疫球蛋白样受体1(LAIR1)、IgA受体的Fc片段(FCAR或CD89)、白细胞免疫球蛋白样受体亚家族A成员2(LILRA2)、CD300分子样家族成员f(CD300LF)、C型凝集素结构域家族12成员A(CLEC12A)、骨髓基质细胞抗原2(BST2)、含有EGF样模块的粘蛋白样激素受体样2(EMR2)、淋巴细胞抗原75(LY75)、磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)、Fc受体样5(FCRL5)、MUC16、5T4、8H9、αvβθ整联蛋白、αvβ6整联蛋白、甲胎蛋白(AFP)、B7-H6、ca-125、CA9、CD44、CD44v7/8、CD52、E-钙粘蛋白、EMA(上皮膜抗原)、上皮糖蛋白-2(EGP-2)、上皮糖蛋白-40(EGP-40)、ErbB4、上皮肿瘤抗原(ETA)、叶酸结合蛋白(FBP)、激酶***结构域受体(KDR)、k-轻链、L1细胞粘附分子、MUC18、NKG2D、癌胚抗原(h5T4)、肿瘤/睾丸抗原1B、GAGE、GAGE-1、BAGE、SCP-1、CTZ9、SAGE、CAGE、CT10、MART-1、免疫球蛋白λ样多肽1(IGLL1)、乙型肝炎表面抗原结合蛋白(HBsAg)、病毒衣壳抗原(VCA)、早期抗原(EA)、EBV核抗原(EBNA)、HHV-6p41早期抗原、HHV-6B U94潜伏抗原、HHV-6B p98晚期抗原、巨细胞病毒(CMV)抗原、大T抗原、小T抗原、腺病毒抗原、呼吸道合胞病毒(RSV)抗原、血凝素(HA)、神经氨酸酶(NA)、副流感1型抗原、副流感2型抗原、副流感3型抗原、副流感4型抗原、人偏肺病毒(HMPV)抗原、丙型肝炎病毒(HCV)核心抗原、HIV p24抗原、人T细胞淋巴营养性病毒(HTLV-1)抗原、梅克尔细胞多瘤病毒小T抗原、梅克尔细胞多瘤病毒大T抗原、卡波济氏肉瘤相关疱疹病毒(KSHV)裂解核抗原以及KSHV潜伏核抗原。在一些实施方案中，抗原结合结构域包含SEQ ID NO:321和/或322。
铰链/间隔区结构域
在一些实施方案中，本公开的CAR包含铰链或间隔区结构域。在一些实施方案中，铰链/间隔区结构域可包含截短的铰链/间隔区结构域(THD)，THD结构域是完整铰链/间隔区结构域(“CHD”)的截短型式。在一些实施方案中，细胞外结构域来自或源自(例如，包含全部或其片段)ErbB2、血型糖蛋白A(GpA)、CD2、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD4、CD7、CD8a、CD8[T CDlla(IT GAL)、CDl lb(IT GAM)、CDl lc(ITGAX)、CDl ld(IT GAD)、CD18(ITGB2)、CD19(B4)、CD27(TNFRSF7)、CD28、CD28T、CD29(ITGB1)、CD30(TNFRSF8)、CD40(TNFRSF5)、CD48(SLAMF2)、CD49a(ITGA1)、CD49d(ITGA4)、CD49f(ITGA6)、CD66a(CEACAM1)、CD66b(CEACAM8)、CD66c(CEACAM6)、CD66d(CEACAM3)、CD66e(CEACAM5)、CD69(CLEC2)、CD79A(B细胞抗原受体复合物相关α链)、CD79B(B细胞抗原受体复合物相关β链)、CD84(SLAMF5)、CD96(Tactile)、CD100(SEMA4D)、CD103(ITGAE)、CD134(0X40)、CD137(4-1BB)、CD150(SLAMF1)、CD158A(KIR2DL1)、CD158B1(KIR2DL2)、CD158B2(KIR2DL3)、CD158C(KIR3DP1)、CD158D(KIRDL4)、CD158F1(KIR2DL5A)、CD158F2(KIR2DL5B)、CD158K(KIR3DL2)、CD160(BY55)、CD162(SELPLG)、CD226(DNAM1)、CD229(SLAMF3)、CD244(SLAMF4)、CD247(CD3-δ)、CD258(LIGHT)、CD268(BAFFR)、CD270(TNFSF14)、CD272(BTLA)、CD276(B7-H3)、CD279(PD-1)、CD314(NKG2D)、CD319(SLAMF7)、CD335(NK-p46)、CD336(NK-p44)、CD337(NK-p30)、CD352(SLAMF6)、CD353(SLAMF8)、CD355(CRT AM)、CD357(TNFRSF18)、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)、LFA-1(CDl la/CD18)、NKG2C、DAP-10、ICAM-1、NKp80(KLRF1)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、LFA-1、SLAMF9、LAT、GADS(GrpL)、SLP-76(LCP2)、PAG1/CBP、CD83配体、Fcγ受体、MHC 1类分子、MHC 2类分子、TNF受体蛋白、免疫球蛋白蛋白质、细胞因子受体、整联蛋白、激活NK细胞受体、Toll配体受体以及其片段或组合。铰链或间隔区结构域可源自天然来源或源自合成来源。
在一些实施方案中，铰链或间隔区结构域位于抗原结合分子(例如，scFv)与跨膜结构域之间。以这种取向，铰链/间隔区结构域提供抗原结合分子与表达CAR的细胞膜表面之间的距离。在一些实施方案中，铰链或间隔区结构域来自或源自免疫球蛋白。在一些实施方案中，铰链或间隔区结构域选自IgGl、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgD、IgE和IgM或其片段的铰链/间隔区。在一些实施方案中，铰链或间隔区结构域包含、来自或源自CD8α的铰链/间隔区。在一些实施方案中，铰链或间隔区结构域包含、来自或源自CD28的铰链/间隔区。在一些实施方案中，铰链或间隔区结构域包含CD8α的铰链/间隔区的片段或CD28的铰链/间隔区的片段，其中所述片段是小于完整铰链/间隔区的任何片段。在一些实施方案中，CD8α铰链/间隔区的片段或CD28铰链/间隔区的片段包含排除CD8α铰链/间隔区或CD28铰链/间隔区的N端或C端或两者处的至少1、至少2、至少3、至少4、至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19或至少20个氨基酸的氨基酸序列。
跨膜结构域
本公开的CAR还可包含跨膜结构域和/或细胞内信号传导结构域。跨膜结构域可被设计为与CAR的细胞外结构域融合。它可类似地融合至CAR的细胞内结构域。在一些实施方案中，使用与CAR中的结构域之一天然相关的跨膜结构域。在一些情况下，可对跨膜结构域进行选择或修饰(例如，通过氨基酸取代)以避免此类结构域结合至相同或不同表面膜蛋白的跨膜结构域，以便使与受体复合物的其他成员的相互作用最小化。跨膜结构域可源自天然来源或合成来源。在来源是天然来源的情况下，所述结构域可源自任何膜结合蛋白或跨膜蛋白。
跨膜区可源自(即，包含)受体酪氨酸激酶(例如，ErbB2)、血型糖蛋白A(GpA)、4-1BB/CD137、激活NK细胞受体、免疫球蛋白蛋白质、B7-H3、BAFFR、BFAME(SEAMF8)、BTEA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD 18、CD 19、CD 19a、CD2、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96(Tactile)、CD1 la、CD1 lb、CD1 lc、CD1 Id、CDS、CEACAM1、CRT AM、细胞因子受体、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(EIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα(CD79a)、IE-2Rβ、IE-2Rγ、IE-7Rα、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)、整联蛋白、ITGA4、ITGA4、ITGA6、IT GAD、ITGAE、ITGAE、IT GAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、EAT、LFA-1、LFA-1、与CD83特异性地结合的配体、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9(CD229)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1；CDl-la/CD18)、MHC 1类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程序性死亡-1(PD-1)、PSGL1、SELPLG(CD162)、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4(CD244；2B4)、SLAMF6(NTB-A；Lyl08)、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、TNFSF14、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6或其片段、截短或组合。
在一些实施方案中，合适的细胞内信号传导结构域包括但不限于激活巨噬细胞/骨髓细胞受体CSFR1、MYD88、CD14、TIE2、TLR4、CR3、CD64、TREM2、DAP10、DAP12、CD169、DECTIN1、CD206、CD47、CD163、CD36、MARCO、TIM4、MERTK、F4/80、CD91、C1QR、LOX-1、CD68、SRA、BAI-1、ABCA7、CD36、CD31、乳铁蛋白或其片段、截短或组合。
在一些实施方案中，受体酪氨酸激酶可源自(例如，包含)胰岛素受体(InsR)、***I受体(IGF1R)、胰岛素受体相关受体(IRR)、血小板源性生长因子受体α(PDGFRa)、血小板源性生长因子受体β(PDGFRfi)、KIT原癌基因受体酪氨酸激酶(Kit)、集落刺激因子1受体(CSFR)、fms相关酪氨酸激酶3(FLT3)、fms相关酪氨酸激酶1(VEGFR-1)、激酶***结构域受体(VEGFR-2)、fms相关酪氨酸激酶4(VEGFR-3)、成纤维细胞生长因子受体1(FGFR1)、成纤维细胞生长因子受体2(FGFR2)、成纤维细胞生长因子受体3(FGFR3)、成纤维细胞生长因子受体4(FGFR4)、蛋白酪氨酸激酶7(CCK4)、神经营养受体酪氨酸激酶1(trkA)、神经营养受体酪氨酸激酶2(trkB)、神经营养受体酪氨酸激酶3(trkC)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体1(ROR1)、受体酪氨酸激酶样孤儿受体2(ROR2)、肌肉相关受体酪氨酸激酶(MuSK)、MET原癌基因、受体酪氨酸激酶(MET)、巨噬细胞刺激1受体(Ron)、AXL受体酪氨酸激酶(Axl)、TYR03蛋白酪氨酸激酶(Tyro3)、MER原癌基因、酪氨酸激酶(Mer)、具有免疫球蛋白样和EGF样结构域的酪氨酸激酶1(TIE1)、TEK受体酪氨酸激酶(TIE2)、EPH受体A1(EphAl)、EPH受体A2(EphA2)、(EPH受体A3)EphA3、EPH受体A4(EphA4)、EPH受体A5(EphA5)、EPH受体A6(EphA6)、EPH受体A7(EphA7)、EPH受体A8(EphA8)、EPH受体A10(EphAlO)、EPH受体B1(EphBl)、EPH受体B2(EphB2)、EPH受体B3(EphB3)、EPH受体B4(EphB4)、EPH受体B6(EphB6)、ret原癌基因(Ret)、受体样酪氨酸激酶(RYK)、盘状结构域受体酪氨酸激酶1(DDR1)、盘状结构域受体酪氨酸激酶2(DDR2)、c-ros致癌基因1、受体酪氨酸激酶(ROS)、凋亡相关酪氨酸激酶(Lmrl)、狐猴酪氨酸激酶2(Lmr2)、狐猴酪氨酸激酶3(Lmr3)、白细胞受体酪氨酸激酶(LTK)、ALK受体酪氨酸激酶(ALK)或丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶1(STYK1)。
共刺激结构域
在某些实施方案中，CAR包含共刺激结构域。在一些实施方案中，共刺激结构域包含4-1BB(CD137)、CD28或两者，和/或细胞内T细胞信号传导结构域。在一个优选的实施方案中，共刺激结构域是人CD28、人4-1BB或两者，并且细胞内T细胞信号传导结构域是人CD3δ(δ)。4-1BB、CD28、CD3δ或这些中的任一者可分别包含少于完整的4-1BB、CD28或CD3δ。嵌合抗原受体可并入共刺激(信号传导)结构域以增加其效力。参见美国专利号7,741,465和6,319,494以及Krause等人和Finney等人(同上)；Song等人,Blood 119:696-706(2012)；Kalos等人,Sci Transl.Med.3:95(2011)；Porter等人,N.Engl.J.Med.365:725-33(2011)和Gross等人,Amur.Rev.Pharmacol.Toxicol.56:59-83(2016)。
在一些实施方案中，共刺激结构域包含SEQ ID NO:318或320的氨基酸序列。
细胞内信号传导结构域
本文公开的工程化T细胞的细胞内(信号传导)结构域可向激活结构域提供信号传导，所述激活结构域然后激活免疫细胞的至少一种正常效应功能。例如，T细胞的效应功能可以是溶细胞活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。
在一些实施方案中，合适的细胞内信号传导结构域包括(例如，包含)但不限于4-1BB/CD137、激活NK细胞受体、免疫球蛋白蛋白质、B7-H3、BAFFR、BLAME(SLAMF8)、BTLA、CD100(SEMA4D)、CD103、CD160(BY55)、CD18、CD19、CD 19a、CD2、CD247、CD27、CD276(B7-H3)、CD28、CD29、CD3δ、CD3ε、CD3γ、CD30、CD4、CD40、CD49a、CD49D、CD49f、CD69、CD7、CD84、CD8α、CD8β、CD96(Tactile)、CD1 la、CD1 lb、CD1 lc、CD1 Id、CDS、CEACAM1、CRT AM、细胞因子受体、DAP-10、DNAM1(CD226)、Fcγ受体、GADS、GITR、HVEM(LIGHTR)、IA4、ICAM-1、ICAM-1、Igα(CD79a)、IL-2Rβ、IL-2Rγ、IL-7Rα、诱导性T细胞共刺激因子(ICOS)、整联蛋白、ITGA4、ITGA4、ITGA6、IT GAD、ITGAE、ITGAL、IT GAM、ITGAX、ITGB2、ITGB7、ITGB1、KIRDS2、LAT、LFA-1、LFA-1、与CD83特异性地结合的配体、LIGHT、LIGHT、LTBR、Ly9(CD229)、Lyl08)、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1；CDl-la/CD18)、MHC 1类分子、NKG2C、NKG2D、NKp30、NKp44、NKp46、NKp80(KLRF1)、OX-40、PAG/Cbp、程序性死亡-1(PD-1)、PSGL1、SELLPG(CD162)、信号传导淋巴细胞激活分子(SLAM蛋白)、SLAM(SLAMF1；CD150；IPO-3)、SLAMF4(CD244；2B4)、SLAMF6(NTB-A、SLAMF7、SLP-76、TNF受体蛋白、TNFR2、TNFSF14、Toll配体受体、TRANCE/RANKL、VLA1或VLA-6或其片段、截短或组合。
CD3是天然T细胞上T细胞受体的元件，并且已被证明是CAR中重要的细胞内激活元件。在一些实施方案中，CD3是CD3δ。在一些实施方案中，激活结构域包含与SEQ ID NO:319的多肽序列具有至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％同一性的氨基酸序列。
3.4T细胞受体
TCR使用国际免疫遗传学(IMGT)TCR命名法进行描述，并与TCR序列的IMGT公共数据库相联系。天然α-β异二聚体TCR具有α链和β链。广义上讲，每条链可包含可变区、连接区和恒定区，并且β链还通常在可变区与连接区之间含有短的多样性区，但此多样性区通常被认为是连接区的一部分。每个可变区可包含嵌入框架序列中的三个CDR(互补决定区)，一个是称为CDR3的高变区。存在通过其框架、CDR1和CDR2序列并且通过部分定义的CDR3序列来区分的几种类型的α链可变(Vα)区和几种类型的β链可变(Vβ)区。Vα类型在IMGT命名法中由独特TRAV编号表示。因此，“TRAV21”定义具有独特框架以及CDR1和CDR2序列以及CDR3序列的TCR Vα区，所述CDR3序列部分由从TCR到TCR保留的氨基酸序列定义、但也包含从TCR到TCR变化的氨基酸序列。以相同的方式，“TRBV5-1”定义具有独特框架以及CDR1和CDR2序列、但仅部分定义的CDR3序列的TCR Vβ区。
TCR的连接区由独特的IMGT TRAJ和TRBJ命名法类似地定义，并且恒定区由IMGTTRAC和TRBC命名法类似地定义。
β链多样性区在IMGT命名法中以缩写TRBD表示，并且如前所述，级联TRBD/TRBJ区通常一起被视为连接区。
由IMGT命名法定义的独特序列是广泛已知的，并且可供在TCR领域工作的人员使用。例如，它们可在IMGT公共数据库中找到。“Tcell Receptor Factsbook”,(2001)LeFranc和LeFranc,Academic Press,ISBN 0-12-441352-8也公开了由IMGT命名法定义的序列，但由于其出版日期和随之而来的时滞，其中的信息有时需要参考IMGT数据库进行确认。
天然TCR以异二聚体αβ或γδ形式存在。然而，由αα或ββ同二聚体组成的重组TCR先前已显示与肽MHC分子结合。因此，本发明的TCR可以是异二聚体αβTCR或者可以是αα或ββ同二聚体TCR。
为了用于过继疗法，αβ异二聚体TCR可例如被转染为具有细胞质结构域和跨膜结构域的全长链。在某些实施方案中，本发明的TCR可在相应恒定结构域的残基之间具有引入的二硫键，如例如WO 2006/000830中所述。
本发明的TCR，特别是α-β异二聚体TCR，可包含α链TRAC恒定结构域序列和/或β链TRBC1或TRBC2恒定结构域序列。α和β链恒定结构域序列可通过截短或取代进行修饰以缺失TRAC的外显子2的Cys4与TRBC1或TRBC2的外显子2的Cys2之间的天然二硫键。α和/或β链恒定结构域序列也可通过用半胱氨酸残基取代TRAC的Thr 48和TRBC1或TRBC2的Ser 57来进行修饰，所述半胱氨酸在TCR的α与β恒定结构域之间形成二硫键。
结合亲和力(与平衡常数KD成反比)和结合半衰期(表示为T1/2)可通过任何适当的方法来确定。应当理解，将TCR的亲和力加倍导致KD减半。T1/2被计算为ln 2除以解离速率(koff)。因此，T1/2加倍导致koff减半。TCR的KD和koff值通常针对TCR的可溶性形式测量，即被截断以除去细胞质结构域残基和跨膜结构域残基的那些形式。因此，应理解，如果给定TCR的可溶性形式具有所述特征，则所述TCR对亲本TCR具有改进的结合亲和力和/或结合半衰期。优选地，使用相同的测定方案多次(例如3次或更多次)测量给定TCR的结合亲和力或结合半衰期，并取得结果的平均值。
由于本发明的TCR在过继疗法中具有效用，因此本发明包括呈递本发明的TCR的非天然存在的和/或纯化的和/或工程化的细胞，尤其是T细胞。有许多方法适用于用编码本发明的TCR的核酸(如DNA、cDNA或RNA)转染T细胞(参见例如Robbins等人,(2008)JImmunol.180:6116-6131)。表达本发明的TCR的T细胞将适用于癌症如胰腺癌和肝癌的基于过继疗法的治疗。如本领域技术人员所已知，存在许多可进行过继疗法的合适方法(参见例如Rosenberg等人,(2008)Nat Rev Cancer 8(4):299-308)。
如本领域所熟知的，本发明的TCR在由经转染的细胞表达时可进行翻译后修饰。糖基化是一种这样的修饰，其可包括寡糖部分与TCR链中的限定氨基酸的共价连接。例如，天冬酰胺残基或丝氨酸/苏氨酸残基是众所周知的寡糖连接位置。特定蛋白质的糖基化状态取决于许多因素，包括蛋白质序列、蛋白质构象和某些酶的可用性。此外，糖基化状态(即寡糖类型、共价键联和连接总数)可影响蛋白质功能。因此，在产生重组蛋白时，通常需要控制糖基化。经转染TCR的糖基化可通过经转染基因的突变来控制(Kuball J等人(2009),J ExpMed 206(2):463-475)。此类突变也涵盖于本发明中。
TCR可对下组中的抗原具有特异性：MAGE-A1、MAGE-A2、MAGE-A3、MAGE-A4、MAGE-A5、MAGE-A6、MAGE-A7、MAGE-A8、MAGE-A9、MAGE-A10、MAGE-A11、MAGE-A12、MAGE-A13、GAGE-1、GAGE-2、GAGE-3、GAGE-4、GAGE-5、GAGE-6、GAGE-7、GAGE-8、BAGE-1、RAGE-1、LB33/MUM-1、PRAME、NAG、MAGE-Xp2(MAGE-B2)、MAGE-Xp3(MAGE-B3)、MAGE-Xp4(AGE-B4)、酪氨酸酶、脑糖原磷酸化酶、Melan-A、MAGE-C1、MAGE-C2、NY-ESO-1、LAGE-1、SSX-1、SSX-2(HOM-MEL-40)、SSX-1、SSX-4、SSX-5、SCP-1、CT-7、α-肌动蛋白-4、Bcr-Abl融合蛋白、Casp-8、β-连环蛋白、cdc27、cdk4、cdkn2a、coa-1、dek-can融合蛋白、EF2、ETV6-AML1融合蛋白、LDLR-岩藻糖基转移酶AS融合蛋白、HLA-A2、HLA-A11、hsp70-2、KIAAO205、Mart2、Mum-2和3、neo-PAP、I类肌球蛋白、OS-9、pml-RARa融合蛋白、PTPRK、K-ras、N-ras、磷酸丙糖异构酶、GnTV、Herv-K-mel、Lage-1、Mage-C2、NA-88、Lage-2、SP17和TRP2-Int2、(MART-I)、gp100(Pmel 17)、TRP-1、TRP-2、MAGE-1、MAGE-3、p15(58)、CEA、NY-ESO(LAGE)、SCP-1、Hom/Mel-40、p53、H-Ras、HER-2/neu、BCR-ABL、E2A-PRL、H4-RET、IGH-IGK、MYL-RAR、爱泼斯坦巴尔病毒抗原、EBNA、人***瘤病毒(HPV)抗原E6和E7、TSP-180、MAGE-4、MAGE-5、MAGE-6、p185erbB2、p180erbB-3、c-met、nm-23H1、PSA、TAG-72-4、CA 19-9、CA 72-4、CAM 17.1、NuMa、K-ras、β-连环蛋白、CDK4、Mum-1、p16、TAGE、PSMA、PSCA、CT7、端粒酶、43-9F、5T4、791Tgp72、α-胎蛋白、13HCG、BCA225、BTAA、CA 125、CA 15-3(CA 27.29\BCAA)、CA 195、CA 242、CA-50、CAM43、CD68\KP1、CO-029、FGF-5、G250、Ga733(EpCAM)、HTgp-175、M344、MA-50、MG7-Ag、MOV18、NB\170K、NY-CO-1、RCAS1、SDCCAG16、TA-90(Mac-2结合蛋白\亲环蛋白C相关蛋白)、TAAL6、TAG72、TLP以及TPS。
3.5转录因子
调控性T细胞(Treg)在维持体内平衡、控制炎症应答的幅度和持续时间以及预防自身免疫性和过敏性应答方面是重要的。
一般来说，Treg被认为主要参与抑制免疫应答，部分充当免疫***的“自我检查”以预防过度反应。特别地，Treg参与维持对自身抗原、诸如花粉或食物的无害物质的耐受性，以及消除自身免疫性疾病。
Treg遍布全身，包括但不限于肠道、皮肤、肺和肝。此外，Treg细胞也可存在于身体的某些不直接暴露于外部环境的隔室中，如脾、***以及甚至脂肪组织。已知或怀疑这些Treg细胞群中的每一个都具有一种或多种独特的特征，并且可在Lehtimaki和Lahesmaa,Regulatory T cells control immune responses through their non-redundanttissue specific features,2013,FRONTIERS IN IMMUNOL.,4(294):1-10中找到另外的信息，所述文献的公开内容特此整体并入。
通常，已知Treg需要TGF-β和IL-2来正常激活和发育。表达大量IL-2受体(IL-2R)的Treg依赖于由激活的T细胞产生的IL-2。已知Treg产生IL-10和TGF-β两者，两者都是有效的免疫抑制细胞因子。此外，已知Treg抑制抗原呈递细胞(APC)刺激T细胞的能力。一种提出的APC抑制机制是通过CTLA-4，CTLA-4由Foxp3+Treg表达。据认为，CTLA-4可结合至APC上的B7分子，并通过导致内化来阻断这些分子或将这些分子除去，从而导致B7的可用性降低和不能为免疫应答提供足够的共刺激。关于Treg的起源、分化和功能的另外论述可在Dhamneet al.,Peripheral and thymic Foxp3+regulatory Tcells in search of origin,distinction,and function,2013,Frontiers in Immunol.,4(253):1-11中找到，所述文献的公开内容特此整体并入。
FOXP3、STAT5B和/或HELIOS的描述和/或氨基酸序列在本文和www.uniprot.org数据库在以下登录号下提供：Q9BZS1(FOXP3)、P51692(STAT5b)和/或Q9UKS7(HELIOS)。
Foxp3
在一些实施方案中，转录因子是叉头框P3转录因子(Foxp3)。Foxp3已显示是Treg的分化和活性的关键调控因子。事实上，Foxp3基因的功能丧失性突变已显示导致致命IPEX综合征(免疫失调，多发性内分泌病，肠病，X连锁)。IPEX患者患有严重的自身免疫应答、持续性湿疹和结肠炎。表达Foxp3的Treg细胞在限制肠道炎症应答中起关键作用(Josefowicz,S.Z.等人Nature,2012,482,395-U1510)。
STAT
信号转导因子和转录激活因子(STAT)蛋白家族的成员是介导细胞免疫、增殖、凋亡和分化的许多方面的细胞内转录因子。它们主要提供膜受体相关的Janus激酶(JAK)激活。此途径的失调经常在原发性肿瘤中观察到，并且导致血管生成增加、肿瘤存活增强和免疫抑制。基因敲除研究提供的证据表明STAT蛋白参与免疫***的发育和功能，并在维持免疫耐受和肿瘤监视中发挥作用。
存在已经鉴定的7个哺乳动物STAT家族成员：STAT1、STAT2、STAT3、STAT4、STAT5(包括STAT5A和STAT5B)和STATE。
细胞因子或生长因子的细胞外结合诱导受体相关Janus激酶的激活，所述激酶通过其SH2结构域磷酸化STAT蛋白内的特定酪氨酸残基，从而促进二聚化。然后磷酸化的二聚体通过输入蛋白α/β三元复合物主动转运至细胞核。最初，STAT蛋白被描述为潜在细胞质转录因子，因为磷酸化被认为是核保留所必需的。然而，未磷酸化的STAT蛋白也在细胞溶质与细胞核之间穿梭，并在基因表达中发挥作用。一旦STAT到达细胞核，它就结合至细胞因子诱导型基因的启动子区域中称为γ激活位点(GAS)的共有DNA识别基序并激活转录。STAT蛋白可提供核磷酸酶去磷酸化，这导致STAT失活并随后通过输出蛋白-RanGTP复合物转运出细胞核。
在一些实施方案中，本公开的STAT蛋白可以是包含调节其表达水平或活性的修饰的STAT蛋白。在一些实施方案中，此类修饰尤其包括影响STAT二聚化、STAT蛋白与信号传导配偶体的结合、STAT蛋白定位或STAT蛋白降解的突变。在一些实施方案中，本公开的STAT蛋白具有组成型活性。在一些实施方案中，本公开的STAT蛋白由于组成型二聚化而具有组成型活性。在一些实施方案中，本公开的STAT蛋白由于组成型磷酸化而具有组成型活性，如Onishi,M.等人,Mol.Cell.Biol.1998年7月第18卷第7期3871-3879中所描述，所述文献的全部内容以引用的方式并入本文。
3.6疫苗
在一个实施方案中，一个或多个表达序列编码抗原，例如肿瘤抗原或其片段。在一些实施方案中，这种序列的表达产生免疫原性组合物，例如能够引起特定T细胞应答的疫苗组合物。在一些实施方案中，抗原是新抗原。
4.裂解位点
在一些实施方案中，多核苷酸构建体中的两个或更多个表达序列可由一个或多个裂解位点序列隔开。
裂解位点可以是使两个或更多个多肽变得分离的任何序列。裂解位点可以是自裂解的，使得当产生多肽时，它立即被裂解成单独多肽，而不需要任何外部裂解活性。
裂解位点可以是弗林蛋白酶裂解位点。
弗林蛋白酶是属于枯草杆菌蛋白酶样原蛋白转化酶家族的酶。这一家族的成员是将潜在前体蛋白加工成其生物活性产物的原蛋白转化酶。弗林蛋白酶是可使前体蛋白在其成对碱性氨基酸加工位点处有效裂解的钙依赖性丝氨酸内切蛋白酶。弗林蛋白酶底物的实例包括甲状旁腺激素原、转化生长因子β1前体、原白蛋白、原β-分泌酶、膜1型基质金属蛋白酶、原神经生长因子的β亚基和冯·维勒布兰德因子。弗林蛋白酶裂解刚好在碱性氨基酸靶序列下游的蛋白(规范地表示为，Arg-X-(Arg/Lys)-Arg)，并在高尔基体中富集。
裂解位点可编码自裂解肽。
裂解位点可通过核糖体跳跃，如2A自裂解肽的C末端处的甘氨酰基-丙基键的跳跃来操作。在一些实施方案中，空间位阻导致核糖体跳变。在一些实施方案中，2A自裂解肽含有序列GDVEXNPGP(SEQ ID NO:324)，其中X是E或S。在一些实施方案中，在2A自裂解肽上游编码的蛋白质在翻译后连接至2A自裂解肽，除了C末端脯氨酸。在一些实施方案中，在2A自裂解肽下游编码的蛋白质在翻译后在其N末端连接至脯氨酸。
自裂解肽可以是来自口疮病毒或心病毒的2A自裂解肽。口疮病毒和心病毒的初级2A/2B裂解是通过其自身C末端的2A裂解介导的。在口疮病毒，如***病毒(FMDV)和马鼻炎A病毒中，2A区是由约18个氨基酸组成的小段，其与蛋白2B的N末端残基(保守的脯氨酸残基)一起代表能够介导其自身C末端的裂解的自主元件(Donelly等人(2001))。
除了口疮病毒或心病毒、“小核糖核酸病毒样”昆虫病毒、C型轮状病毒以及锥虫属和细菌序列中的重复序列外，还在小核糖核酸病毒中发现了2A样序列(Donnelly等人(2001))。裂解位点可包含这些2A样序列中的一个，如表8中所列的那些。
在一些实施方案中，自裂解肽是F2A。在一些实施方案中，自裂解肽源自***病毒。在一些实施方案中，自裂解肽是E2A。在一些实施方案中，自裂解肽源自马鼻炎A病毒。在一些实施方案中，自裂解肽是P2A。在一些实施方案中，自裂解肽源猪捷申病毒-1。在一些实施方案中，自裂解肽是T2A。在一些实施方案中，自裂解肽源自明脉扁刺蛾病毒。在一些实施方案中，自裂解肽具有表8中所列的序列。
在一个实施方案中，编码通过裂解位点隔开的治疗性蛋白质的表达序列具有相同水平的蛋白质表达。
在一些实施方案中，自裂解肽描述于Liu,Z.,Chen,O.,Wall,J.B.J.等人Systematic comparison of 2A peptides for cloning multi-genes in apolycistronic vector.Sci Rep 7,2193(2017)中。
5.含有第二IRES的多核苷酸
在一些实施方案中，由第一和第二表达序列编码的治疗性蛋白质的表达比率可通过circRNA中使用的IRES以及裂解位点或第二IRES是否分隔所述第一和第二表达序列控制或影响。当需要由第一和第二表达序列编码的蛋白质的相等表达时，circRNA可编码位于第一表达序列与第二表达序列之间的裂解位点，例如，2A自裂解肽。当需要由第一表达序列编码的蛋白质的更高表达时，circRNA可编码第一IRES和第二IRES，其中与第二IRES相比，所述第一IRES与更高表达相关，或者其中第二IRES是基因间区(IGR)IRES。当需要由第二表达序列编码的蛋白质的更高表达时，circRNA可编码第一IRES和第二IRES，其中与第一IRES相比，所述第一IRES与更高表达相关。
在一些实施方案中，RNA多核苷酸包含如本文所述的第一IRES和第二IRES。在一些实施方案中，DNA载体编码如本文所述的第一IRES和第二IRES。
在一个实施方案中，第一IRES和第二IRES具有相同的序列。在一个实施方案中，第一IRES和第二IRES具有不同的序列。在一个实施方案中，第一IRES是具有如表1中所列序列的IRES(SEQ ID NO:1-72)。在一些实施方案中，第一IRES是萨力病毒IRES。在一些实施方案中，第一IRES是SZ1 IRES。在一个实施方案中，第二IRES是具有如表1中所列序列的IRES(SEQ ID NO:1-72)。在一些实施方案中，第二IRES是萨力病毒IRES。在一些实施方案中，第一IRES是SZ1 IRES。
在一些实施方案中，与第二IRES相比，第一IRES与更高表达相关(例如，当与使用含有单个IRES的构建体相比时，高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％表达)。在一些实施方案中，与第一IRES相比，第二IRES与更高表达相关(例如，当与使用含有单个IRES的构建体相比时，高10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％表达)。在一些实施方案中，第二IRES是基因间区(IGR)IRES。
与使用多种多核苷酸表达相比，用单一circRNA多核苷酸表达2种蛋白质具有优点。在一些实施方案中，与来自多种多核苷酸的表达相比，来自本发明circRNA多核苷酸的2种蛋白质的表达产生更一致的表达比率。在一些实施方案中，来自本发明circRNA多核苷酸的2种蛋白质的表达产生瞬时表达，相对于DNA的持久表达这可能是合乎需要的。
6.多核苷酸的产生
本文提供的载体可使用分子生物学的标准技术制备。例如，本文提供的载体的各种元件可使用重组方法获得，如通过从细胞中筛选cDNA和基因组文库，或通过从已知包含多核苷酸的载体产生它们。
基于已知序列，本文提供的载体的各种元件也可合成产生，而不是克隆。完整序列可由通过标准方法制备并组装成完整序列的重叠寡核苷酸组装。参见例如，Edge,Nature(1981)292:756；Nambair等人,Science(1984)223:1299；和Jay等人,J.Biol.Chem.(1984)259:631 1。
因此，特定核苷酸序列可从具有所需序列的载体获得，或者在适当的情况下使用本领域已知的各种寡核苷酸合成技术如定点诱变和聚合酶链式反应(PCR)技术完全或部分地合成。获得编码所需载体元件的核苷酸序列的一种方法是使常规自动化多核苷酸合成仪中产生的重叠合成寡核苷酸的互补组退火，然后用合适的DNA连接酶连接并通过PCR扩增连接的核苷酸序列。参见例如，Jayaraman等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1991)88:4084-4088。此外，可使用寡核苷酸指导的合成(Jones等人,Nature(1986)54:75-82)、预先存在的核苷酸区域的寡核苷酸指导的诱变(Riechmann等人,Nature(1988)332:323-327和Verhoeyen等人,Science(1988)239:1534-1536)以及使用T4 DNA聚合酶对有缺口的寡核苷酸进行酶促填充(Queen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)86:10029-10033)。
本文提供的前体RNA可通过在允许由载体编码的前体RNA转录的条件下孵育本文提供的载体来产生。例如，在一些实施方案中，通过在允许体外转录的条件下将本文提供的载体与相容的RNA聚合酶一起孵育来合成前体RNA，所述载体在其5'双链体形成区和/或表达序列上游包含RNA聚合酶启动子。在一些实施方案中，通过噬菌体RNA聚合酶在细胞内孵育载体或通过宿主RNA聚合酶II在细胞核中孵育载体。
在某些实施方案中，本文提供了通过使用本文提供的载体作为模板(例如，具有位于5'双链体形成区上游的RNA聚合酶启动子的本文提供的载体)进行体外转录来产生前体RNA的方法。
在某些实施方案中，所得前体RNA可用于通过在镁离子和鸟苷核苷酸或核苷存在下在RNA环化发生的温度(例如介于20℃与60℃之间)下孵育来产生环状RNA(例如，本文提供的环状RNA多核苷酸)。
因此，在某些实施方案中，本文提供了制备环状RNA的方法。在某些实施方案中，方法包括通过以下方式合成前体RNA：使用本文提供的载体(例如，剪接后3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、表达序列、编码裂解位点的多核苷酸序列、第二表达序列和5'I组内含子片段)作为模板转录(例如，失控转录(run-off transcription))并在二价阳离子(例如镁离子)和GTP存在下孵育所得前体RNA，以使得其环化形成环状RNA。在一些实施方案中，本文公开的前体RNA能够在不存在镁离子和GTP和/或没有与镁离子和GTP孵育的步骤的情况下环化。已经发现环状RNA相对于相应的mRNA具有降低的免疫原性，至少部分是因为mRNA含有免疫原性5'帽。当从某些启动子(例如，T7启动子)转录DNA载体以产生前体RNA时，应理解前体RNA的5'端是G。为了降低含有低水平的污染线性mRNA的环状RNA组合物的免疫原性，相对于GTP过量的GMP可在转录过程中提供，以使得大多数转录物含有5'GMP，其不能被加帽。因此，在一些实施方案中，在过量GMP存在下进行转录。在一些实施方案中，进行转录，其中GMP浓度与GTP浓度的比率在约3:1至约15:1的范围内，例如约3:1至约10:1、约3:1至约5:1、约3:1、约4:1或约5:1。
在一些实施方案中，包含环状RNA的组合物已被纯化。环状RNA可通过本领域常用的任何已知方法纯化，如柱色谱法、凝胶过滤色谱法和尺寸排阻色谱法。在一些实施方案中，纯化包括以下步骤中的一个或多个：磷酸酶处理、HPLC尺寸排阻纯化和RNA酶R消化。在一些实施方案中，纯化依次包括以下步骤：RNA酶R消化、磷酸酶处理和HPLC尺寸排阻纯化。在一些实施方案中，纯化包括反相HPLC。在一些实施方案中，与未纯化的RNA相比，纯化的组合物含有更少的双链RNA、DNA夹板、三磷酸化RNA、磷酸酶蛋白、蛋白连接酶、加帽酶和/或切口RNA。在一些实施方案中，纯化的组合物的免疫原性低于未纯化的组合物。在一些实施方案中，与暴露于未纯化的组合物的免疫细胞相比，暴露于纯化组合物的免疫细胞产生更少的TNFα、RIG-I、IL-2、IL-6、IFNγ和/或1型干扰素(例如，IFN-β1)。
7.纳米颗粒
在某些方面，本文提供了包含本文提供的环状RNA的药物组合物。在某些实施方案中，将此类药物组合物用纳米颗粒配制以促进递送。
在某些实施方案中，本文提供的环状RNA可以转移媒介物例如纳米颗粒或包含纳米颗粒的组合物的形式递送和/或靶向至细胞。在一些实施方案中，环状RNA还可以转移媒介物或包含转移媒介物的组合物形式递送给受试者。在一些实施方案中，转移媒介物是纳米颗粒。在一些实施方案中，纳米颗粒是脂质纳米颗粒、固体脂质纳米颗粒、聚合物核-壳纳米颗粒或生物可降解纳米颗粒。在一些实施方案中，转移媒介物包含或包被有一种或多种阳离子脂质、非阳离子脂质、可电离脂质、PEG修饰的脂质、聚谷氨酸聚合物、透明质酸聚合物、聚β-氨基酯、聚β氨基肽或带正电荷的肽。
在一个实施方案中，可选择和/或制备转移媒介物以优化circRNA至靶细胞的递送。例如，如果靶细胞是肝细胞，则可优化转移媒介物的性质(例如，大小、电荷和/或pH)以有效地将这种转移媒介物递送至靶细胞，减少免疫清除和/或促进在所述靶细胞中的保留。
本发明考虑使用转移媒介物来促进将核酸递送至靶细胞。脂质体(例如，脂质体脂质纳米颗粒)通常适用于研究、工业和医学中的各种应用，尤其其在体内用作诊断性或治疗性化合物的转移媒介物(Lasic,Trends Biotechnol.,16:307-321,1998；Drummond等人,Pharmacol.Rev.,51:691-743,1999)并且通常特征为微观囊泡，其具有通过一个或多个双层膜与外部介质隔离的内部含水空间。脂质体的双层膜通常由两亲性分子形成，如合成或天然来源的脂质，所述脂质包含空间分离的亲水性和疏水性结构域(Lasic,TrendsBiotechnol.,16:307-321,1998)。脂质体的双层膜也可通过两亲性聚合物和表面活性剂(例如，聚合物囊泡、囊泡等)来形成。
在本发明的上下文中，转移媒介物通常用于将环状RNA运输至靶细胞。对于本发明的目的，转移媒介物被制备为含有或包封所需的核酸。将所需实体(例如，核酸)并入脂质体的过程通常被称为负载(Lasic等人,FEBS Lett.,312:255-258,1992)。并入脂质体的核酸可完全或部分位于脂质体的内部空间、脂质体的双层膜内，或与脂质体膜的外部表面相关联。将circRNA并入转移媒介物如脂质体的目的经常是保护核酸免于可能含有使核酸降解的酶或化学品和/或导致核酸快速***的***或受体的环境。因此，在本发明的一个实施方案中，选定的转移媒介物能够增强其中所含的circRNA的稳定性。脂质体能够允许包封的circRNA到达靶细胞，或者可替代地限制这种circRNA递送至其他部位或细胞，在所述部位或细胞中所施用的circRNA的存在可能是无用的或不合乎需要的。此外，将circRNA并入转移媒介物例如阳离子脂质体中也有助于将这种circRNA递送至靶细胞中。在一些实施方案中，本文公开的转移媒介物可用于促进例如包封在转移媒介物(例如，脂质纳米颗粒)中的内容物的内体或溶酶体释放。
理想地，转移媒介物被制备为包封一种或多种所需的circRNA，以使得组合物展现高转染效率和增强的稳定性。虽然脂质体可促进将核酸引入靶细胞中，但添加聚阳离子(例如，聚L-赖氨酸和鱼精蛋白)作为共聚物可在一些情况下使几种类型的阳离子脂质体在体外和体内在许多细胞系中的转染效率显著增强2-28倍。(参见N J.Caplen等人,GeneTher.1995；2:603；S.Li等人,Gene Ther.1997；4,891。)
在本文公开的某些实施方案中是可电离脂质，所述脂质可用作转移媒介物的组分以促进或增强环状RNA至一个或多个靶细胞的递送和释放(例如，通过渗透或与此类靶细胞的脂质膜融合)。在某些实施方案中，可电离脂质包含一个或多个可裂解官能团(例如，二硫键)，所述官能团允许例如亲水性官能头基与化合物的亲脂性官能尾基解离(例如，在暴露于氧化、还原或酸性条件时)，从而促进一个或多个靶细胞的脂质双层中的相变。
在一些实施方案中，可电离脂质是如国际专利申请PCT/US2018/058555中所述的脂质。
在一些实施方案中，阳离子脂质具有下式：
Figure BDA0003951010620001181
其中：
R1和R2相同或不同，并且独立地是任选取代的C10-C24烷基、任选取代的C10-C24烯基、任选取代的C10-C24炔基或任选取代的C10-C24酰基；
R3和R4相同或不同，并且独立地是任选取代的C1-C6烷基、任选取代的C2-C6烯基或任选取代的C2-C6炔基，或者R3和R4可连接形成4至6个碳原子和1或2个选自氮和氧的杂原子的任选取代的杂环；
R5不存在或存在，并且当存在时是氢或C1-C6烷基；m、n和p相同或不同，并且独立地是0或1，条件是m、n和p不同时为0；q是0、1、2、3或4；并且
Y和Z相同或不同，并且独立地是O、S或NH。
在一个实施方案中，R1和R2各自是亚油基，并且氨基脂质是二亚油基氨基脂质。
在一个实施方案中，氨基脂质是二亚油基氨基脂质。
在各种其他实施方案中，阳离子脂质具有以下结构：
Figure BDA0003951010620001191
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
R1和R2各自独立地选自由H和C1-C3烷基组成的组；并且
R3和R4各自独立地是具有约10至约20个碳原子的烷基，其中R3和R4中的至少一者包含至少两个不饱和位点。
在一些实施方案中，R3和R4各自独立地选自十二碳二烯基、十四碳二烯基、十六碳二烯基、亚油基和二十碳二烯基。在一个实施方案中，R3和R4两者均是亚油基。在一些实施方案中，R3和/或R4可包含至少三个不饱和位点(例如，R3和/或R4可以是例如十二碳三烯基、十四碳三烯基、十六碳三烯基、亚麻基和二十碳三烯基)。
在一些实施方案中，阳离子脂质具有以下结构：
Figure BDA0003951010620001201
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
R1和R2各自独立地选自H和C1-C3烷基；
R3和R4各自独立地是具有约10至约20个碳原子的烷基，其中R3和R4中的至少一者包含至少两个不饱和位点。
在一个实施方案中，R3和R4是相同的，例如，在一些实施方案中，R3和R4两者均是亚油基(C18-烷基)。在另一个实施方案中，R3和R4是不同的，例如，在一些实施方案中，R3是十四碳三烯基(C14-烷基)，并且R4是亚油基(C18-烷基)。在一个优选的实施方案中，本发明的阳离子脂质是对称的，即，R3和R4是相同的。在另一个优选的实施方案中，R3和R4两者均包含至少两个不饱和位点。在一些实施方案中，R3和R4各自独立地选自十二碳二烯基、十四碳二烯基、十六碳二烯基、亚油基和二十碳二烯基。在一个实施方案中，R3和R4两者均是亚油基。在一些实施方案中，R3和/或R4包含至少三个不饱和位点并且各自独立地选自十二碳三烯基、十四碳三烯基、十六碳三烯基、亚麻基和二十碳三烯基。
在各种实施方案中，阳离子脂质具有下式：
Figure BDA0003951010620001202
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
Xaa是具有式-NRN-CR1R2-C(C＝O)-的D-或L-氨基酸残基，或具有式-{NRN-CR1R2-C(C＝O)}n-的肽或氨基酸残基的肽，其中n是2至20的整数；
R1在每次出现时独立地是非氢或氨基酸的取代的或未取代的侧链；
R2和RN在每次出现时独立地是氢、由碳、氧、氮、硫和氢原子或前述的任何组合组成并且具有1至20个碳原子的有机基团、C(1-5)烷基、环烷基、环烷基烷基、C(1-5)烯基、C(1-5)炔基、C(1-5)烷酰基、C(1-5)烷酰基氧基、C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷基、C(1-5)烷氧基-C(1-5)烷氧基、C(1-5)烷基-氨基-C(1-5)烷基-、C(1-5)二烷基-氨基-C(1-5)烷基-、硝基-C(1-5)烷基、氰基-C(1-5)烷基、芳基-C(1-5)烷基、4-联苯基-C(1-5)烷基、羧基或羟基；
Z是-NH-、-O-、-S-、-CH2S-、-CH2S(O)-，或由1-40个选自氢、碳、氧、氮和硫原子的原子组成的有机接头(优选地，Z是-NH-或-O-)；
Rx和Ry独立地是(i)衍生自脂质(其可以是天然存在的或合成的)的亲脂性尾部，例如磷脂、糖脂、三酰基甘油、甘油磷脂、鞘脂、神经酰胺、鞘磷脂、脑苷脂或神经节苷脂，其中所述尾部任选地包含类固醇；(ii)选自氢、羟基、氨基和有机保护基团的氨基酸末端基团；或(iii)取代的或未取代的C(3-22)烷基、C(6-12)环烷基、C(6-12)环烷基-C(3-22)烷基、C(3-22)烯基、C(3-22)炔基、C(3-22)烷氧基或C(6-12)-烷氧基C(3-22)烷基；
在一些实施方案中，Rx和Ry中的一者是如上定义的亲脂性尾部，并且另一者是氨基酸末端基团。在一些实施方案中，Rx和Ry两者均是亲脂性尾部。
在一些实施方案中，Rx和Ry中的至少一者被一个或多个生物可降解基团(例如，-OC(O)-、-C(O)O-、-SC(O)-、-C(O)S-、-OC(S)-、-C(S)O-、-S-S-、-C(O)(NR5)-、-N(R5)C(O)-、-C(S)(NR5)-、-N(R5)C(O)-、-N(R5)C(O)N(R5)-、-OC(O)O-、-OSi(R5)2O-、-C(O)(CR3R4)C(O)O-、-OC(O)(CR3R4)C(O)-或
Figure BDA0003951010620001221
中断。
在一些实施方案中，R11是C2-C8烷基或烯基。
在一些实施方案中，R5的每次出现独立地是H或烷基。
在一些实施方案中，R3和R4的每次出现独立地是H、卤素、OH、烷基、烷氧基、-NH2、烷基氨基或二烷基氨基；或者R3和R4与它们所直接连接的碳原子一起形成环烷基。在一些特定实施方案中，R3和R4的每次出现独立地是H或C1-C4烷基。
在一些实施方案中，Rx和Ry各自独立地具有一个或多个碳-碳双键。
在一些实施方案中，阳离子脂质是以下中的一者：
Figure BDA0003951010620001222
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
R1和R2各自独立地是烷基、烯基或炔基，它们各自可任选地被取代；
R3和R4各自独立地是C1-C6烷基，或者R3和R4一起形成任选取代的杂环。
代表性的有用的二亚油基氨基脂质具有下式：
Figure BDA0003951010620001231
其中n是0、1、2、3或4。
在一个实施方案中，阳离子脂质是DLin-K-DMA。在一个实施方案中，阳离子脂质是DLin-KC2-DMA(上述DLin-K-DMA，其中n是2)。
在一个实施方案中，阳离子脂质具有以下结构：
Figure BDA0003951010620001232
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
R1和R2在每次出现时各自独立地是任选取代的C10-C30烷基、任选取代的C10-C30烯基、任选取代的C10-C30炔基或任选取代的C10-C30酰基；
R3是H、任选取代的C2-C10烷基、任选取代的C2-C10烯基、任选取代的C2-C10炔基、烷基杂环、烷基磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、烷基二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、烷基胺、羟烷基、ω-氨基烷基、ω-(取代的)氨基烷基、ω-磷酸烷基、ω-硫代磷酸烷基、任选取代的聚乙二醇(PEG，mw 100-40K)、任选取代的mPEG(mw 120-40K)、杂芳基或杂环或接头配体，例如，在一些实施方案中，R3是(CΗ3)2Ν(CH2)n-，其中n是1、2、3或4；
E是O、S、N(Q)、C(O)、OC(O)、C(O)O、N(Q)C(O)、C(O)N(Q)、(Q)N(CO)O、O(CO)N(Q)、S(O)、NS(O)2N(Q)、S(O)2、N(Q)S(O)2、SS、O＝N、芳基、杂芳基、环状或杂环，例如-C(O)O，其中-是与R3的连接点；并且
Q是H、烷基、ω-氨基烷基、ω-(取代的)氨基烷基、ω-磷酸烷基或ω-硫代磷酸烷基；
在一个具体实施方案中，实施方案1、2、3、4或5的阳离子脂质具有以下结构：
Figure BDA0003951010620001241
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
E是O、S、N(Q)、C(O)、N(Q)C(O)、C(O)N(Q)、(Q)N(CO)O、O(CO)N(Q)、S(O)、NS(O)2N(Q)、S(O)2、N(Q)S(O)2、SS、O＝N、芳基、杂芳基、环状或杂环；
Q是H、烷基、ω-氨基烷基、ω-(取代的)氨基烷基、ω-磷酸烷基或ω-硫代磷酸烷基；
R1和R2以及Rx在每次出现时各自独立地是H、任选取代的C1-C10烷基、任选取代的C10-C30烷基、任选取代的C10-C30烯基、任选取代的C10-C30炔基、任选取代的C10-C30酰基或接头-配体，条件是R1、R2和Rx中的至少一者不是H；
R3是H、任选取代的C1-C10烷基、任选取代的C2-C10烯基、任选取代的C2-C10炔基、烷基杂环、烷基磷酸酯、烷基硫代磷酸酯、烷基二硫代磷酸酯、烷基膦酸酯、烷基胺、羟烷基、ω-氨基烷基、ω-(取代的)氨基烷基、ω-磷酸烷基、ω-硫代磷酸烷基、任选取代的聚乙二醇(PEG，mw 100-40K)、任选取代的mPEG(mw 120-40K)、杂芳基或杂环或接头-配体；并且
n是0、1、2或3。
在一个实施方案中，实施方案1、2、3、4或5的阳离子脂质具有式I的结构：
Figure BDA0003951010620001251
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1或L2中的一者是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，并且L1或L2中的另一者是-O(C＝O)、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或
