CN116019907A - 抗pd-1抗体药物组合物及其用途 - Google Patents

抗pd-1抗体药物组合物及其用途 Download PDF

Info

Publication number
CN116019907A
CN116019907A CN202210929845.3A CN202210929845A CN116019907A CN 116019907 A CN116019907 A CN 116019907A CN 202210929845 A CN202210929845 A CN 202210929845A CN 116019907 A CN116019907 A CN 116019907A
Authority
CN
China
Prior art keywords
concentration
antibody
buffer
pharmaceutical composition
stabilizer
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202210929845.3A
Other languages
English (en)
Inventor
刘洪川
刘沛想
杜晓洁
孟琴
刘辉
冯辉
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Junshi Biosciences Co Ltd
Suzhou Junmeng Biosciences Co Ltd
Original Assignee
Shanghai Junshi Biosciences Co Ltd
Suzhou Junmeng Biosciences Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Junshi Biosciences Co Ltd, Suzhou Junmeng Biosciences Co Ltd filed Critical Shanghai Junshi Biosciences Co Ltd
Publication of CN116019907A publication Critical patent/CN116019907A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • A61K39/39591—Stabilisation, fragmentation
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/16—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing nitrogen, e.g. nitro-, nitroso-, azo-compounds, nitriles, cyanates
    • A61K47/18—Amines; Amides; Ureas; Quaternary ammonium compounds; Amino acids; Oligopeptides having up to five amino acids
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/26—Carbohydrates, e.g. sugar alcohols, amino sugars, nucleic acids, mono-, di- or oligo-saccharides; Derivatives thereof, e.g. polysorbates, sorbitan fatty acid esters or glycyrrhizin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2803—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily
    • C07K16/2818—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the immunoglobulin superfamily against CD28 or CD152
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/02—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
    • A61K47/08—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite containing oxygen, e.g. ethers, acetals, ketones, quinones, aldehydes, peroxides
    • A61K47/12—Carboxylic acids; Salts or anhydrides thereof
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/08—Solutions
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/14—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles
    • A61K9/19—Particulate form, e.g. powders, Processes for size reducing of pure drugs or the resulting products, Pure drug nanoparticles lyophilised, i.e. freeze-dried, solutions or dispersions
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
    • C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

本发明提供稳定的抗PD‑1抗体药物组合物及其用途。该药物组合物含有缓冲液和抗PD‑1抗体或其抗原结合片段；其中所述抗PD‑1抗体或其抗原结合片段的浓度为约100～250mg/mL，且包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3和氨基酸序列分别如SEQ IDNO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；其中，所述药物组合物的pH为约5.0～6.5。本发明还提供含有所述药物组合物的注射剂以及所述药物组合物和注射剂在制备通过消除、抑制或降低PD‑1活性来治疗疾病或病症的药物中的用途。

Description

抗PD-1抗体药物组合物及其用途
技术领域
本发明涉及治疗性药物组合物领域，具体涉及抗PD-1抗体药物组合物及其用途。
背景技术
免疫逃逸是癌症的特征之一。Ahmadzadeh,M.等，Blood,114:1537-44中公开了肿瘤特异性T淋巴细胞常存在于肿瘤微环境、引流***和外周血中，但由于肿瘤微环境中存在的免疫抑制机制网络，其通常无法控制肿瘤的进展。CD8+肿瘤浸润T淋巴细胞(TIL)通常表达活化诱导的抑制受体，包括CTLA-4和PD-1，而肿瘤细胞经常表达免疫抑制配体，包括PD-1配体1(PD-L1，也叫B7-H1或CD274)，该配体抑制T细胞激活和效应功能。在抑制机制中，PD-1及其配体已成为肿瘤细胞利用其抑制肿瘤微环境中激活的T细胞的重要途径。
程序性死亡受体1(PD-1)在免疫调节及周边耐受性维持中起重要作用。PD-1主要在激活的T细胞和B细胞中表达，功能是抑制淋巴细胞的激活，这是免疫***的一种正常的防治免疫过激的外周组织耐受机制。但是，在肿瘤微环境中浸润的活化T细胞高表达PD-1分子，活化白细胞分泌的炎症因子会诱导肿瘤细胞高表达PD-1的配体PD-L1和PD-L2，导致肿瘤微环境中活化T细胞PD-1通路持续激活，T细胞功能被抑制，无法杀伤肿瘤细胞。治疗型PD-1抗体可以阻断这一通路，部分恢复T细胞的功能，使活化T细胞能够继续杀伤肿瘤细胞。
近十年来，PD-1/PD-L1通路阻断已被证明是在各种癌症适应症中诱导持久抗肿瘤应答的有效途径。阻断PD/PD-L1通路的单克隆抗体(mAbs)可以增强肿瘤特异性T细胞的活化和效应功能，减轻肿瘤负担，提高生存率。
抗体药物制剂应当是长期稳定的、含有安全且有效量的药物制剂，由抗体的特殊结构及性质决定，抗体类药物在制备、保存、运输过程中需要能够使其稳定的环境。对于不同种类的蛋白质，不同种类的抗体，其理化性质和降解反应等都不同；因此，抗体类药物制剂的缓冲液、辅料等配方也不尽相同。
为提高肿瘤患者的顺应性和给药便捷性，皮下(SC)注射是一种优选实施方式，但其发挥效应所需要的剂量较高，因此需要制备高浓度的制剂。然而，高浓度的抗体制剂常常伴有许多的困难。比如，这类制剂的粘度很高，在使用注射器抽吸和推打药物时很困难，药物在容器和针筒中的残留高造成给药剂量偏差大，且造成注射部位疼痛等等；此外，制剂的高粘度还会在其生产过程中带来严重的工艺问题，如浓缩和过滤的环节需要极高的压力，或者根本无法通过滤膜。再比如，制剂中的高浓度抗体蛋白极易发生聚集，造成制剂不稳定，易形成不溶微粒，增加药物免疫原性，增加药物副作用等。
因此，本领域尚需研发一种以人程序性死亡受体1为靶点的高浓度抗体制剂，以满足对高抗体浓度且长期稳定、无聚集、低粘度等的制造与临床应用需求。
发明内容
本发明所述的药物组合物是一种含有与PD-1特异性结合的抗体的高稳定性药物组合物。特别地，本发明通过选择适当的缓冲体系和pH，优化稳定剂和表面活性剂，并进行药代动力学和药效研究，开发得到的高浓度抗体制剂可用于皮下给药，且长期稳定、无聚集、超低粘度。
本发明提供了一种药物组合物，包含：(1)缓冲液；(2)抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
在一些方案中，上述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列分别如SEQ IDNO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和氨基酸序列分别如SEQID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些方案中，上述抗PD-1抗体或其抗原结合片段选自鼠源抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段，优选为人源化抗体或其抗原结合片段。