-NRaC(＝O)O-或直接键；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1a和R1b在每次出现时独立地是(a)H或C1-C12烷基，或(b)R1a是H或C1-C12烷基，并且R1b与它所结合的碳原子一起与相邻的R1b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R2a和R2b在每次出现时独立地是(a)H或1-C12烷基，或(b)R2a是H或C1-C12烷基，并且R2b与它所结合的碳原子一起与相邻的R2b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R3a和R3b在每次出现时独立地是(a)H或C1-C12烷基，或(b)R3a是H或C1-C12烷基，并且R3b与它所结合的碳原子一起与相邻的R3b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R4a和R4b在每次出现时独立地是(a)H或C1-C12烷基，或(b)R4a是H或C1-C12烷基，并且R4b与它所结合的碳原子一起与相邻的R4b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R5和R6各自独立地是甲基或环烷基；
R7在每次出现时独立地是H或C1-C12烷基；
R8和R9各自独立地是未取代的C1-C12烷基；或者R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成包含一个氮原子的5、6或7元杂环；
a和d各自独立地是0至24的整数；
b和c各自独立地是1至24的整数；
e是1或2；并且
x是0、1或2。
在式I的一些实施方案中，L1和L2独立地是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-。
在式I的某些实施方案中，R1a、R2a、R3a或R4a中的至少一者是C1-C12烷基，或者L1或L2中的至少一者是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-。在其他实施方案中，R1a和R1b在a是6时不是异丙基或者在a是8时不是正丁基。
式I的其他实施方案中，R1a、R2a、R3a或R4a中的至少一者是C1-C12烷基，或者L1或L2中的至少一者是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-；并且
R1a和R1b在a是6时不是异丙基或者在a是8时不是正丁基。
在式I的其他实施方案中，R8和R9各自独立地是未取代的C1-C12烷基；或者R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成包含一个氮原子的5、6或7元杂环；
在式I的某些实施方案中，L1或L2中的任一者可以是-O(C＝O)-或碳-碳双键。L1和L2可各自是-O(C＝O)-或者可各自是碳-碳双键。
在式I的一些实施方案中，L1或L2中的一者是-O(C＝O)-。在其他实施方案中，L1和L2两者均是-O(C＝O)-。
在式I的一些实施方案中，L1或L2中的一者是-(C＝O)O-。在其他实施方案中，L1和L2两者均是-(C＝O)O-。
在式I的一些其他实施方案中，L1或L2中的一者是碳-碳双键。在其他实施方案中，L1和L2两者均是碳-碳双键。
在式I的其他实施方案中，L1或L2中的一者是-O(C＝O)-，并且L1或L2中的另一者是-(C＝O)O-。在更多实施方案中，L1或L2中的一者是-O(C＝O)-，并且L1或L2中的另一者是碳-碳双键。在更多实施方案中，L1或L2中的一者是-(C＝O)O-，并且L1或L2中的另一者是碳-碳双键。
应当理解，如在整个说明书中所用，“碳-碳”双键是指以下结构中的一者：
Figure BDA0003951010620001271
其中Ra和Rb在每次出现时独立地是H或取代基。例如，在一些实施方案中，Ra和Rb在每次出现时独立地是H、C1-C12烷基或环烷基，例如H或C1-C12烷基。
在其他实施方案中，式I的脂质化合物具有下式(Ia)：
Figure BDA0003951010620001281
在其他实施方案中，式I的脂质化合物具有下式(Ib)：
Figure BDA0003951010620001282
在其他实施方案中，式I的脂质化合物具有下式(Ic)：
Figure BDA0003951010620001283
在式I的脂质化合物的某些实施方案中，a、b、c和d各自独立地是2至12的整数或4至12的整数。在其他实施方案中，a、b、c和d各自独立地是8至12或5至9的整数。在一些某些实施方案中，a是0。在一些实施方案中，a是1。在其他实施方案中，a是2。在更多实施方案中，a是3。在其他实施方案中，a是4。在一些实施方案中，a是5。在其他实施方案中，a是6。在更多实施方案中，a是7。在其他实施方案中，a是8。在一些实施方案中，a是9。在其他实施方案中，a是10。在更多实施方案中，a是11。在其他实施方案中，a是12。在一些实施方案中，a是13。在其他实施方案中，a是14。在更多实施方案中，a是15。在其他实施方案中，a是16。
在式I的一些其他实施方案中，b是1。在其他实施方案中，b是2。在更多实施方案中，b是3。在其他实施方案中，b是4。在一些实施方案中，b是5。在其他实施方案中，b是6。在更多实施方案中，b是7。在其他实施方案中，b是8。在一些实施方案中，b是9。在其他实施方案中，b是10。在更多实施方案中，b是11。在其他实施方案中，b是12。在一些实施方案中，b是13。在其他实施方案中，b是14。在更多实施方案中，b是15。在其他实施方案中，b是16。
在式I的一些更多实施方案中，c是1。在其他实施方案中，c是2。在更多实施方案中，c是3。在其他实施方案中，c是4。在一些实施方案中，c是5。在其他实施方案中，c是6。在更多实施方案中，c是7。在其他实施方案中，c是8。在一些实施方案中，c是9。在其他实施方案中，c是10。在更多实施方案中，c是11。在其他实施方案中，c是12。在一些实施方案中，c是13。在其他实施方案中，c是14。在更多实施方案中，c是15。在其他实施方案中，c是16。
在式I的一些某些其他实施方案中，d是0。在一些实施方案中，d是1。在其他实施方案中，d是2。在更多实施方案中，d是3。在其他实施方案中，d是4。在一些实施方案中，d是5。在其他实施方案中，d是6。在更多实施方案中，d是7。在其他实施方案中，d是8。在一些实施方案中，d是9。在其他实施方案中，d是10。在更多实施方案中，d是11。在其他实施方案中，d是12。在一些实施方案中，d是13。在其他实施方案中，d是14。在更多实施方案中，d是15。在其他实施方案中，d是16。在式I的一些其他各种实施方案中，a和d相同。
在一些其他实施方案中，b和c相同。在一些其他具体实施方案中，a和d相同并且b和c相同。
式I中a和b的和以及c和d的和是可改变以获得具有所需性质的式I脂质的因素。在一个实施方案中，选择a和b以使它们的和是14至24范围内的整数。在其他实施方案中，选择c和d以使它们的和是14至24范围内的整数。在其他实施方案中，a和b的和以及c和d的和相同。例如，在一些实施方案中，a和b的和以及c和d的和两者是可在14至24范围内的相同整数。在更多实施方案中，选择a、b、c和d以使a和b的和以及c和d的和是12或更大。
在式I的一些实施方案中，e是1。在其他实施方案中，e是2。
式I的R1a、R2a、R3a和R4a处的取代基没有特别限制。在某些实施方案中，R1a、R2a、R3a和R4a在每次出现时是H。在某些其他实施方案中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一者是C1-C12烷基。在某些其他实施方案中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一者是C1-C8烷基。在某些其他实施方案中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一者是C1-C6烷基。在一些前述实施方案中，C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在式I的某些实施方案中，R1a、R1b、R4a和R4b在每次出现时是C1-C12烷基。
在式I的其他实施方案中，R1b、R2b、R3b和R4b中的至少一者是H，或者R1b、R2b、R3b和R4b在每次出现时是H。
在式(I)的某些实施方案中，R1b与它所结合的碳原子一起与相邻的R1b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键。在前述的其他实施方案中，R4b与它所结合的碳原子一起与相邻的R4b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键。
在前述实施方案中，式I的R5和R6处的取代基没有特别限制。在某些实施方案中，R5或R6中的一者或两者是甲基。在某些其他实施方案中，R5或R6中的一者或两者是环烷基，例如环己基。在这些实施方案中，环烷基可被取代或未被取代。在某些其他实施方案中，环烷基被C1-C12烷基，例如叔丁基取代。
在式I的前述实施方案中，R7处的取代基没有特别限制。在某些实施方案中，至少一个R7是H。在一些其他实施方案中，R7在每次出现时是H。在某些其他实施方案中，R7是C1-C12烷基。
在式I的某些其他前述实施方案中，R8或R9中的一者是甲基。在其他实施方案中，R8和R9两者均是甲基。
在式I的一些不同实施方案中，R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5、6或7元杂环。在前述的一些实施方案中，R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5元杂环，例如吡咯烷基环。
在实施方案3的一些实施方案中，第一和第二阳离子脂质各自独立地选自式I的脂质。
在各种不同的实施方案中，式I的脂质具有以下表1中列出的结构中的一者。
表1：式I的代表性脂质
Figure BDA0003951010620001311
Figure BDA0003951010620001321
Figure BDA0003951010620001331
Figure BDA0003951010620001341
Figure BDA0003951010620001351
Figure BDA0003951010620001361
在一些实施方案中，实施方案1、2、3、4或5的阳离子脂质具有式II的结构：
Figure BDA0003951010620001371
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1或L2中的一者是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，并且L1或L2中的另一者是-O(C＝O)、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或
-NRaC(＝O)O-或直接键；
G1是C1-C2亚烷基、-(C＝O)-、-O(C＝O)-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-或直接键；
G2是-C(＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)S-、-C(＝O)NRa-或直接键；
G3是C1-C6亚烷基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1a和R1b在每次出现时独立地是：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R1a是H或C1-C12烷基，并且R1b与它所结合的碳原子一起与相邻的R1b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R2a和R2b在每次出现时独立地是：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R2a是H或C1-C12烷基，并且R2b与它所结合的碳原子一起与相邻的R2b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R3a和R3b在每次出现时独立地是(a)：H或C1-C12烷基；或(b)R3a是H或C1-C12烷基，并且R3b与它所结合的碳原子一起与相邻的R3b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R4a和R4b在每次出现时独立地是：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R4a是H或C1-C12烷基，并且R4b与它所结合的碳原子一起与相邻的R4b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R5和R6各自独立地是H或甲基；
R7是C4-C20烷基；
R8和R9各自独立地是C1-C12烷基；或者R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5、6或7元杂环；
a、b、c和d各自独立地是1至24的整数；并且
x是0、1或2。
在式(II)的一些实施方案中，L1和L2各自独立地是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或直接键。在其他实施方案中，G1和G2各自独立地是-(C＝O)-或直接键。在一些不同的实施方案中，L1和L2各自独立地是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或直接键；并且G1和G2各自独立地是-(C＝O)-或直接键。
在式(II)的一些不同实施方案中，L1和L2各自独立地是-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRa-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa、-OC(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)O-、-NRaS(O)xNRa-、-NRaS(O)x-或-S(O)xNRa-。
在式(II)的其他前述实施方案中，脂质化合物具有以下式(IIA)或(IIB)中的一者：
Figure BDA0003951010620001391
在式(II)的一些实施方案中，脂质化合物具有式(IIA)。在其他实施方案中，脂质化合物具有式(IIB)。
在式(II)的任何前述实施方案中，L1或L2中的一者是-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L1和L2各自是-O(C＝O)-。
在式(II)的一些不同实施方案中，L1或L2中的一者是-(C＝O)O-。例如，在一些实施方案中，L1和L2各自是-(C＝O)O-。
在式(II)的不同实施方案中，L1或L2中的一者是直接键。如本文所用，“直接键”是指基团(例如，L1或L2)不存在。例如，在一些实施方案中，L1和L2各自是直接键。
在式(II)的其他不同实施方案中，对于R1a和R1b的至少一次出现，R1a是H或C1-C12烷基，并且R1b与它所结合的碳原子一起与相邻的R1b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键。
在式(II)的其他不同实施方案中，对于R4a和R4b的至少一次出现，R4a是H或C1-C12烷基，并且R4b与它所结合的碳原子一起与相邻的R4b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键。
在式(II)的更多实施方案中，对于R2a和R2b的至少一次出现，R2a是H或C1-C12烷基，并且R2b与它所结合的碳原子一起与相邻的R2b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键。
在式(II)的其他不同实施方案中，对于R3a和R3b的至少一次出现，R3a是H或C1-C12烷基，并且R3b与它所结合的碳原子一起与相邻的R3b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键。
在式(II)的各种其他实施方案中，脂质化合物具有以下式(IIC)或(IID)中的一者：
Figure BDA0003951010620001401
其中e、f、g和h各自独立地是1至12的整数。
在式(II)的一些实施方案中，脂质化合物具有式(IIC)。在其他实施方案中，脂质化合物具有式(IID)。
在式(IIC)或(IID)的各种实施方案中，e、f、g和h各自独立地是4至10的整数。
在式(II)的某些实施方案中，a、b、c和d各自独立地是2至12的整数或4至12的整数。在其他实施方案中，a、b、c和d各自独立地是8至12或5至9的整数。在一些某些实施方案中，a是0。在一些实施方案中，a是1。在其他实施方案中，a是2。在更多实施方案中，a是3。在其他实施方案中，a是4。在一些实施方案中，a是5。在其他实施方案中，a是6。在更多实施方案中，a是7。在其他实施方案中，a是8。在一些实施方案中，a是9。在其他实施方案中，a是10。在更多实施方案中，a是11。在其他实施方案中，a是12。在一些实施方案中，a是13。在其他实施方案中，a是14。在更多实施方案中，a是15。在其他实施方案中，a是16。
在式(II)的一些实施方案中，b是1。在其他实施方案中，b是2。在更多实施方案中，b是3。在其他实施方案中，b是4。在一些实施方案中，b是5。在其他实施方案中，b是6。在更多实施方案中，b是7。在其他实施方案中，b是8。在一些实施方案中，b是9。在其他实施方案中，b是10。在更多实施方案中，b是11。在其他实施方案中，b是12。在一些实施方案中，b是13。在其他实施方案中，b是14。在更多实施方案中，b是15。在其他实施方案中，b是16。
在式(II)的一些实施方案中，c是1。在其他实施方案中，c是2。在更多实施方案中，c是3。在其他实施方案中，c是4。在一些实施方案中，c是5。在其他实施方案中，c是6。在更多实施方案中，c是7。在其他实施方案中，c是8。在一些实施方案中，c是9。在其他实施方案中，c是10。在更多实施方案中，c是11。在其他实施方案中，c是12。在一些实施方案中，c是13。在其他实施方案中，c是14。在更多实施方案中，c是15。在其他实施方案中，c是16。
在式(II)的一些某些实施方案中，d是0。在一些实施方案中，d是1。在其他实施方案中，d是2。在更多实施方案中，d是3。在其他实施方案中，d是4。在一些实施方案中，d是5。在其他实施方案中，d是6。在更多实施方案中，d是7。在其他实施方案中，d是8。在一些实施方案中，d是9。在其他实施方案中，d是10。在更多实施方案中，d是11。在其他实施方案中，d是12。在一些实施方案中，d是13。在其他实施方案中，d是14。在更多实施方案中，d是15。在其他实施方案中，d是16。
在式(II)的一些实施方案中，e是1。在其他实施方案中，e是2。在更多实施方案中，e是3。在其他实施方案中，e是4。在一些实施方案中，e是5。在其他实施方案中，e是6。在更多实施方案中，e是7。在其他实施方案中，e是8。在一些实施方案中，e是9。在其他实施方案中，e是10。在更多实施方案中，e是11。在其他实施方案中，e是12。
在式(II)的一些实施方案中，f是1。在其他实施方案中，f是2。在更多实施方案中，f是3。在其他实施方案中，f是4。在一些实施方案中，f是5。在其他实施方案中，f是6。在更多实施方案中，f是7。在其他实施方案中，f是8。在一些实施方案中，f是9。在其他实施方案中，f是10。在更多实施方案中，f是11。在其他实施方案中，f是12。
在式(II)的一些实施方案中，g是1。在其他实施方案中，g是2。在更多实施方案中，g是3。在其他实施方案中，g是4。在一些实施方案中，g是5。在其他实施方案中，g是6。在更多实施方案中，g是7。在其他实施方案中，g是8。在一些实施方案中，g是9。在其他实施方案中，g是10。在更多实施方案中，g是11。在其他实施方案中，g是12。
在式(II)的一些实施方案中，h是1。在其他实施方案中，e是2。在更多实施方案中，h是3。在其他实施方案中，h是4。在一些实施方案中，e是5。在其他实施方案中，h是6。在更多实施方案中，h是7。在其他实施方案中，h是8。在一些实施方案中，h是9。在其他实施方案中，h是10。在更多实施方案中，h是11。在其他实施方案中，h是12。
在式(II)的一些其他各种实施方案中，a和d相同。在一些其他实施方案中，b和c相同。在一些其他具体实施方案中，a和d相同并且b和c相同。
式(II)的a和b的和以及c和d的和是可改变以获得具有所需性质的脂质的因素。在一个实施方案中，选择a和b以使它们的和是14至24范围内的整数。在其他实施方案中，选择c和d以使它们的和是14至24范围内的整数。在其他实施方案中，a和b的和以及c和d的和相同。例如，在一些实施方案中，a和b的和以及c和d的和两者是可在14至24范围内的相同整数。在更多实施方案中，选择a、b、c和d以使a和b的和以及c和d的和是12或更大。
式(II)的R1a、R2a、R3a和R4a处的取代基没有特别限制。在一些实施方案中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一者是H。在某些实施方案中，R1a、R2a、R3a和R4a在每次出现时是H。在某些其他实施方案中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一者是C1-C12烷基。在某些其他实施方案中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一者是C1-C8烷基。在某些其他实施方案中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一者是C1-C6烷基。在一些前述实施方案中，C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在式(II)的某些实施方案中，R1a、R1b、R4a和R4b在每次出现时是C1-C12烷基。
在式(II)的其他实施方案中，R1b、R2b、R3b和R4b中的至少一者是H，或者R1b、R2b、R3b和R4b在每次出现时是H。
在式(II)的某些实施方案中，R1b与它所结合的碳原子一起与相邻的R1b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键。在前述的其他实施方案中，R4b与它所结合的碳原子一起与相邻的R4b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键。
在前述实施方案中，式(II)的R5和R6处的取代基没有特别限制。在某些实施方案中，R5或R6中的一者是甲基。在其他实施方案中，R5或R6各自是甲基。
在前述实施方案中，式(II)的R7处的取代基没有特别限制。在某些实施方案中，R7是C6-C16烷基。在一些其他实施方案中，R7是C6-C9烷基。在这些实施方案的一些中，R7被-(C＝O)ORb、-O(C＝O)Rb、-C(＝O)Rb、-ORb、-S(O)xRb、-S-SRb、-C(＝O)SRb、-SC(＝O)Rb、-NRaRb、-NRaC(＝O)Rb、-C(＝O)NRaRb、-NRaC(＝O)NRaRb、-OC(＝O)NRaRb、-NRaC(＝O)ORb、-NRaS(O)xNRaRb、-NRaS(O)xRb或-S(O)xNRaRb，其中：Ra是H或C1-C12烷基；Rb是C1-C15烷基；并且x是0、1或2。例如，在一些实施方案中，R7被-(C＝O)ORb或-O(C＝O)Rb取代。
在式(II)的一些前述实施方案中，Rb是支链C1-C16烷基。例如，在一些实施方案中，Rb具有以下结构中的一者：
Figure BDA0003951010620001441
在式(II)的某些其他前述实施方案中，R8或R9中的一者是甲基。在其他实施方案中，R8和R9两者均是甲基。
在式(II)的一些不同实施方案中，R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5、6或7元杂环。在前述的一些实施方案中，R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成5元杂环，例如吡咯烷基环。在前述的一些不同实施方案中，R8和R9与它们所连接的氮原子一起形成6元杂环，例如哌嗪基环。
在实施方案3的某些实施方案中，第一和第二阳离子脂质各自独立地选自式II的脂质。
在前述式(II)脂质的其他实施方案中，G3是C2-C4亚烷基，例如C3亚烷基。在各种不同的实施方案中，脂质化合物具有以下表2中列出的结构中的一者
表2：式(II)的代表性脂质
Figure BDA0003951010620001451
Figure BDA0003951010620001461
Figure BDA0003951010620001471
Figure BDA0003951010620001481
Figure BDA0003951010620001491
Figure BDA0003951010620001501
Figure BDA0003951010620001511
Figure BDA0003951010620001521
在一些其他实施方案中，实施方案1、2、3、4或5的阳离子脂质具有式III的结构：
Figure BDA0003951010620001522
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
L1或L2中的一者是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或-NRaC(＝O)O-，并且L1或L2中的另一者是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-或
-NRaC(＝O)O-或直接键；
G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；
G3是C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基、C3-C8亚环烯基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3是H、OR5、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NR5C(＝O)R4；
R4是C1-C12烷基；
R5是H或C1-C6烷基；并且
x是0、1或2。
在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有以下式(IIIA)或(IIIB)中的一者：
Figure BDA0003951010620001531
其中：
A是3至8元环烷基或亚环烷基环；
R6在每次出现时独立地是H、OH或C1-C24烷基；n是1至15范围内的整数。
在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有式(IIIA)，并且在其他实施方案中，脂质具有式(IIIB)。
在式(III)的其他实施方案中，脂质具有以下式(IIIC)或(IIID)中的一者：
Figure BDA0003951010620001532
其中y和z各自独立地是1至12范围内的整数。
在式(III)的任何前述实施方案中，L1或L2中的一者是-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L1和L2各自是-O(C＝O)-。在任何前述的一些不同实施方案中，L1和L2各自独立地是-(C＝O)O-或-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L1和L2各自是-(C＝O)O-。
在式(III)的一些不同实施方案中，脂质具有以下式(IIIE)或(IIIF)中的一者：
Figure BDA0003951010620001541
在式(III)的一些前述实施方案中，脂质具有以下式(IIIG)、(IIIH)、(IIII)或(IIIJ)中的一者：
Figure BDA0003951010620001542
在式(III)的一些前述实施方案中，n是2至12，例如2至8或2至4范围内的整数。例如，在一些实施方案中，n是3、4、5或6。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，n是4。在一些实施方案中，n是5。在一些实施方案中，n是6。
在式(III)的一些其他前述实施方案中，y和z各自独立地是2至10范围内的整数。例如，在一些实施方案中，y和z各自独立地是4至9或4至6范围内的整数。
在式(III)的一些前述实施方案中，R6是H。在其他前述实施方案中，R6是C1-C24烷基。在其他实施方案中，R6是OH。
在式(III)的一些实施方案中，G3未被取代。在其他实施方案中，G3被取代。在各种不同的实施方案中，G3是直链C1-C24亚烷基或直链C1-C24亚烯基。
在式(III)的一些其他前述实施方案中，R1或R2或两者是C6-C24烯基。例如，在一些实施方案中，R1和R2各自独立地具有以下结构：
Figure BDA0003951010620001551
其中：
R7a和R7b在每次出现时独立地是H或C1-C12烷基；并且
a是2至12的整数，
其中各自选择R7a、R7b和a以使R1和R2各自独立地包含6至20个碳原子。例如，在一些实施方案中，a是5至9或8至12范围内的整数。
在式(III)的一些前述实施方案中，R7a的至少一次出现是H。例如，在一些实施方案中，R7a在每次出现时是H。在前述的其他不同实施方案中，R7b的至少一次出现是C1-C8烷基。例如，在一些实施方案中，C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在式(III)的不同实施方案中，R1或R2或两者具有以下结构中的一者：
Figure BDA0003951010620001561
在式(III)的一些前述实施方案中，R3是OH、CN、-C(＝O)OR4、-OC(＝O)R4或-NHC(＝O)R4。在一些实施方案中，R4是甲基或乙基。
在实施方案3的一些具体实施方案中，第一和第二阳离子脂质各自独立地选自式III的脂质。
在各种不同的实施方案中，式(III)的公开的实施方案中的任一者的阳离子脂质(例如，阳离子脂质、第一阳离子脂质、第二阳离子脂质)具有以下表3中列出的结构中的一者。
表3：式(III)的代表性化合物
Figure BDA0003951010620001562
Figure BDA0003951010620001571
Figure BDA0003951010620001581
Figure BDA0003951010620001591
Figure BDA0003951010620001601
Figure BDA0003951010620001611
Figure BDA0003951010620001621
Figure BDA0003951010620001631
在一个实施方案中，实施方案1、2、3、4或5中任一项的阳离子脂质具有式(IV)的结构：
Figure BDA0003951010620001632
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
G1或G2中的一者在每次出现时是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)y-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-N(Ra)C(＝O)-、-C(＝O)N(Ra)-、-N(Ra)C(＝O)N(Ra)-、-OC(＝O)N(Ra)-或-N(Ra)C(＝O)O-，并且G1或G2中的另一者在每次出现时是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)y-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-N(Ra)C(＝O)-、-C(＝O)N(Ra)-、-N(Ra)C(＝O)N(Ra)-、-OC(＝O)N(Ra)-或-N(Ra)C(＝O)O-或直接键；
L在每次出现时是～O(C＝O)-，其中～表示与X的共价键；
X是CRa；
Z是烷基、环烷基或当n是1时是包含至少一个极性官能团的单价部分；或者Z是亚烷基、亚环烷基或当n大于1时是包含至少一个极性官能团的多价部分；
Ra在每次出现时独立地是H、C1-C12烷基、C1-C12羟基烷基、C1-C12氨基烷基、C1-C12烷基胺基烷基、C1-C12烷氧基烷基、C1-C12烷氧基羰基、C1-C12烷基羰基氧基、C1-C12烷基羰基氧基烷基或C1-C12烷基羰基；
R在每次出现时独立地是：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R与它所结合的碳原子一起与相邻的R和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R1和R2在每次出现时分别具有以下结构：
Figure BDA0003951010620001641
a1和a2在每次出现时独立地是3至12的整数；
b1和b2在每次出现时独立地是0或1；
c1和c2在每次出现时独立地是5至10的整数；
d1和d2在每次出现时独立地是5至10的整数；
y在每次出现时独立地是0至2的整数；并且
n是1至6的整数，
其中每个烷基、亚烷基、羟基烷基、氨基烷基、烷基胺基烷基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷基羰基氧基、烷基羰基氧基烷基和烷基羰基任选地被一个或多个取代基取代。
在式(IV)的一些实施方案中，G1和G2各自独立地是
-O(C＝O)-或-(C＝O)O-。
在式(IV)的其他实施方案中，X是CH，
在式(IV)的不同实施方案中，a1+b1+c1的和或a2+b2+c2的和是12至26的整数。
在式(IV)的其他实施方案中，a1和a2独立地是3至10的整数。例如，在一些实施方案中，a1和a2独立地是4至9的整数。
在式(IV)的各种实施方案中，b1和b2是0。在不同的实施方案中，b1和b2是1。
在式(IV)的更多实施方案中，c1、c2、d1和d2独立地是6至8的整数。
在式(IV)的其他实施方案中，c1和c2在每次出现时独立地是6至10的整数，并且d1和d2在每次出现时独立地是6至10的整数。
在式(IV)的其他实施方案中，c1和c2在每次出现时独立地是5至9的整数，并且d1和d2在每次出现时独立地是5至9的整数。
在式(IV)的更多实施方案中，Z是烷基、环烷基或当n是1时是包含至少一个极性官能团的单价部分。在其他实施方案中，Z是烷基。
在前述式(IV)的各种实施方案中，R在每次出现时独立地是：(a)H或甲基；或(b)R与它所结合的碳原子一起与相邻的R和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键。在某些实施方案中，每个R是H。在其他实施方案中，至少一个R与它所结合的碳原子一起与相邻的R和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键。
在式(IV)化合物的其他实施方案中，R1和R2独立地具有以下结构中的一者：
Figure BDA0003951010620001661
在式(IV)的某些实施方案中，化合物具有以下结构中的一者：
Figure BDA0003951010620001671
Figure BDA0003951010620001681
Figure BDA0003951010620001691
在不同的实施方案中，实施方案1、2、3、4或5的阳离子脂质具有式(V)的结构：
Figure BDA0003951010620001701
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
G1或G2中的一者在每次出现时是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)y-、-S-S-、-C(＝O)S-、SC(＝O)-、-N(Ra)C(＝O)-、-C(＝O)N(Ra)-、-N(Ra)C(＝O)N(Ra)-、-OC(＝O)N(Ra)-或-N(Ra)C(＝O)O-，并且G1或G2中的另一者在每次出现时是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)y-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-N(Ra)C(＝O)-、-C(＝O)N(Ra)-、-N(Ra)C(＝O)N(Ra)-、-OC(＝O)N(Ra)-或-N(Ra)C(＝O)O-或直接键；
L在每次出现时是～O(C＝O)-，其中～表示与X的共价键；
X是CRa；
Z是烷基、环烷基或当n是1时是包含至少一个极性官能团的单价部分；或者Z是亚烷基、亚环烷基或当n大于1时是包含至少一个极性官能团的多价部分；
Ra在每次出现时独立地是H、C1-C12烷基、C1-C12羟基烷基、C1-C12氨基烷基、C1-C12烷基胺基烷基、C1-C12烷氧基烷基、C1-C12烷氧基羰基、C1-C12烷基羰基氧基、C1-C12烷基羰基氧基烷基或C1-C12烷基羰基；
R在每次出现时独立地是：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R与它所结合的碳原子一起与相邻的R和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R1和R2在每次出现时分别具有以下结构：
Figure BDA0003951010620001711
R'在每次出现时独立地是H或C1-C12烷基；
a1和a2在每次出现时独立地是3至12的整数；
b1和b2在每次出现时独立地是0或1；
c1和c2在每次出现时独立地是2至12的整数；
d1和d2在每次出现时独立地是2至12的整数；
y在每次出现时独立地是0至2的整数；并且
n是1至6的整数，
其中选择a1、a2、c1、c2、d1和d2以使a1+c1+d1的和是18至30的整数，并且a2+c2+d2的和是18至30的整数，并且其中每个烷基、亚烷基、羟烷基、氨基烷基、烷基胺基烷基、烷氧基烷基、烷氧基羰基、烷基羰基氧基、烷基羰基氧基烷基和烷基羰基任选地被一个或多个取代基取代。
在式(V)的某些实施方案中，G1和G2各自独立地是
-O(C＝O)-或-(C＝O)O-。
在式(V)的其他实施方案中，X是CH。
在式(V)的一些实施方案中，a1+c1+d1的和是20至30的整数，并且a2+c2+d2的和是18至30的整数。在其他实施方案中，a1+c1+d1的和是20至30的整数，并且a2+c2+d2的和是20至30的整数。在式(V)的更多实施方案中，a1+b1+c1的和或a2+b2+c2的和是12至26的整数。在其他实施方案中，选择a1、a2、c1、c2、d1和d2以使a1+c1+d1的和是18至28的整数，并且a2+c2+d2的和是18至28的整数，
在式(V)的其他实施方案中，a1和a2独立地是3至10的整数，例如4至9的整数。
在式(V)的其他实施方案中，b1和b2是0。在不同的实施方案中，b1和b2是1。
在式(V)的某些其他实施方案中，c1、c2、d1和d2独立地是6至8的整数。
在式(V)的不同其他实施方案中，Z是烷基或当n是1时是包含至少一个极性官能团的单价部分；或者Z是亚烷基或当n大于1时是包含至少一个极性官能团的多价部分。
在式(V)的更多实施方案中，Z是烷基、环烷基或当n是1时是包含至少一个极性官能团的单价部分。在其他实施方案中，Z是烷基。
在式(V)的其他不同实施方案中，R在每次出现时独立地是：(a)H或甲基；或(b)R与它所结合的碳原子一起与相邻的R和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键。例如，在一些实施方案中，每个R是H。在其他实施方案中，至少一个R与它所结合的碳原子一起与相邻的R和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键。
在更多实施方案中，每个R'是H。
在式(V)的某些实施方案中，a1+c1+d1的和是20至25的整数，并且a2+c2+d2的和是20至25的整数。
在式(V)的其他实施方案中，R1和R2独立地具有以下结构中的一者：
Figure BDA0003951010620001731
在式(V)的更多实施方案中，化合物具有以下结构中的一者：
Figure BDA0003951010620001732
Figure BDA0003951010620001741
Figure BDA0003951010620001751
在式(IV)或(V)的任何前述实施方案中，n是1。在式(IV)或(V)的其他前述实施方案中，n大于1。
在式(IV)或(V)的更多任何前述实施方案中，Z是包含至少一个极性官能团的单价或多价部分。在一些实施方案中，Z是包含至少一个极性官能团的单价部分。在其他实施方案中，Z是包含至少一个极性官能团的多价部分。
在式(IV)或(V)的更多任何前述实施方案中，极性官能团是羟基、烷氧基、酯、氰基、酰胺、氨基、烷基胺基、杂环基或杂芳基官能团。
在式(IV)或(V)的任何前述实施方案中，Z是羟基、羟烷基、烷氧基烷基、氨基、氨基烷基、烷基胺基、烷基胺基烷基、杂环基或杂环基烷基。
在式(IV)或(V)的一些其他实施方案中，Z具有以下结构：
Figure BDA0003951010620001761
其中：
R5和R6独立地是H或C1-C6烷基；
R7和R8独立地是H或C1-C6烷基，或者R7和R8与它们所连接的氮原子一起连接形成3-7元杂环；并且
x是0至6的整数。
在式(IV)或(V)的不同实施方案中，Z具有以下结构：
Figure BDA0003951010620001771
其中：
R5和R6独立地是H或C1-C6烷基；
R7和R8独立地是H或C1-C6烷基，或者R7和R8与它们所连接的氮原子一起连接形成3-7元杂环；并且
x是0至6的整数。
在式(IV)或(V)的不同实施方案中，Z具有以下结构：
Figure BDA0003951010620001772
其中：
R5和R6独立地是H或C1-C6烷基；
R7和R8独立地是H或C1-C6烷基，或者R7和R8与它们所连接的氮原子一起连接形成3-7元杂环；并且
x是0至6的整数。
在式(IV)或(V)的一些其他实施方案中，Z是羟基烷基、氰基烷基或被一个或多个酯或酰胺基团取代的烷基。
例如，在式(IV)或(V)的任何前述实施方案中，Z具有以下结构中的一者：
Figure BDA0003951010620001781
在式(IV)或(V)的其他实施方案中，Z-L具有以下结构中的一者：
Figure BDA0003951010620001782
Figure BDA0003951010620001791
在其他实施方案中，Z-L具有以下结构中的一者：
Figure BDA0003951010620001792
在其他实施方案中，X是CH并且Z-L具有以下结构中的一者：
Figure BDA0003951010620001801
在各种不同实施方案中，实施方案1、2、3、4或5中任一项的阳离子脂质具有以下表4中列出的结构中的一者。
表4：式(IV)或(V)的代表性化合物
Figure BDA0003951010620001802
在一个实施方案中，阳离子脂质是具有以下结构(VI)的化合物：
Figure BDA0003951010620001803
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1和L2各自独立地是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa-、-OC(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)O-或直接键；
G1是C1-C2亚烷基、-(C＝O)-、-O(C＝O)-、-SC(＝O)-、-NRaC(＝O)-或直接键；
G2是-C(＝O)-、-(C＝O)O-、-C(＝O)S-、-C(＝O)NRa-或直接键；
G3是C1-C6亚烷基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1a和R1b在每次出现时独立地是：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R1a是H或C1-C12烷基，并且R1b与它所结合的碳原子一起与相邻的R1b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R2a和R2b在每次出现时独立地是：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R2a是H或C1-C12烷基，并且R2b与它所结合的碳原子一起与相邻的R2b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R3a和R3b在每次出现时独立地是(a)：H或C1-C12烷基；或(b)R3a是H或C1-C12烷基，并且R3b与它所结合的碳原子一起与相邻的R3b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R4a和R4b在每次出现时独立地是：(a)H或C1-C12烷基；或(b)R4a是H或C1-C12烷基，并且R4b与它所结合的碳原子一起与相邻的R4b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键；
R5和R6各自独立地是H或甲基；
R7是H或C1-C20烷基。
R8是OH、-N(R9)(C＝O)R10、-(C-O)NR9R10、-NR9R10、-(C＝O)OR11或-O(C＝O)R11，条件是当R8是-NR9R10时，G3是C4-C6亚烷基，
R9和R10各自独立地是H或C1-C12烷基；
R11是芳烷基；
a、b、c和d各自独立地是1至24的整数；并且x是0、1或2。
其中每个烷基、亚烷基和芳烷基任选地被取代。
在结构(VI)的一些实施方案中，L1和L2各自独立地是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或直接键。在其他实施方案中，G1和G2各自独立地是-(C＝O)-或直接键。在一些不同的实施方案中，L1和L2各自独立地是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或直接键；并且G1和G2各自独立地是-(C＝O)-或直接键。
在结构(VI)的一些不同实施方案中，L1和L2各自独立地是-C(＝O)-、-O-、-S(O)x-、-S-S-、-C(＝O)S-、-SC(＝O)-、-NRa-、-NRaC(＝O)-、-C(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)NRa、-OC(＝O)NRa-、-NRaC(＝O)O-、-NRaS(O)xNRa-、-NRaS(O)x-或-S(O)xNRa-。
在结构(VI)的其他前述实施方案中，化合物具有以下结构(VIA)或(VIB)中的一者：
Figure BDA0003951010620001821
在一些实施方案中，化合物具有结构(VIA)。在其他实施方案中，化合物具有结构(VIB)。
在结构(VI)的任何前述实施方案中，L1或L2中的一者是-O(C＝O)-。例如，在一些实施方案中，L1和L2各自是-O(C＝O)-。
在任何前述的一些不同实施方案中，L1或L2中的一者是-(C＝O)O-。例如，在一些实施方案中，L1和L2各自是-(C＝O)O-。
在结构(VI)的不同实施方案中，L1或L2中的一者是直接键。如本文所用，“直接键”是指基团(例如，L1或L2)不存在。例如，在一些实施方案中，L1和L2各自是直接键。
在前述的其他不同实施方案中，对于R1a和R1b的至少一次出现，R1a是H或C1-C12烷基，并且R1b与它所结合的碳原子一起与相邻的R1b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键。
在结构(VI)的其他不同实施方案中，对于R4a和R4b的至少一次出现，R4a是H或C1-C12烷基，并且R4b与它所结合的碳原子一起与相邻的R4b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键。
在结构(VI)的更多实施方案中，对于R2a和R2b的至少一次出现，R2a是H或C1-C12烷基，并且R2b与它所结合的碳原子一起与相邻的R2b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键。
在前述任一者的其他不同实施方案中，对于R3a和R3b的至少一次出现，R3a是H或C1-C12烷基，并且R3b与它所结合的碳原子一起与相邻的R3b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键。
应理解，“碳-碳”双键是指以下结构中的一者：
Figure BDA0003951010620001831
其中Rc和Rd在每次出现时独立地是H或取代基。例如，在一些实施方案中，Rc和Rd在每次出现时独立地是H、C1-C12烷基或环烷基，例如H或C1-C12烷基。
在各种其他实施方案中，化合物具有以下结构(VIC)或(VID)中的一者：
Figure BDA0003951010620001841
其中e、f、g和h各自独立地是1至12的整数。
在一些实施方案中，化合物具有结构(VIC)。在其他实施方案中，化合物具有结构(VID)。
在结构(VIC)或(VID)的化合物的各种实施方案中，e、f、g和h各自独立地是4至10的整数。
在其他不同的实施方案中，
Figure BDA0003951010620001842
或两者独立地具有以下结构中的一者：
Figure BDA0003951010620001851
在前述的某些实施方案中，a、b、c和d各自独立地是2至12的整数或4至12的整数。在其他实施方案中，a、b、c和d各自独立地是8至12或5至9的整数。在一些某些实施方案中，a是0。在一些实施方案中，a是1。在其他实施方案中，a是2。在更多实施方案中，a是3。在其他实施方案中，a是4。在一些实施方案中，a是5。在其他实施方案中，a是6。在更多实施方案中，a是7。在其他实施方案中，a是8。在一些实施方案中，a是9。在其他实施方案中，a是10。在更多实施方案中，a是11。在其他实施方案中，a是12。在一些实施方案中，a是13。在其他实施方案中，a是14。在更多实施方案中，a是15。在其他实施方案中，a是16。
在结构(VI)的一些实施方案中，b是1。在其他实施方案中，b是2。在更多实施方案中，b是3。在其他实施方案中，b是4。在一些实施方案中，b是5。在其他实施方案中，b是6。在更多实施方案中，b是7。在其他实施方案中，b是8。在一些实施方案中，b是9。在其他实施方案中，b是10。在更多实施方案中，b是11。在其他实施方案中，b是12。在一些实施方案中，b是13。在其他实施方案中，b是14。在更多实施方案中，b是15。在其他实施方案中，b是16。
在结构(VI)的一些实施方案中，c是1。在其他实施方案中，c是2。在更多实施方案中，c是3。在其他实施方案中，c是4。在一些实施方案中，c是5。在其他实施方案中，c是6。在更多实施方案中，c是7。在其他实施方案中，c是8。在一些实施方案中，c是9。在其他实施方案中，c是10。在更多实施方案中，c是11。在其他实施方案中，c是12。在一些实施方案中，c是13。在其他实施方案中，c是14。在更多实施方案中，c是15。在其他实施方案中，c是16。
在结构(VI)的一些特定实施方案中，d是0。在一些实施方案中，d是1。在其他实施方案中，d是2。在更多实施方案中，d是3。在其他实施方案中，d是4。在一些实施方案中，d是5。在其他实施方案中，d是6。在更多实施方案中，d是7。在其他实施方案中，d是8。在一些实施方案中，d是9。在其他实施方案中，d是10。在更多实施方案中，d是11。在其他实施方案中，d是12。在一些实施方案中，d是13。在其他实施方案中，d是14。在更多实施方案中，d是15。在其他实施方案中，d是16。
在结构(VI)的一些实施方案中，e是1。在其他实施方案中，e是2。在更多实施方案中，e是3。在其他实施方案中，e是4。在一些实施方案中，e是5。在其他实施方案中，e是6。在更多实施方案中，e是7。在其他实施方案中，e是8。在一些实施方案中，e是9。在其他实施方案中，e是10。在更多实施方案中，e是11。在其他实施方案中，e是12。
在结构(VI)的一些实施方案中，f是1。在其他实施方案中，f是2。在更多实施方案中，f是3。在其他实施方案中，f是4。在一些实施方案中，f是5。在其他实施方案中，f是6。在更多实施方案中，f是7。在其他实施方案中，f是8。在一些实施方案中，f是9。在其他实施方案中，f是10。在更多实施方案中，f是11。在其他实施方案中，f是12。
在结构(VI)的一些实施方案中，g是1。在其他实施方案中，g是2。在更多实施方案中，g是3。在其他实施方案中，g是4。在一些实施方案中，g是5。在其他实施方案中，g是6。在更多实施方案中，g是7。在其他实施方案中，g是8。在一些实施方案中，g是9。在其他实施方案中，g是10。在更多实施方案中，g是11。在其他实施方案中，g是12。
在结构(VI)的一些实施方案中，h是1。在其他实施方案中，e是2。在更多实施方案中，h是3。在其他实施方案中，h是4。在一些实施方案中，e是5。在其他实施方案中，h是6。在更多实施方案中，h是7。在其他实施方案中，h是8。在一些实施方案中，h是9。在其他实施方案中，h是10。在更多实施方案中，h是11。在其他实施方案中，h是12。
在结构(VI)的一些其他各种实施方案中，a和d相同。在一些其他实施方案中，b和c相同。在一些其他具体实施方案中，a和d相同并且b和c相同。
a和b的和以及c和d的和是可改变以获得具有所需性质的脂质的因素。在一个实施方案中，选择a和b以使它们的和是14至24范围内的整数。在其他实施方案中，选择c和d以使它们的和是14至24范围内的整数。在其他实施方案中，a和b的和以及c和d的和相同。例如，在一些实施方案中，a和b的和以及c和d的和两者是可在14至24范围内的相同整数。在更多实施方案中，选择a、b、c和d以使a和b的和以及c和d的和是12或更大。
R1a、R2a、R3a和R4a处的取代基没有特别限制。在一些实施方案中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一者是H。在某些实施方案中，R1a、R2a、R3a和R4a在每次出现时是H。在某些其他实施方案中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一者是C1-C12烷基。在某些其他实施方案中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一者是C1-C8烷基。在某些其他实施方案中，R1a、R2a、R3a和R4a中的至少一者是C1-C6烷基。在一些前述实施方案中，C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在前述的某些实施方案中，R1a、R1b、R4a和R4b在每次出现时是C1-C12烷基。
在前述的其他实施方案中，R1b、R2b、R3b和R4b中的至少一者是H，或者R1b、R2b、R3b和R4b在每次出现时是H。
在前述的某些实施方案中，R1b与它所结合的碳原子一起与相邻的R1b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键。在前述的其他实施方案中，R4b与它所结合的碳原子一起与相邻的R4b和它所结合的碳原子一起形成碳-碳双键。
在前述实施方案中，R5和R6处的取代基没有特别限制。在某些实施方案中，R5或R6中的一者是甲基。在其他实施方案中，R5或R6各自是甲基。
在前述实施方案中，R7处的取代基没有特别限制。在某些实施方案中，R7是C6-C16烷基。在一些其他实施方案中，R7是C6-C9烷基。在这些实施方案的一些中，R7被-(C＝O)ORb、-O(C＝O)Rb、-C(＝O)Rb、-ORb、-S(O)xRb、-S-SRb、-C(＝O)SRb、-SC(＝O)Rb、-NRaRb、-NRaC(＝O)Rb、-C(＝O)NRaRb、-NRaC(＝O)NRaRb、-OC(＝O)NRaRb、-NRaC(＝O)ORb、-NRaS(O)xNRaRb、-NRaS(O)xRb或-S(O)xNRaRb，其中：Ra是H或C1-C12烷基；Rb是C1-C15烷基；并且x是0、1或2。例如，在一些实施方案中，R7被-(C＝O)ORb或-O(C＝O)Rb取代。
在结构(VI)的各种前述实施方案中，Rb是支链C3-C15烷基。例如，在一些实施方案中，Rb具有以下结构中的一者：
Figure BDA0003951010620001891
在某些实施方案中，R8是OH。
在结构(VI)的其他实施方案中，R8是-N(R9)(C＝O)R10。在一些其他实施方案中，R8是-(C＝O)NR9R10。在更多实施方案中，R8是-NR9R10。在一些前述实施方案中，R9和R10各自独立地是H或C1-C8烷基，例如H或C1-C3烷基。在更具体的这些实施方案中，C1-C8烷基或C1-C3烷基未被取代或被羟基取代。在其他这些实施方案中，R9和R10各自是甲基。
在结构(VI)的更多实施方案中，R8是-(C＝O)OR11。在这些实施方案的一些中，R11是苄基。
在结构(VI)的更具体的实施方案中，R8具有以下结构中的一者：
Figure BDA0003951010620001892
Figure BDA0003951010620001901
在前述化合物的其他实施方案中，G3是C2-C5亚烷基，例如C2-C4亚烷基、C3亚烷基或C4亚烷基。在这些实施方案的一些中，R8是OH。在其他实施方案中，G2不存在并且R7是C1-C2亚烷基，如甲基。
在各种不同的实施方案中，化合物具有以下表5中列出的结构中的一者。
表5.结构(VI)的代表性阳离子脂质
Figure BDA0003951010620001902
Figure BDA0003951010620001911
Figure BDA0003951010620001921
Figure BDA0003951010620001931
Figure BDA0003951010620001941
Figure BDA0003951010620001951
在一个实施方案中，阳离子脂质是具有以下结构(VII)的化合物：
Figure BDA0003951010620001952
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
X和X'各自独立地是N或CR；
Y和Y'各自独立地不存在，是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或NR，条件是：
a)当X是N时，Y不存在；
b)当X'是N时，Y'不存在；
c)当X是CR时，Y是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或NR；并且
d)当X'是CR时，Y'是-O(C＝O)-、-(C＝O)O-或NR，
L1和L1'各自独立地是-O(C＝O)R1、-(C＝O)OR1、-C(＝O)R1、-OR1、-S(O)zR1、-S-SR1、-C(＝O)SR1、-SC(＝O)R1、-NRaC(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc、-OC(＝O)NRbRc或-NRaC(＝O)OR1；
L2和L2'各自独立地是-O(C＝O)R2、-(C＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)zR2、-S-SR2、-C(＝O)SR2、-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf、-OC(＝O)NReRf；-NRdC(＝O)OR2或与R2的直接键；
G1、G1'、G2和G2'各自独立地是C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
G3是C2-C24杂亚烷基或C2-C24杂亚烯基；
Ra、Rb、Rd和Re在每次出现时独立地是H、C1-C12烷基或C2-C12烯基；
Rc和Rf在每次出现时独立地是C1-C12烷基或C2-C12烯基；
R在每次出现时独立地是H或C1-C12烷基；
R1和R2在每次出现时独立地是支链C6-C24烷基或支链C6-C24烯基；
z是0、1或2，并且
其中每个烷基、烯基、亚烷基、亚烯基、杂亚烷基和杂亚烯基独立地被取代或未被取代，除非另有说明。
在结构(VII)的其他不同实施方案中：
X和X'各自独立地是N或CR；
Y和Y'各自独立地不存在或是NR，条件是：
a)当X是N时，Y不存在；
b)当X'是N时，Y'不存在；
c)当X是CR时，Y是NR；并且
d)当X'是CR时，Y'是NR，
L1和L1'各自独立地是-O(C＝O)R1、-(C＝O)OR1、-C(＝O)R1、-OR1、-S(O)zR1、-S-SR1、-C(＝O)SR1、-SC(＝O)R1、-NRaC(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc、-OC(＝O)NRbRc或-NRaC(＝O)OR1；
L2和L2'各自独立地是-O(C＝O)R2、-(C＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)zR2、-S-SR2、-C(＝O)SR2、-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf、-OC(＝O)NReRf；-NRdC(＝O)OR2或与R2的直接键；
G1、G1'、G2和G2'各自独立地是C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
G3是C2-C24环氧烷或C2-C24亚烯基氧化物；
Ra、Rb、Rd和Re在每次出现时独立地是H、C1-C12烷基或C2-C12烯基；
Rc和Rf在每次出现时独立地是C1-C12烷基或C2-C12烯基；
R在每次出现时独立地是H或C1-C12烷基；
R1和R2在每次出现时独立地是支链C6-C24烷基或支链C6-C24烯基；
z是0、1或2，并且
其中每个烷基、烯基、亚烷基、亚烯基、环氧烷和亚烯基氧化物独立地被取代或未被取代，除非另有说明。
在结构(VII)的一些实施方案中，G3是C2-C24环氧烷或C2-C24亚烯基氧化物。在某些实施方案中，G3未被取代。在其他实施方案中，G3被取代，例如被羟基取代。在更具体的实施方案中，G3是C2-C12环氧烷，例如，在一些实施方案中，G3是C3-C7环氧烷，或在其他实施方案中，G3是C3-C12环氧烷。
在结构(VII)的其他实施方案中，G3是C2-C24亚烷基胺基或C2-C24亚烯基胺基，例如C6-C12亚烷基胺基。在这些实施方案的一些中，G3未被取代。在其他这些实施方案中，G3被C1-C6烷基取代。
在结构(VII)的一些实施方案中，X和X'各自是N，并且Y和Y'各自不存在。在其他实施方案中，X和X'各自是CR，并且Y和Y'各自是NR。在这些实施方案的一些中，R是H。
在结构(VII)的某些实施方案中，X和X'各自是CR，并且Y和Y'各自独立地是-O(C＝O)-或-(C＝O)O-。
在结构(VII)的一些前述实施方案中，化合物具有以下结构(VIIA)、(VIIB)、(VIIC)、(VIID)、(VIIE)、(VIIF)、(VIIG)或(VIIH)中的一者：
Figure BDA0003951010620001991
其中Rd在每次出现时独立地是H或任选取代的C1-C6烷基。例如，在一些实施方案中，Rd是H。在其他实施方案中，Rd是C1-C6烷基，如甲基。在其他实施方案中，Rd是取代的C1-C6烷基，如被-O(C＝O)R、-(C＝O)OR、-NRC(＝O)R或-C(＝O)N(R)2取代的C1-C6烷基，其中R在每次出现时独立地是H或C1-C12烷基。
在结构(VII)的一些前述实施方案中，L1和L1’各自独立地是-O(C＝O)R1、-(C＝O)OR1或-C(＝O)NRbRc，并且L2和L2'各自独立地是-O(C＝O)R2、-(C＝O)OR2或-C(＝O)NReRf。例如，在一些实施方案中，L1和L1'各自是-(C＝O)OR1，并且L2和L2'各自是-(C＝O)OR2。在其他实施方案中，L1和L1'各自是-(C＝O)OR1，并且L2和L2'各自是-C(＝O)NReRf。在其他实施方案中，L1和L1'各自是-C(＝O)NRbRc，并且L2和L2'各自是-C(＝O)NReRf。
在前述的一些实施方案中，G1、G1'、G2和G2'各自独立地是C2-C8亚烷基，例如C4-C8亚烷基。
在结构(VII)的一些前述实施方案中，R1或R2在每次出现时各自独立地是支链C6-C24烷基。例如，在一些实施方案中，R1和R2在每次出现时独立地具有以下结构：
Figure BDA0003951010620002001
其中：
R7a和R7b在每次出现时独立地是H或C1-C12烷基；并且
a是2至12的整数，
其中各自选择R7a、R7b和a以使R1和R2各自独立地包含6至20个碳原子。例如，在一些实施方案中，a是5至9或8至12范围内的整数。
在结构(VII)的一些前述实施方案中，R7a的至少一次出现是H。例如，在一些实施方案中，R7a在每次出现时是H。在前述的其他不同实施方案中，R7b的至少一次出现是C1-C8烷基。例如，在一些实施方案中，C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在结构(VII)的不同实施方案中，R1或R2或两者在每次出现时独立地具有以下结构中的一者：
Figure BDA0003951010620002011
在结构(VII)的一些前述实施方案中，当存在时，Rb、Rc、Re和Rf各自独立地是C3-C12烷基。例如，在一些实施方案中，当存在时，Rb、Rc、Re和Rf是正己基，并且在其他实施方案中，当存在时，Rb、Rc、Re和Rf是正辛基。
在结构(VII)的各种不同实施方案中，阳离子脂质具有以下表6中列出的结构中的一者。
表6.结构(VII)的代表性阳离子脂质
Figure BDA0003951010620002012
Figure BDA0003951010620002021
Figure BDA0003951010620002031
在一个实施方案中，阳离子脂质是具有以下结构(VIII)的化合物：
Figure BDA0003951010620002032
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
X是N并且Y不存在；或者X是CR并且Y是NR；
L1是-O(C＝O)R1、-(C＝O)OR1、-C(＝O)R1、-OR1、-S(O)xR1、-S-SR1、-C(＝O)SR1、-SC(＝O)R1、-NRaC(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc、-OC(＝O)NRbRc或-NRaC(＝O)OR1；
L2是-O(C＝O)R2、-(C＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)xR2、-S-SR2、-C(＝O)SR2、-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf、-OC(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)OR2或与R2的直接键；
L3是-O(C＝O)R3或-(C＝O)OR3；
G1和G2各自独立地是C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；G3是C1-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、C1-C24杂亚烷基或C2-C24杂亚烯基；
Ra、Rb、Rd和Re各自独立地是H或C1-C12烷基或C1-C12烯基；
Rc和Rf各自独立地是C1-C12烷基或C2-C12烯基；
每个R独立地是H或C1-C12烷基；
R1、R2和R3各自独立地是C1-C24烷基或C2-C24烯基；并且
x是0、1或2，并且
其中每个烷基、烯基、亚烷基、亚烯基、杂亚烷基和杂亚烯基独立地被取代或未被取代，除非另有说明。
在结构(I)的更多实施方案中：
X是N并且Y不存在；或者X是CR并且Y是NR；
L1是-O(C＝O)R1、-(C＝O)OR1、-C(＝O)R1、-OR1、-S(O)xR1、-S-SR1、-C(＝O)SR1、-SC(＝O)R1、-NRaC(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc、-OC(＝O)NRbRc或-NRaC(＝O)OR1；
L2是-O(C＝O)R2、-(C＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)xR2、-S-SR2、-C(＝O)SR2、-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf、-OC(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)OR2或与R2的直接键；
L3是-O(C＝O)R3或-(C＝O)OR3；
G1和G2各自独立地是C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
当X是CR且Y是NR时，G3是C1-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、C1-C24杂亚烷基或C2-C24杂亚烯基；并且当X是N且Y不存在时，G3是C1-C24杂亚烷基或C2-C24杂亚烯基；
Ra、Rb、Rd和Re各自独立地是H或C1-C12烷基或C1-C12烯基；
Rc和Rf各自独立地是C1-C12烷基或C2-C12烯基；
每个R独立地是H或C1-C12烷基；
R1、R2和R3各自独立地是C1-C24烷基或C2-C24烯基；并且
x是0、1或2，并且
其中每个烷基、烯基、亚烷基、亚烯基、杂亚烷基和杂亚烯基独立地被取代或未被取代，除非另有说明。
在结构(I)的其他实施方案中：
X是N并且Y不存在；或者X是CR并且Y是NR；
L1是-O(C＝O)R1、-(C＝O)OR1、-C(＝O)R1、-OR1、-S(O)xR1、-S-SR1、-C(＝O)SR1、-SC(＝O)R1、-NRaC(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc、-OC(＝O)NRbRc或-NRaC(＝O)OR1；
L2是-O(C＝O)R2、-(C＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)xR2、-S-SR2、-C(＝O)SR2、-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf、-OC(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)OR2或与R2的直接键；
L3是-O(C＝O)R3或-(C＝O)OR3；
G1和G2各自独立地是C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
G3是C1-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、C1-C24杂亚烷基或C2-C24杂亚烯基；
Ra、Rb、Rd和Re各自独立地是H或C1-C12烷基或C1-C12烯基；
Rc和Rf各自独立地是C1-C12烷基或C2-C12烯基；
每个R独立地是H或C1-C12烷基；
R1、R2和R3各自独立地是支链C6-C24烷基或支链C6-C24烯基；并且
x是0、1或2，并且
其中每个烷基、烯基、亚烷基、亚烯基、杂亚烷基和杂亚烯基独立地被取代或未被取代，除非另有说明。
在结构(VIII)的某些实施方案中，G3未被取代。在更具体的实施方案中，G3是C2-C12亚烷基，例如，在一些实施方案中，G3是C3-C7亚烷基，或者在其他实施方案中，G3是C3-C12亚烷基。在一些实施方案中，G3是C2或C3亚烷基。
在结构(VIII)的其他实施方案中，G3是C1-C12杂亚烷基，例如C1-C12胺基亚烷基。
在结构(VIII)的某些实施方案中，X是N并且Y不存在。在其他实施方案中，X是CR并且Y是NR，例如在这些实施方案的一些中，R是H。
在结构(VIII)的一些前述实施方案中，化合物具有以下结构(VIIIA)、(VIIIB)、(VIIIC)或(VIIID)中的一者：
Figure BDA0003951010620002061
在结构(VIII)的一些前述实施方案中，L1是-O(C＝O)R1、-(C＝O)OR1或-C(＝O)NRbRc，并且L2是-O(C＝O)R2、-(C＝O)OR2或-C(＝O)NRcRf。在其他具体实施方案中，L1是-(C＝O)OR1并且L2是-(C＝O)OR2。在任何前述实施方案中，L3是-(C＝O)OR3。
在结构(VIII)的一些前述实施方案中，G1和G2各自独立地是C2-C12亚烷基，例如C4-C10亚烷基。
在结构(VIII)的一些前述实施方案中，R1、R2和R3各自独立地是支链C6-C24烷基。例如，在一些实施方案中，R1、R2和R3各自独立地具有以下结构：
Figure BDA0003951010620002071
其中：
R7a和R7b在每次出现时独立地是H或C1-C12烷基；
和
a是2至12的整数，
其中各自选择R7a、R7b和a以使R1和R2各自独立地包含6至20个碳原子。例如，在一些实施方案中，a是5至9或8至12范围内的整数。
在结构(VIII)的一些前述实施方案中，R7a的至少一次出现是H。例如，在一些实施方案中，R7a在每次出现时是H。在前述的其他不同实施方案中，R7b的至少一次出现是C1-C8烷基。例如，在一些实施方案中，C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在结构(VIII)的一些前述实施方案中，X是CR，Y是NR并且R3是C1-C12烷基，如乙基、丙基或丁基。在这些实施方案的一些中，R1和R2各自独立地是支链C6-C24烷基。
在结构(VIII)的不同实施方案中，R1、R2和R3各自独立地具有以下结构中的一者：
Figure BDA0003951010620002081
在结构(VIII)的某些实施方案中，R1和R2以及R3各自独立地是支链C6-C24烷基，并且R3是C1-C24烷基或C2-C24烯基。
在结构(VIII)的一些前述实施方案中，Rb、Rc、Re和Rf各自独立地是C3-C12烷基。例如，在一些实施方案中，Rb、Rc、Re和Rf是正己基，并且在其他实施方案中，Rb、Rc、Re和Rf是正辛基。
在结构(VIII)的各种不同实施方案中，化合物具有以下表7中列出的结构中的一者。
表7.结构(VIII)的代表性阳离子脂质
Figure BDA0003951010620002091
Figure BDA0003951010620002101
在一个实施方案中，阳离子脂质是具有以下结构(IX)的化合物:
Figure BDA0003951010620002102
或其药学上可接受的盐、前药或立体异构体，其中：
L1是-O(C＝O)R1、-(C＝O)OR1、-C(＝O)R1、-OR1、-S(O)xR1、-S-SR1、-C(＝O)SR1、-SC(＝O)R1、-NRaC(＝O)R1、-C(＝O)NRbRc、-NRaC(＝O)NRbRc、-OC(＝O)NRbRc或-NRaC(＝O)OR1；
L2是-O(C＝O)R2、-(C＝O)OR2、-C(＝O)R2、-OR2、-S(O)xR2、-S-SR2、-C(＝O)SR2、-SC(＝O)R2、-NRdC(＝O)R2、-C(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)NReRf、-OC(＝O)NReRf、-NRdC(＝O)OR2或与R2的直接键；
G1和G2各自独立地是C2-C12亚烷基或C2-C12亚烯基；
G3是C1-C24亚烷基、C2-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基或C3-C8亚环烯基；
Ra、Rb、Rd和Re各自独立地是H或C1-C12烷基或C1-C12
烯基；
Rc和Rf各自独立地是C1-C12烷基或C2-C12烯基；
R1和R2各自独立地是支链C6-C24烷基或支链C6-C24烯基；
R3是-N(R4)R5；
R4是C1-C12烷基；
R3是取代的C1-C12烷基；并且
x是0、1或2，并且
其中每个烷基、烯基、亚烷基、亚烯基、亚环烷基、亚环烯基、芳基和芳烷基独立地被取代或未被取代，除非另有说明。
在结构(XI)的某些实施方案中，G3未被取代。在更具体的实施方案中，G3是C2-C12亚烷基，例如，在一些实施方案中，G3是C3-C7亚烷基，或者在其他实施方案中，G1是C3-C12亚烷基。在一些实施方案中，G3是C2或C3亚烷基。
在结构(IX)的一些前述实施方案中，化合物具有以下结构(IX A)：
Figure BDA0003951010620002111
其中y和z各自独立地是2至12范围内的整数，例如2至6、4至10的整数，或例如4或5。在某些实施方案中，y和z各自相同并且选自4、5、6、7、8和9。
在结构(IX)的一些前述实施方案中，L1是-O(C＝O)R1、-(C-O)OR1或-C(＝O)NRbRc，并且L2是-O(C＝O)R2，-(C＝O)OR2或-C(＝O)NReRf。例如，在一些实施方案中，L1和L2分别是-(C＝O)OR1和-(C＝O)OR2。在其他实施方案中，L1是-(C＝O)OR1并且L2是-C(＝O)NReRf。在其他实施方案中，L1是-C(＝O)NRbRc并且L2是-C(＝O)NReRf。
在前述的其他实施方案中，化合物具有以下结构(IXB)、(IXC)、(IXD)或(IXE)中的一者：
Figure BDA0003951010620002121
在一些前述实施方案中，化合物具有结构(IXB)，在其他实施方案中，化合物具有结构(IXC)，并且在其他实施方案中，化合物具有结构(IXD)。在其他实施方案中，化合物具有结构(IXE)。
在前述的一些不同实施方案中，化合物具有以下结构(IXF)、(IXG)、(IXH)或(IXJ)中的一者：
Figure BDA0003951010620002131
其中y和z各自独立地是2至12范围内的整数，例如2至6的整数，例如4。
在结构(IX)的一些前述实施方案中，y和z各自独立地是2至10、2至8、4至10或4至7范围内的整数。例如，在一些实施方案中，y是4、5、6、7、8、9、10、11或12。在一些实施方案中，z是4、5、6、7、8、9、10、11或12。在一些实施方案中，y和z相同，而在其他实施方案中，y和z不同。
在结构(IX)的一些前述实施方案中，R1或R2或两者是支链C6-C24烷基。例如，在一些实施方案中，R1和R2各自独立地具有以下结构：
Figure BDA0003951010620002132
其中：
R7a和R7b在每次出现时独立地是H或C1-C12烷基；
并且
a是2至12的整数，
其中各自选择R7a、R7b和a以使R1和R2各自独立地包含6至20个碳原子。例如，在一些实施方案中，a是5至9或8至12范围内的整数。
在结构(IX)的一些前述实施方案中，R7a的至少一次出现是H。例如，在一些实施方案中，R7a在每次出现时是H。在前述的其他不同实施方案中，R7b的至少一次出现是C1-C8烷基。例如，在一些实施方案中，C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在结构(IX)的不同实施方案中，R1或R2或两者具有以下结构中的一者：
Figure BDA0003951010620002141
在结构(IX)的一些前述实施方案中，Rb、Rc、Re和Rf各自独立地是C3-C12烷基。例如，在一些实施方案中，Rb、Rc、Re和Rf是正己基，并且在其他实施方案中，Rb、Rc、Re和Rf是正辛基。
在结构(IX)的任何上述实施方案中，R4是取代的或未取代的：甲基、乙基、丙基、正丁基、正己基、正辛基或正壬基。例如，在一些实施方案中，R4未被取代。在其他中，R4被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：-ORg、-NRgC(＝O)Rh、-C(＝O)NRgRh、-C(＝O)Rh、-OC(＝O)Rh、-C(＝O)ORh和-ORiOH，其中：
Rg在每次出现时独立地是H或C1-C6烷基；
Rh在每次出现时独立地是C1-C6烷基；并且
Ri在每次出现时独立地是C1-C6亚烷基。
在结构(IX)的其他前述实施方案中，R5是取代的：甲基、乙基、丙基、正丁基、正己基、正辛基或正壬基。在一些实施方案中，R5是取代的乙基或取代的丙基。在其他不同的实施方案中，R5被羟基取代。在更多实施方案中，R5被一个或多个选自由以下组成的组的取代基取代：-ORg、-NRgC(＝O)Rh、-C(＝O)NRgRh、-C(＝O)Rh、-OC(＝O)Rh、-C(＝O)ORh和-ORiOH，其中：
Rg在每次出现时独立地是H或C1-C6烷基；
Rh在每次出现时独立地是C1-C6烷基；并且
Ri在每次出现时独立地是C1-C6亚烷基。
在结构(IX)的其他实施方案中，R4是未取代的甲基，并且R5是取代的：甲基、乙基、丙基、正丁基、正己基、正辛基或正壬基。在这些实施方案的一些中，R5被羟基取代。
在结构(IX)的一些其他具体实施方案中，R3具有以下结构中的一者：
Figure BDA0003951010620002151
在结构(IX)的各种不同实施方案中，阳离子脂质具有以下表8中列出的结构中的一者。
表8.结构(IX)的代表性阳离子脂质
Figure BDA0003951010620002161
Figure BDA0003951010620002171
在一个实施方案中，阳离子脂质是具有以下结构(X)的化合物：
Figure BDA0003951010620002181
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
G1是-OH、-NR3R4、-(C＝O)NR5或-NR3(C＝O)R5；
G2是-CH2-或-(C＝O)-；
R在每次出现时独立地是H或OH；
R1和R2各自独立地是支链、饱和或不饱和的C12-C36烷基；
R3和R4各自独立地是H或直链或支链的、饱和或不饱和的C1-C6烷基；
R5是直链或支链的、饱和或不饱和的C1-C6烷基；并且
n是2至6的整数。
在一些实施方案中，R1和R2各自独立地是支链的、饱和或不饱和的C12-C30烷基、C12-C20烷基或C15-C20烷基。在一些具体实施方案中，R1和R2各自是饱和的。在某些实施方案中，R1和R2中的至少一者是不饱和的。
在结构(X)的一些前述实施方案中，R1和R2具有以下结构：
Figure BDA0003951010620002182
在结构(X)的一些前述实施方案中，化合物具有以下结构(XA)：
Figure BDA0003951010620002191
其中：
R6和R7在每次出现时独立地是H或直链或支链的、饱和或不饱和的C1-C14烷基；
a和b各自独立地是1至15的整数，条件是R6和a以及R7和b各自独立地选择，以使R1和R2分别各自独立地是支链的、饱和或不饱和的C12-C36烷基。
在一些前述实施方案中，化合物具有以下结构(XB)：
Figure BDA0003951010620002192
其中：
R8、R9、R10和R11各自独立地是直链或支链的、饱和或不饱和的C4-C12烷基，条件是R8和R9以及R10和R11各自独立地选择，以使R1和R2分别各自独立地是支链的、饱和或不饱和的C12-C36烷基。在(XB)的一些实施方案中，R8、R9、R10和R11各自独立地是直链或支链的、饱和或不饱和的C6-C10烷基。在(XB)的某些实施方案中，R8、R9、R10和R11中的至少一者是不饱和的。在(XB)的其他某些具体实施方案中，R8、R9、R10和R11中的每一者是饱和的。
在一些前述实施方案中，化合物具有结构(XA)，并且在其他实施方案中，化合物具有结构(XB)。
在一些前述实施方案中，G1是-OH，并且在一些实施方案中，G1是-NR3R4。例如，在一些实施方案中，G1是-NH2、-NHCH3或-N(CH3)2。在某些实施方案中，G1是-(C＝O)NR5。在某些其他实施方案中，G1是-NR3(C＝O)R5。例如，在一些实施方案中，G1是-NH(C＝O)CH3或-NH(C＝O)CH2CH2CH3。
在结构(X)的一些前述实施方案中，G2是-CH2-。在一些不同实施方案中，G2是-(C＝O)-。
在结构(X)的一些前述实施方案中，n是2至6的整数，例如，在一些实施方案中，n是2、3、4、5或6。在一些实施方案中，n是2。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，n是4。
在结构(X)的某些前述实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5中的至少一者未被取代。例如，在一些实施方案中，R1、R2、R3、R4和R5各自未被取代。在一些实施方案中，R3被取代。在其他实施方案中，R4被取代。在更多实施方案中，R5被取代。在某些具体实施方案中，R3和R4各自被取代。在一些实施方案中，R3、R4或R5上的取代基是羟基。在某些实施方案中，R3和R4各自被羟基取代。
在结构(X)的一些前述实施方案中，至少一个R是OH。在一其他实施方案中，每个R5是H。
在结构(X)的各种不同实施方案中，化合物具有以下表9中列出的结构中的一者。
表9.结构(X)的代表性阳离子脂质
Figure BDA0003951010620002211
Figure BDA0003951010620002221
Figure BDA0003951010620002231
在实施方案1、2、3、4或5中的任一项中，LNP还包含中性脂质。在各种实施方案中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比在约2:1至约8:1的范围内。在某些实施方案中，中性脂质以5至10mol％、5至15mol％、7至13mol％或9至11mol％范围内的浓度存在于任何前述LNP中。在某些具体实施方案中，中性脂质以约9.5、10或10.5mol％的浓度存在。在一些实施方案中，阳离子脂质与中性脂质的摩尔比在约4.1:1.0至约4.9:1.0、约4.5:1.0至约4.8:1.0或约4.7:1.0至4.8:1.0的范围内。在一些实施方案中，总阳离子脂质与中性脂质的摩尔比在约4.1:1.0至约4.9:1.0、约4.5:1.0至约4.8:1.0或约4.7:1.0至4.8:1.0的范围内。
用于实施方案1、2、3、4或5中任一项的示例性中性脂质包括例如二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰甘油(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰-磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰-磷脂酰乙醇胺(POPE)和二油酰-磷脂酰乙醇胺4-(N-马来酰亚胺甲基)-环己烷-1甲酸酯(DOPE-mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰-磷脂酰乙醇胺(DSPE)、16-O-单甲基PE、16-O-二甲基PE、18-1-反式PE、l-硬脂酰-2-油酰磷脂酰乙醇胺(SOPE)和1,2-二反油酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺(反式DOPE)。在一个实施方案中，中性脂质是1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3磷酸胆碱(DSPC)。在一些实施方案中，中性脂质选自DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE和SM。在其他实施方案中，中性脂质是DSPC。
在实施方案1、2、3、4或5的各种实施方案中，任何公开的脂质纳米颗粒包含类固醇或类固醇类似物。在某些实施方案中，类固醇或类固醇类似物是胆固醇。在一些实施方案中，类固醇以39至49摩尔％、40至46摩尔％、40至44摩尔％、40至42摩尔％、42至44摩尔％或44至46摩尔％范围内的浓度存在。在某些具体实施方案中，类固醇以40、41、42、43、44、45或46摩尔％的浓度存在。
在某些实施方案中，阳离子脂质与类固醇的摩尔比在1.0:0.9至1.0:1.2或1.0:1.0至1.0:1.2的范围内。在这些实施方案的一些中，阳离子脂质与胆固醇的摩尔比在约5:1至1:1的范围内。在某些实施方案中，类固醇以32至40mol％类固醇范围内的浓度存在。
在某些实施方案中，总阳离子与类固醇的摩尔比在1.0:0.9至1.0:1.2或1.0:1.0至1.0:1.2的范围内。在这些实施方案的一些中，总阳离子脂质与胆固醇的摩尔比在约5:1至1:1的范围内。在某些实施方案中，类固醇以32至40mol％类固醇范围内的浓度存在。
在实施方案1、2、3、4或5的一些实施方案中，LNP还包含聚合物缀合脂质。在实施方案1、2、3、4或5的各种其他实施方案中，聚合物缀合脂质是聚乙二醇化脂质。例如，一些实施方案包括聚乙二醇化二酰基甘油(PEG-DAG)如1-(单甲氧基-聚乙二醇)-2,3-二肉豆蔻酰基甘油(PEG-DMG)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG-PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEG-S-DAG)如4-O-(2',3'-二(十四烷酰基氧基)丙基-1-O-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG-S-DMG)、聚乙二醇化神经酰胺(PEG-cer)或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯如ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基-N-(2,3-二(十四烷氧基)丙基)氨基甲酸酯或2,3-二(十四烷氧基)丙基-N-(ω-甲氧基(聚乙氧基)乙基)氨基甲酸酯。
在各种实施方案中，聚合物缀合脂质以1.0至2.5摩尔％的浓度存在。在某些具体实施方案中，聚合物缀合脂质以约1.7摩尔％的浓度存在。
在一些实施方案中，聚合物缀合脂质以约1.5摩尔％的浓度存在。
在某些实施方案中，阳离子脂质与聚合物缀合脂质的摩尔比在约35:1至约25:1的范围内。在一些实施方案中，阳离子脂质与聚合物缀合脂质的摩尔比在约100:1至约20:1的范围内。
在某些实施方案中，总阳离子脂质(即，第一和第二阳离子脂质的和)与聚合物缀合脂质的摩尔比在约35:1至约25:1的范围内。在一些实施方案中，总阳离子脂质与聚合物缀合脂质的摩尔比在约100:1至约20:1的范围内。
在实施方案1、2、3、4或5的一些实施方案中，当存在时，聚乙二醇化脂质具有下式(XI)：
Figure BDA0003951010620002261
或其药学上可接受的盐、互变异构体或立体异构体，其中：
R12和R13各自独立地是含有10至30个碳原子的直链或支链的、饱和或不饱和的烷基链，其中所述烷基链任选地被一个或多个酯键中断；并且
w具有在30至60范围内的平均值。
在一些实施方案中，R12和R13各自独立地是含有12至16个碳原子的直链饱和烷基链。在其他实施方案中，平均w在42至55的范围内，例如，平均w是42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54或55。在一些具体实施方案中，平均w是约49。
在一些实施方案中，聚乙二醇化脂质具有下式(XIa)：
Figure BDA0003951010620002262
其中平均w是约49。
在实施方案1、2、3、4或5的一些实施方案中，核酸是选自反义和信使RNA中的一者。例如，信使RNA可用于例如通过免疫原性蛋白质的翻译诱导免疫应答(例如，作为疫苗)。
在实施方案1、2、3、4或5的其他实施方案中，核酸是mRNA，并且LNP中的mRNA与脂质比率(即，N/P，其中N表示阳离子脂质的摩尔数，并且P表示作为核酸的一部分存在的磷酸酯的摩尔数)。
在一个实施方案中，转移媒介物包含美国专利公布号20190314524中描述的脂质或可电离脂质。
本发明的一些实施方案提供核酸-脂质纳米颗粒组合物，所述核酸-脂质纳米颗粒组合物包含一种或多种本文所述的如表10中所列结构的新型阳离子脂质，在体内提供增加的核酸活性和改善的组合物耐受性。
在一个实施方案中，可电离脂质具有以下结构(XII)：
Figure BDA0003951010620002271
或其药学上可接受的盐、互变异构体、前药或立体异构体，其中：
L1或L2中的一者是—O(C═O)—、—(C═O)O—、—C(═O)—、—O—、—S(O)x—、—S—S—、—C(═O)S—、SC(═O)—、—NRaC(═O)—、—C(═O)NRa—、NRaC(═)NRa—、—OC(═O)NRa—或—NRaC(═O)O—，并且L1或L2中的另一者是—O(C═O)—、—(C═O)O—、—C(═O)—、—O—、—S(O)x—、—S—S—、—C(═O)S—、SC(═O)—、—NRaC(═O)—、—C(═O)NRa—、NRaC(═O)NRa—、—OC(═O)NRa—或—NRaC(═O)O—或直接键；
G1和G2各自独立地是未取代的C1-C12亚烷基或C1-C12亚烯基；
G3是C1-C24亚烷基、C1-C24亚烯基、C3-C8亚环烷基、C3-C8亚环烯基；
Ra是H或C1-C12烷基；
R1和R2各自独立地是C6-C24烷基或C6-C24烯基；
R3是H、OR5、CN、—C(═O)OR4、—OC(═O)R4或—NR5C(═O)R4；
R4是C1-C12烷基；
R5是H或C1-C6烷基；并且
x是0、1或2。
在一些实施方案中，可电离脂质具有以下结构(XIIA)或(XIIB)中的一者：
Figure BDA0003951010620002281
其中：
A是3至8元环烷基或亚环烷基环；
R6在每次出现时独立地是H、OH或C1-C24烷基；并且
n是1至15范围内的整数。
在一些实施方案中，可电离脂质具有结构(XIIA)，并且在其他实施方案中，可电离脂质具有结构(XIIB)。
在其他实施方案中，可电离脂质具有以下结构(XIIC)或(XIID)中的一者：
Figure BDA0003951010620002291
其中y和z各自独立地是1至12范围内的整数。
在一些实施方案中，L1或L2中的一者是—O(C═O)—。例如，在一些实施方案中，L1和L2各自是—O(C═O)—。在前述中任一者的一些不同实施方案中，L1和L2各自独立地是—(C═O)O—或—O(C═O)—。例如，在一些实施方案中，L1和L2各自是—(C═O)O—。
在一些实施方案中，可电离脂质具有以下结构(XIIE)或(XIIF)中的一者：
Figure BDA0003951010620002292
在一些实施方案中，可电离脂质具有以下结构(XIIG)、(XIIH)、(XIII)或(XIIJ)中的一者：
Figure BDA0003951010620002293
Figure BDA0003951010620002301
在一些实施方案中，n是2至12，例如2至8或2至4范围内的整数。例如，在一些实施方案中，n是3、4、5或6。在一些实施方案中，n是3。在一些实施方案中，n是4。在一些实施方案中，n是5。在一些实施方案中，n是6。
在一些实施方案中，y和z各自独立地是2至10范围内的整数。例如，在一些实施方案中，y和z各自独立地是4至9或4至6范围内的整数。
在一些实施方案中，R6是H。在其他实施方案中，R6是C1-C24烷基。在其他实施方案中，R6是OH。
在一些实施方案中，G3是未取代的。在其他实施方案中，G3是取代的。在各种不同实施方案中，G3是直链C1-C24亚烷基或直链C1-C24亚烯基。
在一些实施方案中，R1或R2或两者是C6-C24烯基。例如，在一些实施方案中，R1和R2各自独立地具有以下结构：
Figure BDA0003951010620002311
其中：
R7a和R7b在每次出现时独立地是H或C1-C12烷基；并且
a是2至12的整数，
其中R7a、R7b和a各自选择，使得R1和R2各自独立地包含6至20个碳原子。
在一些实施方案中，a是5至9或8至12范围内的整数。
在一些实施方案中，R7a的至少一次出现是H。例如，在一些实施方案中，R7a在每次出现时都是H。在其他不同的实施方案中，R7b的至少一次出现是C1-C8烷基。例如，在一些实施方案中，C1-C8烷基是甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、异丁基、叔丁基、正己基或正辛基。
在不同的实施方案中，R1或R2或两者具有以下结构中的一者：
Figure BDA0003951010620002312
在一些实施方案中，R3是—OH、—CN、—C(═O)OR4、—OC(═O)R4或—NHC(═O)R4。在一些实施方案中，R4是甲基或乙基。
在一些实施方案中，可电离脂质是式(1)化合物：
Figure BDA0003951010620002321
其中：
每个n独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；并且
L1和L3各自独立地是-OC(O)-*或-C(O)O-*，其中“*”指示与R1或R3的连接点；
R1和R3各自独立地是任选地被一个或多个选自以下的取代基取代的直链或支链C9-C20烷基或C9-C20烯基：氧代基、卤基、羟基、氰基、烷基、烯基、醛、杂环基烷基、羟烷基、二羟烷基、羟烷基氨基烷基、氨基烷基、烷基氨基烷基、二烷基氨基烷基、(杂环基)(烷基)氨基烷基、杂环基、杂芳基、烷基杂芳基、炔基、烷氧基、氨基、二烷基氨基、氨基烷基羰基氨基、氨基羰基烷基氨基、(氨基羰基烷基)(烷基)氨基、烯基羰基氨基、羟基羰基、烷氧基羰基、氨基羰基、氨基烷基氨基羰基、烷基氨基烷基氨基羰基、二烷基氨基烷基氨基羰基、杂环基烷基氨基羰基、(烷基氨基烷基)(烷基)氨基羰基、烷基氨基烷基羰基、二烷基氨基烷基羰基、杂环基羰基、烯基羰基、炔基羰基、烷基亚砜、烷基亚砜烷基、烷基磺酰基和烷基砜烷基。
在一些实施方案中，R1和R3是相同的。在一些实施方案中，R1和R3是不同的。
在一些实施方案中，R1和R3各自独立地是支链饱和C9-C20烷基。在一些实施方案中，R1和R3中的一者是支链饱和C9-C20烷基，并且另一者是非支链饱和C9-C20烷基。在一些实施方案中，R1和R3各自独立地选自由以下组成的组：
Figure BDA0003951010620002331
在各种实施方案中，R2选自由以下组成的组：
Figure BDA0003951010620002332
在一些实施方案中，R2可如国际专利公布号WO2019/152848A1中所描述，所述专利公布以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，可电离脂质是式(1-1)或式(1-2)化合物：
Figure BDA0003951010620002333
Figure BDA0003951010620002341
其中n、R1、R2和R3如式(1)中所定义。
上述化合物和组合物的制备方法在本文下文进行了描述和/或在本领域中已知。
本领域技术人员将了解，在本文描述的方法中，中间体化合物的官能团可需要通过适合的保护基来保护。此类官能团包括例如羟基、氨基、巯基和羧酸。羟基的合适保护基团包括例如三烷基甲硅烷基或二芳基烷基甲硅烷基(例如，叔丁基二甲基甲硅烷基、叔丁基二苯基甲硅烷基或三甲基甲硅烷基)、四氢吡喃基、苄基等。氨基、脒基和胍基的合适保护基团包括例如叔丁氧基羰基、苄氧基羰基等。巯基的合适保护基团包括例如-C(O)-R”(其中R”是烷基、芳基或芳烷基)、对甲氧基苄基、三苯甲基等。羧酸的合适保护基团包括例如烷基、芳基或芳烷基酯。可根据标准技术添加或去除保护基团，所述标准技术为本领域技术人员已知的并且如本文所述。保护基团的使用在例如Green,T.W.和P.G.M.Wutz,ProtectiveGroups in Organic Synthesis(1999),第3版,Wiley.中进行了详细描述。如本领域技术人员将了解，保护基团还可是聚合物树脂如王氏树脂、Rink树脂或2-氯三苯甲基-氯化物树脂。
本领域技术人员还将了解，虽然本发明的化合物的此类受保护的衍生物可同样不拥有药理学活性，但是它们可向哺乳动物施用并且此后在身体中代谢以形成具有药理学活性的本发明的化合物。因此，此类衍生物可被描述为前药。本发明化合物的所有前药都包括在本发明的范围内。
此外，以游离碱或酸形式存在的本发明的所有化合物可通过用适合的无机或有机碱或酸通过本领域技术人员已知的方法处理来转化为它们的药学上可接受的盐。本发明化合物的盐也可通过标准技术转化为它们的游离碱或酸形式。
以下反应方案说明用于制备式(1)化合物的示例性方法：
Figure BDA0003951010620002351
A1购买或根据本领域已知的方法制备。A1与二醇A2在适当缩合条件(例如，DCC)下反应产生酯/醇A3，然后可将其氧化(例如，用PCC)以产生醛A4。A4与胺A5在还原性胺化条件下反应产生式(1)化合物。
以下反应方案说明用于制备式(1)化合物的第二种示例性方法，其中R1和R3相同：
Figure BDA0003951010620002352
对上述反应方案的修改(如使用保护基团)可产生其中R1和R3不同的化合物。对上述反应方案使用保护基团以及其他修改方法对于本领域普通技术人员来说将是显而易见的。
应当理解，本领域技术人员能够通过类似方法或通过组合本领域技术人员已知的其他方法来制备这些化合物。还应理解，本领域技术人员将能够通过使用适合的起始材料并修改合成参数来制备本文未具体说明的其他式(1)化合物。通常，起始材料可获自诸如Sigma Aldrich、Lancaster Synthesis,Inc.、Maybridge、Matrix Scientific、TCI和Fluorochem USA等的来源或根据本领域技术人员已知的来源合成(参见，例如AdvancedOrganic Chemistry:Reactions,Mechanisms,and Structure,第5版(Wiley,2000年12月))或如本发明中所述来制备。
在一些实施方案中，可电离脂质是式(2)化合物：
Figure BDA0003951010620002361
其中每个n独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15。
在一些实施方案中，如式(2)中所用，R1和R2如式(1)中所定义。
在一些实施方案中，如式(2)中所用，R1和R2各自独立地选自由以下组成的组：
Figure BDA0003951010620002362
Figure BDA0003951010620002371
在一些实施方案中，如在式(2)中使用的R1和/或R2可如国际专利公布号WO2015/095340 A1中所描述，所述专利公布以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，如在式(2)中使用的R1可如国际专利公布号WO2019/152557 A1中所描述，所述专利公布以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，如在式(2)中所用，R3选自由以下组成的组：
Figure BDA0003951010620002381
在一些实施方案中，可电离脂质是式(3)化合物
Figure BDA0003951010620002382
其中X选自-O-、-S-或-OC(O)-*，其中*指示与R1的连接点。
在一些实施方案中，可电离脂质是式(3-1)化合物：
Figure BDA0003951010620002383
在一些实施方案中，可电离脂质是式(3-2)化合物：
Figure BDA0003951010620002391
在一些实施方案中，可电离脂质是式(3-3)化合物：
Figure BDA0003951010620002392
在一些实施方案中，如在式(3-1)、(3-2)或(3-3)中所用，每个R1独立地是支链饱和C9-C20烷基。在一些实施方案中，每个R1独立地选自由以下组成的组：
Figure BDA0003951010620002393
在一些实施方案中，式(3-1)、(3-2)或(3-3)中的每个R1相同。
在一些实施方案中，如在式(3-1)、(3-2)或(3-3)中所用，R2选自由以下组成的组：
Figure BDA0003951010620002401
在一些实施方案中，如在式(3-1)、(3-2)或(3-3)中使用的R2可如国际专利公布号WO2019/152848A1中所描述，所述专利公布以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，可电离脂质是式(5)化合物：
Figure BDA0003951010620002402
其中：
每个n独立地是1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14或15；并且
R2如式(1)中所定义。
在一些实施方案中，如在式(5)中所用，R4和R5分别如式(1)中的R1和R3所定义。在一些实施方案中，如在式(5)中所用，R4和R5可如国际专利公布号WO2019/191780 A1中所描述，所述专利公布以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，本公开的可电离脂质选自表10a。在一些实施方案中，可电离脂质是表10a中的脂质26。在一些实施方案中，可电离脂质是表10a中的脂质27。在一些实施方案中，可电离脂质是表10a中的脂质53。在一些实施方案中，可电离脂质是表10a中的脂质54。