在一些方案中，上述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:7所示的轻链可变区，和如SEQ ID NO:8所示的重链可变区。
在一些方案中，上述抗PD-1抗体包含如SEQ ID NO:9所示的轻链氨基酸序列，和如SEQ ID NO:10所示的重链氨基酸序列。
在一些方案中，上述药物组合物中抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约100～250mg/mL，优选为约150～250mg/mL，更优选为约150～200mg/mL；更优选地，上述抗PD-1抗体或其抗原结合片段浓度为约100mg/mL，110mg/mL，120mg/mL，130mg/mL，140mg/mL，150mg/mL，160mg/mL，170mg/mL，175mg/mL，180mg/mL，185mg/mL，190mg/mL，195mg/mL，200mg/mL，210mg/mL，220mg/mL，优选为约180mg/mL，185mg/mL，190mg/mL或195mg/mL。
在一些方案中，上述药物组合物的pH为约5.0～6.5，优选为约5.5～6.2，更优选5.9～6.1，更优选为约6.0。
在一些方案中，上述药物组合物的渗透压在260～320mOsm/kg的范围内，优选在290～310mOsm/kg的范围内。
在一些方案中，上述药物组合物在约25℃测得的粘度≤8.0cP。
在一些方案中，上述缓冲液选自醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液和组氨酸缓冲液中的一种或多种；优选地，所述缓冲液为组氨酸缓冲液。
在一些方案中，上述组氨酸缓冲液选自组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液或组氨酸-组氨酸醋酸盐缓冲液，优选组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液。
在一些方案中，上述组氨酸缓冲液为组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液。在一些方案中，上述组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液由组氨酸和组氨酸盐酸盐制成，优选L-组氨酸和L-组氨酸单盐酸盐。在一些方案中，组氨酸缓冲液由1～30mM的L-组氨酸和1～30mM的L-组氨酸单盐酸盐制成。在一些方案中，组氨酸缓冲液由摩尔比为1:1到1:4的组氨酸和组氨酸盐酸盐制成。在一些方案中，组氨酸缓冲液由摩尔比为约1:1组氨酸和组氨酸盐酸盐制成。在一些方案中，组氨酸缓冲液由摩尔比为约1:3的组氨酸和组氨酸盐酸盐制成。在一些方案中，组氨酸制剂为：由约4.5mM的L-组氨酸和约15.5mM的L-组氨酸单盐酸盐制成的pH为约5.5的组氨酸缓冲剂。在一些方案中，组氨酸制剂为：由约7.5mM的L-组氨酸和约22.5mM的L-组氨酸单盐酸盐制成的pH为约5.5的组氨酸缓冲剂。在一些方案中，组氨酸制剂为：由约10mM的组氨酸和约10mM的组氨酸盐酸盐制成的pH为约6.0的组氨酸缓冲液。
在一些方案中，上述组氨酸缓冲液为组氨酸-组氨酸醋酸盐缓冲液，优选地，两者的摩尔比为1:1到1.5:1，优选地，此类缓冲液的pH为6.0±0.3，优选为约6.0，优选地，这类缓冲液含有10～15mM的组氨酸和10～15mM的组氨酸醋酸盐。
在一些方案中，上述缓冲液为醋酸缓冲液，优选地，所述醋酸缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液或醋酸-醋酸钾缓冲液，优选醋酸-醋酸钠缓冲液。在一些方案中，醋酸缓冲液由1～30mM的醋酸和1～30mM的醋酸钠制成。在一些方案中，醋酸缓冲液由摩尔比为约1:2.1的醋酸和醋酸钠制成。在一些方案中，醋酸缓冲液由摩尔比为约1:5.7的醋酸和醋酸钠制成。在一些方案中，醋酸缓冲液为：由约6.5mM的醋酸和约13.5mM的醋酸钠制成的pH为约5.0的醋酸缓冲液。在一些方案中，醋酸缓冲液为：由约3mM的醋酸和约17mM的醋酸钠制成的pH为约5.5的醋酸缓冲液。
在一些方案中，上述缓冲液为柠檬酸缓冲液，优选地，所述柠檬酸缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。在一些方案中，柠檬酸缓冲液由1～30mM的柠檬酸和1～30mM的柠檬酸钠制成。在一些方案中，柠檬酸缓冲液由摩尔比为约1:1到1:4的柠檬酸和柠檬酸钠制成。在一些方案中，柠檬酸缓冲液为：由约5.0mM的柠檬酸和约15.0mM的柠檬酸钠制成的pH为约6.0的柠檬酸缓冲液。在一些方案中，柠檬酸缓冲液为：由约10mM的柠檬酸和约10mM的柠檬酸钠制成的pH为约6.0的柠檬酸缓冲液。
在一些方案中，上述缓冲液的浓度为约5～100mM，优选为约10～50mM，优选为约10～30mM；优选为约15～25mM，上述缓冲液浓度非限制性实施例为约10mM，15mM，20mM，25mM，30mM、40mM、45mM、50mM或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围，优选为约15mM、20mM或25mM。