在一些实施方案中，本公开的可电离脂质选自由以下组成的组：
Figure BDA0003951010620002411
Figure BDA0003951010620002421
表10a
Figure BDA0003951010620002422
Figure BDA0003951010620002431
Figure BDA0003951010620002441
Figure BDA0003951010620002451
Figure BDA0003951010620002461
Figure BDA0003951010620002471
Figure BDA0003951010620002481
Figure BDA0003951010620002491
Figure BDA0003951010620002501
Figure BDA0003951010620002511
Figure BDA0003951010620002521
Figure BDA0003951010620002531
Figure BDA0003951010620002541
Figure BDA0003951010620002551
Figure BDA0003951010620002561
Figure BDA0003951010620002571
Figure BDA0003951010620002581
Figure BDA0003951010620002591
Figure BDA0003951010620002601
Figure BDA0003951010620002611
Figure BDA0003951010620002621
Figure BDA0003951010620002631
Figure BDA0003951010620002641
在一些实施方案中，可电离脂质具有β-羟基胺头基。在一些实施方案中，可电离脂质具有γ-羟基胺头基。
在一些实施方案中，本公开的可电离脂质是选自表10b的脂质。在一些实施方案中，本公开的可电离脂质是来自表10b的脂质15。在一个实施方案中，可电离脂质描述于美国专利公布号US20170210697A1中。在一个实施方案中，可电离脂质描述于美国专利公布号US20170119904A1中。
表10b
Figure BDA0003951010620002642
Figure BDA0003951010620002651
Figure BDA0003951010620002661
Figure BDA0003951010620002671
Figure BDA0003951010620002681
Figure BDA0003951010620002691
Figure BDA0003951010620002701
Figure BDA0003951010620002711
Figure BDA0003951010620002721
在一些实施方案中，可电离脂质具有下表10中列出的结构之一。
表10
Figure BDA0003951010620002722
Figure BDA0003951010620002731
Figure BDA0003951010620002741
Figure BDA0003951010620002751
Figure BDA0003951010620002761
Figure BDA0003951010620002771
Figure BDA0003951010620002781
Figure BDA0003951010620002791
Figure BDA0003951010620002801
Figure BDA0003951010620002811
Figure BDA0003951010620002821
Figure BDA0003951010620002831
在一些实施方案中，可电离脂质具有下表11中列出的结构之一。在一些实施方案中，表11中所列的可电离脂质如国际专利申请PCT/US2010/061058中所描述。
表11
Figure BDA0003951010620002841
Figure BDA0003951010620002851
Figure BDA0003951010620002861
Figure BDA0003951010620002871
Figure BDA0003951010620002881
Figure BDA0003951010620002891
Figure BDA0003951010620002901
Figure BDA0003951010620002911
Figure BDA0003951010620002921
Figure BDA0003951010620002931
Figure BDA0003951010620002941
Figure BDA0003951010620002951
Figure BDA0003951010620002961
Figure BDA0003951010620002971
Figure BDA0003951010620002981
Figure BDA0003951010620002991
Figure BDA0003951010620003001
Figure BDA0003951010620003011
Figure BDA0003951010620003021
Figure BDA0003951010620003031
Figure BDA0003951010620003041
Figure BDA0003951010620003051
Figure BDA0003951010620003061
Figure BDA0003951010620003071
Figure BDA0003951010620003081
Figure BDA0003951010620003091
Figure BDA0003951010620003101
Figure BDA0003951010620003111
Figure BDA0003951010620003121
Figure BDA0003951010620003131
Figure BDA0003951010620003141
Figure BDA0003951010620003151
Figure BDA0003951010620003161
Figure BDA0003951010620003171
Figure BDA0003951010620003181
Figure BDA0003951010620003191
Figure BDA0003951010620003201
Figure BDA0003951010620003211
Figure BDA0003951010620003221
Figure BDA0003951010620003231
Figure BDA0003951010620003241
Figure BDA0003951010620003251
Figure BDA0003951010620003261
Figure BDA0003951010620003271
Figure BDA0003951010620003281
Figure BDA0003951010620003291
Figure BDA0003951010620003301
Figure BDA0003951010620003311
Figure BDA0003951010620003321
Figure BDA0003951010620003331
Figure BDA0003951010620003341
Figure BDA0003951010620003351
Figure BDA0003951010620003361
Figure BDA0003951010620003371
Figure BDA0003951010620003381
Figure BDA0003951010620003391
在一些实施方案中，转移媒介物包含脂质A、脂质B、脂质C和/或脂质D。在一些实施方案中，包含脂质A、脂质B、脂质C和/或脂质D改善包封和/或内体逃逸。在一些实施方案中，脂质A、脂质B、脂质C和/或脂质D在国际专利申请PCT/US2017/028981中进行了描述。
在一些实施方案中，可电离脂质是脂质A，其是十八碳9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛基氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯，也称为(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯酸3-((4,44双(辛基氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯。脂质A可被描绘为：
Figure BDA0003951010620003401
脂质A可根据WO2015/095340(例如，第84-86页)合成，所述文献以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，可电离脂质是脂质B，其是((5-((二甲氨基)甲基)-1,3-亚苯基)双(氧基))双(辛烷-8,1-二基)双(癸酸酯)。脂质B可被描绘为：
Figure BDA0003951010620003402
脂质B可根据WO2014/136086(例如，第107-09页)合成，所述文献以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，可电离脂质是脂质C，其是2-((4-(((3-(二甲氨基)丙氧基)羰基)氧基)十六酰基)氧基)丙烷-1,3-二基(9Z,9'Z,12Z,12'Z)-双(十八碳-9,12-二烯酸酯)。脂质C可被描绘为：
Figure BDA0003951010620003411
在一些实施方案中，可电离脂质是脂质D，其是3-辛基十一烷酸3-(((3-(二甲氨基)丙氧基)羰基)氧基)-13-(辛酰基氧基)十三烷基酯。脂质D可被描绘为：
Figure BDA0003951010620003412
脂质C和脂质D可根据WO2015/095340合成，所述文献以引用的方式整体并入。
在一些实施方案中，可电离脂质描述于美国专利公布号20190321489中。在一些实施方案中，可电离脂质描述于国际专利公布WO 2010/053572中，所述专利公布以引用的方式并入本文。在一些实施方案中，可电离脂质是在WO 2010/053572的段落[00225]描述的C12-200。
一些可电离脂质已经在文献中描述，其中许多可商购获得。在某些实施方案中，此类可电离脂质包含在本文所述的转移媒介物中。在一些实施方案中，使用可电离脂质N-[1-(2,3-二油酰氧基)丙基]-N,N,N-三甲基氯化铵或“DOTMA”。(Felgner等人Proc.Nat'lAcad.Sci.84,7413(1987)；美国专利号4,897,355)。DOTMA可单独配制，或者可与中性脂质、二油酰基磷脂酰乙醇胺或“DOPE”或其他阳离子或非阳离子脂质组合成脂质纳米颗粒。其他合适的阳离子脂质包括例如，如在2012年3月29日提交的美国临时专利申请61/617,468(以引用的方式并入本文)中描述的可电离阳离子脂质，例如(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-15,18-二烯-1-胺(HGT5000)、(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-4,15,18-三烯-1-胺(HGT5001)和(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-5,15,18-三烯-1-胺(HGT5002)、C12-200(描述于WO 2010/053572中)、2-(2,2-二((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧杂环戊-4-基)-N,N-二甲基乙胺(DLinKC2-DMA))(参见，WO 2010/042877；Semple等人,Nature Biotech.28:172-176(2010))、2-(2,2-二((9Z,2Z)-十八-9,12-二烯-1-基)-1,3-二氧杂环戊-4-基)-N,N-二甲基乙胺(DLin-KC2-DMA)、3-(1H-咪唑-4-基)丙酸(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊并[a]菲-3-基酯(ICE)、(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-(9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-15,18-二烯-1-胺(HGT5000)、(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-4,15,18-三烯-1-胺(HGT5001)、(15Z,18Z)-N,N-二甲基-6-((9Z,12Z)-十八-9,12-二烯-1-基)二十四-5,15,18-三烯-1-胺(HGT5002)、5-羧基精胺基甘氨酸-二辛油酰基酰胺(DOGS)、2,3-二油酰氧基-N-[2(精胺-甲酰胺基)乙基]-N,N-二甲基-1-丙铵(DOSPA)(Behr等人Proc.Nat.'l Acad.Sci.86,6982(1989)；美国专利第5,171,678号；第5,334,761号)、1,2-二油酰基-3-二甲基铵-丙烷(DODAP)、1,2-二油酰基-3-三甲基铵-丙烷或(DOTAP)。所考虑的可电离脂质还包括1,2-二硬脂酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DSDMA)、1,2-二油酰氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DODMA)、1,2-二亚油醇氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLinDMA)、1,2-二亚油烯醇氧基-N,N-二甲基-3-氨基丙烷(DLenDMA)、N-二油酰基-N,N-二甲基氯化铵(DODAC)、N,N-二硬脂酰基-N,N-二甲基溴化铵(DDAB)、N-(1,2-二肉豆蔻氧基丙-3-基)-N,N-二甲基-N-羟乙基溴化铵(DMRIE)、3-二甲氨基-2-(胆甾-5-烯-3-β-氧基丁烷-4-氧基)-1-(顺式,顺式-9,12-十八二烯氧基)丙烷(CLinDMA)、2-[5'-(胆甾-5-烯-3-β-氧基)-3'-氧杂戊氧基)-3-二甲基1-1-(顺式,顺式-9’,1-2’-十八二烯氧基)丙烷(CpLinDMA)、N,N-二甲基-3,4-二油酰氧基苄胺(DMOBA)、1,2-N,N'-二油基氨基甲酰基-3-二甲氨基丙烷(DOcarbDAP)、2,3-二亚油醇氧基-N,N-二甲基丙胺(DLinDAP)、1,2-N,N'-二亚油醇氨基甲酰基-3-二甲氨基丙烷(DLincarbDAP)、1,2-二亚油醇氨基甲酰基-3-二甲氨基丙烷(DLinCDAP)、2,2-二亚油醇-4-二甲氨基甲基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-DMA)、2,2-二亚油醇-4-二甲氨基乙基-[1,3]-二氧戊环(DLin-K-XTC2-DMA)或GL67或它们的混合物。(Heyes,J.等人,J ControlledRelease 107:276-287(2005)；Morrissey,D V.等人,Nat.Biotechnol.23(8):1003-1007(2005)；PCT公布WO2005/121348A1)。本发明还考虑使用基于胆固醇的可电离脂质来配制转移媒介物(例如，脂质纳米颗粒)。此类基于胆固醇的可电离脂质可单独或与其它脂质组合来使用。合适的基于胆固醇的阳离子脂质包括，例如，DC-胆固醇(N,N-二甲基-N-乙基甲酰胺基胆固醇)和1,4-双(3-N-油基氨基-丙基)哌嗪(Gao,等人,Biochem.Biophys.Res.Comm.179,280(1991)；Wolf等人BioTechniques 23,139(1997)；美国专利号5,744,335)。
还考虑了阳离子脂质，如基于二烷基氨基的、基于咪唑的和基于胍鎓的脂质。例如，还考虑使用可电离脂质3-(1H-咪唑-4-基)丙酸(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊并[a]菲-3-基酯(ICE)，如国际申请号PCT/US2010/058457中所公开，所述申请以引用的方式并入本文。
还考虑了可电离脂质，如基于二烷基氨基的、基于咪唑的和基于胍鎓的脂质。例如，某些实施方案涉及包含一种或多种基于咪唑的可电离脂质的组合物，例如，咪唑胆固醇酯或“ICE”脂质3-(1H-咪唑-4-基)丙酸(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊并[a]菲-3-基酯，如以下结构(XIII)所表示。在一个实施方案中，用于递送circRNA的转移媒介物可包含一种或多种基于咪唑的可电离脂质，例如咪唑胆固醇酯或“ICE”脂质3-(1H-咪唑-4-基)丙酸(3S,10R,13R,17R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊并[a]菲-3-基酯，如结构(XIII)所表示。
Figure BDA0003951010620003441
不希望受特定理论束缚，据信基于咪唑的阳离子脂质ICE的融合原性与咪唑基团促进的内体破坏有关，咪唑基团相对于传统的可电离脂质具有较低的pKa。内体破坏进而促进渗透溶胀和脂质体膜的破坏，随后将负载于其中的核酸内含物转染或细胞内释放到靶细胞中。
基于咪唑的可电离脂质的特征还在于它们相对于其他可电离脂质的毒性降低。
在一些实施方案中，美国专利公布号20190314284描述了可电离脂质。在某些实施方案中，可电离脂质由结构3、4、5、6、7、8、9或10描述(例如，HGT4001、HGT4002、HGT4003、HGT4004和/或HGT4005)。在某些实施方案中，一个或多个可裂解官能团(例如，二硫键)允许例如亲水性官能头基与化合物的亲脂性官能尾基解离(例如，在暴露于氧化、还原或酸性条件时)，从而促进一个或多个靶细胞的脂质双层中的相变。例如，当转移媒介物(例如，脂质纳米颗粒)包含结构3-10的脂质中的一者或多者时，一种或多种靶细胞的脂质双层中的相变有助于将circRNA递送至一种或多种靶细胞中。
在某些实施方案中，可电离脂质由结构(XIV)描述，
Figure BDA0003951010620003451
其中：
R1选自由以下组成的组：咪唑、胍鎓、氨基、亚胺、烯胺、任选取代的烷基氨基(例如，烷基氨基如二甲氨基)和吡啶基；
R2选自由结构XV和结构XVI组成的组；
Figure BDA0003951010620003452
其中R3和R4各自独立地选自由以下组成的组：任选取代的、可变饱和的或不饱和的C6-C20烷基和任选取代的、可变饱和的或不饱和的C6-C20酰基；并且其中n是零或任何正整数(例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更大)。在某些实施方案中，R3和R4各自是任选取代的多不饱和C18烷基，而在其他实施方案中，R3和R4各自是未取代的多不饱和C18烷基。在某些实施方案中，R3和R4中的一者或多者是(9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯。
本文还公开了包含结构XIV化合物的药物组合物，其中R1选自由以下组成的组：咪唑、胍鎓、氨基、亚胺、烯胺、任选取代的烷基氨基(例如，烷基氨基如二甲氨基)和吡啶基；其中R2是结构XV；并且其中n是0或任何正整数。本文进一步公开了包含结构XIV化合物的药物组合物，其中R1选自由以下组成的组：咪唑、胍鎓、氨基、亚胺、烯胺、任选取代的烷基氨基(例如，烷基氨基如二甲氨基)和吡啶基；其中R2是结构XVI；其中R3和R4各自独立地选自由以下组成的组：任选取代的、可变饱和的或不饱和的C6-C20烷基和任选取代的、可变饱和的或不饱和的C6-C20酰基；并且其中n是0或任何正整数。在某些实施方案中。R3和R4各自是任选取代的多不饱和C18烷基，而在其他实施方案中，R3和R4各自是未取代的多不饱和C18烷基(例如，十八碳-9,12-二烯)。
在某些实施方案中，R1基团或头基是极性或亲水性基团(例如，咪唑、胍鎓和氨基中的一者或多者)并且通过二硫键(S—S)可裂解接头基团与R2脂质基团结合，例如结构XIV中所描绘。其他考虑的可裂解接头基团可包括包含结合(例如共价结合)至例如烷基(例如，C1至C10烷基)的一个或多个二硫键(S—S)接头基团的组合物。在某些实施方案中，R1基团通过C1-C20烷基共价结合至可裂解接头基团(例如，其中n是1至20)，或者可替代地可直接结合至可裂解接头基团(例如，其中n是0)。在某些实施方案中，二硫键接头基团在体外和/或体内是可裂解的(例如，在暴露于酸性或还原条件时可酶促裂解或可裂解)。
在某些实施方案中，本发明涉及具有结构XVII的化合物5-(((10,13-二甲基-17-(6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊并[a]菲-3-基)二硫烷基)甲基)-1H-咪唑(在本文中称为“HGT4001”)。
Figure BDA0003951010620003471
在某些实施方案中，本发明涉及具有结构XVIII的化合物1-(2-(((3S,10R,13R)-10,13-二甲基-17-((R)-6-甲基庚-2-基)-2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-十四氢-1H-环戊并[a]菲-3-基)二硫烷基)乙基)胍(在本文中称为“HGT4002”)。
Figure BDA0003951010620003472
在某些实施方案中，本发明涉及具有结构XIX的化合物2-((2,3-双((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)丙基)二硫烷基)-N,N-二甲基乙胺(在本文中称为“HGT4003”)。
Figure BDA0003951010620003473
在其他实施方案中，本发明涉及具有结构XX的结构的化合物5-(((2,3-双((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)丙基)二硫烷基)甲基)-1H-咪唑(在本文中称为“HGT4004”)。
Figure BDA0003951010620003474
在其他实施方案中，本发明涉及具有结构XXI的化合物1-(((2,3-双((9Z,12Z)-十八碳-9,12-二烯-1-基氧基)丙基)二硫烷基)甲基)胍(在本文中称为“HGT4005”)。
Figure BDA0003951010620003481
在某些实施方案中，描述为结构3-10的化合物是可电离脂质。
这些化合物，并且特别是描述为结构3-8的基于咪唑的化合物(例如，HGT4001和HGT4004)的特征在于它们的毒性降低，特别是相对于传统可电离脂质而言。在一些实施方案中，本文所述的转移媒介物包含一种或多种基于咪唑的可电离脂质化合物，使得此类药物或脂质体组合物中其他毒性更大的可电离脂质的相对浓度可降低或以其他方式消除。
可电离脂质包括在国际专利申请PCT/US2019/025246和美国专利公布2017/0190661和2017/0114010中公开的那些，所述专利以引用的方式整体并入本文。可电离脂质可包括选自下表12、13、14或15的脂质。
表12
Figure BDA0003951010620003482
Figure BDA0003951010620003491
Figure BDA0003951010620003501
Figure BDA0003951010620003511
Figure BDA0003951010620003521
表13
Figure BDA0003951010620003522
Figure BDA0003951010620003531
Figure BDA0003951010620003541
表14
Figure BDA0003951010620003551
Figure BDA0003951010620003561
Figure BDA0003951010620003571
Figure BDA0003951010620003581
Figure BDA0003951010620003591
Figure BDA0003951010620003601
Figure BDA0003951010620003611
Figure BDA0003951010620003621
Figure BDA0003951010620003631
Figure BDA0003951010620003641
Figure BDA0003951010620003651
Figure BDA0003951010620003661
Figure BDA0003951010620003671
Figure BDA0003951010620003681
表15
Figure BDA0003951010620003682
Figure BDA0003951010620003691
Figure BDA0003951010620003701
在一些实施方案中，可电离脂质如国际专利申请PCT/US2019/015913中所描述。在一些实施方案中，可电离脂质选自以下：
Figure BDA0003951010620003711
Figure BDA0003951010620003721
Figure BDA0003951010620003731
Figure BDA0003951010620003741
Figure BDA0003951010620003751
Figure BDA0003951010620003761
Figure BDA0003951010620003771
Figure BDA0003951010620003781
Figure BDA0003951010620003791
Figure BDA0003951010620003801
Figure BDA0003951010620003811
Figure BDA0003951010620003821
Figure BDA0003951010620003831
Figure BDA0003951010620003841
Figure BDA0003951010620003851
Figure BDA0003951010620003861
Figure BDA0003951010620003871
Figure BDA0003951010620003881
Figure BDA0003951010620003891
Figure BDA0003951010620003901
Figure BDA0003951010620003911
Figure BDA0003951010620003921
Figure BDA0003951010620003931
Figure BDA0003951010620003941
Figure BDA0003951010620003951
Figure BDA0003951010620003961
Figure BDA0003951010620003971
Figure BDA0003951010620003981
Figure BDA0003951010620003991
Figure BDA0003951010620004001
Figure BDA0003951010620004011
Figure BDA0003951010620004021
Figure BDA0003951010620004031
Figure BDA0003951010620004041
Figure BDA0003951010620004051
Figure BDA0003951010620004061
Figure BDA0003951010620004071
Figure BDA0003951010620004081
Figure BDA0003951010620004091
Figure BDA0003951010620004101
Figure BDA0003951010620004111
Figure BDA0003951010620004121
Figure BDA0003951010620004131
Figure BDA0003951010620004141
Figure BDA0003951010620004151
Figure BDA0003951010620004161
Figure BDA0003951010620004171
Figure BDA0003951010620004181
Figure BDA0003951010620004191
Figure BDA0003951010620004201
Figure BDA0003951010620004211
Figure BDA0003951010620004221
Figure BDA0003951010620004231
Figure BDA0003951010620004241
胺脂质
在某些实施方案中，用于递送环状RNA的转移媒介物组合物包含胺脂质。在某些实施方案中，可电离脂质是胺脂质。在一些实施方案中，胺脂质如国际专利申请PCT/US2018/053569中所描述。
在一些实施方案中，胺脂质是脂质E，其是十八碳-9,12-二烯酸(9Z,12Z)-3-((4,4-双(辛基氧基)丁酰基)氧基)-2-((((3-(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙酯。
脂质E可被描绘为：
Figure BDA0003951010620004242
脂质E可根据WO2015/095340(例如，第84-86页)合成。在某些实施方案中，胺脂质等效于脂质E。
在某些实施方案中，胺脂质是脂质E的类似物。在某些实施方案中，脂质E类似物是脂质E的缩醛类似物。在特定转移媒介物组合物中，缩醛类似物是C4-C12缩醛类似物。在一些实施方案中，缩醛类似物是C5-C12缩醛类似物。在另外的实施方案中，缩醛类似物是C5-C10缩醛类似物。在其他实施方案中，缩醛类似物选自C4、C5、C6、C7、C9、C10、C11和C12缩醛类似物。
适用于转移媒介物的胺脂质和其他生物可降解脂质，例如本文所述的脂质纳米颗粒，在体内是生物可降解的。本文所述的胺脂质具有低毒性(例如，在动物模型中可耐受大于或等于10mg/kg的量而无副作用)。在某些实施方案中，包含胺脂质的转移媒介物包括在8、10、12、24或48小时或3、4、5、6、7或10天内从血浆中清除至少75％的胺脂质的那些。
生物可降解脂质包括例如WO2017/173054、WO2015/095340和WO2014/136086的生物可降解脂质。
可通过本领域技术人员已知的方法测量脂质清除率。参见例如，Maier,M.A.，等人Biodegradable Lipids Enabling Rapidly Eliminated Lipid Nanoparticles forSystemic Delivery of RNAi Therapeutics.Mol.Ther.2013,21(8),1570-78。
包含胺脂质的转移媒介物组合物可导致清除率增加。在一些实施方案中，清除率是脂质清除率，例如脂质从血液、血清或血浆中清除的速率。在一些实施方案中，清除率是RNA清除率，例如circRNA从血液、血清或血浆中清除的速率。在一些实施方案中，清除率是转移媒介物从血液、血清或血浆中清除的速率。在一些实施方案中，清除率是转移媒介物从组织，如肝组织或脾组织中清除的速率。在某些实施方案中，高清除率导致没有明显不利影响的安全性特征。胺脂质和生物可降解脂质可减少循环和组织中的转移媒介物累积。在一些实施方案中，循环和组织中转移媒介物累积的减少导致没有明显不利影响的安全性特征。
脂质可以是可电离的，取决于它们所在的介质的pH。例如，在微酸性介质中，脂质如胺脂质可被质子化并因此带有正电荷。相反，在pH大约7.35的微碱性介质，例如血液中，脂质如胺脂质可能不会被质子化并且因此不带电荷。
脂质带电的能力与其固有的pKa相关。在一些实施方案中，本公开的胺脂质可各自独立地具有在约5.1至约7.4范围内的pKa。在一些实施方案中，本公开的生物可利用脂质可各自独立地具有在约5.1至约7.4范围内的pKa。例如，本公开的胺脂质可各自独立地具有在约5.8至约6.5范围内的pKa。pKa在约5.1至约7.4范围内的脂质可有效地在体内例如将货物递送至肝。此外，已发现pKa在约5.3至约6.4范围内的脂质可有效地在体内例如递送至肿瘤中。参见例如，WO2014/136086。
含有二硫键的脂质
在一些实施方案中，可电离脂质描述于美国专利9,708,628中。
本发明提供了由结构(XXII)表示的脂质：
Figure BDA0003951010620004261
在结构(XXII)中，Xa和Xb各自独立地是如下所示的X1或X2。
Figure BDA0003951010620004262
X1中的R4是具有1-6个碳原子的烷基，其可以是直链、支链或环状的。烷基优选具有1-3个碳原子数。具有1-6个碳原子的烷基的具体实例包括甲基、乙基、丙基、异丙基、正丁基、仲丁基、异丁基、叔丁基、戊基、异戊基、新戊基、叔戊基、1,2-二甲基丙基、2-甲基丁基、2-甲基戊基、3-甲基戊基、2,2-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、环己基等。R4优选地是甲基、乙基、丙基或异丙基，最优选是甲基。
X2中的s是1或2。当s是1时，X2是吡咯烷鎓基团，并且当s是2时，X2是哌啶鎓基团。s优选地是2。虽然X2的结合方向没有限制，但X2中的氮原子优选结合至R1a和R1b。
Xa可与Xb相同或不同，并且Xa优选是与Xb相同的基团。
na和nb各自独立地是0或1，优选1。当na是1时，R3a通过Ya和R2a结合至Xa，并且当na是0时，采用R3a—Xa—R1a—S—的结构。类似地，当nb是1时，R3b通过Yb和R2b结合至Xb，并且当nb是0时，采用R3b—Xb—R1b—S—的结构。
na可与nb相同或不同，并且na优选与nb相同。
R1a和R1b各自独立地是具有1-6个碳原子的亚烷基，其可以是直链或支链的，优选直链的。具有1-6个碳原子的亚烷基的具体实例包括亚甲基、亚乙基、三亚甲基、异亚丙基、四亚甲基、异亚丁基、五亚甲基、新亚戊基等。R1a和R1b各自优选地是亚甲基、亚乙基、三亚甲基、异亚丙基或四亚甲基，最优选亚乙基。
R1a可与R1b相同或不同，并且R1a优选是与R1b相同的基团。
R2a和R2b各自独立地是具有1-6个碳原子的亚烷基，其可以是直链或支链的，优选直链的。具有1-6个碳原子的亚烷基的实例包括作为R1a或R1b的具有1-6个碳原子的亚烷基的实例而列举的那些。R2a和R2b各自优选地是亚甲基、亚乙基、三亚甲基、异亚丙基或四亚甲基。
当Xa和Xb各自是X1时，R2a和R2b优选地是三亚甲基。当Xa和Xb各自是X2时，R2a和R2b优选地是亚乙基。
R2a可与R2b相同或不同，并且R2a优选是与R2b相同的基团。
Ya和Yb各自独立地是酯键、酰胺键、氨基甲酸酯键、醚键或脲键，优选酯键、酰胺键或氨基甲酸酯键，最优选酯键。虽然Ya和Yb的结合方向没有限制，但是当Ya是酯键时，R3a—CO—O—R2a—的结构是优选的，并且当Yb是酯键时，R3b—CO—O—R2b—的结构是优选的。
Ya可与Yb相同或不同，并且Ya优选是与Yb相同的基团。
R3a和R3b各自独立地是固醇残基、脂溶性维生素残基或具有12-22个碳原子的脂族烃基，优选脂溶性维生素残基或具有12-22个碳原子的脂族烃基，最优选脂溶性维生素残基。
固醇残基的实例包括胆固醇基(胆固醇残基)、胆甾烷醇基(胆甾烷醇残基)、豆固醇基(豆固醇残基)、β-谷甾醇基(β-谷甾醇残基)、羊毛固醇基(羊毛固醇残基)以及麦角甾醇基(麦角甾醇残基)等。固醇残基优选地是胆固醇基或胆固烷醇基。
作为脂溶性维生素残基，可使用源自脂溶性维生素的残基以及源自通过将作为脂溶性维生素中的官能团的羟基、醛或羧酸适当地转化为其他反应性官能团而获得的衍生物的残基。对于具有羟基的脂溶性维生素，例如，可通过与琥珀酸酐、戊二酸酐等反应将羟基转化为羧酸。脂溶性维生素的实例包括视黄酸、视黄醇、视黄醛、麦角甾醇、7-脱氢胆固醇、钙化醇、胆钙化醇、二氢麦角钙化醇、二氢速固醇、生育酚、生育三烯酚等。脂溶性维生素的优选实例包括视黄酸和生育酚。
具有12-22个碳原子的脂族烃基可以是直链或支链的，优选直链的。脂族烃基可以是饱和的或不饱和的。在不饱和脂族烃基的情况下，脂族烃基通常含有1-6个、优选1-3个、更优选1-2个不饱和键。虽然不饱和键包括碳-碳双键和碳-碳三键，但优选碳-碳双键。脂族烃基的碳数优选为12-18，最优选为13-17。虽然脂族烃基包括烷基、烯基、炔基等，但优选烷基或烯基。具有12-22个碳原子的脂族烃基的具体实例包括十二烷基、十三烷基、十四烷基、十五烷基、十六烷基、十七烷基、十八烷基、十九烷基、二十烷基、二十一烷基、二十二烷基、十二烯基、十三烯基、十四烯基、十五烯基、十六烯基、十七烯基、十八烯基、十九烯基、二十烯基、二十一烯基、二十二烯基、癸二烯基、十三碳二烯基、十四碳二烯基、十五碳二烯基、十六碳二烯基、十七碳二烯基、十八碳二烯基、十九碳二烯基、二十碳二烯基、二十一碳二烯基、二十二碳二烯基、十八碳三烯基、二十碳三烯基、二十碳四烯基、二十碳五烯基、二十二碳六烯基、异硬脂基等。具有12-22个碳原子的脂族烃基优选地是十三烷基、十四烷基、十七烷基、十八烷基、十七碳二烯基或十八碳二烯基，特别优选十三烷基、十七烷基或十七碳二烯基。
在一个实施方案中，使用衍生自脂肪酸、脂肪醇或脂肪胺的具有12-22个碳原子的脂族烃基。当R3a(或R3b)衍生自脂肪酸时，Ya(或Yb)是酯键或酰胺键，并且脂肪酸衍生的羰基碳包含在Ya(或Yb)中。例如，当使用亚油酸时，R3a(或R3b)是十七碳二烯基。
R3a可与R3b相同或不同，并且R3a优选是与R3b相同的基团。
在一个实施方案中，Xa与Xb相同，na与nb相同，R1a与R1b相同，R2a与R2b相同，R3a与R3b相同，并且Ya与Yb相同。
在一个实施方案中，
Xa和Xb各自独立地是X1，
R4是具有1-3个碳原子的烷基，na和nb各自是1，
R1a和R1b各自独立地是具有1-6个碳原子的亚烷基，
R2a和R2b各自独立地是具有1-6个碳原子的亚烷基，
Ya和Yb各自是酯键或酰胺键，并且
R3a和R3b各自独立地是具有12-22个碳原子的脂族烃基。
在一个实施方案中，
Xa和Xb各自是X1，
R4是具有1-3个碳原子的烷基，na和nb各自是1，
R1a和R1b各自是具有1-6个碳原子的亚烷基，
R2a和R2b各自是具有1-6个碳原子的亚烷基，
Ya和Yb各自是酯键或酰胺键，
R3a和R3b各自是具有12-22个碳原子的脂族烃基。
Xa与Xb相同，
R1a与R1b相同，
R2a与R2b相同，并且
R3a与R3b相同。
在一个实施方案中，
Xa和Xb各自是X1，
R4是甲基，na和nb各自是1，
R1a和R1b各自是亚乙基，
R2a和R2b各自是三亚甲基，
Ya和Yb各自是—CO—O—，并且
R3a和R3b各自独立地是具有13-17个碳原子的烷基或烯基。
在一个实施方案中，
Xa和Xb各自是X1，
R4是甲基，na和nb各自是1，
R1a和R1b各自是亚乙基，
R2a和R2b各自是三亚甲基，
Ya和Yb各自是—CO—O—，
R3a和R3b各自是具有13-17个碳原子的烷基或烯基，并且
R3a与R3b相同。
在一个实施方案中，
Xa和Xb各自独立地是X1，
R4是具有1-3个碳原子的烷基，na和nb各自是1，
R1a和R1b各自独立地是具有1-6个碳原子的亚烷基，
R2a和R2b各自独立地是具有1-6个碳原子的亚烷基，
Ya和Yb各自是酯键或酰胺键，并且
R3a和R3b各自独立地是脂溶性维生素残基(例如，视黄酸残基、生育酚残基)。
在一个实施方案中，
Xa和Xb各自是X1，
R4是具有1-3个碳原子的烷基，na和nb各自是1，
R1a和R1b各自是具有1-6个碳原子的亚烷基，
R2a和R2b各自是具有1-6个碳原子的亚烷基，
Ya和Yb各自是酯键或酰胺键，
R3a和R3b各自是脂溶性维生素残基(例如，视黄酸残基、生育酚残基)。
Xa与Xb相同，
R1a与R1b相同，
R2a与R2b相同，并且
R3a与R3b相同。
在一个实施方案中，
Xa和Xb各自是X1，
R4是甲基，na和nb各自是1，
R1a和R1b各自是亚乙基，
R2a和R2b各自是三亚甲基，
Ya和Yb各自是—CO—O—，并且
R3a和R3b各自独立地是脂溶性维生素残基(例如，视黄酸残基、生育酚残基)。
在一个实施方案中，
Xa和Xb各自是X1，
R4是甲基，na和nb各自是1，
R1a和R1b各自是亚乙基，
R2a和R2b各自是三亚甲基，
Ya和Yb各自是—CO—O—，
R3a和R3b各自是脂溶性维生素残基(例如，视黄酸残基、生育酚残基)，并且
R3a与R3b相同。
在一个实施方案中，
Xa和Xb各自独立地是X2，
t是2，
R1a和R1b各自独立地是具有1-6个碳原子的亚烷基，
R2a和R2b各自独立地是具有1-6个碳原子的亚烷基，
Ya和Yb各自是酯键，并且
R3a和R3b各自独立地是脂溶性维生素残基(例如，视黄酸残基、生育酚残基)或具有12-22个碳原子的脂族烃基(例如，具有12-22个碳原子的烷基)。
在一个实施方案中，
Xa和Xb各自独立地是X2，
t是2，
R1a和R1b各自独立地是具有1-6个碳原子的亚烷基，
R2a和R2b各自独立地是具有1-6个碳原子的亚烷基，
Ya和Yb各自是酯键，
R3a和R3b各自独立地是脂溶性维生素残基(例如，视黄酸残基、生育酚残基)或具有12-22个碳原子的脂族烃基(例如，具有12-22个碳原子的烷基)，
Xa与Xb相同，
R1a与R1b相同，
R2a与R2b相同，并且
R3a与R3b相同。
在一个实施方案中，
Xa和Xb各自独立地是X2，
t是2，
R1a和R1b各自是亚乙基，
R2a和R2b各自独立地是具有1-6个碳原子的亚烷基，
Ya和Yb各自是酯键，
R3a和R3b各自独立地是脂溶性维生素残基(例如，视黄酸残基、生育酚残基)或具有12-22个碳原子的脂族烃基(例如，具有12-22个碳原子的烷基)，
Xa与Xb相同，
R2a与R2b相同，并且
R3a与R3b相同。
在一些实施方案中，可电离脂质具有下表15b中列出的结构之一。
表15b
Figure BDA0003951010620004351
Figure BDA0003951010620004361
Figure BDA0003951010620004371
Figure BDA0003951010620004381
本发明的脂质可具有—S—S—(二硫键)键。用于这种化合物的产生方法包括例如，包括产生
R3a—(Ya—R2a)na—Xa—R1a—SH，和
R3b—(Yb—R2b)nb—Xb—R1b—SH，以及
使它们经受氧化(偶联)以得到含有—S—S—的化合物的方法，包括依次将必要部分键合至含有—S—S—键的化合物以最终得到本发明的化合物的方法等。优选后一种方法。
后一种方法的具体实例如下所示，其不应被解释为限制性的。
起始化合物的实例包括含—S—S—键的双末端羧酸、双末端羧酸酯、双末端胺、双末端异氰酸酯、双末端醇、具有诸如MsO(甲磺酸酯基团)等的离去基团的双末端醇、具有诸如pNP(对硝基苯基碳酸酯基团)等的离去基团的双末端碳酸酯。
例如，当制备Xa和Xb的含有X1或X2的化合物时，使含有—S—S—键的化合物(1)的两个末端官能团与具有—NH—基团和在末端的一个官能团的化合物(2)中的—NH—基团反应，使化合物(2)中对反应没有贡献的所述在末端的官能团与含有R3的化合物(3)中的官能团反应，由此可得到本发明的含有—S—S—键、R1a和R1b、Xa和Xb、R2a和R2b、Ya和Yb以及R3a和R3b的化合物。
在化合物(1)与化合物(2)的反应中，可使用诸如碳酸钾、碳酸钠、叔丁醇钾等的碱催化剂作为催化剂，或者可在没有催化剂的情况下进行反应。优选地，使用碳酸钾或碳酸钠作为催化剂。
相对于化合物(1)，催化剂的量是0.1-100摩尔当量，优选0.1-20摩尔当量，更优选0.1-5摩尔当量。相对于化合物(1)，待装入的化合物(2)的量是1-50摩尔当量，优选1-10摩尔当量。
待用于化合物(1)和化合物(2)的反应的溶剂没有特别限制，只要它是不会抑制反应的溶剂或水溶液即可。例如，可提及乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、苯、甲苯等。其中，优选甲苯和氯仿。
反应温度是-20℃至200℃，优选0℃至80℃，更优选20℃至50℃，并且反应时间是1至48小时，优选2至24小时。
当使化合物(1)和化合物(2)的反应产物与化合物(3)反应时，可使用碱催化剂如碳酸钾、碳酸钠、叔丁醇钾等，或酸催化剂如PTS(对甲苯磺酸)、MSA(甲磺酸)等，如用于化合物(1)和化合物(2)的反应的催化剂，或者可在没有催化剂的情况下进行反应。
此外，可通过使用缩合剂如DCC(二环己基碳二亚胺)、DIC(二异丙基碳二亚胺)、EDC(1-乙基-3-(3-二甲氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)等使化合物(1)和化合物(2)的反应产物直接与化合物(3)反应。可替代地，可用缩合剂处理化合物(3)以暂时转化为酸酐等，然后与化合物(1)和化合物(2)的反应产物反应。
相对于化合物(1)和化合物(2)的反应产物，待装入的化合物(3)的量是1-50摩尔当量，优选1-10摩尔当量。
待使用的催化剂根据待反应的官能团适当地选择。
相对于化合物(1)，催化剂的量是0.05-100摩尔当量，优选0.1-20摩尔当量，更优选0.2-5摩尔当量。
待用于化合物(1)和化合物(2)的反应产物与化合物(3)的反应的溶剂没有特别限制，只要它是不会抑制反应的溶剂或水溶液即可。例如，可提及乙酸乙酯、二氯甲烷、氯仿、苯、甲苯等。其中，优选甲苯和氯仿。
反应温度是0℃至200℃，优选0℃至120℃，更优选20℃至50℃，并且反应时间是1小时至48小时，优选2至24小时。
通过上述反应得到的反应产物可通过一般纯化方法，例如用水洗涤、硅胶柱色谱法、结晶、重结晶、液-液萃取、再沉淀、离子交换柱色谱法等适当地纯化。
XXIII结构脂质
在一些实施方案中，可电离脂质描述于美国专利9,765,022中。
本发明提供由结构(XXIII)表示的化合物：
Figure BDA0003951010620004401
在结构XXIII中，亲水性和任选带正电荷的头部是
Figure BDA0003951010620004411
其中Ra、Ra’、Ra”和Ra”’各自独立地是H、C1-C20单价脂族基团、C1-C20单价杂脂族基团、单价芳基或单价杂芳基，并且Z是C1-C20二价脂族基团、C1-C20二价杂脂族基团、二价芳基或二价杂芳基；B是C1-C24单价脂族基团、C1-C24单价杂脂族基团、单价芳基、单价杂芳基，或者
Figure BDA0003951010620004412
R1和R4各自独立地是键、C1-C10二价脂族基团、C1-C10二价杂脂族基团、二价芳基或二价杂芳基；R2和R5各自独立地是键、C1-C20二价脂族基团、C1-C20二价杂脂族基团、二价芳基或二价杂芳基；R3和R6各自独立地是C1-C20单价脂族基团、C1-C20单价杂脂族基团、单价芳基或单价杂芳基；疏水性尾部
Figure BDA0003951010620004413
和也是疏水性尾部的
Figure BDA0003951010620004414
各自具有8至24个碳原子；并且接头X和也是接头的Y各自独立地是
Figure BDA0003951010620004415
其中m、n、p、q和t各自独立地是1-6；W是O、S或NRc；与R1、R2、R4或R5直接连接的L1、L3、L5、L7和L9各自独立地是键、O、S或NRd；L2、L4、L6、L8和L10各自独立地是键、O、S或NRe；V是ORf、SRg或NRhRi；并且Rb、Rc、Rd、Re、Rf、Rg、Rh和Ri各自独立地是H、OH、C1-10脂氧族基团、C1-C10单价脂族基团、C1-C10单价杂脂族基团、单价芳基或单价杂芳基。
上述脂质样化合物的子集包括其中A是
Figure BDA0003951010620004421
的那些，Ra和Ra’各自独立地是C1-C10单价脂族基团、C1-C10单价杂脂族基团、单价芳基或单价杂芳基；并且Z是C1-C10二价脂族基团、C1-C10二价杂脂族基团、二价芳基或二价杂芳基。
本发明的一些脂质样化合物的特征在于R1和R4各自独立地是C1-C6(例如，C1-C4)二价脂族基团或C1-C6(例如，C1-C4)二价杂脂族基团，R2和R3的总碳数是12-20(例如，14-18)，R5和R6的总碳数也是12-20(例如，14-18)，并且X和Y各自独立地是
Figure BDA0003951010620004422
Figure BDA0003951010620004423
X和Y的具体实例包括
Figure BDA0003951010620004424
Figure BDA0003951010620004425
m是2-6。
含有由蛋白质和生物可还原化合物形成的纳米复合物的药物组合物仍在本发明的范围内。在这种药物组合物中，纳米复合物具有50-500nm的粒度；生物可还原化合物含有二硫键疏水性部分、亲水性部分和连接所述二硫键疏水性部分和所述亲水性部分的接头；并且蛋白质通过非共价相互作用、共价键或两者结合至生物可还原化合物。
在某些实施方案中，二硫键疏水性部分是含有一个或多个—S—S—基团和8至24个碳原子的杂脂族基团；亲水性部分是含有一个或多个亲水性基团和1-20个碳原子的脂族或杂脂族基团，所述亲水性基团各自是氨基、烷基氨基、二烷基氨基、三烷基氨基、四烷基铵、羟基氨基、羟基、羧基、羧酸根、氨基甲酸根、脲、碳酸根、磷酸根、亚磷酸根、硫酸根、亚硫酸根或硫代硫酸根；并且接头是O、S、Si、C1-C6亚烷基、
Figure BDA0003951010620004431
Figure BDA0003951010620004432
Figure BDA0003951010620004433
其中变量如上文所定义。
X和Y的具体实例包括O、S、Si、C1-C6亚烷基、
Figure BDA0003951010620004434
Figure BDA0003951010620004435
在一些实施方案中，如以上结构XXIII所示的本发明的脂质样化合物包含(i)亲水性头部，A；(ii)疏水性尾部，R2-S-S-R3；和(iii)接头，X。任选地，这些化合物含有第二疏水性尾部R5-S-S-R6和第二接头Y。
结构XXIII的亲水性头部含有一个或多个亲水性官能团，例如羟基、羰基、羧基、氨基、巯基、磷酸根、酰胺、酯、醚、氨基甲酸根、碳酸根、脲和磷酸二酯。这些基团可形成氢键并且任选带正电荷或带负电荷。
亲水性头部的实例包括：
Figure BDA0003951010620004441
其他实例包括在Akinc等人,Nature Biotechnology,26,561-69(2008)和Mahon等人，美国专利申请公布2011/0293703中描述的那些。
结构XXIII的疏水性尾部是含有二硫键和8-24个碳原子的饱和或不饱和的、直链或支链的、无环或环状的、芳族或非芳族的烃部分。一个或多个碳原子可被杂原子如N、O、P、B、S、Si、Sb、Al、Sn、As、Se和Ge替代。尾部任选地被一个或多个上述基团取代。含有这种二硫键的脂质样化合物可以是生物可还原的。
实例包括：
Figure BDA0003951010620004451
结构XXIII的接头连接亲水性头部和疏水性尾部。接头可以是亲水性或疏水性的、极性或非极性的任何化学基团，例如O、S、Si、氨基、亚烷基、酯、酰胺、氨基甲酸根、脲、碳酸根、磷酸根、亚磷酸根、硫酸根、亚硫酸根和硫代硫酸根。实例包括：
Figure BDA0003951010620004461
下面显示的是本发明的示例性脂质样化合物：
Figure BDA0003951010620004471
Figure BDA0003951010620004481
Figure BDA0003951010620004491
结构XXIII的脂质样化合物可通过本领域熟知的方法制备。参见Wang等人,ACSSynthetic Biology,1,403-07(2012)；Manoharan等人,国际专利申请公布WO 2008/042973；和Zugates等人,美国专利8,071,082。下面显示的途径举例说明这些脂质样化合物的合成：
Figure BDA0003951010620004501
La、La'、L和L'可以是L1-L10中的一者；Wa和Wb各自独立地是W或V；并且Ra和R1-R6以及L1-L10、W和V如上文所定义。
在此示例性合成途径中，使胺化合物，即化合物D与溴化物E1和E2反应以形成化合物F，然后将所述化合物F与G1和G2两者偶联以提供最终产物，即化合物H。此化合物中的一个或两个双键(如上所示)可还原为一个或两个单键，以获得结构XXIII的不同脂质样化合物。
本发明的其他脂质样化合物可使用其他合适的起始材料通过上述合成途径和本领域已知的其他途径来制备。上述方法可包括添加或除去合适的保护基团以最终允许合成脂质样化合物的额外步骤。此外，可按交替顺序或次序进行各种合成步骤，以得到所需的材料。可用于合成适用的脂质样化合物的合成化学转化和保护基团方法学(保护和脱保护)是本领域已知的，包括例如，R.Larock,Comprehensive Organic Transformations(第2版,VCH Publishers 1999)；P.G.M.Wuts和T.W.Greene,Greene's Protective Groups inOrganic Synthesis(第4版,John Wiley and Sons 2007)；L.Fieser和M.Fieser,Fieserand Fieser's Reagents for Organic Synthesis(John Wiley and Sons 1994)；以及L.Paquette,编辑,Encyclopedia of Reagents for Organic Synthesis(第2版,JohnWiley and Sons 2009)及其后续版本。某些脂质样化合物可含有非芳族双键和一个或多个不对称中心。因此，它们可作为外消旋物和外消旋混合物、单一对映异构体、单独非对映异构体、非对映异构体混合物和顺式或反式异构体形式存在。考虑了所有此类异构体形式。
如上所述，这些脂质样化合物可用于药物剂的递送。可通过体外测定初步筛选它们在递送药物剂方面的功效，然后通过动物实验和临床试验进行确认。其他方法对于本领域普通技术人员也将是显而易见的。
不受任何理论的束缚，结构XXIII的脂质样化合物通过形成复合物，例如纳米复合物和微粒来促进药物剂的递送。这种脂质样化合物的带正电荷或负电荷的亲水性头部结合至药物剂的带相反电荷的部分，并且其疏水性部分接合至药物剂的疏水性部分。结合可以是共价的或非共价的。
上述复合物可使用出版物如Wang等人,ACS Synthetic Biology,1,403-07(2012)中描述的程序来制备。通常，它们是通过在缓冲液如乙酸钠缓冲液或磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)中孵育脂质样化合物和药物剂而获得的。
亲水性基团
在某些实施方案中，选定亲水性官能团或部分可改变或以其他方式赋予化合物或赋予这种化合物作为其组分的转移媒介物性质(例如，通过提高所述化合物作为其组分的脂质纳米颗粒的转染效率)。例如，在本文所公开的化合物中引入胍鎓作为亲水性头基可促进此类化合物(或此类化合物作为其组分的转移媒介物)与一种或多种靶细胞的细胞膜的融合原性，从而增强例如此类化合物的转染效率。已经假设来自亲水性胍鎓部分的氮形成六元环转***，其赋予相互作用稳定性，并且由此允许包封材料的细胞摄取。(Wender等人,Adv.Drug Del.Rev.(2008)60:452-472。)类似地，将一个或多个氨基或部分并入所公开的化合物(例如，作为头基)可通过利用此类氨基的融合原性而进一步促进靶细胞的内体/溶酶体膜的破坏。这不仅基于组合物的氨基的pKa，而且基于氨基经历六角相变并与靶细胞表面即囊泡膜融合的能力。(Koltover等人Science(1998)281:78-81。)据信所述结果促进囊泡膜的破坏和脂质纳米颗粒内容物释放到靶细胞中。
类似地，在某些实施方案中，将例如咪唑作为亲水性头基并入本文公开的化合物中可用于促进例如包封在本发明的转移媒介物(例如，脂质纳米颗粒)中的内容物的内体或溶酶体释放。这种增强的释放可通过质子-海绵介导的破坏机制和/或增强的融合原性机制中的一者或两者来实现。质子-海绵机制是基于化合物且特别是化合物的功能部分或基团缓冲内体的酸化的能力。这可通过化合物或构成这种化合物的一种或多种官能团(例如，咪唑)的pKa来操纵或以其他方式控制。因此，在某些实施方案中，例如本文公开的基于咪唑的化合物(例如，HGT4001和HGT4004)的融合原性与内体破坏性质相关，所述性质由此类咪唑基团促进，咪唑基团相对于其他传统可电离脂质具有较低pKa。此类内体破坏性质进而促进渗透溶胀和脂质体膜的破坏，随后将负载或包封在其中的多核苷酸材料转染或细胞内释放到靶细胞中。除了咪唑部分之外，这种现象还可适用于具有所需pKa曲线的各种化合物。此类实施方案还包括基于多氮的官能团，如多胺、多肽(组氨酸)，和基于氮的树枝状结构。
示例性可电离和/或阳离子脂质在国际PCT专利公布WO2015/095340、WO2015/199952、WO2018/011633、WO2017/049245、WO2015/061467、WO2012/040184、WO2012/000104、WO2015/074085、WO2016/081029、WO2017/004 143、WO2017/075531、WO2017/117528、WO2011/022460、WO2013/148541、WO2013/116126、WO2011/153120、WO2012/044638、WO2012/054365、WO2011/090965、WO2013/016058、WO2012/162210、WO2008/042973、WO2010/129709、WO2010/144740、WO20 12/099755、WO2013/049328、WO2013/086322、WO2013/086373、WO2011/071860、WO2009/132131、WO2010/048536、WO2010/088537、WO2010/054401、WO2010/054406、WO2010/054405、WO2010/054384、WO2012/016184、WO2009/086558、WO2010/042877、WO2011/000106、WO2011/000107、WO2005/120152、WO2011/141705、WO2013/126803、WO2006/007712、WO2011/038160、WO2005/121348、WO2011/066651、WO2009/127060、WO2011/141704、WO2006/069782、WO2012/031043、WO2013/006825、WO2013/033563、WO2013/089151、WO2017/099823、WO2015/095346和WO2013/086354以及美国专利公布US2016/0311759、US2015/0376115、US2016/0151284、US2017/0210697、US2015/0140070、US2013/0178541、US2013/0303587、US2015/0141678、US2015/0239926、US2016/0376224、US2017/0119904、US2012/0149894、US2015/0057373、US2013/0090372、US2013/0274523、US2013/0274504、US2013/0274504、US2009/0023673、US2012/0128760、US2010/0324120、US2014/0200257、US2015/0203446、US2018/0005363、US2014/0308304、US2013/0338210、US2012/0101148、US2012/0027796、US2012/0058144、US2013/0323269、US2011/0117125、US2011/0256175、US2012/0202871、US2011/0076335、US2006/0083780、US2013/0123338、US2015/0064242、US2006/0051405、US2013/0065939、US2006/0008910、US2003/0022649、US2010/0130588、US2013/0116307、US2010/0062967、US2013/0202684、US2014/0141070、US2014/0255472、US2014/0039032、US2018/0028664、US2016/0317458和US2013/0195920中进行了描述，所述专利公布全部的内容以引用的方式整体并入本文。国际专利申请WO 2019/131770也以引用的方式整体并入本文。
8.PEG脂质
考虑了聚乙二醇(PEG)修饰的磷脂和衍生脂质(如衍生神经酰胺(PEG-CER)，包括N-辛酰基-鞘氨醇-1-[琥珀酰基(甲氧基聚乙二醇)-2000](C8 PEG-2000神经酰胺)使用和包含于本文所述的脂质体和药物组合物中，优选与本文公开的一种或多种化合物和脂质组合。预期的PEG修饰的脂质包括但不限于与具有C6-C20长度的烷基链的脂质共价连接的长度多达5kDa的聚乙二醇链。在一些实施方案中，本发明的组合物和方法中采用的PEG修饰的脂质是1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油、甲氧基聚乙二醇(2000MW PEG)“DMG-PEG2000”。将PEG修饰的脂质添加至脂质递送媒介物可防止复合物聚集，并且还可提供用于增加循环寿命和增加脂质-多核苷酸组合物递送至靶组织的手段，(Klibanov等人(1990)FEBS Letters,268(1):235-237)，或者它们可被选择为在体内快速交换出制剂(参见美国专利第5,885,613号)。特别有用的可交换脂质是具有较短酰基链(例如，C14或C18)的PEG-神经酰胺。本发明的PEG修饰的磷脂和衍生脂质可占脂质体脂质纳米颗粒中存在的总脂质约0％至约20％、约0.5％至约20％、约1％至约15％、约4％至约10％或约2％摩尔比。
在一个实施方案中，PEG修饰的脂质描述于国际专利申请号PCT/US2019/015913中，所述专利申请以引用的方式整体并入本文。在一个实施方案中，转移媒介物包含一种或多种PEG修饰的脂质。
PEG修饰的脂质的非限制性实例包括PEG修饰的磷脂酰乙醇胺和磷脂酸、PEG-神经酰胺缀合物(例如，PEG-CerC14或PEG-CerC20)、PEG修饰的二烷基胺和PEG修饰的1,2-二酰氧基丙-3-胺。在一些其他实施方案中，PEG修饰的脂质可以是例如PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE。
在一些其他实施方案中，PEG修饰的脂质包括但不限于1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇(PEG-DMG)、1,2-二硬脂酰基-sn-甘油基-3-磷酸乙醇胺-N-[氨基(聚乙二醇)](PEG-DSPE)、PEG-二固醇基甘油(PEG-DSG)、PEG-二棕榈油基、PEG-二油基、PEG-二硬脂基、PEG-二酰基甘油酰胺(PEG-DAG)、PEG-二棕榈酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DPPE)或PEG-l,2-二肉豆蔻酰基氧基丙基-3-胺(PEG-c-DMA)。
在各种实施方案中，PEG修饰的脂质也可称为“PEG化脂质”或“PEG-脂质”。
在一个实施方案中，PEG-脂质选自由以下组成的组：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油以及它们的混合物。
在一些实施方案中，PEG-脂质的脂质部分包括长度为约C14至约C22、如约C14至约C16的那些。在一些实施方案中，PEG部分(例如mPEG-NH2)具有约1000、约2000、约5000、约10,000、约15,000或约20,000道尔顿的大小。在一个实施方案中，PEG-脂质是PEG2k-DMG。
在一个实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒可包含用非扩散性PEG修饰的脂质。非扩散性PEG的非限制性实例包括PEG-DSG和PEG-DSPE。
PEG脂质是本领域已知的，如美国专利第8,158,601号和国际专利公布第WO2015/130584A2号中描述的那些，所述专利以引用的方式整体并入本文。
在各种实施方案中，本文所述的脂质(例如，PEG-脂质)可如国际专利公布号PCT/US2016/000129中所描述来合成，所述专利以引用的方式整体并入。
脂质纳米颗粒组合物的脂质组分可包括一种或多种包含聚乙二醇的分子，如PEG或PEG修饰的脂质。此类物质可替代地称为PEG化脂质。PEG脂质是用聚乙二醇修饰的脂质。PEG脂质可选自包括以下的非限制性组：PEG修饰的磷脂酰乙醇胺、PEG修饰的磷脂酸、PEG修饰的神经酰胺、PEG修饰的二烷基胺、PEG修饰的二酰基甘油、PEG修饰的二烷基甘油以及它们的混合物。例如，PEG脂质可以是PEG-c-DOMG、PEG-DMG、PEG-DLPE、PEG-DMPE、PEG-DPPC或PEG-DSPE脂质。
在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是PEG-DMG的经修饰形式。PEG-DMG具有以下结构：
Figure BDA0003951010620004561
在一些实施方案中，PEG修饰的脂质是PEG-C18或PEG-1的经修饰形式。PEG-1具有以下结构
Figure BDA0003951010620004562
在一个实施方案中，可用于本发明的PEG脂质可以是国际公布第WO2012099755号中描述的PEG化脂质，所述国际公布的内容以引用的方式整体并入本文。可修饰本文所述的这些示例性PEG脂质中的任一者以在PEG链上包含羟基。在某些实施方案中，PEG脂质是PEG-OH脂质。在某些实施方案中，PEG-OH脂质在PEG链上包括一个或多个羟基。在某些实施方案中，PEG-OH或羟基-PEG化脂质在PEG链的末端包含-OH基团。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
在一些实施方案中，PEG脂质是式(P1)的化合物：
Figure BDA0003951010620004571
或其盐或异构体，其中：
r是介于1与100之间的整数；
R是C10-40烷基、C10-40烯基或C10-40炔基；并且任选地R的一个或多个亚甲基独立地被C3-10亚碳环基、4至10元亚杂环基、C6-10亚芳基、4至10元亚杂芳基、-N(RN)-、-O-、-S-、-C(O)-,-C(O)N(RN)-、-NRNC(O)-、-NRNC(O)N(RN)-、-C(O)O-、-OC(O)-、-OC(O)O-、-OC(O)N(RN)-、-NRNC(O)O-、-C(O)S-、-SC(O)-、-C(＝NRN)-、-C(＝NRN)N(RN)-、-NRNC(＝NRN)-、-NRNC(＝NRN)N(RN)-、-C(S)-、-C(S)N(RN)-、-NRNC(S)-、-NRNC(S)N(RN)-、-S(O)-、-OS(O)-、-S(O)O-、-OS(O)O-、-OS(O)2-、-S(O)2O-、-OS(O)2O-、-N(RN)S(O)-、-S(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)N(RN)-、-OS(O)N(RN)-、-N(RN)S(O)O-、-S(O)2-、-N(RN)S(O)2-、-S(O)2N(RN)-、-N(RN)S(O)2N(RN)-、-OS(O)2N(RN)-或-N(RN)S(O)2O-置换；并且
RN的每个实例独立地是氢、C1-6烷基或氮保护基团。
例如，R是C17烷基。例如，PEG脂质是式(P1-a)的化合物：
Figure BDA0003951010620004572
或其盐或异构体，其中r是介于1与100之间的整数。
例如，PEG脂质是下式的化合物：
Figure BDA0003951010620004581
9.辅助脂质
在一些实施方案中，本文所述的转移媒介物(例如，LNP)包含一种或多种非阳离子辅助脂质。在一些实施方案中，辅助脂质是磷脂。在一些实施方案中，辅助脂质是磷脂替代物或取代物。在一些实施方案中，磷脂或磷脂替代物可以是例如一种或多种饱和或(多)不饱和磷脂，或磷脂替代物或它们的组合。一般来说，磷脂包含磷脂部分和一个或多个脂肪酸部分。
磷脂部分可选自，例如，由以下组成的非限制性组：磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰甘油、磷脂酰丝氨酸、磷脂酸、2-溶血磷脂酰胆碱和鞘磷脂。
脂肪酸部分可选自，例如，由以下组成的非限制性组：月桂酸、肉豆蔻酸、肉豆蔻脑酸、棕榈酸、棕榈油酸、硬脂酸、油酸、亚油酸、α-亚麻酸、芥酸、植烷酸、花生酸、花生四烯酸、二十碳五烯酸、山嵛酸、二十二碳五烯酸和二十二碳六烯酸。
磷脂包括但不限于甘油磷脂，如磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、磷脂酰甘油和磷脂酸。磷脂还包括鞘磷脂(phosphosphingolipid)，如鞘磷脂(sphingomyelin)。
在一些实施方案中，辅助脂质是1,2-二硬脂酰基-177-甘油基-3-磷酸胆碱(DSPC)类似物、DSPC替代物、油酸或油酸类似物。
在一些实施方案中，辅助脂质是非磷脂酰胆碱(PC)两性离子脂质、DSPC类似物、油酸、油酸类似物或DSPC替代物。
在一些实施方案中，辅助脂质描述于PCT/US2018/053569中。适用于本公开的脂质组合物中的辅助脂质包括例如多种中性、不带电荷的或两性离子脂质。此类辅助脂质优选与一种或多种本文公开的化合物和脂质组合使用。辅助脂质的实例包括但不限于，5-十七烷基苯-1,3-二醇(间苯二酚)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、磷酸胆碱(DOPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、磷脂酰胆碱(PLPC)、1,2-二硬脂酰sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DAPC)、磷脂酰乙醇胺(PE)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二月桂酰磷脂酰胆碱(DLPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、1-肉豆蔻酰基-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(MPPC)、1-棕榈酰基-2-肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(PMPC)、1-棕榈酰基-2-硬脂酰磷脂酰胆碱(PSPC)、1,2-二花生酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DBPC)、1-硬脂酰基-2-棕榈酰磷脂酰胆碱(SPPC)、1,2-双二十碳烯酰基-sn-甘油基-3-磷酸胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰基磷脂酰胆碱(POPC)、溶血磷脂酰胆碱、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、二亚油酰磷脂酰胆碱二硬脂酰磷脂酰乙醇胺(DSPE)、二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、棕榈酰油酰基磷脂酰乙醇胺(POPE)、溶血磷脂酰乙醇胺以及它们的组合。在一个实施方案中，辅助脂质可以是二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)或二肉豆蔻酰磷脂酰乙醇胺(DMPE)。在另一个实施方案中，辅助脂质可以是二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)。辅助脂质的功能是稳定和改进转移媒介物的加工。此类辅助脂质优选与其他赋形剂(例如本文公开的一种或多种可电离脂质)组合使用。在一些实施方案中，当与可电离脂质组合使用时，辅助脂质可占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的5％至约90％或约10％至约70％摩尔比。
10.结构脂质
在一个实施方案中，结构脂质描述于国际专利申请PCT/US2019/015913中。
本文所述的转移媒介物包含一种或多种结构脂质。在脂质纳米颗粒中并入结构脂质可有助于减轻颗粒中其他脂质的聚集。结构脂质可包括但不限于胆固醇、粪固醇、麦角甾醇、菜籽固醇(bassicasterol)、番茄碱、番茄苷、熊果酸、α-生育酚以及它们的混合物。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇。在某些实施方案中，结构脂质包括胆固醇和皮质类固醇(如例如，***龙、***、***和氢化可的松)或它们的组合。
在一些实施方案中，结构脂质是固醇。在某些实施方案中，结构脂质是类固醇。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇的类似物。在某些实施方案中，结构脂质是α-生育酚。
本文所述的转移媒介物包含一种或多种结构脂质。将结构脂质并入转移媒介物(例如脂质纳米颗粒)中可有助于减轻颗粒中其他脂质的聚集。在某些实施方案中，结构脂质包括胆固醇和皮质类固醇(如例如，***龙、***、***和氢化可的松)或它们的组合。
在一些实施方案中，结构脂质是固醇。结构脂质可包括但不限于固醇(例如植物固醇或动物固醇)。
在某些实施方案中，结构脂质是类固醇。例如，固醇可包括但不限于胆固醇、β-谷甾醇、粪固醇、麦角甾醇、谷甾醇、菜油固醇、豆固醇、菜籽固醇、麦角甾醇、番茄碱、番茄苷、熊果酸或α-生育酚。
在一些实施方案中，转移媒介物包含有效量的免疫细胞递送增强脂质，例如胆固醇类似物或氨基脂质或它们的组合，所述免疫细胞递送增强脂质当存在于转移媒介物例如脂质纳米颗粒中时可通过相对于缺乏免疫细胞递送增强脂质的转移媒介物增强细胞缔合和/或摄取、内化、细胞内运输和/或加工、和/或内体逃逸和/或可增强免疫细胞的识别和/或结合至免疫细胞。因此，虽然不意图受任何特定机制或理论的约束，但在一个实施方案中，本公开的结构脂质或其他免疫细胞递送增强脂质结合至C1q或促进包含此类脂质的转移媒介物与C1q的结合。因此，对于本公开的转移媒介物用于将核酸分子递送至免疫细胞的体外使用，使用包括C1q的培养条件(例如，使用包括血清的培养基或向无血清培养基中添加外源C1q)。对于本公开的转移媒介物的体内使用，对C1q的需求由内源性C1q提供。
在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇。在某些实施方案中，结构脂质是胆固醇的类似物。在一些实施方案中，结构脂质是表16中的脂质：
表16
Figure BDA0003951010620004621
Figure BDA0003951010620004631
Figure BDA0003951010620004641
Figure BDA0003951010620004651
Figure BDA0003951010620004661
Figure BDA0003951010620004671
Figure BDA0003951010620004681
Figure BDA0003951010620004691
Figure BDA0003951010620004701
Figure BDA0003951010620004711
Figure BDA0003951010620004721
Figure BDA0003951010620004731
Figure BDA0003951010620004741
Figure BDA0003951010620004751
Figure BDA0003951010620004761
Figure BDA0003951010620004771
Figure BDA0003951010620004781
Figure BDA0003951010620004791
11.LNP制剂
本文所述的脂质纳米颗粒(LNP)的形成可通过本领域已知的任何方法来完成。例如，如美国专利公布号US2012/0178702 A1中所描述，所述专利公布以引用的方式整体并入本文。脂质纳米颗粒组合物和制备它们的方法的非限制性实例在例如Semple等人(2010)Nat.Biotechnol.28:172-176；Jayarama等人(2012),Angew.Chem.Int.Ed.,51:8529-8533；和Maier等人(2013)Molecular Therapy 21,1570-1578中进行了描述(其各自的内容以引用的方式整体并入本文)。
在一个实施方案中，LNP制剂可通过例如在国际专利公布号WO 2011/127255或WO2008/103276中描述的方法来制备，所述专利公布各自的内容以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，本文所述的LNP制剂可包含聚阳离子组合物。作为非限制性实例，聚阳离子组合物可以是选自美国专利公布号US2005/0222064 A1的式1-60的组合物，所述专利公布的内容以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒可通过在美国专利公布号US2013/0156845 A1和国际专利公布号WO2013/093648 A2或WO2012/024526 A2中描述的方法来配制，所述专利公布各自以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒可通过在美国专利公布号US2013/0164400 A1中描述的***和/或方法在无菌环境中制备，所述专利公布以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，LNP制剂可配制在纳米颗粒，诸如美国专利号8,492,359中描述的核酸-脂质颗粒中，所述专利以引用的方式整体并入本文。
纳米颗粒组合物可任选地包含一个或多个包衣。例如，纳米颗粒组合物可配制在具有包衣的胶囊、薄膜或片剂中。包含本文所述的组合物的胶囊、薄膜或片剂可具有任何有用的尺寸、抗张强度、硬度或密度。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒可使用包括微流体混合器的方法来合成。示例性微流体混合器可包括但不限于狭缝交指式微混合器，包括但不限于由Precision Nanosystems(Vancouver,BC,Canada)、Microinnova(Allerheiligen beiWildon,Austria)制造的那些；和/或交错鲱鱼骨式微混合器(SHM)(Zhigaltsev,I.V.等人(2012)Langmuir.28:3633-40；Belliveau,N.M.等人Mol.Ther.Nucleic.Acids.(2012)1:e37；Chen,D.等人J.Am.Chem.Soc.(2012)134(16):6948-51；所述文献各自以引用的方式整体并入本文)。
在一些实施方案中，包括SHM的LNP产生方法还包括混合至少两个输入流，其中混合通过微结构诱导的混乱平流(MICA)发生。根据这种方法，流体流流过鲱鱼骨图案中存在的通道，从而引起旋转流动并且使流体围绕彼此折叠。这种方法还可包括用于流体混合的表面，其中所述表面在流体循环期间改变取向。使用SHM产生LNP的方法包括在美国专利公布号US2004/0262223 A1和US2012/0276209 A1中公开的那些，所述专利公布各自以引用的方式整体并入本文。
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒可使用微混合器如但不限于狭缝交指式微结构化混合器(SIMM-V2)或标准狭缝交指式微混合器(SSIMM)或卡特彼勒(CPMM)或来自Institut fur Mikrotechnik Mainz GmbH,Mainz Germany)的冲击射流(IJMM)产生进行配制。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒是使用微流体技术产生的(参见，Whitesides(2006)Nature.442:368-373；和Abraham等人(2002)Science.295:647-651；其各自以引用的方式整体并入本文)。作为非限制性实例，受控微流体配制包括用于在低雷诺数下在微通道中混合稳定压力驱动流的多个流的被动方法(参见例如，Abraham等人(2002)Science.295:647651；其以引用的方式整体并入本文)。
在一个实施方案中，本发明的circRNA可配制在使用微混合器芯片，如但不限于来自Harvard Apparatus(Holliston,MA)、Dolomite Microfluidics(Royston,UK)或Precision Nanosystems(Van Couver,BC,Canada)的那些产生的脂质纳米颗粒中。微混合器芯片可用于使用分流和重组机制快速混合两个或更多个流体流。
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒可具有约10至约100nm，如但不限于约10至约20nm、约10至约30nm、约10至约40nm、约10至约50nm、约10至约60nm、约10至约70nm、约10至约80nm、约10至约90nm、约20至约30nm、约20至约40nm、约20至约50nm、约20至约60nm、约20至约70nm、约20至约80nm、约20至约90nm、约20至约100nm、约30至约40nm、约30至约50nm、约30至约60nm、约30至约70nm、约30至约80nm、约30至约90nm、约30至约100nm、约40至约50nm、约40至约60nm、约40至约70nm、约40至约80nm、约40至约90nm、约40至约100nm、约50至约60nm、约50至约70nm约50至约80nm、约50至约90nm、约50至约100nm、约60至约70nm、约60至约80nm、约60至约90nm、约60至约100nm、约70至约80nm、约70至约90nm、约70至约100nm、约80至约90nm、约80至约100nm和/或约90至约100nm的直径。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒可具有约10至500nm的直径。在一个实施方案中，脂质纳米颗粒可具有大于100nm、大于150nm、大于200nm、大于250nm、大于300nm、大于350nm、大于400nm、大于450nm、大于500nm、大于550nm、大于600nm、大于650nm、大于700nm、大于750nm、大于800nm、大于850nm、大于900nm、大于950nm或大于1000nm的直径。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
在一些实施方案中，纳米颗粒(例如，脂质纳米颗粒)具有10-500nm、20-400nm、30-300nm或40-200nm的平均直径。在一些实施方案中，纳米颗粒(例如，脂质纳米颗粒)具有50-150nm、50-200nm、80-100nm或80-200nm的平均直径。
在一些实施方案中，本文所述的脂质纳米颗粒可具有低于0.1μm至至多1mm的直径，如但不限于小于0.1μm、小于1.0μm、小于5μm、小于10μm、小于15μm、小于20μm、小于25μm、小于30μm、小于35μm、小于40μm、小于50μm、小于55μm、小于60μm、小于65μm、小于70μm、小于75μm、小于80μm、小于85μm、小于90μm、小于95μm、小于100μm、小于125μm、小于150μm、小于175μm、小于200μm、小于225μm、小于250μm、小于275μm、小于300μm、小于325μm、小于350μm、小于375μm、小于400μm、小于425μm、小于450μm、小于475μm、小于500μm、小于525μm、小于550μm、小于575μm、小于600μm、小于625μm、小于650μm、小于675μm、小于700μm、小于725μm、小于750μm、小于775μm、小于800μm、小于825μm、小于850μm、小于875μm、小于900μm、小于925μm、小于950μm、小于975μm。
在另一个实施方案中，LNP可具有约1nm至约100nm、约1nm至约10nm、约1nm至约20nm、约1nm至约30nm、约1nm至约40nm、约1nm至约50nm、约1nm至约60nm、约1nm至约70nm、约1nm至约80nm、约1nm至约90nm、约5nm至约100nm、约5nm至约10nm、约5nm至约20nm、约5nm至约30nm、约5nm至约40nm、约5nm至约50nm、约5nm至约60nm、约5nm至约70nm、约5nm至约80nm、约5nm至约90nm、约10至约50nM、约20至约50nm、约30至约50nm、约40至约50nm、约20至约60nm、约30至约60nm、约40至约60nm、约20至约70nm、约30至约70nm、约40至约70nm、约50至约70nm、约60至约70nm、约20至约80nm、约30至约80nm、约40至约80nm、约50至约80nm、约60至约80nm、约20至约90nm、约30至约90nm、约40至约90nm、约50至约90nm、约60至约90nm和/或约70至约90nm的直径。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
纳米颗粒组合物可以是相对均匀的。多分散性指数可用于指示纳米颗粒组合物的均匀性，例如纳米颗粒组合物的粒度分布。小的(例如，小于0.3的)多分散性指数通常指示窄的粒度分布。纳米颗粒组合物可具有约0至约0.25，如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.10、0.1 1、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、0.24或0.25的多分散性指数。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的多分散性指数可以是约0.10至约0.20。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
纳米颗粒组合物的δ电位可用于指示组合物的电动势。例如，δ电位可描述纳米颗粒组合物的表面电荷。通常希望具有相对低的正或负电荷的纳米颗粒组合物，因为带更高电荷的物质可能与体内的细胞、组织和其他元件不期望地相互作用。在一些实施方案中，纳米颗粒组合物的δ电位可以是约-20mV至约+20mV、约-20mV至约+15mV、约-20mV至约+10mV、约-20mV至约+5mV、约-20mV至约0mV、约-20mV至约-5mV、约-20mV至约-10mV、约-20mV至约-15mV、约-20mV至约+20mV、约-20mV至约+15mV、约-20mV至约+10mV、约-20mV至约+5mV、约-20mV至约0mV、约0mV至约+20mV、约0mV至约+15mV、约0mV至约+10mV、约0mV至约+5mV、约+5mV至约+20mV、约+5mV至约+15mV或约+5mV至约+10mV。每种可能性代表本发明的单独实施方案。
治疗剂的包封效率描述相对于所提供的初始量，在制备后由纳米颗粒组合物包封或以其他方式与纳米颗粒组合物缔合的治疗剂的量。期望包封效率高(例如，接近100％)。可例如通过比较在用一种或多种有机溶剂或洗涤剂破碎纳米颗粒组合物之前和之后含有纳米颗粒组合物的溶液中的治疗剂的量来测量包封效率。萦光可用于测量溶液中的治疗剂(例如，核酸)的量。对于本文所述的纳米颗粒组合物，治疗剂的包封效率可以是至少50％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施方案中，包封效率可以是至少80％。在某些实施方案中，包封效率可以是至少90％。每种可能性代表本发明的单独实施方案。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有小于0.4的多分散性值。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒在中性pH下具有净中性电荷。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒具有50-200nm的平均直径。
脂质纳米颗粒制剂的性质可受以下因素影响，包括但不限于阳离子脂质组分的选择、阳离子脂质饱和度、非阳离子脂质组分的选择、非阳离子脂质饱和度、结构脂质组分的选择、聚乙二醇化的性质、所有组分的比例和生物物理参数如大小。如本文所述，PEG脂质组分的纯度对LNP的性质和性能也是重要的。
12.方法
在一个实施方案中，脂质纳米颗粒制剂可通过在国际公布第WO2011127255号或第WO2008103276号中描述的方法来制备，所述公布各自以引用的方式整体并入本文。在一些实施方案中，脂质纳米颗粒制剂可如国际公布号WO2019131770中所述，所述公布以引用的方式整体并入本文。
在一些实施方案中，根据美国专利申请15/809,680中描述的方法配制环状RNA。在一些实施方案中，本发明提供了将环状RNA包封在转移媒介物中的方法，所述方法包括将脂质成形为预先形成的转移媒介物(即，在不存在RNA的情况下形成)、然后将预先形成的转移媒介物与RNA合并的步骤。在一些实施方案中，与在没有预先形成脂质纳米颗粒的步骤的情况下(例如，将脂质直接与RNA合并)制备的相同RNA制剂相比，新的配制方法产生在体外和体内具有更高效力(肽或蛋白质表达)和更高功效(生物学相关终点的改善)与潜在更好的耐受性的RNA制剂。
对于RNA的某些阳离子脂质纳米颗粒制剂，为了实现RNA的高包封，必须加热缓冲液(例如柠檬酸盐缓冲液)中的RNA。在那些过程或方法中，加热需要在配制过程之前进行(即加热单独的组分)，因为配制后加热(纳米颗粒的形成后)不会提高脂质纳米颗粒中RNA的包封效率。相比之下，在本发明的新颖方法的一些实施方案中，RNA的加热顺序似乎不影响RNA包封百分比。在一些实施方案中，在配制过程之前或之后不需要加热(即，保持在环境温度)包含预先形成的脂质纳米颗粒的溶液、包含RNA的溶液和包含脂质纳米颗粒包封的RNA的混合溶液中的一者或多者。
RNA可提供在溶液中以与脂质溶液混合，使得RNA可被包封在脂质纳米颗粒中。合适的RNA溶液可以是含有各种浓度的待包封RNA的任何水溶液。例如，合适的RNA溶液可含有浓度等于或大于约0.01mg/ml、0.05mg/ml、0.06mg/ml、0.07mg/ml、0.08mg/ml、0.09mg/ml、0.1mg/ml、0.15mg/ml、0.2mg/ml、0.3mg/ml、0.4mg/ml、0.5mg/ml、0.6mg/ml、0.7mg/ml、0.8mg/ml、0.9mg/ml或1.0mg/ml的RNA。在一些实施方案中，合适的RNA溶液可含有浓度在约0.01-1.0mg/ml、0.01-0.9mg/ml、0.01-0.8mg/ml、0.01-0.7mg/ml、0.01-0.6mg/ml、0.01-0.5mg/ml、0.01-0.4mg/ml、0.01-0.3mg/ml、0.01-0.2mg/ml、0.01-0.1mg/ml、0.05-1.0mg/ml、0.05-0.9mg/ml、0.05-0.8mg/ml、0.05-0.7mg/ml、0.05-0.6mg/ml、0.05-0.5mg/ml、0.05-0.4mg/ml、0.05-0.3mg/ml、0.05-0.2mg/ml、0.05-0.1mg/ml、0.1-1.0mg/ml、0.2-0.9mg/ml、0.3-0.8mg/ml、0.4-0.7mg/ml或0.5-0.6mg/ml范围内的RNA。
通常，合适的RNA溶液还可含有缓冲剂和/或盐。一般而言，缓冲剂可包括HEPES、Tris、硫酸铵、碳酸氢钠、柠檬酸钠、乙酸钠、磷酸钾或磷酸钠。在一些实施方案中，缓冲剂的合适浓度可在约0.1mM至100mM、0.5mM至90mM、1.0mM至80mM、2mM至70mM、3mM至60mM、4mM至50mM、5mM至40mM、6mM至30mM、7mM至20mM、8mM至15mM或9至12mM的范围内。
示例性盐可包括氯化钠、氯化镁和氯化钾。在一些实施方案中，RNA溶液中盐的合适浓度可在约1mM至500mM、5mM至400mM、10mM至350mM、15mM至300mM、20mM至250mM、30mM至200mM、40mM至190mM、50mM至180mM、50mM至170mM、50mM至160mM、50mM至150mM或50mM至100mM的范围内。
在一些实施方案中，合适的RNA溶液可具有在约3.5-6.5、3.5-6.0、3.5-5.5、3.5-5.0、3.5-4.5、4.0-5.5、4.0-5.0、4.0-4.9、4.0-4.8、4.0-4.7、4.0-4.6或4.0-4.5范围内的pH。
可使用多种方法来制备适用于本发明的RNA溶液。在一些实施方案中，RNA可直接溶解于本文所述的缓冲溶液中。在一些实施方案中，可在与脂质溶液混合用于包封之前通过将RNA储备溶液与缓冲溶液混合来产生RNA溶液。在一些实施方案中，可在与脂质溶液混合用于包封之前立即通过将RNA储备溶液与缓冲溶液混合来产生RNA溶液。
根据本发明，脂质溶液含有适于形成用于包封RNA的转移媒介物的脂质混合物。在一些实施方案中，合适的脂质溶液是基于乙醇的。例如，合适的脂质溶液可含有溶解于纯乙醇(即100％乙醇)中的所需脂质的混合物。在另一个实施方案中，合适的脂质溶液是基于异丙醇的。在另一个实施方案中，合适的脂质溶液是基于二甲亚砜的。在另一个实施方案中，合适的脂质溶液是合适溶剂(包括但不限于乙醇、异丙醇和二甲亚砜)的混合物。
合适的脂质溶液可含有各种浓度的所需脂质的混合物。在一些实施方案中，合适的脂质溶液可含有总浓度在约0.1-100mg/ml、0.5-90mg/ml、1.0-80mg/ml、1.0-70mg/ml、1.0-60mg/ml、1.0-50mg/ml、1.0-40mg/ml、1.0-30mg/ml、1.0-20mg/ml、1.0-15mg/ml、1.0-10mg/ml、1.0-9mg/ml、1.0-8mg/ml、1.0-7mg/ml、1.0-6mg/ml或1.0-5mg/ml范围内的所需脂质的混合物。
13.靶向
本发明还考虑通过被动和主动靶向手段对靶细胞和组织的区别性靶向。被动靶向现象利用体内转移媒介物的自然分布模式，而不依赖于使用额外的赋形剂或手段来增强靶细胞对转移媒介物的识别。例如，经受网状内皮***的细胞的吞噬作用的转移媒介物可能在肝或脾中累积，并且因此，可提供被动地将组合物递送至此类靶细胞的手段。
可替代地，本发明考虑主动靶向，其涉及使用可与转移媒介物键合(共价或非共价)的靶向部分以促进此类转移媒介物在某些靶细胞或靶组织的定位。例如，靶向可通过在转移媒介物中或转移媒介物上包含一个或多个内源性靶向部分以促进分布至靶细胞或组织来介导。靶组织对靶向部分的识别积极促进转移媒介物和/或其内容物在靶细胞和组织中的组织分布和细胞摄取(例如，在转移媒介物中或转移媒介物上包含载脂蛋白-E靶向配体促进转移媒介物的识别和与肝细胞表达的内源性低密度脂蛋白受体的结合)。如本文所提供，组合物可包含能够增强组合物对靶细胞的亲和力的部分。靶向部分可在配制期间或配制后连接至脂质颗粒的外双层。这些方法是本领域熟知的。此外，一些脂质颗粒制剂可采用融合聚合物，如PEAA、血凝素、其他脂肽(参见美国专利申请序列号08/835,281和60/083,294，所述专利以引用的方式并入本文)和其他可用于体内和/或细胞内递送的特征。在其他一些实施方案中，本发明的组合物表现出提高的转染功效，和/或表现出对目标靶细胞或组织的增强的选择性。因此，所考虑的是包含一个或多个部分(例如，肽、适体、寡核苷酸、维生素或其他分子)的组合物，所述一个或多个部分能够增强组合物以及其核酸内容物对于靶细胞或组织的亲和力。合适的部分可任选地结合或连接至转移媒介物的表面。在一些实施方案中，靶向部分可跨越转移媒介物的表面或被包封在转移媒介物内。合适的部分是基于它们的物理、化学或生物性质(例如，选择性亲和力和/或对靶细胞表面标志物或特征的识别)来选择的。细胞特异性靶位点及其相应的靶向配体可广泛不同。选择合适的靶向部分使得可以利用靶细胞的独特特征，从而允许组合物区分靶细胞和非靶细胞。例如，本发明的组合物可包含选择性地增强对肝细胞的识别或与肝细胞的亲和力(例如，通过受体介导的对此类表面标记物的识别和结合)的表面标记物(例如，载脂蛋白-B或载脂蛋白-E)。作为实例，使用半乳糖作为靶向部分将预期将本发明的组合物引导至实质肝细胞，或者可替代地使用含有甘露糖的糖残基作为靶向配体将预期将本发明的组合物引导至肝内皮细胞(例如，可优先结合至肝细胞中存在的无唾液酸糖蛋白受体的含甘露糖的糖残基)。(参见Hillery A M,等人“Drug Delivery and Targeting:For Pharmacists andPharmaceutical Scientists”(2002)Taylor&Francis,Inc.)。与转移媒介物(例如脂质纳米颗粒)中存在的部分缀合的此类靶向部分的呈现因此有助于本发明的组合物在靶细胞和组织中的识别和吸收。合适的靶向部分的实例包括一种或多种肽、蛋白质、适体、维生素和寡核苷酸。
在特定实施方案中，转移媒介物包含靶向部分。在一些实施方案中，靶向部分选择性地介导经受体介导的胞吞作用进入特定细胞群。在一些实施方案中，靶向部分能够结合至T细胞抗原。在一些实施方案中，靶向部分能够结合至NK、NKT或巨噬细胞抗原。在一些实施方案中，靶向部分能够结合至选自下组的蛋白质：CD3、CD4、CD8、PD-1、4-1BB和CD2。在一些实施方案中，靶向部分是单链Fv(scFv)片段、纳米抗体、肽、基于肽的大环、微型抗体、重链可变区、轻链可变区或其片段。在一些实施方案中，靶向部分选自T细胞受体基序抗体、T细胞α链抗体、T细胞β链抗体、T细胞γ链抗体、T细胞δ链抗体、CCR7抗体、CD3抗体、CD4抗体、CD5抗体、CD7抗体、CD8抗体、CD11b抗体、CD11c抗体、CD16抗体、CD19抗体、CD20抗体、CD21抗体、CD22抗体、CD25抗体、CD28抗体、CD34抗体、CD35抗体、CD40抗体、CD45RA抗体、CD45RO抗体、CD52抗体、CD56抗体、CD62L抗体、CD68抗体、CD80抗体、CD95抗体、CD117抗体、CD127抗体、CD133抗体、CD137(4-1BB)抗体、CD163抗体、F4/80抗体、IL-4Rα抗体、Sca-1抗体、CTLA-4抗体、GITR抗体、GARP抗体、LAP抗体、颗粒酶B抗体、LFA-1抗体、转铁蛋白受体抗体及其片段。在一些实施方案中，靶向部分是淋巴细胞上胞外酶的小分子结合剂。胞外酶的小分子结合剂包括A2A抑制剂CD73抑制剂、CD39或腺苷酸受体A2aR和A2bR。潜在小分子包括AB928。
在一些实施方案中，转移媒介物如Shobaki N,Sato Y,Harashima H.Mixinglipids to manipulate the ionization status of lipid nanoparticles forspecific tissue targeting.Int J Nanomedicine.2018；13:8395-8410.(2018年12月10日发布)中所述来配制和/或靶向。在一些实施方案中，转移媒介物由3种脂质类型组成。在一些实施方案中，转移媒介物由4种脂质类型组成。在一些实施方案中，转移媒介物由5种脂质类型组成。在一些实施方案中，转移媒介物由6种脂质类型组成。
14.靶细胞
当需要将核酸递送至免疫细胞时，免疫细胞代表靶细胞。在一些实施方案中，本发明的组合物在区别性基础上转染靶细胞(即，不转染非靶细胞)。本发明的组合物还可被制备成优先靶向多种靶细胞，包括但不限于T细胞、B细胞、巨噬细胞和树突细胞。
在一些实施方案中，靶细胞缺乏目标蛋白质或酶。例如，当需要将核酸递送至肝细胞时，肝细胞代表靶细胞。在一些实施方案中，本发明的组合物在区别性基础上转染靶细胞(即，不转染非靶细胞)。本发明的组合物还可被制备成优先靶向多种靶细胞，所述靶细胞包括但不限于肝细胞、上皮细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞、肺细胞、骨细胞、干细胞、间充质细胞、神经细胞(例如脑膜、星形胶质细胞、运动神经元、背根神经节细胞和前角运动神经元)、感光细胞(例如视杆细胞和视锥细胞)、视网膜色素上皮细胞、分泌细胞、心脏细胞、脂肪细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、β细胞、垂体细胞、滑膜衬里细胞、卵巢细胞、睾丸细胞、成纤维细胞、B细胞、T细胞、网织红细胞、白细胞、粒细胞和肿瘤细胞。
本发明的组合物可被制备成优先分布至诸如心脏、肺、肾、肝和脾中的靶细胞。在一些实施方案中，本发明的组合物分布至肝或脾的细胞中以促进肝的细胞(例如肝细胞)或脾的细胞(例如免疫细胞)递送和随后表达包含在其中的circRNA。靶细胞可充当能够产生并全身***功能性蛋白质或酶的生物“储库”或“贮库”。因此，在本发明的一个实施方案中，转移媒介物可在递送时靶向肝细胞或免疫细胞和/或优先分布至肝或脾的细胞。在一个实施方案中，在靶肝细胞或免疫细胞转染后，负载于媒介物中的circRNA被翻译并且功能性蛋白质产物产生、分泌且全身分布。在其他实施方案中，除肝细胞以外的细胞(例如，肺、脾、心脏、眼或中枢神经***的细胞)可用作蛋白质产生的贮库位置。
在一个实施方案中，本发明的组合物促进受试者的一种或多种功能性蛋白质和/或酶的内源性产生。在本发明的一个实施方案中，转移媒介物包含编码缺陷型蛋白质或酶的circRNA。在将此类组合物分布至靶组织并随后转染此类靶细胞后，负载至转移媒介物(例如脂质纳米颗粒)中的外源性circRNA可在体内翻译以产生由外源施用的circRNA编码的功能性蛋白质或酶(例如，受试者所缺乏的蛋白质或酶)。因此，本发明的组合物利用受试者翻译外源性或重组制备的circRNA以产生内源性翻译的蛋白质或酶且由此产生(并在适用的情况下分泌)功能性蛋白质或酶的能力。表达的或翻译的蛋白质或酶的特征还可在于在体内包含在重组制备的蛋白质或酶中通常不存在的天然的翻译后修饰，从而进一步降低翻译的蛋白质或酶的免疫原性。
施用编码缺陷性蛋白质或酶的circRNA避免将核酸递送至靶细胞内的特定细胞器的需要。相反，在转染靶细胞并将核酸递送至靶细胞的细胞质后，转移媒介物的circRNA内容物可被翻译并表达功能性蛋白质或酶。
在一些实施方案中，环状RNA包含一个或多个miRNA结合位点。在一些实施方案中，环状RNA包含由存在于一种或多种非靶细胞或非靶细胞类型(例如，库普弗细胞或肝细胞)中且不存在于一种或多种靶细胞或靶细胞类型(例如，肝细胞或T细胞)中的miRNA识别的一个或多个miRNA结合位点。在一些实施方案中，与一种或多种靶细胞或靶细胞类型(例如，肝细胞或T细胞)相比，环状RNA包含由在一种或多种非靶细胞或非靶细胞类型(例如，库普弗细胞或肝细胞)中以增加的浓度存在的miRNA识别的一个或多个miRNA结合位点。miRNA被认为通过与RNA分子内的互补序列配对、从而导致基因沉默来发挥作用。
在一些实施方案中，本发明的组合物在区别性基础上转染或分布至靶细胞(即，不转染非靶细胞)。本发明的组合物还可被制备成优先靶向多种靶细胞，所述靶细胞包括但不限于肝细胞、上皮细胞、造血细胞、上皮细胞、内皮细胞、肺细胞、骨细胞、干细胞、间充质细胞、神经细胞(例如脑膜、星形胶质细胞、运动神经元、背根神经节细胞和前角运动神经元)、感光细胞(例如视杆细胞和视锥细胞)、视网膜色素上皮细胞、分泌细胞、心脏细胞、脂肪细胞、血管平滑肌细胞、心肌细胞、骨骼肌细胞、β细胞、垂体细胞、滑膜衬里细胞、卵巢细胞、睾丸细胞、成纤维细胞、B细胞、T细胞、网织红细胞、白细胞、粒细胞和肿瘤细胞。
15.药物组合物
在某些实施方案中，本文提供了包含本文提供的治疗剂的组合物(例如药物组合物)。在一些实施方案中，治疗剂是本文提供的环状RNA多核苷酸。在一些实施方案中，治疗剂是本文提供的载体。在一些实施方案中，治疗剂是包含本文提供的环状RNA或载体的细胞(例如，人细胞，如人T细胞)。在某些实施方案中，组合物还包含药学上可接受的载剂。在一些实施方案中，本文提供的组合物包含本文提供的治疗剂与其他药物活性剂或药物，如抗炎药物或能够靶向B细胞抗原的抗体，例如抗CD20抗体，例如利妥昔单抗的组合。
关于药物组合物，药学上可接受的载剂可以是任何常规使用的那些，并且仅受化学-物理考量(如溶解度和缺乏与活性剂的反应性)和施用途径限制。本文所述的药学上可接受的载剂(例如媒介物、佐剂、赋形剂和稀释剂)是本领域技术人员熟知的，并且公众容易获得。优选药学上可接受的载剂是对治疗剂呈化学惰性且在使用条件下没有有害副作用或毒性的一种载剂。
载剂的选择将部分取决于特定的治疗剂以及用于施用所述治疗剂的特定方法。因此，本文提供的药物组合物有多种合适的制剂。
在某些实施方案中，药物组合物包含防腐剂。在某些实施方案中，合适的防腐剂可包括例如对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、苯甲酸钠和苯扎氯铵。任选地，可使用两种或更多种防腐剂的混合物。防腐剂或其混合物通常以总组合物的约0.0001重量％至约2重量％的量存在。
在一些实施方案中，药物组合物包含缓冲剂。在一些实施方案中，合适的缓冲剂可包括例如柠檬酸、柠檬酸钠、磷酸、磷酸钾和各种其他酸和盐。可任选地使用两种或更多种缓冲剂的混合物。缓冲剂或其混合物通常以总组合物的约0.001重量％至约4重量％的量存在。
在一些实施方案中，药物组合物中治疗剂的浓度可变化，例如按重量计小于约1％，或至少约1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或约50％或更高，并且根据所选择的特定施用模式可主要通过流体体积和粘度进行选择。
用于口服、气雾剂、胃肠外(例如，皮下、静脉内、动脉内、肌肉内、皮内、腹膜内和鞘内)和局部施用的以下制剂仅仅是示例性的并且绝不是限制性的。可使用多于一种途径来施用本文提供的治疗剂，并且在某些情况下，特定途径可提供比另一种途径更直接且更有效的反应。
适用于口服施用的制剂可包含以下或由以下组成：(a)液体溶液，如溶解在稀释剂(如水、盐水或橙汁)中的有效量的治疗剂；(b)胶囊、小药囊、片剂、锭剂和糖锭剂，各自含有预定量的固体或颗粒形式的活性成分；(c)粉末；(d)在适当液体中的悬浮液；以及(e)合适的乳液。液体制剂可包含稀释剂，如水和醇，例如乙醇、苄基醇和聚乙烯醇，其中添加或不添加药学上可接受的表面活性剂。胶囊形式可以是普通的硬壳或软壳明胶类型，其含有例如表面活性剂、润滑剂和惰性填充剂(如乳糖、蔗糖、磷酸钙和玉米淀粉)。片剂形式可包含乳糖、蔗糖、甘露糖醇、玉米淀粉、马铃薯淀粉、藻酸、微晶纤维素、***树胶、明胶、瓜尔胶、胶体二氧化硅、交联羧甲基纤维素钠、滑石、硬脂酸镁、硬脂酸钙、硬脂酸锌、硬脂酸和其他赋形剂、着色剂、稀释剂、缓冲剂、崩解剂、润湿剂、防腐剂、调味剂以及其他药理学上相容的赋形剂中的一种或多种。锭剂形式可包含具有调味剂(通常为蔗糖、***胶或黄蓍胶)的治疗剂。锭剂(pastille)可包含具有惰性基质的治疗剂，所述惰性基质如明胶和甘油、或蔗糖和***胶、乳剂、凝胶等，此外还含有本领域已知的此类赋形剂。
适用于胃肠外施用的制剂包括水性和非水性等张无菌注射溶液，其可含有抗氧化剂、缓冲剂、抑菌剂和致使制剂与预期接受者的血液等张的溶质；以及水性和非水性无菌悬浮液，其可包含悬浮剂、增溶剂、增稠剂、稳定剂和防腐剂。在一些实施方案中，本文提供的治疗剂可在药物载剂(诸如无菌液体或液体混合物)中在生理学上可接受的稀释剂中施用，所述无菌液体或液体混合物包括水、盐水、水性右旋糖以及相关糖溶液、醇(诸如乙醇或十六烷醇)、二醇(诸如丙二醇或聚乙二醇)、二甲亚砜、甘油、缩酮如2,2-二甲基-1,3-二氧戊环-4-甲醇、醚、聚(乙二醇)400、油、脂肪酸、脂肪酸酯或甘油酯或乙酰化脂肪酸甘油酯，其中添加或不添加药学上可接受的表面活性剂(如皂或洗涤剂)、悬浮剂(如果胶、卡波姆、甲基纤维素、羟丙基甲基纤维素或羧甲基纤维素)或乳化剂和其他药物佐剂。
在一些实施方案中可用于胃肠外制剂中的油包括石油、动物油、植物油或合成油。油的具体实例包括花生、大豆、芝麻、棉籽、玉米、橄榄、凡士林和矿物油。用于胃肠外制剂的合适的脂肪酸包括油酸、硬脂酸和异硬脂酸。油酸乙酯和肉豆蔻酸异丙酯是合适的脂肪酸酯的实例。
用于胃肠外制剂的某些实施方案中的合适的皂包括脂肪碱金属、铵和三乙醇胺盐，并且合适的洗涤剂包括(a)阳离子洗涤剂，诸如例如二甲基二烷基卤化铵和烷基吡啶鎓卤化物，(b)阴离子洗涤剂，例如像烷基、芳基和烯烃磺酸酯、烷基、烯烃、醚以及单酸甘油酯硫酸酯和磺基琥珀酸盐，(c)非离子洗涤剂，例如像脂肪胺氧化物、脂肪酸链烷醇酰胺和聚氧乙烯-聚丙烯共聚物，(d)两性洗涤剂，例如像烷基-β-氨基丙酸盐和2-烷基-咪唑啉季铵盐以及(e)它们的混合物。
在一些实施方案中，胃肠外制剂含有溶液中例如约0.5重量％至约25重量％的治疗剂。可使用防腐剂和缓冲剂。为了最小化或消除注射部位的刺激，此类组合物可含有具有例如约12至约17的亲水-亲油平衡(HLB)的一种或多种非离子表面活性剂。此类制剂中表面活性剂的量通常将在例如约5重量％至约15重量％的范围内。合适的表面活性剂包括聚乙二醇、脱水山梨糖醇脂肪酸酯诸如脱水山梨醇单油酸酯、以及环氧乙烷与疏水基质的高分子量加合物(通过环氧丙烷与丙二醇的缩合形成)。胃肠外制剂可以单位剂量或多剂量密封容器如安瓿或小瓶形式呈现，并且可储存于冷冻干燥(冻干)条件下，仅需在使用前即刻添加无菌液体赋形剂(例如水)以供注射。即时注射溶液和悬浮液可从先前所述种类的无菌粉末、颗粒和片剂制备。
在某些实施方案中，本文提供了可注射制剂。可注射组合物对有效药物载剂的要求是本领域普通技术人员众所周知的(参见例如，Pharmaceutics and PharmacyPractice,J.B.Lippincott Company,Philadelphia,PA,Banker和Chalmers,编,第238-250页(1982)；以及ASHP Handbook on Injectable Drugs,Toissel,第4版,第622-630页(1986))。
在一些实施方案中，本文提供了局部制剂。局部制剂(包括可用于经皮药物释放的那些)在本文提供的某些实施方案的上下文中适合施加至皮肤。在一些实施方案中，治疗剂单独或与其他合适的组分组合可制成气雾剂制剂以通过吸入施用。这些气雾剂制剂可被置于加压可接受的推进剂中，如二氯二氟甲烷、丙烷、氮等。它们也可被配制成药物用于非加压制备，诸如在喷雾器或雾化器中。此类喷雾制剂也可用于喷雾粘膜。
在某些实施方案中，本文提供的治疗剂可配制成包合复合物，如环糊精包合复合物或脂质体。脂质体可用于使治疗剂靶向特定组织。脂质体也可用于增加治疗剂的半衰期。许多方法可用于制备脂质体，如在例如Szoka等人,Ann.Rev.Biophys.Bioeng.,9,467(1980)以及美国专利4,235,871、4,501,728、4,837,028和5,019,369中所描述。
在一些实施方案中，本文提供的治疗剂被配制在定时释放、延迟释放或持续释放递送***中，使得组合物的递送在待治疗部位的致敏之前发生并且有足够的时间引起待治疗部位的致敏。此类***可避免治疗剂的重复施用，从而增加受试者和医生的便利，并且可能特别适用于本文提供的某些组合物实施方案。在一个实施方案中，本发明的组合物被配制为使得它们适合于其中所含的circRNA的延长释放。这种延长释放组合物可以延长的给药间隔方便地施用于受试者。例如，在一个实施方案中，本发明的组合物每天两次、每天或每隔一天施用至受试者。在一个实施方案中，本发明的组合物每周两次、每周一次、每十天、每两周、每三周、每四周、每月一次、每六周、每八周、每三个月、每四个月、每六个月、每八个月、每九个月或每年一次施用至受试者。
在一些实施方案中，由本发明的多核苷酸编码的蛋白质由靶细胞产生持续量的时间。例如，蛋白质可在施用后产生持续超过一小时、超过四小时、超过六小时、超过12小时、超过24小时、超过48小时或超过72小时。在一些实施方案中，多肽在施用后约六小时以峰值水平表达。在一些实施方案中，多肽的表达至少维持在治疗水平。在一些实施方案中，多肽在施用后至少以治疗水平表达超过1小时、超过4小时、超过6小时、超过12小时、超过24小时、超过48小时或超过72小时。在一些实施方案中，多肽在患者组织(例如肝或肺)中以治疗水平可检测到。在一些实施方案中，可检测多肽的水平来自circRNA组合物在施用后超过1小时、超过4小时、超过6小时、超过12小时、超过24小时、超过48小时或超过72小时的时间段内的连续表达。
在某些实施方案中，由本发明的多核苷酸编码的蛋白质以高于正常生理水平的水平产生。与对照相比，蛋白质水平可增加。在一些实施方案中，对照是正常个体或正常个体群中多肽的基线生理水平。在其他实施方案中，对照是相关蛋白质或多肽缺乏的个体或相关蛋白质或多肽缺乏的个体群中多肽的基线生理水平。在一些实施方案中，对照可以是向其施用组合物的个体中相关蛋白质或多肽的正常水平。在其他实施方案中，对照是在其他治疗干预后，例如在直接注射相应多肽后，在一个或多个相当的时间点时多肽的表达水平。
在某些实施方案中，在施用后3天、4天、5天或1周或更长时间可检测到由本发明的多核苷酸编码的蛋白质的水平。可在组织(例如肝或肺)中观察到蛋白的水平增加。
在一些实施方案中，方法产生由本发明的多核苷酸编码的蛋白质的持续循环半衰期。例如，可检测到蛋白质持续比通过皮下注射蛋白质或编码蛋白质的mRNA观察到的半衰期长数小时或数天。在一些实施方案中，蛋白质的半衰期是1天、2天、3天、4天、5天或1周或更长时间。
许多类型的释放递送***是可用的并且是本领域普通技术人员已知的。它们包括基于聚合物的***，如聚(丙交酯-乙交酯)、共聚草酸酯、聚己内酯、聚酯酰胺、聚原酸酯、聚羟基丁酸和聚酐。基丁酸和聚酐。含有药物的前述聚合物的微胶囊描述于例如美国专利5,075,109中。递送***还包括非聚合物***，其是脂质，包括固醇如胆固醇、胆固醇酯和脂肪酸或中性脂肪如甘油单酯、甘油二酯和甘油三酯；水凝胶释放***；弹性***(sylasticsystem)；基于肽的***：蜡包衣；使用常规粘合剂和赋形剂的压制片剂；部分融合的植入物等。具体实例包括但不限于：(a)侵蚀***，其中活性组合物以某种形式包含在基质内，如美国专利4,452,775、4,667,014、4,748,034和5,239,660中描述的那些；以及(b)扩散***，其中活性组分以受控速率从聚合物中渗透，如美国专利3,832,253和3,854,480中所描述。此外，可使用基于泵的硬件递送***，其中一些适用于植入。
在一些实施方案中，治疗剂可通过连接部分与靶向部分直接或间接缀合。用于将治疗剂与靶向部分缀合的方法是本领域已知的。参见例如，Wadwa等人,J,Drug Targeting3:111(1995)和美国专利5,087,616。
在一些实施方案中，本文提供的治疗剂被配制成贮库形式，使得治疗剂释放到其被施用的身体中的方式关于时间和体内的位置进行控制(参见例如，美国专利4,450,150)。治疗剂的贮库形式可以是例如包含治疗剂和多孔或无孔材料(如聚合物)的可植入组合物，其中治疗剂被材料包封或扩散到材料中和/或降解无孔材料。然后将贮库植入体内所需的位置，并且治疗剂以预定速率从植入物中释放。
16.治疗方法
在某些方面，本文提供了一种治疗和/或预防疾患，例如自身免疫性病症或癌症的方法。
在某些实施方案中，将本文提供的治疗剂与一种或多种另外的治疗剂(例如，在同一药物组合物中或在单独的药物组合物中)共同施用。在一些实施方案中，可首先施用本文提供的治疗剂，然后可施用一种或多种另外的治疗剂，或反之亦然。可替代地，本文提供的治疗剂和一种或多种另外的治疗剂可同时施用。
在一些实施方案中，受试者是哺乳动物。在一些实施方案中，本文所指的哺乳动物可以是任何哺乳动物，包括但不限于啮齿目哺乳动物，如小鼠和仓鼠，或兔形目哺乳动物，如兔。哺乳动物可来自食肉目，包括猫科动物(猫)和犬科动物(狗)。哺乳动物可来自偶蹄目，包括牛科动物(牛)和猪科动物(猪)；或奇蹄目哺乳动物，包括马科动物(马)。哺乳动物可属于灵长目、直翅目或类猴目(猴)或类人猿目(人和猿)。优选地，哺乳动物是人。
17.序列
表17.IRES序列。
Figure BDA0003951010620004991
Figure BDA0003951010620005001
Figure BDA0003951010620005011
Figure BDA0003951010620005021
Figure BDA0003951010620005031
Figure BDA0003951010620005041
Figure BDA0003951010620005051
Figure BDA0003951010620005061
Figure BDA0003951010620005071
Figure BDA0003951010620005081
Figure BDA0003951010620005091
Figure BDA0003951010620005101
Figure BDA0003951010620005111
Figure BDA0003951010620005121
Figure BDA0003951010620005131
Figure BDA0003951010620005141
Figure BDA0003951010620005151
Figure BDA0003951010620005161
Figure BDA0003951010620005171
Figure BDA0003951010620005181
Figure BDA0003951010620005191
Figure BDA0003951010620005201
Figure BDA0003951010620005211
Figure BDA0003951010620005221
Figure BDA0003951010620005231
Figure BDA0003951010620005241
Figure BDA0003951010620005251
Figure BDA0003951010620005261
Figure BDA0003951010620005271
Figure BDA0003951010620005281
Figure BDA0003951010620005291
Figure BDA0003951010620005301
Figure BDA0003951010620005311
Figure BDA0003951010620005321
Figure BDA0003951010620005331
Figure BDA0003951010620005341
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Figure BDA0003951010620005381
Figure BDA0003951010620005391
Figure BDA0003951010620005401
Figure BDA0003951010620005411
Figure BDA0003951010620005421
Figure BDA0003951010620005431
Figure BDA0003951010620005441
Figure BDA0003951010620005451
Figure BDA0003951010620005461
Figure BDA0003951010620005471
Figure BDA0003951010620005481
Figure BDA0003951010620005491
Figure BDA0003951010620005501
Figure BDA0003951010620005511
Figure BDA0003951010620005521
Figure BDA0003951010620005531
Figure BDA0003951010620005541
Figure BDA0003951010620005551
Figure BDA0003951010620005561
Figure BDA0003951010620005571
Figure BDA0003951010620005581
Figure BDA0003951010620005591
Figure BDA0003951010620005601
Figure BDA0003951010620005611
Figure BDA0003951010620005621
Figure BDA0003951010620005631
Figure BDA0003951010620005641
在一些实施方案中，本发明的IRES是具有如表17(SEQ ID NO:1-72和348-389)所列的序列的IRES。在一些实施方案中，IRES是萨力病毒IRES。在一些实施方案中，IRES是萨力病毒SZ1 IRES。在一些实施方案中，IRES是AP1.0(SEQ ID NO:348)。在一些实施方案中，IRES是CK1.0(SEQ ID NO:349)。在一些实施方案中，IRES是PV1.0(SEQ ID NO:350)。在一些实施方案中，IRES是SV1.0(SEQ ID NO:351)。
表18.鱼腥藻属置换位点5'内含子片段序列。
Figure BDA0003951010620005642
Figure BDA0003951010620005651
Figure BDA0003951010620005661
在一些实施方案中，5'内含子片段是具有表18中所列序列的片段。通常，含有表18中列出的5'内含子片段的构建体将含有如表19中列出的相应3'内含子片段(例如，两者均表示具有L9a-8置换位点的片段)。
表19.鱼腥藻属置换位点3'内含子片段序列。
Figure BDA0003951010620005671
Figure BDA0003951010620005681
Figure BDA0003951010620005691
Figure BDA0003951010620005701
在一些实施方案中，3'内含子片段是具有表19中所列序列的片段。在一些实施方案中，含有表19中列出的3'内含子片段的构建体将含有如表18中列出的相应5'内含子片段(例如，两者均表示具有L9a-8置换位点的片段)。
表20.非鱼腥藻属置换位点5'内含子片段序列。
Figure BDA0003951010620005702
Figure BDA0003951010620005711
在一些实施方案中，5'内含子片段是具有表20中所列序列的片段。含有表20中列出的5'内含子片段的构建体将含有表21中的相应3'内含子片段(例如，两者均表示具有Azop1内含子的片段)。
表21.非鱼腥藻属置换位点3'内含子片段序列。
Figure BDA0003951010620005712
Figure BDA0003951010620005721
在一些实施方案中，3'内含子片段是具有表21中所列序列的片段。含有表21中列出的3'内含子片段的构建体将含有如表20中列出的相应5'内含子片段(例如，两者均表示具有Azop1内含子的片段)。
表22.间隔区和鱼腥藻属5'内含子片段序列。
Figure BDA0003951010620005731
Figure BDA0003951010620005741
Figure BDA0003951010620005751
Figure BDA0003951010620005761
Figure BDA0003951010620005771
在一些实施方案中，间隔区和5'内含子片段是具有如表22中所列序列的间隔区和片段。
表23.间隔区和鱼腥藻属3'内含子片段序列。
Figure BDA0003951010620005772
Figure BDA0003951010620005781
Figure BDA0003951010620005791
Figure BDA0003951010620005801
Figure BDA0003951010620005811
Figure BDA0003951010620005821
Figure BDA0003951010620005831
Figure BDA0003951010620005841
在一些实施方案中，间隔区和3'内含子片段是具有如表23中所列的序列的间隔区和内含子片段。
表24.CAR序列
Figure BDA0003951010620005851
Figure BDA0003951010620005861
Figure BDA0003951010620005871
Figure BDA0003951010620005881
Figure BDA0003951010620005891
Figure BDA0003951010620005901
Figure BDA0003951010620005911
Figure BDA0003951010620005921
Figure BDA0003951010620005931
Figure BDA0003951010620005941
在一些实施方案中，CAR由如表24中所列的核苷酸序列编码。
表25.CAR结构域序列。
Figure BDA0003951010620005942
在一些实施方案中，由本发明的多核苷酸编码的CAR结构域具有如表25中所列的序列。
表26.PD-1或PD-L1序列。
Figure BDA0003951010620005943
Figure BDA0003951010620005951
Figure BDA0003951010620005961
在一些实施方案中，分离由本发明多核苷酸编码的表达序列的裂解位点具有表26中列出的序列。
表27.细胞因子序列。
Figure BDA0003951010620005962
Figure BDA0003951010620005971
在一些实施方案中，由本发明的多核苷酸编码的细胞因子具有如表27中所列的序列。
表28.转录因子序列。
Figure BDA0003951010620005981
Figure BDA0003951010620005991
在一些实施方案中，由本发明的多核苷酸编码的转录因子具有如表28中所列的序列。
表29.另外的辅助序列
Figure BDA0003951010620005992
Figure BDA0003951010620006001
Figure BDA0003951010620006011
Figure BDA0003951010620006021
Figure BDA0003951010620006031
Figure BDA0003951010620006041
Figure BDA0003951010620006051
Figure BDA0003951010620006061
Figure BDA0003951010620006071
Figure BDA0003951010620006081
在一些实施方案中，本文公开的环状RNA或前体RNA(例如，线性前体RNA)包含如表29中所列的序列。
在一些实施方案中，多核苷酸或由多核苷酸编码的蛋白质含有与本文公开的一个或多个序列具有至少约70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％相似性的序列。在一些实施方案中，多核苷酸或由多核苷酸编码的蛋白质含有与本文公开的一个或多个序列同一的序列。
本文描述了优选实施方案。阅读上述说明书后那些优选实施方案的变型对于本领域普通技术人员可变得明显。发明人希望技术人员适当地采用此类变型，并且发明人意图以其它方式而不是如本文所特别描述的来实施本发明。因此，本发明包括在适用法律允许的本发明随附的权利要求中叙述的主题的所有修改和等效物。此外，除非本文另外指示或明显地与上下文矛盾，否则本发明涵盖其所有可能变型中的上述要素的任何组合。
实施例
Wesselhoeft等人(2019)RNA Circularization Diminishes Immunogenicityand Can Extend Translation Duration In Vivo.Molecular Cell.74(3),508-520和Wesselhoeft等人(2018)Engineering circular RNA for Potent and StableTranslation in Eukaryotic Cells.Nature Communications.9,2629以引用的方式整体并入。
本发明将参考以下实施例进一步详细地描述，但不限于以下实施例。这些实施例涵盖说明的任何和所有变型，旨在向本领域普通技术人员提供关于如何制备和使用本发明的完整公开和描述，并且不意图限制被视为本发明的事物的范围。
实施例1
实施例1A：外部同源区允许使用置换内含子外显子(PIE)环化策略环化长前体RNA。
将含有全长脑心肌炎病毒(EMCV)IRES、高斯萦光素酶(GLuc)表达序列和置换内含子-外显子(PIE)构建体的两个短外显子片段的1,100nt序列***T4噬菌体的胸苷酸合酶(Td)基因中置换的I组催化内含子的3'内含子与5'内含子之间。前体RNA是通过失控转录合成的。通过在镁离子和GTP存在下加热前体RNA来尝试环化，但没有获得剪接产物。
设计完美互补的9个核苷酸和19个核苷酸长的同源区并添加在前体RNA的5'和3'端。这些同源臂的添加将9个核苷酸同源区的剪接效率从0％增加至16％，并将19个核苷酸同源区的剪接效率提高到48％，如通过前体RNA条带的消失所评估。
将剪接产物用RNA酶R处理。跨RNA酶R处理的剪接反应的推定剪接接点的测序揭示连接的外显子，并且用寡核苷酸靶向的RNA酶H消化RNA酶R处理的剪接反应产生单一条带，相比之下由RNA酶H消化的线性前体产生两个条带。这表明环状RNA是含有9或19个核苷酸长的外部同源区的前体RNA的剪接反应的主要产物。
实施例1B：保护IRES和PIE剪接位点的二级结构的间隔区提高环化效率。
设计一系列间隔区并***3'PIE剪接位点与IRES之间。这些间隔区旨在保护或破坏IRES、3'PIE剪接位点和/或5'剪接位点中内含子序列内的二级结构。添加旨在保护二级结构的间隔区序列产生87％的剪接效率，而添加破坏性间隔区序列导致没有可检测的剪接。
实施例2
实施例2A：除了外部同源区之外，内部同源区产生剪接泡并允许翻译若干表达序列。
间隔区被设计为非结构化的，与内含子和IRES序列非同源，并且含有间隔区-间隔区同源区。将这些***构建体中的5'外显子与IRES之间以及3'外显子与表达序列之间，所述构建体含有外部同源区、EMCV IRES以及高斯萦光素酶(总长度：1289nt)、萤火虫萦光素酶(2384nt)、eGFP(1451nt)、人***(1313nt)和Cas9核酸内切酶(4934nt)的表达序列。实现了所有5个构建体的环化。利用T4噬菌体和鱼腥藻属内含子的构建体的环化大致相等。对于较短的序列，环化效率更高。为了测量翻译，将每个构建体转染到HEK293细胞中。高斯和萤火虫萦光素酶转染的细胞产生稳健反应，如通过发光所测量，在用***circRNA转染的细胞培养基中可检测到人***，并且从用EGFP circRNA转染的细胞中观察到EGFP萦光。与仅sgRNA对照相比，将Cas9 circRNA与针对GFP的sgRNA共转染到组成性表达GFP的细胞中导致高达97％的细胞的萦光消融。
实施例2B：使用CVB3 IRES增加蛋白质产生。
制备了具有内部和外部同源区和不同IRES的构建体，所述IRES含有高斯萦光素酶或萤火虫萦光素酶表达序列。转染后24小时，通过HEK293细胞上清液中的发光测量蛋白质产生。在两种情况下，柯萨奇病毒B3(CVB3)IRES构建体产生的蛋白质最多。
实施例2C：使用多聚A或多聚AC间隔区增加蛋白质产生。
将30个核苷酸长的多聚A或多聚AC间隔区添加构建体中的IRES与剪接接点之间，每个IRES产生实施例2B中的蛋白质。转染后24小时，通过HEK293细胞上清液中的发光测量高斯萦光素酶活性。与没有间隔区的对照构建体相比，两种间隔区均改善了每个构建体中的表达。
实施例3
与用相当的未经修饰的或经修饰的线性RNA转染的细胞相比，用环状RNA转染的HEK293或HeLa细胞产生更多的蛋白质。
将HPLC纯化的高斯萦光素酶编码circRNA(CVB3-GLuc-pAC)与规范的未经修饰的5'甲基鸟苷加帽和3'多聚A加尾的线性GLuc mRNA和市售核苷修饰(假尿苷，5-甲基胞嘧啶)的线性GLuc mRNA(来自Trilink)进行比较。转染后24小时测量发光，揭示circRNA在HEK293细胞中产生比未经修饰的线性mRNA多811.2％的蛋白质，并且比经修饰的mRNA多54.5％的蛋白质。在HeLa细胞中获得了类似的结果，并且将编码人***的优化的circRNA与用5-甲氧基尿苷修饰的线性mRNA进行了比较。
在6天内收集发光数据。在HEK293细胞中，circRNA转染导致蛋白质产生半衰期为80小时，相比之下未经修饰的线性mRNA为43小时，并且经修饰的线性mRNA为45小时。在HeLa细胞中，circRNA转染导致蛋白质产生半衰期为116小时，相比之下未经修饰的线性mRNA为44小时，并且经修饰的线性mRNA为49小时。在两种细胞类型中，CircRNA在其整个生命周期中产生的蛋白质显著多于未经修饰的和经修饰的线性mRNA两者。
实施例4
实施例4A：通过RNA酶消化、HPLC纯化和磷酸酶处理纯化circRNA降低免疫原性。完全纯化的环状RNA的免疫原性显著低于未纯化或部分纯化的环状RNA。蛋白质表达稳定性和细胞活力取决于细胞类型和环状RNA纯度。
将人胚肾293(HEK293)和人肺癌A549细胞用以下转染：
·未纯化的GLuc环状RNA剪接反应的产物，
·剪接反应的RNA酶R消化的产物，
·剪接反应的RNA酶R消化和HPLC纯化的产物，或
·剪接反应的RNA酶消化、HPLC纯化和磷酸酶处理的产物。
与未转染的对照相比，剪接反应的RNA酶R消化不足以阻止A549细胞中的细胞因子释放。
添加HPLC纯化也不足以阻止细胞因子释放，尽管与未纯化的剪接反应相比，存在白细胞介素-6(IL-6)的显著减少和干扰素-α1(IFN-α1)的显著增加。
在HPLC纯化之后和RNA酶R消化之前添加磷酸酶处理显著降低了A549细胞中评估的所有上调细胞因子的表达。分泌的单核细胞趋化蛋白1(MCP1)、IL-6、IFN-α1、肿瘤坏死因子α(TNFα)和IFNγ诱导蛋白-10(IP-10)降至不可检测或未转染的基线水平。
HEK293细胞中没有大量细胞因子释放。当用更高纯度的环状RNA转染时，A549细胞具有提高的GLuc表达稳定性和细胞活力。完全纯化的环状RNA具有与转染的293细胞相似的稳定性表型。
实施例4B：环状RNA不会引起显著免疫原性并且不是RIG-I配体。
将A549细胞用剪接反应的产物转染：
将A549细胞用以下转染：
·未纯化的环状RNA，
·高分子量(线性和环状拼接)RNA，
·环状(切口)RNA，
·纯化的环状RNA的早期级分(与切口RNA峰重叠较多)，
·纯化的环状RNA的后期级分(与切口RNA峰重叠较少)，
·在环化过程中切除的内含子，或
·媒介物(即未转染的对照)。
由于难以从剪接反应中获得适当纯的线性前体RNA，将前体RNA以剪接位点缺失突变体(DS)的形式单独合成和纯化。在每种情况下测量细胞因子释放和细胞活力。
观察到响应于剪接反应中存在的大多数物质以及前体RNA的稳健IL-6、RANTES和IP-10释放。早期circRNA级分引发了与其他非circRNA级分相当的细胞因子反应，从而表明即使相对少量的线性RNA污染物也能够在A549细胞中诱导显著细胞免疫应答。后期circRNA级分没有引发超过来自未转染对照的细胞因子反应。与所有其他级分相比，对于后期circRNA级分在转染后36小时的A549细胞活力显著更高。
分析了用后期circRNA HPLC级分、前体RNA或未纯化的剪接反应转染A549细胞后的RIG-I和IFN-β1转录物诱导。与前体RNA和未纯化的剪接反应相比，后期circRNA级分的RIG-I和IFN-β1转录物的诱导较弱。单独RNA酶R处理剪接反应不足以消除这种效应。将极少量的RIG-I配体3p-hpRNA添加至环状RNA诱导显著RIG-I转录。在HeLa细胞中，RNA酶R消化的剪接反应的转染诱导RIG-I和IFN-β1，但纯化的circRNA则不。总体而言，与A549细胞相比，HeLa细胞对污染RNA种类不那么敏感。
在用剪接反应或完全纯化的circRNA转染A549细胞后的前8小时内，监测RIG-I、IFN-β1、IL-6和RANTES转录物诱导的时程实验并未揭示针对circRNA的瞬时应答。纯化的circRNA同样未能在RAW264.7鼠巨噬细胞中诱导促炎性转录物。
用含有EMCV IRES和EGFP表达序列的纯化circRNA转染A549细胞。这未能产生对促炎性转录物的实质性诱导。这些数据表明，剪接反应的非环状组分是造成先前研究中观察到的免疫原性的原因，并且circRNA不是RIG-I的天然配体。
实施例5
环状RNA避免TLR的检测。
用多个线性或环状RNA构建体转染TLR 3、7和8报告细胞系，并测量分泌的胚胎碱性磷酸酶(SEAP)。
通过缺失内含子和同源臂序列构建线性化RNA。然后用磷酸酶处理线性RNA构建体(在加帽RNA的情况下，在加帽后)并通过HPLC纯化。
尝试的转染均未在TLR7报告细胞中产生应答。TLR3和TLR8报告细胞被加帽的线性化RNA、聚腺苷酸化的线性化RNA、切口circRN AHPLC级分和早期circRNA级分激活。后期circRNA级分和m1ψ-mRNA不会在任何细胞系中引起TLR介导的应答。
在第二实验中，将circRNA使用两种方法线性化：在镁离子存在下用加热处理circRNA和DNA寡核苷酸引导的RNA酶H消化。两种方法均产生了大部分全长线性RNA和少量完整circRNA。将TLR3、7和8报告细胞用环状RNA、通过加热降解的环状RNA或通过RNA酶H降解的环状RNA转染，并在转染后36小时测量SEAP分泌。TLR8报告细胞响应于两种形式的降解的环状RNA分泌SEAP，但对环状RNA转染的反应并不比模拟转染更大。尽管体外转录的线性化RNA激活TLR3，但在TLR3和TLR7报告细胞中未观察到在降解或完整条件下的激活。
实施例6
与线性RNA相比，未经修饰的环状RNA产生增加的持续体内蛋白质表达。
对小鼠注射并用未经修饰和m1ψ经修饰的人***(hEpo)线性mRNA和circRNA转染HEK293细胞。m1ψ-mRNA和未经修饰的circRNA的等摩尔转染在HEK293细胞中产生稳健蛋白质表达。在HEK293和A549细胞的等重量转染后，hEpo线性mRNA和circRNA显示出与GLuc线性mRNA和circRNA相比相似的相对蛋白质表达模式和细胞活力。
在小鼠中，将hEpo circRNA或线性mRNA注射进内脏脂肪后，在血清中检测到hEpo。注射未经修饰的circRNA后检测到的hEpo比来自未修饰或m1ψ-mRNA的衰减更慢，并且在注射后42小时仍然存在。注射未纯化的circRNA剪接反应物或未经修饰的线性mRNA后，血清hEpo迅速下降。注射未纯化的剪接反应产生了在血清中可检测到的细胞因子反应，而对于其他RNA(包括纯化的circRNA)未观察到。
实施例7
环状RNA可通过脂质纳米颗粒在体内或体外有效递送。
纯化的环状RNA被配制成具有可电离类脂质cKK-E12的脂质纳米颗粒(LNP)(Dong等人,2014；Kauffman等人,2015)。颗粒形成均匀的多层结构，其平均大小、多分散性指数和包封效率与含有用5moU修饰的市售对照线性mRNA的颗粒相似。
当包封在LNP中并添加至HEK293细胞中时，纯化的hEpo circRNA显示出比5moU-mRNA更高的表达。LNP-RNA在HEK293细胞中的表达稳定性与通过转染试剂递送的RNA的表达稳定性相似，除了5moU-mRNA和circRNA的衰减略有延迟。未经修饰的circRNA和5moU-mRNA均未能在体外激活RIG-I/IFN-β1。
在小鼠中，LNP-RNA通过局部注射到内脏脂肪组织中递送或静脉内递送至肝。在两种情况下，来自circRNA的血清hEpo表达较低，但与递送后6小时来自5moU-mRNA的表达相当。脂肪注射未经修饰的LNP-circRNA后检测到的血清hEpo比LNP-5moU-mRNA的衰减得更慢，其中血清中存在的表达衰减延迟与体外观察到的相似，但静脉内注射LNP-circRNA或LNP-5moU-mRNA后的血清hEpo以大致相同的速率衰减。在这些情况中的任一者下，血清细胞因子或局部RIG-I、TNFα或IL-6转录物诱导均没有增加。
实施例8
实施例8A：IRES在HEK293、HepG2和1C1C7细胞中的表达和功能稳定性。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯萦光素酶表达序列和不同IRES的构建体环化。使用Lipofectamine MessengerMax将100ng的每种环化反应分别转染到20,000个HEK293细胞、HepG2细胞和1C1C7细胞中。24小时后评估每种上清液中的发光作为蛋白质表达的量度。在HEK293细胞中，包含Crohivirus B、萨力病毒FHB、爱知病毒、萨力病毒HG-J1和肠道病毒J IRES的构建体在24小时时产生最多的发光(图1A)。在HepG2细胞中，包含爱知病毒、萨力病毒FHB、EMCV-Cf和CVA3 IRES的构建体在24小时时产生高发光(图1B)。在1C1C7细胞中，包含萨力病毒FHB、爱知病毒、萨力病毒NG-J1和萨力病毒A SZ-1IRES的构建体在24小时时产生高发光(图1C)。
观察到较大的IRES在24小时时产生较大的发光的趋势。较短的总序列长度往往提高环化效率，因此选择高表达和相对短的IRES可产生改进的构建体。在HEK293细胞中，使用Crohivirus B IRES的构建体产生最高的发光，尤其是与其他类似长度的IRES相比(图2A)。针对IRES大小绘制的来自HepG2和1C1C7细胞中IRES构建体的表达在图2B和2C中。
在3天内测量了HepG2和1C1C7细胞中选定IRES构建体的功能稳定性。在用100ng的每种环化反应转染20,000个细胞后，每24小时测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光，然后完全更换培养基。萨力病毒A GUT和萨力病毒FHB在HepG2细胞中表现出最高的功能稳定性，并且萨力病毒N-J1和萨力病毒FHB在1C1C7细胞中产生最稳定的表达(图3A和3B)。
实施例8B：另外的IRES的筛选
测量了HEK293细胞中另外的IRES构建体的功能稳定性。简言之，从GenBank鉴定了目标5'非翻译区(UTR)。将选定UTR UTR从5'端截短至675nt，并***编码高斯萦光素酶(Gluc)的环状RNA主链构建体中，并位于Gluc编码区的前面。将环状RNA转染到HEK293细胞中。24小时后，收集上清液并使用市售试剂测量来自分泌的Gluc蛋白的发光。结果描绘于图1D和1E以及表30中，表明许多天然IRES序列增强环状RNA背景下的蛋白质表达。
表30
Figure BDA0003951010620006181
Figure BDA0003951010620006191
Figure BDA0003951010620006201
Figure BDA0003951010620006211
Figure BDA0003951010620006221
Figure BDA0003951010620006231
实施例9
IRES在Jurkat细胞中的表达和功能稳定性。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯萦光素酶表达序列和先前测试的IRES子组的2组构建体环化。将60,000个Jurkat细胞用1μg的每种环化反应进行电穿孔。在电穿孔后24小时测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光。CVB3 IRES构建体均包含于两组中，以用于组之间以及与先前定义的IRES功效的比较。CVB1和萨力病毒A SZ1 IRES构建体在24小时时产生最多的表达。数据可在图4A和4B中找到。
在3天内测量每轮电穿孔Jurkat细胞中IRES构建体的功能稳定性。在用1μg的每种环化反应对60,000个细胞进行电穿孔后，每24小时测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光，然后完全更换培养基(图5A和5B)。
与其他构建体相比，萨力病毒A SZ1和萨力病毒A BN2 IRES构建体具有高功能稳定性。
实施例10
Jurkat细胞中环状和线性RNA的表达、功能稳定性和细胞因子释放。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯萦光素酶表达序列和萨力病毒FHBIRES的构建体环化。包含高斯萦光素酶表达序列和约150nt多聚A尾且经修饰以用5-甲氧基尿苷(5moU)置换100％的尿苷的mRNA可商购获得，并且购自Trilink。5moU核苷酸修饰已被证明提高mRNA的稳定性和表达(Bioconjug Chem.2016Mar16；27(3):849-53)。测量并比较了Jurkat细胞中经修饰的mRNA、环化反应(不纯)和通过尺寸排阻HPLC纯化的circRNA(纯)的表达(图6A)。用1μg的每种RNA种类对60,000个细胞进行电穿孔后24小时，测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光。
在用1ug的每种RNA种类对60,000个细胞进行电穿孔后，每24小时测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光，然后完全更换培养基。图6B是Jurkat细胞中经修饰mRNA和circRNA在3天内的功能稳定性数据的比较。
用1μg的上述每种RNA种类和3p-hpRNA(5'三磷酸发夹RNA，其是已知的RIG-I激动剂)对60,000个Jurkat细胞进行电穿孔后18小时测量IFNγ(图7A)、IL-6(图7B)、IL-2(图7C)、RIG-I(图7D)、IFN-β1(图7E)和TNFα(图7F)转录物诱导。
实施例11
环状和线性RNA在单核细胞和巨噬细胞中的表达。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯萦光素酶表达序列和萨力病毒FHBIRES的构建体环化。包含高斯萦光素酶表达序列和约150nt多聚A尾且经修饰以用5-甲氧基尿苷(5moU)置换100％的尿苷的mRNA购自Trilink。在人原代单核细胞(图8A)和人原代巨噬细胞(图8B)中测量了环状和经修饰的mRNA的表达。用1μg的每种RNA种类对60,000个细胞进行电穿孔后24小时，测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光。还在人原代巨噬细胞电穿孔后4天测量了发光，每24小时更换培养基(图8C)。结果可在图8中找到。在每种情况下，发光的差异在统计学上是显著的(p<0.05)。
实施例12
IRES在原代T细胞中的表达和功能稳定性。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯萦光素酶表达序列和先前测试的IRES子组的构建体环化，并将反应产物通过尺寸排阻HPLC纯化。将150,000个原代人CD3+T细胞用1μg的每种circRNA进行电穿孔。在电穿孔后24小时测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光(图9A)。爱知病毒和CVB3 IRES构建体在24小时时具有最多表达。
还在电穿孔后每24小时测量发光持续3天，以比较每种个构建体的功能稳定性(图9B)。具有萨力病毒A SZ1 IRES的构建体是最稳定的。
实施例13
环状和线性RNA在原代T细胞和PBMC中的表达和功能稳定性。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯萦光素酶表达序列和萨力病毒A SZ1IRES或萨力病毒FHB IRES的构建体环化。包含高斯萦光素酶表达序列和约150nt多聚A尾且经修饰以用5-甲氧基尿苷(5moU)置换100％的尿苷的mRNA购自Trilink。测量萨力病毒ASZ1 IRES HPLC纯化的环状和经修饰的mRNA在人原代CD3+T细胞中的表达。测量萨力病毒FHB HPLC纯化的环状、未纯化的环状和经修饰的mRNA在人PBMC中的表达。用1μg的每种RNA种类对150,000个细胞进行电穿孔后24小时，测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光。原代人T细胞的数据显示在图10A和10B中，并且PBMC的数据显示在图10C中。在每种情况下，纯化的环状RNA与未纯化的环状RNA或线性RNA之间的表达差异是显著的(p<0.05)。
在电穿孔后在3天内每24小时测量来自原代T细胞上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光，以比较构建体功能稳定性。数据在图10B中示出。对于原代T细胞，来自纯化的环状RNA与线性RNA之间第1天测量的相对发光的差异在第2天和第3天是显著的
实施例14
根据鱼腥藻属内含子中的置换位点的环化效率。
产生了包含CVB3 IRES、高斯萦光素酶表达序列、鱼腥藻属内含子/外显子区域、间隔区、内部同源区和同源臂的RNA构建体。通过HPLC测量使用传统鱼腥藻属内含子置换位点和P9中5个连续置换位点的构建体的环化效率。P9中5个连续置换位点的HPLC色谱图如图11A所示。
在各种置换位点测量环化效率。环化效率被定义为以下各项的HPLC色谱图曲线下面积：circRNA/(circRNA+前体RNA)。每个置换位点的环化效率的分级量化在图11B中。选择了3个置换位点(如图11B所示)进行进一步研究。
此实施例中的环状RNA通过体外转录(IVT)，然后通过旋转柱进行纯化来进行环化。如果包括与Mg2+和鸟苷核苷酸孵育的额外步骤，则所有构建体的环化效率将可能更高；然而，除去这一步骤允许环状RNA构建体之间的比较和优化。这种优化水平对于保持大RNA构建体(如编码嵌合抗原受体的那些构建体)的高环化效率特别有用。
实施例15
选择性内含子的环化效率。
创建了含有可变物种起源或置换位点的置换1组内含子和若干恒定元件的前体RNA，所述若干恒定元件包括：CVB3 IRES、高斯萦光素酶表达序列、间隔区、内部同源区和同源臂。环化数据可见于图12中。图12A示出解析前体、CircRNA和内含子的色谱图。图12B基于图12A中所示的色谱图提供环化效率的分级量化，作为内含子构建体的函数。
此实施例中的环状RNA通过体外转录(IVT)，然后旋转柱纯化来进行环化。如果包括与Mg2+和鸟苷核苷酸孵育的额外步骤，则所有构建体的环化效率将可能更高；然而，除去这一步骤允许环状RNA构建体之间的比较和优化。这种优化水平对于保持大RNA构建体(如编码嵌合抗原受体的那些构建体)的高环化效率特别有用。
实施例16
根据同源臂存在或长度的环化效率。
产生了包含CVB3 IRES、高斯萦光素酶表达序列、鱼腥藻属内含子/外显子区域、间隔区和内部同源区的RNA构建体。用30nt、25％GC同源臂或无同源臂(“NA”)测试代表3个鱼腥藻属内含子置换位点的构建体。使这些构建体环化，无需Mg2+孵育步骤。测量并比较环化效率。数据可在图13A和13B中找到。对于缺乏同源臂的每个构建体，环化效率更高。图13A提供环化效率的分级量化；图13B提供解析前体、circRNA和内含子的色谱图。
对于3个置换位点中的每一个，产生了具有10nt、20nt和30nt臂长以及25％、50％和75％ GC含量的构建体。测量这些构建体的剪接效率并且与没有同源臂的构建体进行比较(图14)。剪接效率被定义为剪接反应中游离内含子相对于总RNA的比例。
图15A(左)示出HPLC色谱图，从而表明强同源臂对提高剪接效率的贡献。左上：75％ GC含量，10nt同源臂。左中：75％ GC含量，20nt同源臂。左下：75％ GC含量，30nt同源臂。
图15A(右)示出HPLC色谱图，其显示与切口增加配对的剪接效率增加，在circRNA峰上显示为肩峰。右上：75％ GC含量，10nt同源臂。右中：75％ GC含量，20nt同源臂。右下：75％ GC含量，30nt同源臂。
图15B(左)示出假设证明提高的环化效率的置换位点和同源臂的选定组合。
图15B(右)示出假设证明提高的环化效率的置换位点和同源臂的选定组合，用大肠杆菌多聚A聚合酶处理。
此实施例中的环状RNA通过体外转录(IVT)，然后旋转柱纯化来进行环化。如果包括与鸟苷核苷酸的额外Mg2+孵育步骤，则所有构建体的环化效率将可能更高；然而，除去这一步骤允许环状RNA构建体之间的比较和优化。这种优化水平对于保持大RNA构建体(如编码嵌合抗原受体的那些构建体)的高环化效率特别有用。
实施例17
编码嵌合抗原受体的环状RNA
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、Kymriah嵌合抗原受体(CAR)表达序列和CVB3 IRES的构建体环化。将100,000个人原代CD3+T细胞用500ng的circRNA电穿孔，并与稳定表达GFP和萦火虫萦光素酶的Raji细胞共培养24小时。效应物与靶标比率(E:T比率)0.75:1。将100,000个人原代CD3+T细胞模拟电穿孔并共培养作为对照(图16)。
将一组100,000个人原代CD3+T细胞模拟电穿孔或用1μg的circRNA电穿孔，然后与稳定表达GFP和萤火虫萦光素酶的Raji细胞以E:T比率10:1共培养48小时(图17)。
Raji靶细胞的特异性裂解的定量通过检测萤火虫发光来确定(图18)。将100,000个模拟电穿孔或用编码不同CAR序列的circRNA电穿孔的人原代CD3+T细胞与稳定表达GFP和萤火虫萦光素酶的Raji细胞共培养48小时。特异性裂解％定义为1-[CAR条件发光]/[模拟条件发光]。E:T比率10:1。
实施例18
环状和线性RNA在Jurkat细胞和静息人T细胞中的表达和功能稳定性。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯萦光素酶表达序列和先前测试的IRES子组的构建体环化，并将反应产物通过尺寸排阻HPLC纯化。将150,000个Jurkat细胞用1μg的环状RNA或5moU-mRNA进行电穿孔。电穿孔后24小时测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光(图19A左)。用1μg环状RNA或5moU-mRNA对150,000个静息原代人CD3+T细胞(刺激后10天)进行电穿孔。在电穿孔后24小时测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光(图19A右)。
在电穿孔后每24小时测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光，然后完全更换培养基。功能稳定性数据显示在图19B中。在每种情况下，环状RNA比线性RNA具有更高的功能稳定性，在Jurkat细胞中差异更明显。
实施例19
用线性RNA或不同环状RNA构建体电穿孔的细胞的IFN-β1、RIG-I、IL-2、IL-6、IFNγ和TNFα转录物诱导。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、高斯萦光素酶表达序列和先前测试的IRES子组的构建体环化，并将反应产物通过尺寸排阻HPLC纯化。将150,000个CD3+人T细胞用1μg的环状RNA、5moU-mRNA或免疫刺激阳性对照聚肌苷:胞嘧啶进行电穿孔。在电穿孔后18小时测量IFN-β1(图20A)、RIG-I(图20B)、IL-2(图20C)、IL-6(图20D)、IFNγ(图20E)和TNFα(图20F)转录物诱导。
实施例20
用不同量的环状或线性RNA电穿孔的CAR表达细胞特异性裂解靶细胞和IFNγ转录物诱导；CAR表达细胞以不同E:T比率对靶细胞和非靶细胞的特异性裂解。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、抗CD19 CAR表达序列和CVB3 IRES的构建体环化，并将反应产物通过尺寸排阻HPLC进行纯化。将150,000个模拟电穿孔或用不同数量的编码抗CD19 CAR序列的circRNA电穿孔的人原代CD3+T细胞与稳定表达GFP和萤火虫萦光素酶的Raji细胞以2:1的E:T比率共培养12小时。Raji靶细胞的特异性裂解通过检测萤火虫发光来测定(图21A)。特异性裂解％定义为1-[CAR条件发光]/[模拟条件发光]。在电穿孔后24小时测量IFNγ转录物诱导(图21B)。
将150,000个人原代CD3+T细胞模拟电穿孔或用500ng编码抗CD19 CAR序列的circRNA或m1ψ-mRNA电穿孔，然后与稳定表达萤火虫萦光素酶的Raji细胞以不同E:T比率共培养24小时。Raji靶细胞的特异性裂解％通过检测萤火虫发光来确定(图22A)。特异性裂解％定义为1-[CAR条件发光]/[模拟条件发光]。
将表达CAR的T细胞也与稳定表达萤火虫萦光素酶的Raji或K562细胞以不同E:T比率共培养24小时。Raji靶细胞或K562非靶细胞的特异性裂解通过检测萤火虫发光来确定(图22B)。特异性裂解％被定义为1-[CAR条件发光]/[模拟条件发光]。
实施例21
用编码CAR的环状RNA或线性RNA电穿孔的T细胞对靶细胞的特异性裂解。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、抗CD19 CAR表达序列和CVB3 IRES的构建体环化，并将反应产物通过尺寸排阻HPLC纯化。用500ng环状RNA或等摩尔量的m1ψ-mRNA(各自编码CD19靶向CAR)对人原代CD3+T细胞进行电穿孔。将Raji细胞在7天内以10:1的E:T比例添加至CAR-T细胞培养物中。在第1、3、5和7天测量两种构建体的特异性裂解％(图23)。
实施例22
表达抗CD19 CAR或抗BCMA CAR的T细胞对Raji细胞的特异性裂解。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、抗CD19或抗BCMA CAR表达序列和CVB3 IRES的构建体环化，并将反应产物通过尺寸排阻HPLC纯化。将150,000个原代人CD3+T细胞用500ng的circRNA电穿孔，然后与Raji细胞以2:1的E:T比例共培养。在电穿孔后12小时测量特异性裂解％(图24)。
实施例23
实施例23A：化合物的合成
本发明的代表性可电离脂质的合成描述于PCT申请PCT/US2016/052352、PCT/US2016/068300、PCT/US2010/061058、PCT/US2018/058555、PCT/US2018/053569、PCT/US2017/028981、PCT/US2019/025246、PCT/US2018/035419、PCT/US2019/015913以及公布号为20190314524、20190321489和20190314284的美国申请，所述申请各自的内容以引用的方式整体并入本文。
实施例23B：化合物的合成
本发明的代表性可电离脂质的合成描述于美国专利公布号US20170210697A1中，所述专利公布的内容以引用的方式整体并入本文。
实施例24
器官的蛋白质表达
产生编码FLuc的环状或线性RNA，并使用以下配方负载到转移媒介物中：50％表10b中的可电离脂质15、10％ DSPC、1.5％PEG-DMG、38.5％胆固醇。将CD-1小鼠以0.2mg/kg的剂量给药，并在6小时(活体IVIS)和24小时(活体IVIS和离体IVIS)测量发光。测量了肝、脾、肾、肺和心脏的总通量(目标区域上的光子/秒)(图25和26)。
实施例25
脾中的表达分布
产生编码GFP的环状或线性RNA，并使用以下配方负载到转移媒介物中：50％表10b中的可电离脂质15、10％ DSPC、1.5％PEG-DMG、38.5％胆固醇。将所述制剂施用于CD-1小鼠。流式细胞术在脾细胞上运行以确定跨细胞类型的表达分布。
实施例26
纳米颗粒组合物的产生
为了研究用于将环状RNA递送至细胞的安全且有效的纳米颗粒组合物，制备并测试了一系列制剂。具体地，对纳米颗粒组合物的脂质组分中的特定要素及其比例进行了优化。
纳米颗粒可在1种流体流中或用混合方法如两种流体流的微流体和T型接合混合来制备，其中一种流体流含有环状RNA，并且另一种流体流具有脂质组分。
通过将可电离脂质、任选的辅助脂质(如可从Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL获得的DOPE、DSPC或油酸)、PEG脂质(例如1,2-二肉豆蔻酰基-sn-甘油甲氧基聚乙二醇，也称为PEG-DMG，可从Avanti Polar Lipids,Alabaster,AL获得)和结构脂质如胆固醇在溶剂(例如乙醇)中以约例如40或50mM的浓度合并来制备脂质组合物。应将溶液冷藏以在例如-20℃下储存。将脂质合并以产生所需的摩尔比(参见例如下表31a和31b)并用水和乙醇稀释至例如介于约5.5mM与约25mM之间的最终脂质浓度。
表31a
Figure BDA0003951010620006331
Figure BDA0003951010620006341
在一些实施方案中，转移媒介物具有如表31a中所述的配方。
表31b
Figure BDA0003951010620006342
Figure BDA0003951010620006351
在一些实施方案中，转移媒介物具有如表31b中所述的配方。
对于包含circRNA的纳米颗粒组合物，将在去离子水中浓度为0.1mg/ml的circRNA的溶液在pH介于3与4之间的缓冲液，例如50mM柠檬酸钠缓冲液中稀释以形成储备溶液。可替代地，将在去离子水中浓度为0.15mg/ml的circRNA的溶液在pH介于3与4.5之间的缓冲液，例如6.25mM乙酸钠缓冲液中稀释以形成储备溶液。
通过将脂质溶液与包含环状RNA的溶液以介于约5:1至约50:1之间的脂质组分与circRNA wt:wt比率合并来制备包含环状RNA和脂质组分的纳米颗粒组合物。使用例如基于NanoAssemblr微流体的***以介于约10ml/min与约18ml/min之间或介于约5ml/min与约18ml/min之间的流速将脂质溶液快速注射到circRNA溶液中，以产生水与乙醇比率介于约1:1与约4:1之间的悬浮液。
可通过渗析来加工纳米颗粒组合物以除去乙醇并实现缓冲液交换。使用Slide-A-Lyzer盒(Thermo Fisher Scientific Inc.Rockford,IL)将制剂针对pH 7.4、体积为初产物200倍的磷酸盐缓冲盐水(PBS)透析两次，其中分子量截断是10kDa或20kDa。然后将制剂在4℃下透析过夜。将所得纳米颗粒悬浮液通过0.2μm无菌过滤器(Sarstedt,Nümbrecht,Germany)过滤到玻璃小瓶中并用卷边封闭物密封。通常获得0.01mg/ml至0.15mg/ml的纳米颗粒组合物溶液。
上述方法诱导纳米沉淀和颗粒形成。
替代方法(包括但不限于T-接合和直接注入)可用于实现相同的纳米沉淀。B.纳米颗粒组合物的表征
Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)可用于测定纳米颗粒组合物的粒度、多分散性指数(PDI)和δ电位，在1×PBS中测定粒度并且在15mM PBS中测定δ电位。
紫外-可见光谱可用于测定纳米颗粒组合物中circRNA的浓度。将100μL在1×PBS中的稀释制剂添加至900μL的甲醇与氯仿的4:1(v/v)混合物中。在混合后，例如在DU 800分光光度计(Beckman Coulter,Beckman Coulter,Inc.,Brea,CA)上在230nm与330nm之间记录溶液的吸收光谱。可基于纳米颗粒组合物中使用的circRNA的消光系数以及在例如260nm波长处的吸光度与在例如330nm波长处的基线值之间的差异来计算所述组合物中的circRNA的浓度。
可使用QUANT-ITTM
Figure BDA0003951010620006372
RNA测定(Invitrogen CorporationCarlsbad,CA)来评价纳米颗粒组合物对circRNA的包封。将样品在TE缓冲溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5)中稀释至大约5μg/mL或1μg/mL的浓度。将50μL的稀释样品转移至聚苯乙烯96孔板，并且将50μL的TE缓冲液或50μL的2％-4％ Triton X-100溶液添加至孔中。将板在37℃的温度下孵育15分钟。将
Figure BDA0003951010620006371
试剂在TE缓冲液中1:100或1:200稀释，并且将100μL的此溶液添加至每个孔中。可使用萦光板读取器(Wallac Victor1420Multilabel Counter；Perkin Elmer,Waltham,MA)在例如约480nm的激发波长和例如约520nm的发射波长下测量萦光强度。从每个样品的萦光值中减去试剂空白的萦光值，并且通过用完整样品(没有添加Triton X-100)的萦光强度除以分解样品(通过添加Triton X-100造成)的萦光值来确定游离circRNA的百分比。
体内制剂研究：
为了监测各种纳米颗粒组合物将circRNA递送至靶细胞的效率，制备了包含circRNA的不同纳米颗粒组合物并将其施用于啮齿动物群。向小鼠静脉内、肌肉内、动脉内或肿瘤内施用包括具有脂质纳米颗粒配方的纳米颗粒组合物的单一剂量。在一些情况下，可使小鼠吸入剂量。剂量大小可在0.001mg/kg至10mg/kg的范围内，其中10mg/kg描述对于每1kg小鼠体重在纳米颗粒组合物中包含10mg circRNA的剂量。也可使用包含PBS的对照组合物。
将纳米颗粒组合物施用于小鼠后，可通过酶联免疫吸附测定(ELISA)、生物发光成像或其他方法来测量特定制剂及其剂量的剂量递送曲线、剂量响应和毒性。还可评价蛋白质表达的时程。从啮齿动物中收集的用于评价的样品可包括血液和组织(例如，来自肌肉内注射部位的肌肉组织和内部组织)；样品采集可涉及动物的处死。
通过施用包含circRNA的组合物诱导的更高的蛋白质表达水平将指示更高的circRNA翻译和/或纳米颗粒组合物circRNA递送效率。由于认为非RNA组分本身不会影响翻译机制，因此较高的蛋白质表达水平可能指示相对于其他纳米颗粒组合物或所述纳米颗粒组合物不存在的情况，给定纳米颗粒组合物对circRNA的递送效率更高。
实施例27
纳米颗粒组合物的表征
Zetasizer Nano ZS(Malvern Instruments Ltd,Malvern,Worcestershire,UK)可用于测定转移媒介物组合物的粒度、多分散性指数(PDI)和δ电位，在1×PBS中测定粒度并且在15mM PBS中测定δ电位。
紫外-可见光谱法可用于测定转移媒介物组合物中治疗剂和/或预防剂(例如RNA)的浓度。将100μL在1×PBS中的稀释制剂添加至900μL的甲醇与氯仿的4:1(v/v)混合物中。在混合后，例如在DU 800分光光度计(Beckman Coulter,Beckman Coulter,Inc.,Brea,CA)上在230nm与330nm之间记录溶液的吸收光谱。可基于转移媒介物组合物中使用的治疗剂和/或预防剂的消光系数以及在例如260nm波长处的吸光度与在例如330nm波长处的基线值之间的差异来计算所述组合物中的治疗剂和/或预防剂的浓度。
对于包含RNA的转移媒介物组合物，可使用QUANT-ITTM
Figure BDA0003951010620006381
RNA测定(Invitrogen Corporation Carlsbad,CA)来评价转移媒介物组合物对RNA的包封。将样品在TE缓冲溶液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，pH 7.5)中稀释至大约5μg/mL或1μg/mL的浓度。将50μL的稀释样品转移至聚苯乙烯96孔板，并且将50μL的TE缓冲液或50μL的2％-4％Triton X-100溶液添加至孔中。将板在37℃的温度下孵育15分钟。将
Figure BDA0003951010620006391
试剂在TE缓冲液中1:100或1:200稀释，并且将100μL的此溶液添加至每个孔中。可使用萦光平板读取器(Wallac Victor 1420Multilablel Counter；Perkin Elmer,Waltham,MA)在例如约480nm的激发波长和例如约520nm的发射波长下测量萦光强度。从每个样品的萦光值中减去试剂空白的萦光值，
并且通过用完整样品(没有添加Triton X-100)的萦光强度除以分解样品(通过添加Triton X-100造成)的萦光值来确定游离RNA的百分比。
实施例28
T细胞靶向
为了使转移媒介物靶向T细胞，将T细胞抗原结合剂(例如抗CD8抗体)偶联至转移媒介物的表面。将抗T细胞抗原抗体在PBS中的EDTA存在下用过量的DTT轻度还原，以暴露游离铰链区硫醇。为了除去DTT，使抗体通过脱盐柱。异双功能交联剂SM(PEG)24用于将抗体锚定至负载circRNA的转移媒介物的表面(胺基存在于PEG脂质的头基中，抗体上的游离硫醇基团由DTT产生，SM(PEG)24使胺与硫醇基团之间交联)。将转移媒介物首先与过量的SM(PEG)24一起孵育并离心以除去未反应的交联剂。然后将激活的转移媒介物与过量的还原性抗T细胞抗原抗体一起孵育。使用离心过滤装置除去未结合的抗体。
实施例29
使用RV88的含RNA的转移媒介物。
在此实施例中，使用带有阳离子脂质RV88的2-D涡旋微流体芯片合成含有RNA的转移媒介物，以用于递送circRNA。
Figure BDA0003951010620006401
表32a
Figure BDA0003951010620006402
RV88、DSPC和胆固醇均在乙醇中以10mg/ml的浓度在硼硅小瓶中制备。脂质14:0-PEG2K PE也在硼硅玻璃小瓶中以4mg/ml的浓度制备。通过在乙醇中对脂质进行超声处理2分钟来使脂质在储备液浓度下溶解。然后将溶液在设置为170rpm的轨道倾斜振荡器上在37℃下加热10分钟。然后将小瓶在26℃下平衡至少45分钟。然后通过添加如表32b中所示体积的储备脂质来混合脂质。然后用乙醇调节溶液，使得最终脂质浓度是7.92mg/ml。
表32b
Figure BDA0003951010620006411
RNA被制备为含有75mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)和RNA浓度为1.250mg/ml的储备溶液。然后用pH 6.0的75mM柠檬酸盐缓冲液将RNA的浓度调节至0.1037mg/ml，平衡至26℃。然后将溶液在26℃下孵育至少25分钟。
将微流体室用乙醇清洗，并通过将注射器负载RNA溶液和另一个注射器负载乙醇脂质来制备neMYSIS注射泵。将两个注射器都在neMESYS软件的控制下负载。然后将溶液以2的水相与有机相比率和22ml/min的总流速(对于RNA 14.67ml/min，且对于脂质溶液7.33ml/min)施加至混合芯片上。两个泵同步启动。将从微流体芯片流动的混合器溶液以4x1 ml级分收集，其中第一级分作为废物丢弃。通过使用G-25微型脱盐柱将含有RNA脂质体的剩余溶液交换为pH 7.5的10mM Tris-HCl、1mM EDTA。缓冲液交换后，分别通过DLS分析和Ribogreen测定对材料的大小和RNA截留进行表征。
实施例30
使用RV94的含RNA的转移媒介物。
在此实施例中，使用带有阳离子脂质RV94的2-D涡旋微流体芯片合成含有RNA的脂质体，以用于递送circRNA。
Figure BDA0003951010620006421
表33
Figure BDA0003951010620006422
脂质如实施例29中使用表34中指定的材料量制备至7.92mg/ml的最终脂质浓度。
表34
Figure BDA0003951010620006423
circRNA的水溶液被制备为含有75mM柠檬酸盐缓冲液(pH 6.0)和circRNA浓度为1.250mg/ml的储备溶液。然后用pH 6.0的75mM柠檬酸盐缓冲液将RNA的浓度调节至0.1037mg/ml，平衡至26℃。然后将溶液在26℃下孵育至少25分钟。
将微流体室用乙醇清洗，并通过将注射器负载RNA溶液和另一个注射器负载乙醇脂质来制备neMYSIS注射泵。将两个注射器都在neMESYS软件的控制下负载。然后将溶液以2的水相与有机相比率和22ml/min的总流速(对于RNA 14.67ml/min，且对于脂质溶液7.33ml/min)施加至混合芯片上。两个泵同步启动。将从微流体芯片流动的混合器溶液以4x1 ml级分收集，其中第一级分作为废物丢弃。如上所述，通过使用G-25微型脱盐柱将含有circRNA转移媒介物的剩余溶液交换为pH 7.5的10mM Tris-HCl、1mM EDTA。缓冲液交换后，分别通过DLS分析和Ribogreen测定对材料的大小和RNA截留进行表征。脂质体的生物物理分析示于表35中。
表35
Figure BDA0003951010620006431
实施例31
用于在线混合的通用方案。
制备单独的且分开的储备溶液-一种含有脂质，并且另一种含有circRNA。通过溶解在90％乙醇中来制备含有所需脂质或脂质混合物、DSPC、胆固醇和PEG脂质的脂质储备液。剩余的10％是低pH柠檬酸盐缓冲液。脂质储备液的浓度是4mg/mL。这种柠檬酸盐缓冲液的pH可在介于pH 3与pH 5之间的范围内，取决于所使用的脂质的类型。circRNA也以4mg/mL浓度溶解在柠檬酸盐缓冲液中。制备5mL的每种储备溶液。
储备溶液是完全透明的，并且确保脂质在与circRNA合并之前完全溶解。可加热储备溶液以完全溶解脂质。所述过程中使用的circRNA可以是未经修饰的或经修饰的寡核苷酸，并且可与亲脂性部分如胆固醇缀合。
通过将每种溶液泵送至T形接头来将单独储备液合并。双头Watson-Marlow泵用于同时控制两个流的开始和停止。将1.6mm聚丙烯管进一步缩小至0.8mm管以增加线性流速。将聚丙烯线(ID＝0.8mm)连接至T型接头的任一侧。聚丙烯T的线性边缘为1.6mm，最终体积为4.1mm3。将聚丙烯线的每个大端(1.6mm)放入含有溶解的脂质储备液或溶解的circRNA的试管中。在T形接头之后，在合并流的出口处放置单根管。然后将管延伸至具有2x体积PBS的容器中，并快速搅拌。泵的流速设置为300rpm或110mL/min。通过透析除去乙醇并交换为PBS。然后使用离心或渗滤将脂质制剂浓缩至适当的工作浓度。
C57BL/6小鼠(Charles River Labs,MA)通过尾静脉注射接受盐水或配制的circRNA。在施用后的不同时间点，通过眶后取血收集血清样品。使用显色测定(BiophenFVTI,Aniara Corporation,OH)来测定样品中因子VII蛋白的血清水平。为了确定因子VII的肝RNA水平，将动物处死并收获肝，并在液氮中速冻。从冷冻组织制备组织裂解物，并使用分支DNA测定(QuantiGene Assay,Panomics,CA)对因子VII的肝RNA水平进行定量。
在C57BL/6小鼠中静脉内(推注)注射后48小时，在FVTI siRNA处理的动物中评价FVII活性。按照制造商的说明书在微孔板规模下，使用市售试剂盒测量FVII以用于确定血清或组织中的蛋白质水平。针对未处理的对照小鼠测定FVII减少，并且结果表示为残留FVII％。两种剂量水平(0.05和0.005mg/kg FVII siRNA)用于筛选每种新型脂质体组合物。
实施例32
使用预先形成的囊泡的circRNA制剂。
使用预先形成的囊泡法制备含有阳离子脂质的转移媒介物。将阳离子脂质、DSPC、胆固醇和PEG-脂质分别以40/10/40/10的摩尔比溶解于乙醇中。将脂质混合物添加至水性缓冲液(50mM柠檬酸盐，pH 4)中，混合至分别30％(体积/体积)和6.1mg/mL的最终乙醇和脂质浓度，并在挤出前在室温下平衡2分钟。在22℃下，使用Lipex挤出机(Northern Lipids,Vancouver,BC)将水合脂质通过两个堆叠的80nm孔径过滤器(Nuclepore)挤出，直到获得通过Nicomp分析确定的70-90nm的囊泡直径。对于不形成小囊泡的阳离子脂质混合物，用较低pH的缓冲液(50mM柠檬酸盐，pH 3)使脂质混合物水合以质子化DSPC头基上的磷酸基团有助于形成稳定的70-90nm囊泡。
将FVII circRNA(溶解在含有30％乙醇的50mM柠檬酸盐pH 4水溶液中)添加至囊泡中，在混合下以约5mL/min的速率预平衡至35℃。在达到0.06(wt wt)的最终目标circRNA/脂质比率后，将混合物在35℃下再孵育30分钟，以允许囊泡重组和FVIIRNA的包封。然后除去乙醇并通过透析或切向流渗滤用PBS(155mM NaCl、3mM Na2HP04、ImM KH2P04，pH 7.5)置换外部缓冲液。在使用尺寸排阻旋转柱或离子交换旋转柱除去未包封的RNA后，确定最终包封的circRNA与脂质比率。
实施例33
由工程化的环状RNA表达三特异性抗原结合蛋白
环状RNA被设计为包含：(1)3'剪接后I组内含子片段；(2)内部核糖体进入位点(IRES)；(3)三特异性抗原结合蛋白编码区；和(4)3'同源区。构建三特异性抗原结合蛋白区以产生示例性三特异性抗原结合蛋白，其将结合至靶抗原，例如GPC3。
scFv CD3结合结构域的产生
人CD3ε链规范序列是Uniprot登录号P07766。人CD3γ链规范序列是Uniprot登录号P09693。人CD3δ链规范序列是Uniprot登录号P043234。针对CD3ε、CD3γ或CD3δ的抗体是通过诸如亲和力成熟的已知技术产生的。在使用鼠抗CD3抗体作为起始材料的情况下，鼠抗CD3抗体的人源化在临床环境中是所需的，其中小鼠特异性残基可在接受本文所述的三特异性抗原结合蛋白的治疗的受试者中诱导人抗小鼠抗原(HAMA)应答。人源化是通过将来自鼠抗CD3抗体的CDR区移植到适当的人种系受体框架上来实现的，任选地包括对CDR和/或框架区的其他修饰。
因此，人或人源化抗CD3抗体用于产生三特异性抗原结合蛋白的CD3结合结构域的scFv序列。获得编码人或人源化VL和VH结构域的DNA序列，并且任选地针对在来自智人的细胞中的表达优化构建体的密码子。改变VL和VH结构域在scFv中出现的顺序(VL-VH或VH-VL取向)，并且“G4S”或“G4S”亚基(G4S)3的三个拷贝连接可变结构域以产生scFv结构域。抗CD3scFv质粒构建体可具有任选的Flag、His或其他亲和标签，并被电穿孔到HEK293或其他合适的人或哺乳动物细胞系中并进行纯化。验证测定包括通过FACS进行的结合分析、使用Proteon的动力学分析以及对表达CD3的细胞进行染色。
scFv磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)结合结构域的产生
磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3(GPC3)是存在于肝细胞癌但不存在于健康正常肝组织上的细胞表面蛋白之一。经常观察到它在肝细胞癌中升高，并且与HCC患者的预后不良相关。已知激活Wnt信号传导。已经产生了GPC3抗体，包括MDX-1414、HN3、GC33和YP7。
与上述产生与CD3的scFv结合结构域的方法类似，产生与GPC-3或另一靶抗原结合的scFv。
三特异性抗原结合蛋白的体外表达
使用CHO细胞表达***(Flp-
Figure BDA0003951010620006471
，Life Technologies)，其是CHO-K1中国仓鼠卵巢细胞(ATCC，CCL-61)的衍生物(Kao和Puck,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1968；60(4):1275-81)。根据由Life Technologies提供的标准细胞培养方案对贴壁细胞进行继代培养。
为了适应悬浮生长，使细胞从组织培养烧瓶脱离并置于无血清培养基中。将悬浮适应的细胞冷冻保存在含有10％ DMSO的培养基中。
稳定表达分泌的三特异性抗原结合蛋白的重组CHO细胞系是通过悬浮适应细胞的转染产生的。在使用抗生素潮霉素B进行选择期间，每周测量两次活细胞密度，并将细胞离心并以0.1×106个活细胞/mL的最大密度重新悬浮于新鲜选择培养基中。在选择2-3周后，此时将细胞转移至振荡烧瓶中的标准培养基，回收稳定表达三特异性抗原结合蛋白的细胞池。通过进行蛋白质凝胶电泳或流式细胞术来确认重组分泌蛋白的表达。将稳定细胞池冷冻保存在含有DMSO的培养基中。
三特异性抗原结合蛋白通过分泌到细胞培养上清液中，在稳定转染的CHO细胞系的10天补料分批培养物中产生。10天后，在培养活力通常>75％的情况下收获细胞培养上清液。每隔一天从生产培养物中收集样品并评估细胞密度和活力。在收获当天，在进一步使用前通过离心和真空过滤澄清细胞培养上清液。
通过SDS-PAGE分析细胞培养上清液中的蛋白质表达滴度和产物完整性。
三特异性抗原结合蛋白的纯化
以两步程序从CHO细胞培养上清液中纯化三特异性抗原结合蛋白。在第一步骤中对构建体进行亲和色谱，然后在第二步骤中在Superdex 200上进行制备型尺寸排阻色谱(SEC)。将样品进行缓冲液交换并通过超滤浓缩至>1mg/mL的典型浓度。在还原和非还原条件下通过SDS PAGE评估最终样品的纯度和同质性(通常>90％)，然后分别进行使用抗HSA或抗独特型抗体的免疫印迹以及分析型SEC。将纯化的蛋白质等分储存在-80℃直至使用。
实施例34
与没有半衰期延长结构相比，具有半衰期延长结构域的工程化环状RNA的表达改善了药代动力学参数
将实施例23的circRNA分子上编码的三特异性抗原结合蛋白以0.5mg/kg推注注射肌肉内施用于食蟹猴。另一个食蟹猴组接受在circRNA分子上编码的可比蛋白质，所述circRNA分子在大小上具有与CD3和GPC-3的结合结构域，但缺乏半衰期延长结构域。第三组和第四组分别接受编码在具有CD3和半衰期延长结构域结合结构域的circRNA分子上的蛋白质和具有GPC-3和半衰期延长结构域的蛋白质。由circRNA编码的两种蛋白质在大小上与三特异性抗原结合蛋白相当。每个测试组由5只猴子组成。在所指示的时间点采集血清样品，连续稀释，并使用与CD3和/或GPC-3的结合ELISA确定蛋白质的浓度。
使用测试物品血浆浓度进行药代动力学分析。当针对给药后时间作图时，每种测试物品的组平均血浆数据符合多指数曲线。数据通过标准两室模型拟合，所述模型具有用于分布和消除阶段的推注输入和一阶速率常数。用于静脉内施用的数据的最佳拟合的一般方程是：c(t)＝Ae～at+Be～pt，其中c(t)是时间t的血浆浓度，A和B是Y轴上的截距，并且a和β是分别为分布和消除阶段的表观一级速率常数。a阶段是清除的初始阶段，并且反映蛋白质在动物所有细胞外液中的分布，而衰减曲线的第二或β相部分代表真正的血浆清除。用于拟合此类方程的方法是本领域众所周知的。例如，A＝D/V(a-k21)/(a-p)，B＝D/V(p-k21)/(a-p)，并且a和β(对于α>β)是二次方程的根：r2+(k12+k21+k10)r+k21k10＝0，使用估计参数V＝分布容积，k10＝消除速率，k12＝从区室1至区室2的转移速率，k21＝从区室2至区室1的转移速率，并且D＝施用剂量。
数据分析：使用KaleidaGraph制成浓度对时间曲线的图(KaleidaGraphTMV.3.09Copyright 1986-1997.Synergy Software.Reading,Pa.)。报告为小于可报告(LTR)的值不包括在PK分析中，并且未以图形表示。药代动力学参数使用WinNonlin软件通过区室分析确定(
Figure BDA0003951010620006491
Professional V.3.1WinNonlinTM Copyright 1998-1999.Pharsight Corporation.Mountain View,Calif)。如Ritschel W A和Kearns G L,1999,EST:Handbook Of Basic Pharmacokinetics Including Clinical Applications,第5版,American Pharmaceutical Assoc.,Washington,D C.所描述计算药代动力学参数。
预期实施例23的circRNA分子上编码的三特异性抗原结合蛋白与缺乏半衰期延长结构域的蛋白质相比具有改善的药代动力学参数，如消除半衰期增加。
实施例35
三特异性抗原结合蛋白的细胞毒性
在体外评价在实施例23的circRNA分子上编码的三特异性抗原结合蛋白对针对GPC-3+靶细胞的T细胞依赖性细胞毒性的介导。
在实施例23的三特异性抗原结合蛋白存在下，将萦光标记的GPC3靶细胞与作为效应细胞的随机供体的分离的PBMC或T细胞一起孵育。在37℃下在湿润孵育箱中孵育4小时后，萦光染料从靶细胞释放到上清液中在分光萦光计中测定。在没有实施例23的三特异性抗原结合蛋白的情况下孵育的靶细胞和在孵育结束时通过添加皂苷完全裂解的靶细胞分别充当阴性对照和阳性对照。
基于测量的剩余活靶细胞，根据以下公式计算特异性细胞裂解的百分比：[1-(活靶标(样品)的数量/活靶标(自发)的数量)]×100％。S形剂量反应曲线和EC50值使用GraphPad软件通过非线性回归/4参数逻辑拟合计算。对于给定抗体浓度获得的裂解值用于通过使用Prism软件的4参数逻辑拟合分析计算S形剂量反应曲线。
实施例36
可电离脂质的合成
38.1((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯)(脂质27，表10a)和((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯))(脂质26，表10a)的合成
在与冷凝器连接的100mL圆底烧瓶中，将3-(1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(100mg，0.799mmol)或3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(0.799mmol)、2-己基癸酸6-溴己基酯(737.2mg，1.757mmol)、碳酸钾(485mg，3.515mmol)和碘化钾(13mg，0.08mmol)在乙腈(30mL)中混合，并将反应混合物加热至80℃持续48小时。将混合物冷却至室温并通过硅藻土垫过滤。将滤液用乙酸乙酯稀释。在用水、盐水洗涤并经无水硫酸钠干燥后。蒸发溶剂并通过快速色谱法(SiO2:CH2Cl2＝100％至10％的于CH2Cl2中的甲醇)纯化粗残余物，得到无色油状产物(92mg，15％)。((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯))的分子式是C50H95N3O4，并且分子量(Mw)是801.7。
((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)双(己烷-6,1-二基)双(2-己基癸酸酯))(脂质26，表10a)的反应方案。
Figure BDA0003951010620006511
脂质26的表征通过LC-MS进行。图27A-C示出脂质26的表征。图27A示出对于脂质26观察到的质子NMR。图27B是脂质26的代表性LC/MS曲线，示出总离子和UV色谱图。
38.2脂质22-S14的合成
38.2.1 2-(十四烷基硫代)乙-1-醇的合成
在25℃下向2-硫烷基乙醇(5.40g，69.11mmol，4.82mL，0.871当量)于乙腈(200mL)中的混合物添加1-溴十四烷(22g，79.34mmol，23.66mL，1当量)和碳酸钾(17.55g，126.95mmol，1.6当量)。将反应混合物温至40℃并搅拌12小时。TLC(乙酸乙酯/石油醚＝25/1，Rf＝0.3，通过I2染色)显示起始材料完全消耗，并产生了新的主要斑点。将反应混合物过滤，并将滤饼用乙腈(50mL)洗涤，然后将滤液在真空下浓缩，得到残余物，将所述残余物通过硅胶柱(乙酸乙酯/石油醚＝1/100至1/25)纯化，得到呈白色固体的2-(十四烷基硫代)乙-1-醇(14g，产率64.28％)。
1H NMR(ET36387-45-P1A,400MHz,氯仿-d)δ0.87-0.91(m,3H)1.27(s,20H)1.35-1.43(m,2H)1.53-1.64(m,2H)2.16(br s,1H)2.49-2.56(m,2H)2.74(t,J＝5.93Hz,2H)3.72(br d,J＝4.89Hz,2H)。图28示出相应的核磁共振(NMR)光谱。
38.2.2丙烯酸2-(十四烷基硫代)乙酯的合成
在0℃下在氮气下向2-(十四烷基硫代)乙-1-醇(14g，51.00mmol，1当量)于二氯甲烷(240mL)中的溶液逐滴添加三乙胺(7.74g，76.50mmol，10.65mL，1.5当量q)和丙-2-烯酰氯(5.54g，61.20mmol，4.99mL，1.2当量)。将反应混合物温至25℃并搅拌12小时。TLC(乙酸乙酯/石油醚＝25/1，Rf＝0.5，通过I2染色)显示起始材料完全消耗，并产生了新的主要斑点。将反应溶液在真空下浓缩，得到粗品，将所述粗品通过硅胶柱(乙酸乙酯/石油醚＝1/100至1/25)纯化，得到呈无色油状物的丙烯酸2-(十四烷基硫代)乙酯(12g，产率71.61％)。
1H NMR(ET36387-49-P1A,400MHz,氯仿-d)δ0.85-0.93(m,3H)1.26(s,19H)1.35-1.43(m,2H)1.53-1.65(m,2H)2.53-2.62(m,2H)2.79(t,J＝7.03Hz,2H)4.32(t,J＝7.03Hz,2H)5.86(dd,J＝10.39,1.47Hz,1H)6.09-6.19(m,1H)6.43(dd,J＝17.30,1.41Hz,1H)。图29示出相应的核磁共振(NMR)光谱。
38.2.3双(2-(十四烷基硫代)乙基)3,3'-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)二丙酸酯(脂质22-S14)的合成
向烧瓶中装入3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(300mg，2.16mmol)和丙烯酸2-(十四烷基硫代)乙酯(1.70g，5.17mmol)。将纯净的反应混合物加热至80℃并搅拌48小时。TLC(乙酸乙酯，Rf＝0.3，通过I2染色，添加一滴氢氧化铵)显示起始材料完全消耗，并且形成了新的主要斑点。将反应混合物用二氯甲烷(4mL)稀释并通过硅胶柱(石油醚/乙酸乙酯＝3/1至0/1，添加0.1％氢氧化铵)纯化，得到呈无色油状物的双(2-(十四烷基硫代)乙基)3,3'-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)二丙酸酯(501mg，产率29.1％)。
1H NMR(ET36387-51-P1A,400MHz，氯仿-d)δ0.87(t,J＝6.73Hz,6H)1.25(s,40H)1.33-1.40(m,4H)1.52-1.61(m,4H)1.81-1.90(m,2H)2.36(s,3H)2.39-2.46(m,6H)2.53(t,J＝7.39Hz,4H)2.70-2.78(m,8H)3.84(t,J＝7.17Hz,2H)4.21(t,J＝6.95Hz,4H)6.85(s,1H)6.89(s,1H)。图30示出相应的核磁共振(NMR)光谱。
38.3双(2-(十四烷基硫代)乙基)3,3'-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)二丙酸酯(脂质93-S14)的合成
向烧瓶中装入3-(1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(300mg，2.40mmol，1当量)和丙烯酸2-(十四烷基硫代)乙酯(1.89g，5.75mmol，2.4当量)。将纯净的反应混合物加热至80℃并搅拌48小时。TLC(乙酸乙酯，Rf＝0.3，通过I2染色，添加一滴氢氧化铵)显示起始材料完全消耗，并且形成了新的主要斑点。将反应混合物用二氯甲烷(4mL)稀释并通过硅胶柱(石油醚/乙酸乙酯＝1/20-0/100，添加0.1％氢氧化铵)纯化，得到呈无色油状物的双(2-(十四烷基硫代)乙基)3,3'-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)氮烷二基)二丙酸酯(512mg，产率27.22％)。
1H NMR(ET36387-54-P1A,400MHz,氯仿-d)δ0.89(t,J＝6.84Hz,6H)1.26(s,40H)1.34-1.41(m,4H)1.58(br t,J＝7.50Hz,4H)1.92(t,J＝6.62Hz,2H)2.36-2.46(m,6H)2.55(t,J＝7.50Hz,4H)2.75(q,J＝6.84Hz,8H)3.97(t,J＝6.95Hz,2H)4.23(t,J＝6.95Hz,4H)6.95(s,1H)7.06(s,1H)7.51(s,1H)。图31示出相应的核磁共振(NMR)光谱。
38.4 8-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(脂质54，表10a)的合成
38.4.1 8-溴辛酸壬酯(3)的合成
Figure BDA0003951010620006541
向8-溴辛酸(2)(18.6g，83.18mmol)和壬-1-醇(1)(10g，69.32mmol)于CH2Cl2(500mL)中的混合物添加DMAP(1.7g，13.86mmol)、DIPEA(48mL，277.3mmol)和EDC(16g，83.18mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。在浓缩反应混合物后，将粗残余物溶解在乙酸乙酯(500mL)中，用1N HCl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂，并将粗残余物通过快速色谱法(SiO2:己烷＝100％至30％的于己烷中的EtOAc)纯化，得到无色油状产物3(9g，37％)。
38.4.2 8-溴辛酸十七烷-9-基酯(5)的合成
Figure BDA0003951010620006542
向8-溴辛酸(2)(10g，44.82mmol)和十七烷-9-醇(4)(9.6g，37.35mmol)于CH2Cl2(300mL)中的混合物添加DMAP(900mg，7.48mmol)、DIPEA(26mL，149.7mmol)和EDC(10.7g，56.03mmol)。将反应物在室温下搅拌过夜。在浓缩反应混合物后，将粗残余物溶解在乙酸乙酯(300mL)中，用1N HCl、饱和NaHCO3、水和盐水洗涤。将有机层经无水Na2SO4干燥。蒸发溶剂，并将粗残余物通过快速色谱法(SiO2:己烷＝100％至30％的于己烷中的EtOAc)纯化，并且得到无色油状产物5(5g，29％)。
38.4.3 8-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(7)的合成
Figure BDA0003951010620006551
在与冷凝器连接的100mL圆底烧瓶中，将8-溴辛酸十七烷-9-基酯(5)(860mg，1.868mmol)和3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙-1-胺(6)(1.3g，9.339mmol)在乙醇(10mL)中混合。将反应混合物加热至回流过夜。MS(APCI)显示预期产物。将混合物冷却至室温并浓缩。将粗残余物通过快速色谱法(SiO2:CH2Cl2＝100％至10％的甲醇+1％NH4OH于CH2Cl2中)纯化，并且得到无色油状产物7(665mg，69％)。
38.4.4 8-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(脂质54，表10a)的合成
Figure BDA0003951010620006552
在与冷凝器连接的100mL圆底烧瓶中，将8-((3-(2-甲基-1H-咪唑-1-基)丙基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(7)(665mg，1.279mmol)和8-溴辛酸壬酯(3)(536mg，1.535mmol)在乙醇(10mL)中混合，然后添加DIPEA(0.55mL，3.198mmol)。将反应混合物加热至回流过夜。MS(APCI)和TLC(10％MeOH+1％NH4OH于CH2Cl2中)两者均显示产物和一些未反应的起始材料。将混合物冷却至室温并浓缩。将粗残余物通过快速色谱法(SiO2:CH2Cl2＝100％至10％的甲醇+1％NH4OH于CH2Cl2中)纯化，并且得到无色油状物(170mg，17％)。
38.5 8-((3-(1H-咪唑-1-基)丙基)(8-(壬基氧基)-8-氧代辛基)氨基)辛酸十七烷-9-基酯(脂质53，表10a)的合成
Figure BDA0003951010620006561
来自表10a的脂质53根据上述方案合成。除了3-(1H-咪唑-1-基)丙-1-胺作为咪唑胺之外，反应条件与脂质54相同。
实施例37
含有环状RNA的脂质纳米颗粒制剂
脂质纳米颗粒(LNP)是使用带有“NextGen”混合室的Precision NanosystemsIgnite仪器形成的。将含有16:1:4:1重量比或62:4:33:1摩尔比的来自表10a的可电离脂质26、DSPC、胆固醇和DSPE-PEG2000(Avanti Polar Lipids Inc.)的乙醇相与含有环状RNA和25mM乙酸钠缓冲液(pH 5.2)的水相合并。使用3:1的水性与乙醇混合比。然后将配制的LNP在1L水中透析，并在18小时内交换2次。使用0.2μm过滤器过滤透析的LNP。在体内给药之前，将LNP在PBS中稀释。LNP大小通过动态光散射确定。使用Malvern Panalytical ZetasizerPro测量在PBS(pH 7.4)中含有1mL的20μg/mL LNP的比色皿的Z平均值。记录Z平均值和多分散性指数。
39.1来自表10a的脂质26和27的制剂
脂质纳米颗粒(LNP)是使用带有“NextGen”混合室的Precision NanosystemsIgnite仪器形成的。将含有16:1:4:1重量比或62:4:33:1摩尔比的来自表10a的可电离脂质26或脂质27、DOPE、胆固醇和DSPE-PEG 2000(Avanti Polar Lipids Inc.)的乙醇相与含有环状RNA和25mM乙酸钠缓冲液(pH 5.2)的水相合并。使用3:1的水性与乙醇混合比。然后将配制的LNP在1L水中透析，并在18小时内交换2次。使用0.2μm过滤器过滤透析的LNP。在体内给药之前，将LNP在PBS中稀释。LNP大小通过动态光散射确定。使用Malvern PanalyticalZetasizer Pro测量在PBS(pH 7.4)中含有1mL的20μg/mL LNP的比色皿的Z平均值。记录Z平均值和多分散性指数。
39.2来自表10a的脂质53和54的制剂
脂质纳米颗粒(LNP)是使用带有“NextGen”混合室的Precision NanosystemsIgnite仪器形成的。将含有50:10:38.5:1.5摩尔比的表10a的可电离脂质53或54、DOPE、胆固醇和DSPE-PEG 2000(Avanti Polar Lipids Inc.)的乙醇相与含有环状RNA和25mM乙酸钠缓冲液(pH 5.2)的水相合并。使用3:1的水性与乙醇混合比。然后将配制的LNP在1L的1xPBS中透析，并在18小时内交换2次。使用0.2μm过滤器过滤透析的LNP。在体内给药之前，将LNP在PBS中稀释。LNP大小通过动态光散射确定。使用Malvern Panalytical ZetasizerPro测量在PBS(pH 7.4)中含有1mL的20μg/mL LNP的比色皿的Z平均值。记录Z平均值和多分散性指数。
使用Malvern Panalytical Zetasizer Pro测量LNPδ电位。将含有200μL颗粒水溶液和800μL不含RNA酶的蒸馏水(最终颗粒浓度为400μg/mL)的混合物负载至zetasizer毛细管单元中进行分析。
使用Ribogreen测定确定RNA包封。将纳米颗粒溶液在三乙二胺四乙酸(TE)缓冲液中稀释，理论oRNA浓度为2μg/mL。制备范围为2μg/mL至0.125μg/mL的在TE缓冲液中稀释的标准oRNA溶液。将颗粒和标准品添加至所有孔中，并进行第二次孵育(37℃以350rpm持续3分钟)。使用
Figure BDA0003951010620006582
GEMINI XS微板萦光光谱仪测量萦光。使用标准曲线计算每种颗粒溶液中环状RNA的浓度。从在裂解的与未裂解的颗粒之间检测到的oRNA的比率计算包封效率。
表36a.LNP的表征
Figure BDA0003951010620006581
表36b.LNP的表征
可电离脂质 Z平均值(nm) PDI RNA截留(％)
22-S14 64 0.05 97
93-S14 74 0.04 95
脂质26，表10a 84 0.04 96
实施例38
体内分析
将22-25g范围内的雌性CD-1或雌性c57BL/6J小鼠以0.5mg/kg RNA静脉内给药。注射后6小时，向小鼠腹膜内注射200μL浓度为15mg/mL的D-萦光素。注射后5分钟，使用异氟烷麻醉小鼠，并将小鼠背侧朝上置于IVIS谱体内成像***(Perkin Elmer)内。脂质22-S14、93-S14、脂质26(表10a)的全身总IVIS通量呈现于图32A中。注射10分钟后，扫描小鼠的发光。将小鼠安乐死，并在注射萦光素后25分钟内取出器官，以扫描肝、脾、肾、肺和心脏中的发光。使用Living Images(Perkin Elmer)软件分析图像(图33A-B、34A-B、35A-B)。绘制目标区域以获得通量和平均辐射度并分析蛋白质表达的生物分布(图32A-B)。
图32A示出与用脂质22-S14和93-S14制成的LNP相比，从具有脂质26(表10a)LNP的萦光素酶oRNA观察到的全身总通量增加。图32B示出组织的离体IVIS分析进一步突出显示在脂质26(表10a)情况下总体表达增加，同时保持在脂质22-S14和93-S14情况下观察到的所需脾肝比，尽管具有被设计用于改善表达的显著结构变化。与先前报告的脂质相比，这些数据突出显示由脂质26(表10a)提供的改进。
如上所述的类似分析也用包封在用来自表10b的脂质15或来自表10a的脂质53或54形成的LNP中的oRNA进行。图36A-C示出组织的离体IVIS分析，分别突出显示在脂质15、53和54情况下的总体表达，同时保持所需的脾肝比，尽管具有被设计用于改善表达的显著结构变化。图36D示出PBS对照的结果。这些数据证明与先前报告的脂质如93-S14和22-S14相比，由来自表10a的脂质15、53和54提供的改进。
实施例39
萦光素酶的递送
用包封萤火虫萦光素酶(f.luc)环状RNA的脂质纳米颗粒(LNP)转染人外周血单核细胞(PBMC)(Stemcell Technologies)，并检查萦光素酶表达。将来自两个不同供体的PBMC与五种不同的LNP组合物在体外在37℃下在RPMI、2％人血清、IL-2(10ng/mL)和50uM BME中孵育，所述组合物含有编码萤火虫萦光素酶的环状RNA(200ng)。在没有LNP的情况下孵育的PBMC用作阴性对照。24小时后，裂解细胞并基于生物发光(Promega BrightGlo)分析萤火虫萦光素酶表达。
代表性数据呈现于图37A和37B中，表明所测试的LNP能够将环状RNA递送至原代人类免疫细胞中，从而产生蛋白质表达。
实施例40
绿色萦光蛋白(GFP)或嵌合抗原受体(CAR)的体外递送
用包封GFP的LNP转染人PBMC(Stemcell Technologies)并通过流式细胞术进行检查。将来自五个不同供体的PBMC(PBMC A-E)与一种LNP组合物在体外在37℃下在RPMI、2％人血清、IL-2(10ng/mL)和50uM BME中孵育，所述组合物含有编码GFP或CD19-CAR的环状RNA(200ng)。在没有LNP的情况下孵育的PBMC用作阴性对照。在LNP孵育24、48或72小时后，分析细胞的CD3、CD19、CD56、CD14、CD11b、CD45、可固定活死和有效负载(GFP或CD19-CAR)。
代表性数据呈现于图38A和38B中，表明所测试的LNP能够将环状RNA递送至原代人类免疫细胞中，从而产生蛋白质表达。
实施例41
多种IRES变体可在体外介导鼠CD19 CAR的表达
编码抗鼠CD19 CAR的多种环状RNA构建体含有独特的IRES序列，并被脂转染到1C1C7细胞系中。在脂转染之前，将1C1C7细胞在完全RPMI中扩增数天。一旦细胞扩增至合适的数量，就用四种不同的环状RNA构建体对1C1C7细胞进行脂转染(Invitrogen RNAiMAX)。24小时后，将1C1C7细胞与His标记的重组鼠CD19(Sino Biological)蛋白一起孵育，然后用第二抗His抗体染色。之后，通过流式细胞仪对细胞进行分析。
代表性数据呈现于图39中，表明源自所指示病毒(黑线姬鼠小核糖核酸病毒、山羊嵴病毒、parabovirus和萨力病毒)的IRES能够驱动抗小鼠CD19 CAR在鼠T细胞中的表达。
实施例42
小鼠CD19 CAR在体外介导肿瘤细胞杀伤
将编码抗小鼠CD19 CAR的环状RNA电穿孔到鼠T细胞中以评估CAR介导的细胞毒性。对于电穿孔，使用ThermoFisher的Neon转染***用编码抗小鼠CD19 CAR的环状RNA对T细胞进行电穿孔，然后静置过夜。对于细胞毒性测定，将电穿孔的T细胞与Fluc+靶细胞和非靶细胞以1:1的比例在含有10％ FBS、IL-2(10ng/mL)和50uM BME的完全RPMI中共培养，并在37℃下孵育过夜。在共培养后24小时使用萦光素酶测定***(Promega Brightglo萦光素酶***)测量细胞毒性，以检测Fluc+靶细胞和非靶细胞的裂解。所示的值是相对于未转染的模拟信号计算的。
代表性数据呈现于图40中，表明从环状RNA表达的抗小鼠CD19CAR在体外在鼠T细胞中是功能性的。
实施例43
用脂质包封的编码鼠CD19 CAR的环状RNA对B细胞的功能耗减
向C57BL/6J小鼠注射由表10b中的脂质15形成的LNP，所述LNP包封编码抗鼠CD19CAR的环状RNA。作为对照，将包封编码萤火虫萦光素酶(f.Luc)的环状RNA的表10b中的脂质15注射到不同组的小鼠中。每隔一天向20-25g范围内的雌性C57BL.6J静脉内注射5个剂量的0.5mg/kg LNP。在注射之间，通过流式细胞术分析抽血的可固定活/死、CD45、TCRvb、B220、CD11b和抗鼠CAR。最后一次注射后两天，收集脾并进行流式细胞术分析。将脾细胞用可固定活/死、CD45、TCRvb、B220、CD11b、NK1.1、F4/80、CD11c和抗鼠CAR染色。将来自注射抗鼠CD19 CAR LNP的小鼠的数据针对接受f.Luc LNP的小鼠归一化。
代表性数据呈现于图41A、41B和41C中，表明由用LNP体内递送的环状oRNA表达的抗小鼠CD19 CAR在体内鼠T细胞中是功能性的。
实施例44
与由mRNA表达相比，由环状RNA表达的CD19 CAR具有更高产率和更大细胞毒作用
将编码抗CD19嵌合抗原抗原受体的环状RNA电穿孔到人外周T细胞中以评估表面表达和CAR介导的细胞毒性，所述环状RNA从N末端至C末端包含FMC63来源的scFv、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3δ细胞内结构域。为了比较，在此实验中将环状RNA电穿孔的T细胞与mRNA电穿孔的T细胞进行了比较。对于电穿孔，使用来自供体人PBMC的市售T细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)从人PBMC中分离CD3+T细胞。分离后，将T细胞用抗CD3/抗CD28(Stemcell Technologies)刺激，并在5天内在37℃下在含有10％ FBS、IL-2(10ng/mL)和50uM BME的完全RPMI中扩增。刺激后五天，使用ThermoFisher的Neon转染***用编码抗人CD19 CAR的环状RNA对T细胞进行电穿孔，然后静置过夜。对于细胞毒性测定，将电穿孔的T细胞与Fluc+靶细胞和非靶细胞以1:1的比例在含有10％ FBS、IL-2(10ng/mL)和50uMBME的完全RPMI中共培养，并在37℃下孵育过夜。在共培养后24小时使用萦光素酶测定***(Promega Brightglo萦光素酶***)测量细胞毒性，以检测Fluc+靶细胞和非靶细胞的裂解。此外，取得电穿孔的T细胞的等分试样并在分析当天针对活死可固定染色、CD3、CD45和嵌合抗原受体(FMC63)进行染色。
代表性数据呈现于图42和43中。图42A和42B示出与由线性mRNA表达的抗人CD19CAR相比，由环状RNA表达的抗人CD19 CAR以更高水平和更长时间表达。图43A和43B示出相对于由线性mRNA表达的抗人CD19 CAR，由环状RNA表达的抗人CD19 CAR发挥更大的细胞毒性作用。
实施例45
来自单个环状RNA的两个CAR的功能表达
将编码嵌合抗原受体的环状RNA电穿孔到人外周T细胞中，以评估表面表达和CAR介导的细胞毒性。此研究的目的是评估编码两个CAR的环状RNA是否能够用2A(P2A)或IRES序列随机表达。对于电穿孔，CD3+T细胞是商购的(Cellero)并用抗CD3/抗CD28(StemcellTechnologies)刺激，并在5天内在37℃下在含有10％ FBS、IL-2(10ng/mL)和50uM BME的完全RPMI中扩增。刺激后4天，使用ThermoFisher的Neon转染***用编码抗人CD19 CAR、抗人CD19 CAR-2A-抗人BCMA CAR和抗人CD19 CAR-IRES-抗人BCMA CAR的环状RNA对T细胞进行电穿孔，然后静置过夜。对于细胞毒性测定，将电穿孔的T细胞与表达人CD19或BCMA抗原的Fluc+K562细胞以1:1的比例在含有10％ FBS、IL-2(10ng/mL)和50uMBME的完全RPMI中共培养，并在37℃下孵育过夜。在共培养24小时后使用萦光素酶测定***(Promega BrightGlo萦光素酶***)测量细胞毒性，以检测Fluc+靶细胞的裂解。
代表性数据呈现于图44中，表明两个CAR可由同一环状RNA构建体功能性表达并发挥细胞毒性效应子功能。
实施例46
使用Cre报告小鼠进行体内环状RNA转染
如前所述，将编码Cre重组酶(Cre)的环状RNA包封到脂质纳米颗粒中。向雌性6-8周龄B6.Cg-Gt(ROSA)26Sortm9(CAG-tdTomato)Hze/J(Ai9)小鼠静脉内给予0.5mg/kg RNA的脂质纳米颗粒。在Cre重组后，萦光tdTomato蛋白在Ai9小鼠中转录和翻译，这意味着环状RNA已被递送至tdTomato+细胞并在其中翻译。48小时后，将小鼠安乐死并收获脾，加工成单细胞悬液，并用各种萦光团缀合的抗体染色，以通过流式细胞术进行免疫表型分析。
图45A示出在用由来自表10a的脂质27或26或来自表10b的脂质15形成的LNP处理后，在各种脾免疫细胞(CD45+，活)亚群，包括总骨髓细胞(CD11b+)、B细胞(CD19+)和T细胞(TCR-B+)中tdTomato表达的频率的代表性FACS图。注射PBS的Ai9小鼠代表背景tdTomato萦光。图45B定量表达tdTomato的骨髓细胞、B细胞和T细胞的比例(平均值+标准偏差，n＝3)，这相当于已用Cre环状RNA成功转染的每个细胞群的比例。与脂质93-S14相比，用来自表10a的脂质27和26制成的LNP表现出显著更高的骨髓细胞和T细胞转染，从而突出显示由脂质结构修饰赋予的改进。
图45C示出在来自表10a的脂质27和26情况下表达tdTomato的另外脾免疫细胞群的比例(平均值+标准偏差，n＝3)，所述脾免疫细胞群还包括NK细胞(NKp46+，TCR-B-)、经典单核细胞(CD11b+、Ly-6G-、Ly-6C_hi)、非经典单核细胞(CD11b+、Ly-6G-、Ly-6C_lo)、嗜中性粒细胞(CD11b+、Ly-6G+)和树突细胞(CD11c+、MHC-II+)。这些实验证明，用来自表10a的脂质27和26以及来自表10b的脂质15制成的LNP可有效地将环状RNA递送至小鼠中的许多脾免疫细胞亚群，并在这些细胞中产生来自环状RNA的成功蛋白质表达。
实施例47
实施例47A：内置多聚A序列和亲和纯化以产生免疫沉默环状RNA
将多聚A序列(20-30nt)***RNA构建体(内含子中具有内置多聚A序列的前体RNA)的5'和3'端。前体RNA和内含子能够可替代地使用例如大肠杆菌多聚A聚合酶或酵母多聚A聚合酶进行转录后多腺苷酸化，其需要使用额外的酶。
将此实施例中的环状RNA通过体外转录(IVT)进行环化，并通过在市售oligo-dT树脂上洗涤进行亲和纯化，以从剪接反应中选择性地除去多聚A标记的序列(包括游离内含子和前体RNA)。IVT使用商业IVT试剂盒(New England Biolabs)或定制IVT混合物(OrnaTherapeutics)进行，含有不同比例的单磷酸鸟苷(GMP)和三磷酸鸟苷(GTP)(GMP:GTP＝8、12.5或13.75)。在一些实施方案中，高GMP:GTP比率下的GMP可优选作为第一核苷酸包括在内，从而产生大部分单磷酸加帽的前体RNA。作为比较，环状RNA产物可替代地通过用Xrn1、Rna酶R和Dna酶I处理进行纯化(酶纯化)。
然后评估使用亲和纯化或酶纯化过程制备的环状RNA的免疫原性。简言之，将制备的环状RNA转染到A549细胞中。24小时后，裂解细胞并通过qPCR测量相对于模拟样品的干扰素β-1诱导。3p-hpRNA(一种三磷酸化的RNA)用作阳性对照。
图46B和46C示出，当多聚A序列包含于在剪接过程中被除去并存在于未剪接的前体分子中的元件上时，阴性选择亲和纯化从剪接反应中除去非环状产物。图46D示出用所测试的IVT条件和纯化方法制备的环状RNA都是免疫静止的。这些结果表明阴性选择亲和纯化等效于或优于用于环状RNA纯化的酶纯化，并且定制环状RNA合成条件(IVT条件)可减少对GMP过量的依赖以实现最大免疫静止。
实施例47B：用于环状RNA产生的专用结合位点和亲和纯化代替多聚A标签，可包括专门设计序列(DBS，专用结合位点)。
代替多聚A标签，专用结合位点(DBS)，如专门设计的可与树脂结合的互补寡核苷酸，可用于选择性地耗减前体RNA和游离内含子。在此实施例中，将DBS序列(30nt)***前体RNA的5'和3'端。将RNA转录，并将转录产物在与树脂连接的定制互补寡核苷酸上洗涤。
图47B和47C证明，通过阴性亲和纯化，将设计的DBS序列包含于在剪接过程中除去的元件中能够在剪接反应中除去未剪接的前体RNA和游离内含子组分。
实施例47C：编码肌营养不良蛋白的环状RNA的产生
通过RNA前体的体外转录产生编码肌营养不良蛋白的12kb 12,000nt环状RNA，然后使用Xrn1、DNA酶1和RNA酶R的混合物进行酶纯化，以降解剩余的线性组分。图48示出成功地产生了编码肌营养不良蛋白的环状RNA。
实施例48
3'内含子片段与IRES之间的5'间隔区改善环状RNA表达
比较了Jurkat细胞中在3'内含子片段与IRES之间具有不同5'间隔区的纯化circRNA的表达水平。简言之，在用250ng的每种RNA对60,000个细胞进行电穿孔后24小时测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光。
此外，比较了Jurkat细胞中在3'内含子片段与IRES之间具有不同5'间隔区的纯化circRNA的稳定性。简言之，在用250ng的每种RNA对60,000个细胞进行电穿孔后2天内测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光，并针对第1天表达归一化。
结果显示在图49A和49B中，表明添加间隔区可增强IRES功能以及添加的间隔区的序列同一性和长度的重要性。一种可能的解释是，间隔区是在IRES之前添加的，并且可能通过允许IRES与其他结构化元件(如内含子片段)隔离折叠来发挥作用。
实施例49
此实施例描述来自山羊嵴病毒IRES的5'或3'端的缺失扫描。IRES边界通常较差表征并且需要经验分析，并且此实施例可用于定位驱动翻译所需的核心功能序列。简言之，用可操作地连接至高斯萦光素酶编码序列的截短IRES元件产生环状RNA构建体。截短的IRES元件从5'或3'端除去指定长度的核苷酸序列。在用RNA对原代人T细胞进行电穿孔后24和48小时测量上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光。表达稳定性被计算为48小时时间点的表达水平相对于24小时时间点的表达水平的比率。
如图50所示，从IRES的5'端缺失超过40个核苷酸降低了表达并破坏了IRES功能。表达的稳定性相对不受IRES元件截短的影响，但表达水平因从IRES的3'端缺失141个核苷酸的而显著降低，而从3'端缺失57或122个核苷酸对表达水平具有积极影响。
还观察到起始序列前6核苷酸的缺失降低了萦光素酶报告基因的表达水平。用经典kozak序列(GCCACC)替代6核苷酸序列没有显著影响，但至少维持了表达。
实施例50
此实施例描述选定IRES序列，包括山羊嵴病毒(CKV)IRES、Parabovirus IRES、姬鼠小核糖核酸病毒(AP)IRES、嵴病毒SZAL6 IRES、Crohivirus B(CrVB)IRES、CVB3 IRES和SAFV IRES的修饰(例如，截短)。IRES元件的序列提供在SEQ ID NO:348-389中。简言之，用可操作地连接至高斯萦光素酶编码序列的截短IRES元件产生环状RNA构建体。用环状RNA转染HepG2细胞。在转染后24和48小时评估上清液中的发光。表达稳定性被计算为48小时时间点的表达水平相对于24小时时间点的表达水平的比率。
如图51所示，截短取决于IRES的身份具有可变影响，这可能取决于起始机制和用于翻译的蛋白质因子，这在IRES之间通常不同。例如，在CKV IRES的背景下，可有效地组合5'和3'缺失。在一些情况下添加规范Kozak序列显著改善了表达(如在SAFV中，Full对比Full+K)或减少了表达(如在CKV中，5d40/3d122对比5d40/3d122+K)。
实施例51
此实施例描述CK-739、AP-748和PV-743IRES序列的修饰，包括突变替代翻译起始位点。简言之，用可操作地连接至高斯萦光素酶编码序列的经修饰的IRES元件产生环状RNA构建体。在用RNA转染1C1C7细胞后24和48小时测量上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光。
CUG是最常见的替代起始位点，但也表征了许多其他替代起始位点。这些三联体可存在于起始密码子之前的IRES扫描束中，并且可影响正确多肽的翻译。产生了四个替代起始位点突变，IRES序列提供于SEQ ID NO:378-380中。如图52所示，CK-739IRES中替代翻译起始位点的突变影响正确多肽的翻译，在一些情况下是积极的，并且在其他情况下是消极的。所有替代翻译起始位点的突变降低了翻译水平。
起始密码子之前6个核苷酸的替代Kozak序列也可影响表达水平。在CK-739IRES和“6nt起始前”组的样品编号1-5中，起始密码子上游的6个核苷酸的序列分别是gTcacG、aaagtc、gTcacG、gtcatg、gcaaac和acaacc。如图52所示，取代起始密码子之前的某些6核苷酸序列影响翻译。
还观察到AP-748和PV-743IRES序列中的5'和3'末端缺失降低了表达。然而，在具有长扫描束的CK-739IRES中，翻译相对不受扫描束中的缺失影响。
实施例52
此实施例描述通过***5'和/或3'非翻译区(UTR)并产生IRES杂合体来修饰选定IRES序列。简言之，用可操作地连接至高斯萦光素酶编码序列的经修饰的IRES元件产生环状RNA构建体。在用RNA转染HepG2细胞后24和48小时测量上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光。
具有***的UTR的IRES序列提供于SEQ ID NO:390-401中。如图53所示，在IRES的3'端之后和起始密码子之前***5'UTR略微增加了山羊嵴病毒(CK)IRES的翻译，但在一些情况下消除了萨力病毒SZ1 IRES的翻译。在终止盒之后***3'UTR对两个IRES序列没有影响。
杂合CK IRES序列提供于SEQ ID NO:390-401中。CK IRES用作碱基，并且CK IRES的特定区域被来自其他IRES序列的相似结构，例如SZ1和AV(爱知病毒)替代。如图53所示，某些杂合合成IRES序列是功能性的，表明可使用来自不同IRES序列的部分构建杂合IRES，所述IRES序列显示相似的预测结构，而缺失除这些结构会完全消除IRES功能。
实施例53
此实施例描述通过引入终止密码子或盒变体来修饰环状RNA。简言之，产生了具有可操作地连接至高斯萦光素酶编码序列、随后可变终止密码子盒的IRES元件的环状RNA构建体，其包括每个框架中的终止密码子和高斯萦光素酶编码序列的阅读框架中的两个终止密码子。用环状RNA转染1C1C7细胞。在转染后24和48小时评估上清液中的发光。
终止密码子盒的序列列于SEQ ID NO:406-412中。如图54所示，某些终止密码子盒提高了表达水平，尽管它们对表达稳定性几乎没有影响。特别地，具有两个框架1(高斯萦光素酶编码序列的阅读框)终止密码子，第一个是TAA、随后是框架2终止密码子和框架3终止密码子的终止盒对于促进功能性翻译是有效的。
实施例54
此实施例描述通过***5'UTR变体对环状RNA的修饰。简言之，产生了具有在IRES的3'端与起始密码子之间***了5'UTR变体的IRES元件的环状RNA构建体，IRES可操作地连接至高斯萦光素酶编码序列。用环状RNA转染1C1C7细胞。在转染后24和48小时评估上清液中的发光。
5’UTR变体的序列列于SEQ ID NO:402-405中。如图55所示，当添加36个核苷酸的非结构化/低GC间隔区序列(UTR2)时，具有规范Kozak序列(UTR4)的CK IRES更有效，表明富含GC的Kozak序列可干扰核心IRES折叠。使用具有kozak序列的更高GC/结构化间隔区未显示出相同的益处(UTR3)，可能是由于间隔区本身对IRES折叠的干扰。将kozak序列突变为gTcacG(UTR1)使翻译增强至与Kozak+spacer替代方案相同的水平，而无需间隔区。
实施例55
此实施例描述环状RNA中的miRNA靶位点对表达水平的影响。简言之，产生了具有与人***(hEPO)编码序列可操作地连接的IRES元件的环状RNA构建体，其中将2个串联miR-122靶位点***所述构建体中。用环状RNA转染表达miR-122的Huh7细胞。在转染后24和48小时通过夹心ELISA评估上清液中的hEPO表达。
如图56所示，当miR-122靶位点***环状RNA时，hEPO表达水平被消除。此结果表明可通过miRNA调控来自环状RNA的表达。因此，细胞类型或组织特异性表达可通过并入在重组蛋白表达不合乎需要的细胞类型中表达的miRNA的靶位点来实现。
实施例56
实施例56A：来自含有2A位点的一种circRNA的两种蛋白质的表达和功能RNA稳定性。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、不同IRES、编码高斯萦光素酶的第一表达序列、2A自裂解肽和编码GFP或EGFP的第二表达序列的构建体环化。将20,000-40,000个293细胞用40ng的circRNA转染。在转染后每24小时测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光，在每个时间点完全更换培养基。在转染后24小时测量来自表达的GFP或EGFP的萦光。
实施例56B：来自含有2个IRES序列的一种circRNA的2种蛋白质的表达和功能RNA稳定性。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、第一IRES、编码高斯萦光素酶的第一表达序列、任选的间隔区、第二IRES和编码GFP或EGFP的第二表达序列且第一和/或第二IRES随构建体变化的构建体环化。将293细胞用1μg的每种环化反应进行电穿孔。在电穿孔后24小时测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶和GFP或EGFP的发光/萦光。在3天内测量每轮电穿孔293细胞中IRES构建体的功能稳定性。在用1μg的每种环化反应电穿孔细胞后，每24小时测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶和GFP或EGFP的发光/萦光，然后完全更换培养基。
实施例57
含有通过裂解位点隔开的2个表达序列的环状和线性RNA的表达和功能稳定性。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、编码高斯萦光素酶的第一表达序列、2A自裂解肽和编码GFP或EGFP的第二表达序列的构建体环化。产生了编码第一表达序列(所述第一表达序列编码高斯萦光素酶)、2A自裂解肽、编码EGFP的第二表达序列、约150nt聚A尾且经修饰以用1-甲基假尿苷置换100％的尿苷的mRNA。在293细胞中测量环状和经修饰mRNA的表达。在用1μg的每种RNA物质电穿孔细胞后24小时测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶和GFP或EGFP的发光/萦光。在电穿孔后在3天内每24小时测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶和GFP或EGFP的发光/萦光，以比较构建体功能稳定性。
实施例58
实施例58A：双表达与单表达构建体的表达和功能稳定性比较。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、IRES、高斯萦光素酶表达序列、2A自裂解肽以及GFP或EGFP表达序列的构建体环化。还将含有单个表达序列(编码高斯萦光素酶或GFP或EGFP)的构建体环化。还产生了含有单个表达序列(编码高斯萦光素酶或GFP或EGFP)的线性构建体。将293细胞用1μg的每种环化反应或等量的线性RNA进行电穿孔。在电穿孔后24小时测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶和GFP或EGFP阳性的萦光。
在3天内测量每轮电穿孔293细胞中构建体的功能稳定性。在用1μg的每种环化反应或等效mRNA电穿孔细胞后，每24小时测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光，然后完全更换培养基。
实施例58B：双表达与单表达构建体的表达和功能稳定性比较。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、第一IRES、高斯萦光素酶表达序列、第二IRES以及GFP或EGFP表达序列的构建体环化。还将含有单个表达序列(编码高斯萦光素酶或GFP或EGFP)的构建体环化。还产生了含有单个表达序列(编码高斯萦光素酶或GFP或EGFP)的线性构建体。将293细胞用1μg的每种环化反应或等量的线性RNA进行电穿孔。在电穿孔后24小时测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶和GFP或EGFP阳性的萦光。
在3天内测量每轮电穿孔293细胞中构建体的功能稳定性。在用1μg的每种环化反应或等效mRNA电穿孔细胞后，每24小时测量来自上清液中分泌的高斯萦光素酶的发光，然后完全更换培养基。
实施例59
实施例59A：使用IRES和裂解位点表达的TCR有效载荷之间的功能相互作用。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、IRES、TCRα链表达序列、2A自裂解肽和TCRβ链表达序列的构建体环化。
将人原代CD3+T细胞用circRNA电穿孔，并与稳定表达TCR靶标、GFP和萤火虫萦光素酶的细胞共培养24小时。将人原代CD3+T细胞模拟电穿孔并共培养作为对照。靶细胞的特异性裂解的定量通过检测萤火虫发光来确定。特异性裂解％定义为1-[TCR条件发光]/[模拟条件发光]。
实施例59B：使用2个IRES表达的TCR有效载荷之间的功能相互作用。
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、第一IRES、TCRα链表达序列、任选的间隔区、第二IRES和TCRβ链表达序列的构建体环化。
将人原代CD3+T细胞用circRNA电穿孔，并与稳定表达TCR靶标、GFP和萤火虫萦光素酶的细胞共培养24小时。将人原代CD3+T细胞模拟电穿孔并共培养作为对照。靶细胞的特异性裂解的定量通过检测萤火虫发光来确定。特异性裂解％定义为1-[TCR条件发光]/[模拟条件发光]。
实施例60
实施例60A：使用IRES和裂解位点表达的CAR有效载荷
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、IRES、抗CD19 CAR表达序列、2A自裂解肽和抗C20 CAR表达序列的构建体环化。
将人原代CD3+T细胞用circRNA电穿孔，并与稳定表达两种CAR靶标、GFP和萤火虫萦光素酶的细胞共培养24小时。将人原代CD3+T细胞模拟电穿孔并共培养作为对照。靶细胞的特异性裂解的定量通过检测萤火虫发光来确定。特异性裂解％定义为1-[TCR条件发光]/[模拟条件发光]。
实施例60B：使用2个IRES表达的TCR有效载荷
将包含鱼腥藻属内含子/外显子区域、第一IRES、抗CD19 CAR表达序列、任选的间隔区、第二IRES和抗CD20 CAR表达序列的构建体环化。
将人原代CD3+T细胞用circRNA电穿孔，并与稳定表达两种CAR靶标、GFP和萤火虫萦光素酶的细胞共培养24小时。将人原代CD3+T细胞模拟电穿孔并共培养作为对照。靶细胞的特异性裂解的定量通过检测萤火虫发光来确定。特异性裂解％定义为1-[TCR条件发光]/[模拟条件发光]。
实施例61
含有抗CD19 CAR的LNP和环状RNA构建体减少体内血液和脾脏中的B细胞。
如上所述，将编码抗CD19 CAR表达的环状RNA包封在脂质纳米颗粒中。作为比较，将编码萦光素酶表达的环状RNA包封在单独脂质纳米颗粒中。
将6至8周龄的C57BL/6小鼠每隔一天注射任一LNP溶液，每只小鼠共计4次LNP注射。最后一次LNP注射后24小时，收获小鼠脾脏和血液，染色并通过流式细胞术进行分析。如图57A和图57B所示，与用编码萦光素酶的LNP-环状RNA处理的小鼠相比，含有编码抗CD19CAR的LNP-环状RNA构建体的小鼠导致外周血和脾脏中CD19+B细胞的显著减少。
实施例62
在编码CAR的环状RNA中包含的IRES序列改善CAR表达和T细胞的细胞毒性。
用200ng含有独特IRES和小鼠抗CD19 1D3δCAR表达序列的环状RNA构建体电穿孔激活的鼠T细胞。这些构建体中包含的IRES全部或部分来源于山羊嵴病毒、姬鼠小核糖核酸病毒、Parabovirus或萨力病毒。另外对山羊嵴病毒来源的IRES进行了密码子优化。作为对照，使用含有野生型δ小鼠CAR、但不含IRES的环状RNA用于比较。电穿孔后24小时，将T细胞针对CD-19CAR染色，以评价其表面表达，然后与A20 Fluc靶细胞共培养。然后，在T细胞与靶细胞共培养24小时后，评价所述测定的Fluc+A20细胞的细胞毒性杀伤。
如图58A、58B、58C和59中观察到，独特IRES能够增加T细胞表达CAR蛋白的频率和细胞表面上CAR表达的水平。CAR蛋白的表达频率和细胞表面上CAR表达水平的增加导致改善的抗肿瘤应答。
实施例63
在原代人T细胞中，由环状RNA构建体表达的胞质蛋白和表面蛋白。
环状RNA构建体含有编码萦光胞质报告基因或表面抗原报告基因的序列。萦光报告基因包括绿色萦光蛋白、mCitrine、mWasabi、Tsapphire。表面报告基因包括CD52和Thy1.1bio。用抗CD3/抗CD28抗体激活原代人T细胞，并在含有报告基因序列的环状RNA激活后6天电穿孔。电穿孔后24小时收获T细胞，并通过流式细胞术进行分析。将表面抗原用市售抗体(例如，Biolegend,Miltenyi和BD)进行染色。
如图60A和图60B所示，可在原代人T细胞中由编码胞质蛋白和表面蛋白的环状RNA表达所述蛋白质。
实施例64
含有独特IRES序列的环状RNA具有相对于线性mRNA改善的翻译表达。
环状RNA构建体含有独特IRES和萤火虫萦光素酶(FLuc)的表达序列。
将来自2个供体的人T细胞富集并用抗CD3/抗CD28抗体刺激。增殖数天后，收获激活的T细胞，并用等摩尔的表达FLuc有效载荷的mRNA或环状RNA电穿孔。研究了各种IRES序列，包括来自山羊嵴病毒、姬鼠小核糖核酸病毒和Parabovirus的IRES序列，以评价7天内有效载荷表达的表达水平和持久性。在7天内，用Promega Brightglo裂解T细胞以评价其生物萦光。
如图61C、61D、61E、61F和61G所示，环状RNA中IRES的存在可使胞质蛋白的翻译和表达增加多个数量级，并且与线性mRNA相比可改善表达。这在多个人T细胞供体中是一致的。
实施例65
实施例65A：编码抗CD19的LNP-环状RNA介导人T细胞对K562细胞的杀伤。
环状RNA构建体含有编码抗CD19抗体的序列。然后将环状RNA构建体包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。
用抗CD3/抗CD28刺激人T细胞，并使其增殖至多6天。在第6天，将LNP-环状RNA和ApoE3(1μg/mL)与T细胞共培养以介导转染。24小时后，将Fluc+K562细胞用200ng编码抗CD19抗体的环状RNA电穿孔，并稍后在第7天共培养。共培养48小时后，评估所述测定的CAR表达和通过Fluc表达对K562细胞的细胞毒性杀伤。
如图62A和图62B所示，存在来自体外LNP介导的CAR递送至T细胞的抗CD19 CAR的T细胞表达，以及其在工程化的K562细胞中以特异性抗原依赖型方式裂解肿瘤细胞的能力。
实施例65B：编码抗BCMA抗体的LNP-环状RNA介导人T细胞对K562细胞的杀伤。
环状RNA构建体含有编码抗BCMA抗体的序列。然后将环状RNA构建体包封在脂质纳米颗粒(LNP)中。
用抗CD3/抗CD28刺激人T细胞，并使其增殖至多6天。在第6天，将LNP-环状RNA和ApoE3(1μg/mL)与T细胞共培养以介导转染。24小时后，将Fluc+K562细胞用200ng编码抗BCMA抗体的环状RNA电穿孔，并稍后在第7天共培养。共培养48小时后，评估所述测定的CAR表达和通过Fluc表达对K562细胞的细胞毒性杀伤。
如图62B所示，存在来自体外LNP介导的CAR递送至T细胞的BCMA CAR的T细胞表达，以及其在工程化的K562细胞中以特异性抗原依赖型方式裂解肿瘤细胞的能力。
实施例66
抗CD19 CAR T细胞在体外表现出抗肿瘤活性。
将人T细胞用抗CD3/抗CD28激活，并用200ng的表达抗CD19 CAR的环状RNA电穿孔一次。将电穿孔的T细胞与FLuc+Nalm6靶细胞和非靶细胞FLuc+K562共培养，以评价CAR介导的杀伤。共培养24小时后，将T细胞裂解，并检查靶细胞和非靶细胞的剩余FLuc表达，以评价总计8天内的表达和表达的稳定性。
如图63A和63B所示，T细胞以特异性抗原依赖性方式表达环状RNA CAR构建体。结果还显示了与编码CAR的线性mRNA相比，编码CAR的环状RNA的改善的细胞毒性和功能性表面受体的递送。
实施例67
用ApoE3介导的环状RNA的有效LNP转染
用抗CD3/抗CD28刺激人T细胞，并使其增殖至多6天。在第6天，将脂质纳米颗粒(LNP)和表达绿色萦光蛋白的环状RNA溶液(含或不含ApoE3)与T细胞共培养(1μg/mL)。24小时后，将T细胞针对活/死T细胞染色，并在流式细胞仪上分析活T细胞的GFP表达。
如图64A、64B、61C、61D和64E所示，可在激活的T细胞上通过ApoE3介导有效LNP转染，然后是显著有效载荷表达。这些结果在多个供体中得到证实。
以引用的方式并入
本说明书中所提及的所有公布、专利和专利申请以引用的方式并入本文，其引用程度如同已明确且个别地指示将各个别公布、专利和专利申请以引用的方式并入本文一般。

Claims (126)

1.一种环状RNA多核苷酸，其按以下顺序包含剪接后3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、第一表达序列、第二表达序列和剪接后5'I组内含子片段。
2.如权利要求1所述的环状RNA多核苷酸，其包含编码位于所述第一表达序列与所述第二表达序列之间的裂解位点的多核苷酸序列。
3.如权利要求2所述的环状RNA多核苷酸，其中所述裂解位点是自裂解间隔区。
4.如权利要求3所述的环状RNA多核苷酸，其中所述自裂解间隔区是2A自裂解肽。
5.如权利要求1所述的环状RNA多核苷酸，其包含位于所述第一表达序列与所述第二表达序列之间的第二IRES。
6.如权利要求5所述的环状RNA，其中所述第一IRES由根据SEQ ID NO:1-72中任一个的序列组成或包含所述序列。
7.如权利要求5或6所述的环状RNA，其中所述第二IRES由根据SEQ ID NO:1-72中任一个的序列组成或包含所述序列。
8.如任一前述权利要求所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码第一治疗性蛋白，并且所述第二表达序列编码第二治疗性蛋白质。
9.如任一前述权利要求所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列或所述第二表达序列编码抗体。
10.如任一前述权利要求所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列或所述第二表达序列编码嵌合抗原受体。
11.如任一前述权利要求所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列或所述第二表达序列编码转录因子。
12.如任一前述权利要求所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列或所述第二表达序列编码细胞因子。
13.如任一前述权利要求所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列或所述第二表达序列编码免疫抑制性分子。
14.如任一前述权利要求所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列或所述第二表达序列编码共刺激分子的激动剂。
15.如任一前述权利要求所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列或所述第二表达序列编码免疫检查点分子的抑制剂。
16.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码T细胞受体(TCR)的α链，并且所述第二表达序列编码T细胞受体(TCR)的β链。
17.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码T细胞受体(TCR)的β链，并且所述第二表达序列编码T细胞受体(TCR)的α链。
18.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码T细胞受体(TCR)的γ链，并且所述第二表达序列编码T细胞受体(TCR)的δ链。
19.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码T细胞受体(TCR)的δ链，并且所述第二表达序列编码T细胞受体(TCR)的γ链。
20.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码T细胞受体(TCR)，并且所述第二表达序列编码细胞因子。
21.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码细胞因子，并且所述第二表达序列编码T细胞受体(TCR)。
22.如权利要求20-21中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述细胞因子选自IL-2、IL-7、IL-12和IL-15。
23.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码T细胞受体(TCR)，并且所述第二表达序列编码趋化因子。
24.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码趋化因子，并且所述第二表达序列编码T细胞受体(TCR)。
25.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码T细胞受体(TCR)，并且所述第二表达序列编码转录因子。
26.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码转录因子，并且所述第二表达序列编码T细胞受体(TCR)。
27.如权利要求25-26中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述转录因子选自FOXP3、STAT5B、HELIOS、Tbet、GATA3、RORgt和cd25。
28.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码嵌合抗原受体(CAR)，并且所述第二表达序列编码PD1或PDL1拮抗剂。
29.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码PD1或PDL1拮抗剂，并且所述第二表达序列编码嵌合抗原受体(CAR)。
30.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码嵌合抗原受体(CAR)，并且所述第二表达序列编码细胞因子。
31.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码细胞因子，并且所述第二表达序列编码嵌合抗原受体(CAR)。
32.如权利要求30-31中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述细胞因子选自IL-2、IL-7、IL-12和IL-15。
33.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码嵌合抗原受体(CAR)，并且所述第二表达序列编码趋化因子。
34.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码趋化因子，并且所述第二表达序列编码嵌合抗原受体(CAR)。
35.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码转录因子，并且所述第二表达序列编码细胞因子。
36.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码细胞因子，并且所述第二表达序列编码转录因子。
37.如权利要求35-36中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述转录因子选自FOXP3、STAT5B、HELIOS、Tbet、GATA3、RORgt和cd25。
38.如权利要求35-37中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述细胞因子选自IL-10、IL-12和TGFβ。
39.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码转录因子，并且所述第二表达序列编码趋化因子。
40.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码趋化因子，并且所述第二表达序列编码转录因子。
41.如权利要求39-40中任一项所述的环状RNA，其中所述转录因子选自FOXP3、STAT5B和HELIOS。
42.如权利要求39-41中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述趋化因子是CC趋化因子、CXC趋化因子、C趋化因子或CX3C趋化因子。
43.如权利要求39-42中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述趋化因子选自CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9/CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28、CXCL 1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXLC6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL11、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17、XCL1、XCL2和CX3CL1。
44.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码肿瘤抗原，并且所述第二表达序列编码细胞因子。
45.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码细胞因子，并且所述第二表达序列编码肿瘤抗原。
46.如权利要求44-45中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述抗原是新抗原。
47.如权利要求44-46中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述细胞因子是IFNγ。
48.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码CAR，并且所述第二表达序列编码CAR。
49.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码细胞因子，并且所述第二表达序列编码细胞因子。
50.如权利要求49所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列或所述第二表达序列编码选自IL-10、TGFβ和IL-35的细胞因子。
51.如权利要求49-50中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列或所述第二表达序列编码选自IFNγ、IL-2、IL-7、IL-15和IL-18的细胞因子。
52.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码T细胞受体(TCR)，并且所述第二表达序列编码T细胞受体(TCR)。
53.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码趋化因子，并且所述第二表达序列编码趋化因子。
54.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列或所述第二表达序列编码免疫抑制酶。
55.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码限速酶，并且所述第二表达序列编码通量限制酶。
56.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码通量限制酶，并且所述第二表达序列编码限速酶。
57.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码转录因子，并且所述第二表达序列编码存活因子。
58.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码存活因子，并且所述第二表达序列编码转录因子。
59.如权利要求57-58中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述转录因子选自FOXP3、STAT5B、HELIOS、Tbet、GATA3、RORgt和cd25。
60.如权利要求57-59中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述存活因子选自BCL-XL。
61.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列或所述第二表达序列编码伴侣蛋白或复合物。
62.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码转录因子，并且所述第二表达序列编码伴侣蛋白或复合物。
63.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码伴侣蛋白或复合物，并且所述第二表达序列编码转录因子。
64.如权利要求61-63中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述伴侣蛋白或复合物选自Skp、Spy、FkpA、SurA、Hsp60、Hsp70、GroEL、GroES、Hsp90、HtpG、Hsp100、ClpA、ClpX、ClpP和Hsp104。
65.如权利要求61-64中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述转录因子选自FOXP3、STAT5B、HELIOS、Tbet、GATA3、RORgt和cd25。
66.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中一个或两个表达序列编码信号传导蛋白质。
67.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码酶，并且所述第二表达编码所述第一表达序列的负调控抑制因子。
68.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码在所述第二表达序列中编码的酶的负调控抑制因子蛋白。
69.如权利要求67-68中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述负调控抑制因子选自p57kip2、BAX抑制因子和TIPE2。
70.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码显性负性蛋白，并且所述第二表达序列编码免疫蛋白。
71.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码免疫蛋白，并且所述第二表达序列编码显性负性蛋白。
72.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列或所述第二表达序列编码抗炎蛋白。
73.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列编码转录因子，并且所述第二表达序列能够将5-氟胞嘧啶(5-FC)转化为5-氟尿嘧啶(5-FU)。
74.如权利要求1-8中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一表达序列能够将5-氟胞嘧啶(5-FC)转化为5-氟尿嘧啶(5-FU)，并且所述第二表达序列是转录因子。
75.如权利要求73-74中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中能够将5-氟胞嘧啶(5-FC)转化为5-氟尿嘧啶(5-FU)的所述表达序列是胞嘧啶脱氨酶。
76.如任一前述权利要求所述的环状RNA多核苷酸，其包含位于所述5'双链体形成区与所述剪接后3'I组内含子片段之间的第一间隔区，以及位于所述剪接后5'I组内含子片段与所述3'双链体形成区之间的第二间隔区。
77.如权利要求76所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一间隔区和所述第二间隔区各自具有约10至约60个核苷酸的长度。
78.如前述权利要求中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一双链体形成区和所述第二双链体形成区各自具有约9至19个核苷酸的长度。
79.如权利要求77-78中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述第一双链体形成区和所述第二双链体形成区各自具有约30个核苷酸的长度。
80.如前述权利要求中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述IRES具有来自以下的IRES的序列：桃拉综合征病毒、锥蝽病毒、蒂勒脑脊髓炎病毒、猿猴病毒40、红火蚁病毒1、禾谷缢管蚜病毒、网状内皮增生病病毒、人脊髓灰质炎病毒1、斯氏珀蝽肠病毒、克什米尔蜜蜂病毒、人鼻病毒2、琉璃叶蝉病毒-1、人免疫缺陷病毒1型、琉璃叶蝉病毒-1、Himetobi P病毒、丙型肝炎病毒、甲型肝炎病毒、GB型肝炎病毒、***病毒、人肠道病毒71、马鼻炎病毒、茶尺蠖微小RNA病毒样病毒、脑心肌炎病毒、果蝇C病毒、人柯萨奇病毒B3、十字花科植物烟草花叶病毒、蟋蟀麻痹病毒、牛病毒性腹泻病毒1、黑蜂王台病毒、蚜虫致死性麻痹病毒、禽脑脊髓炎病毒、急性蜜蜂麻痹病毒、木槿褪绿环斑病毒、猪瘟病毒、人FGF2、人SFTPA1、人AML1/RUNX1、果蝇触角足、人AQP4、人AT1R、人BAG-1、人BCL2、人BiP、人c-IAPl、人c-myc、人eIF4G、小鼠NDST4L、人LEF1、小鼠HIF1α、人n.myc、小鼠Gtx、人p27kipl、人PDGF2/c-sis、人p53、人Pim-1、小鼠Rbm3、果蝇reaper、犬Scamper、果蝇Ubx、人UNR、小鼠UtrA、人VEGF-A、人XIAP、果蝇无毛、酿酒酵母TFIID、酿酒酵母YAP1、烟草蚀纹病毒、芜菁皱缩病毒、EMCV-A、EMCV-B、EMCV-Bf、EMCV-Cf、EMCV pEC9、小双节RNA病毒、HCV QC64、人寇沙病毒E/D、人寇沙病毒F、人寇沙病毒JMY、鼻病毒NAT001、HRV14、HRV89、HRVC-02、HRV-A21、萨力病毒A SH1、萨力病毒FHB、萨力病毒NG-J1、人副肠孤病毒1、Crohivirus B、Yc-3、Rosavirus M-7、Shanbavirus A、Pasivirus A、Pasivirus A 2、艾柯病毒E14、人副肠孤病毒5、爱知病毒、甲型肝炎病毒HA16、Phopivirus、CVA10、肠道病毒C、肠道病毒D、肠道病毒J、人趋肝性病毒2、GBV-C GT110、GBV-C K1737、GBV-C Iowa、趋肝性病毒A 1220、Pasivirus A 3、萨佩洛病毒、Rosavirus B、Bakunsa病毒、震颤病毒A、猪Pasivirus1、PLV-CHN、Pasivirus A、Sicinivirus、肝炎病毒K、肝炎病毒A、BVDV1、边界病病毒、BVDV2、CSFV-PK15C、SF573双顺反子病毒、湖北微小RNA病毒样病毒、CRPV、萨力病毒A BN5、萨力病毒A BN2、萨力病毒A02394、萨力病毒A GUT、萨力病毒A CH、萨力病毒A SZ1、萨力病毒FHB、CVB3、CVB1、艾柯病毒7、CVB5、EVA71、CVA3、CVA12、EV24或eIF4G的适体。
81.如前述权利要求中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其由天然核苷酸组成。
82.如前述权利要求中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述表达序列是密码子优化的。
83.如前述权利要求中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其被优化为缺乏存在于等效的预先优化的多核苷酸中的至少一个微小RNA结合位点。
84.如前述权利要求中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其被优化为缺乏存在于等效预先优化的多核苷酸中的至少一个核酸内切酶敏感位点。
85.如前述权利要求中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其被优化为缺乏存在于等效预先优化的多核苷酸中的至少一个RNA编辑敏感位点。
86.如前述权利要求中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其中所述环状RNA多核苷酸的长度是约100个核苷酸至约15千碱基。
87.如前述权利要求中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其在人类中具有至少约20小时的体内治疗效果持续时间。
88.如前述权利要求中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其具有至少约20小时的功能性半衰期。
89.如前述权利要求中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其在人细胞中的治疗效果持续时间大于或等于包含相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的治疗效果持续时间。
90.如前述权利要求中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其在人细胞中的功能性半衰期大于或等于包含相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的功能性半衰期。
91.如前述权利要求中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其在人类中的体内治疗效果持续时间大于具有相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的体内治疗效果持续时间。
92.如前述权利要求中任一项所述的环状RNA多核苷酸，其在人类中的体内功能性半衰期大于具有相同表达序列的等效线性RNA多核苷酸的体内功能性半衰期。
93.一种药物组合物，其包含前述权利要求中任一项所述的环状RNA多核苷酸、纳米颗粒和任选的与所述纳米颗粒可操作地连接的靶向部分。
94.如权利要求93所述的药物组合物，其中所述纳米颗粒是脂质纳米颗粒、核-壳纳米颗粒、生物可降解纳米颗粒、生物可降解脂质纳米颗粒、聚合物纳米颗粒或生物可降解聚合物纳米颗粒。
95.如权利要求93或94所述的药物组合物，其包含靶向部分，其中在没有细胞分离或纯化的情况下，所述靶向部分介导经受体介导的胞吞作用或直接融合至选定细胞群或组织的选定细胞中。
96.如权利要求93-95中任一项所述的药物组合物，其包含可操作地连接至所述纳米颗粒的靶向部分。
97.如权利要求93-96中任一项所述的药物组合物，其中所述靶向部分是scFv、纳米抗体、肽、微型抗体、多核苷酸适体、重链可变区、轻链可变区或其片段。
98.如权利要求93-97中任一项所述的药物组合物，其中所述组合物中少于1重量％的多核苷酸是双链RNA、DNA夹板或三磷酸化RNA。
99.如权利要求93-98中任一项所述的药物组合物，其中所述药物组合物中少于1重量％的多核苷酸和蛋白质是双链RNA、DNA夹板、三磷酸化RNA、磷酸酶蛋白质、蛋白质连接酶和加帽酶。
100.一种治疗有需要的受试者的方法，所述方法包括施用治疗有效量的组合物，所述组合物包含权利要求1-92中任一项所述的环状RNA多核苷酸、纳米颗粒和任选的与所述纳米颗粒可操作地连接的靶向部分。
101.如权利要求100所述的方法，其中所述靶向部分是scFv、纳米抗体、肽、微型抗体、重链可变区、轻链可变区或其片段。
102.如权利要求100-101中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒是脂质纳米颗粒、核-壳纳米颗粒或生物可降解纳米颗粒。
103.如权利要求100-102中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含一种或多种阳离子脂质、可电离脂质或聚β-氨基酯。
104.如权利要求100-103中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含一种或多种非阳离子脂质。
105.如权利要求100-104中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含一种或多种PEG修饰的脂质、聚谷氨酸脂质或透明质酸脂质。
106.如权利要求100-105中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含胆固醇。
107.如权利要求100-106中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含花生四烯酸或油酸。
108.如权利要求100-107中任一项所述的方法，其中所述组合物包含靶向部分，其中在没有细胞选择或纯化的情况下，所述靶向部分选择性地介导经受体介导的胞吞作用进入选定细胞群的细胞中。
109.如权利要求100-108中任一项所述的方法，其中所述纳米颗粒包含多于一种环状RNA多核苷酸。
110.如权利要求100-109中任一项所述的方法，其中所述受试者患有选自由以下组成的组的癌症：急性淋巴细胞白血病；急性骨髓性白血病(AML)；肺泡横纹肌肉瘤；B细胞恶性肿瘤；膀胱癌(例如，膀胱癌)；骨癌；脑癌(例如，成神经管细胞瘤)；乳腺癌；***癌、肛管癌或***直肠癌；眼癌；肝内胆管癌；关节癌；颈癌；胆囊癌；胸膜癌；鼻癌、鼻腔癌或中耳癌；口腔癌；外阴癌；慢性淋巴细胞性白血病；慢性骨髓性癌症；结肠癌；食道癌；***；纤维肉瘤；胃肠类癌肿瘤；头颈癌(例如头颈鳞状细胞癌)；霍奇金淋巴瘤；下咽癌；肾癌；喉癌；白血病；液体肿瘤；肝癌；肺癌(例如，非小细胞肺癌和肺腺癌)；淋巴瘤；间皮瘤；肥大细胞瘤；黑素瘤；多发性骨髓瘤；鼻咽癌；非霍奇金淋巴瘤；B-慢性淋巴细胞性白血病；毛细胞白血病；急性淋巴细胞性白血病(ALL)；伯基特淋巴瘤；卵巢癌；胰腺癌；腹膜癌；网膜癌；肠系膜癌；咽癌；***癌；直肠癌；肾癌；皮肤癌；小肠癌；软组织癌；实体瘤；滑膜肉瘤；胃癌；睾丸癌；甲状腺癌；和输尿管癌。
111.如权利要求100-109中任一项所述的方法，其中所述受试者患有选自以下的自身免疫性病症：硬皮病、格雷夫斯病、克罗恩氏病、薛格连氏综合征、多发性硬化症、桥本氏病、银屑病、重症肌无力、自身免疫性多内分泌病综合征、I型糖尿病(TIDM)、自身免疫性胃炎、自身免疫性葡萄膜视网膜炎、多发性肌炎、结肠炎、甲状腺炎和以人类狼疮为代表的广泛性自身免疫性疾病。
112.一种用于制备环状RNA多核苷酸的载体，所述载体按以下顺序包含5'双链体形成区、3'I组内含子片段、内部核糖体进入位点(IRES)、第一表达序列、第二表达序列、5'I组内含子片段和3'双链体形成区。
113.如权利要求112所述的载体，其包含编码位于所述第一表达序列与所述第二表达序列之间的裂解位点的多核苷酸序列。
114.如权利要求112或113所述的载体，其中所述裂解位点是自裂解间隔区。
115.如权利要求112-114中任一项所述的载体，其中所述自***间隔区是2A自裂解肽。
116.如权利要求112-115中任一项所述的载体，其包含位于所述5'双链体形成区与所述3'I组内含子片段之间的第一间隔区，以及位于所述5'I组内含子片段与所述3'双链体形成区之间的第二间隔区。
117.如权利要求112-116中任一项所述的载体，其中所述第一间隔区和所述第二间隔区各自具有约5至约60个核苷酸的长度。
118.如权利要求112-117中任一项所述的载体，其中所述第一间隔区和所述第二间隔区各自包含至少5个核苷酸长的非结构化区域。
119.如权利要求112-118中任一项所述的载体，其中所述第一间隔区和所述第二间隔区各自包含至少7个核苷酸长的结构化区域。
120.如权利要求112-119中任一项所述的载体，其中所述第一双链体形成区和所述第二双链体形成区各自具有约9至50个核苷酸的长度。
121.如权利要求112-120中任一项所述的载体，其中所述载体是密码子优化的。
122.如权利要求112-121中任一项所述的载体，其缺乏存在于等效的预先优化多核苷酸中的至少一个微小RNA结合位点。
123.一种真核细胞，其包含根据权利要求1-92中任一项所述的环状RNA多核苷酸。
124.如权利要求123所述的真核细胞，其中所述真核细胞是人细胞。
125.如权利要求124所述的真核细胞，其中所述真核细胞是免疫细胞。
126.如权利要求125所述的真核细胞，其中所述真核细胞是T细胞。
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