在一些方案中，上述缓冲液的pH为约5.0～6.5，优选为约5.5～6.5，优选为约5.5～6.2，更优选为约5.9～6.1，上述缓冲液的pH非限制性实施例为约5.0，5.1，5.2，5.3，5.4，5.5，5.6，5.7，5.8，5.9，6.0，6.1，6.2，6.3，6.4，6.5，优选为约5.9，6.0或6.1。
在一些方案中，上述的药物组合物还包括稳定剂，所述稳定剂选自精氨酸、精氨酸盐、氯化钠、甘露醇、山梨醇、蔗糖、甘氨酸和海藻糖中的一种或多种；优选地，上述精氨酸盐为盐酸精氨酸。
在一些方案中，上述稳定剂的浓度为约10～400mM，优选为约100～250mM，优选为约120～220mM，优选为约130～180mM，上述稳定剂浓度非限制性实施例为约100mM、110mM、120mM、130mM、140mM、145mM、150mM、160mM、170mM、180mM、190mM、200mM、210mM、220mM、230mM或这些范围内任意两个数值作为端点形成的范围，优选为约140mM、150mM或160mM。
在一些方案中，上述稳定剂为浓度约120～220mM的精氨酸或精氨酸盐；或上述稳定剂为浓度约30～100mM的盐酸精氨酸与浓度约100～180mM的蔗糖的组合；或上述稳定剂为浓度约30～100mM的盐酸精氨酸与浓度约50～150mM的甘氨酸的组合；优选地，上述稳定剂为浓度约130～180mM的精氨酸或精氨酸盐；或上述稳定剂为浓度约30～70mM的盐酸精氨酸与约110～170mM的蔗糖的组合；或上述稳定剂为浓度约30～70mM的盐酸精氨酸与约80～120mM的甘氨酸的组合；优选地，上述精氨酸盐为盐酸精氨酸。
在一些方案中，上述稳定剂为精氨酸或精氨酸盐。在一些方案中，上述稳定剂为浓度约30～250mM的精氨酸或精氨酸盐，上述精氨酸或精氨酸盐的浓度优选为约100～250mM，优选为约120～220mM，优选为约130～180mM，优选为约140～160mM，上述精氨酸或精氨酸盐浓度的非限制性实施例为约100mM，110mM，120mM，125mM，130mM，135mM，140mM，145mM，150mM，155mM，160mM，170mM，180mM，190mM，200mM，优选约135mM，140mM，145mM，150mM或155mM；优选地，上述精氨酸盐为盐酸精氨酸。
在一些方案中，上述稳定剂为蔗糖。在一些方案中，上述稳定剂为浓度约100～300mM的蔗糖，上述蔗糖的浓度优选为约150～300mM，优选为约200～280mM，上述蔗糖浓度的非限制性实施例为约200mM，210mM，220mM，230mM，240mM，250mM，260mM，270mM，280mM，优选为约220mM。
在一些方案中，上述稳定剂为海藻糖。在一些方案中，上述稳定剂为浓度约100～300mM的海藻糖，上述海藻糖的浓度优选为约150～300mM，优选为约200～280mM，上述海藻糖浓度的非限制性实施例为约180mM，200mM，210mM，220mM，230mM，240mM，250mM，260mM，270mM，280mM，优选为约220mM。
在一些方案中，上述稳定剂为氯化钠。在一些方案中，上述稳定剂为浓度约30～200mM的氯化钠，上述氯化钠的浓度优选为约50～190mM，优选为约100～180mM，优选为约120～170mM，优选为约130～150mM，上述氯化钠浓度的非限制性实施例为约100mM，110mM，120mM，125mM，130mM，135mM，140mM，145mM，150mM，155mM，160mM，170mM，180mM，190mM，200mM，优选约135mM或140mM。
在一些方案中，上述稳定剂为甘露醇。在一些方案中，上述稳定剂为浓度约100～300mM的甘露醇，上述甘露醇的浓度优选为约150～300mM，优选为约200～280mM，上述甘露醇浓度的非限制性实施例为约200mM，210mM，220mM，230mM，240mM，250mM，260mM，270mM，280mM，优选为约240mM。
在一些方案中，上述稳定剂为山梨醇。在一些方案中，上述稳定剂为浓度约100～300mM的山梨醇，上述山梨醇的浓度优选为约150～300mM，优选为约200～280mM，上述山梨醇浓度的非限制性实施例为约200mM，210mM，220mM，230mM，240mM，250mM，260mM，270mM，280mM，优选为约240mM。
在一些方案中，上述稳定剂为氯化钠与甘露醇的组合。在一些方案中，上述稳定剂为约30～200mM的氯化钠与约30～200mM的甘露醇的组合，优选约30～100mM的氯化钠与约100～180mM的甘露醇的组合，优选约30～70mM的氯化钠与约120～180mM的甘露醇的组合，上述稳定剂的非限制性实施例为约50mM的氯化钠与约140mM的甘露醇的组合，或约50mM的氯化钠与约150mM的甘露醇的组合。
在一些方案中，上述稳定剂为盐酸精氨酸与蔗糖的组合。在一些方案中，上述稳定剂为约30～200mM盐酸精氨酸的与约30～200mM的蔗糖的组合，优选约30～100mM的盐酸精氨酸与约100～180mM的蔗糖的组合，优选约30～70mM的盐酸精氨酸与约110～170mM的蔗糖的组合，上述稳定剂的非限制性实施例为约50mM的盐酸精氨酸与约130mM的蔗糖的组合，上述稳定剂的非限制性实施例为约50mM的盐酸精氨酸与约140mM的蔗糖的组合，或约50mM的盐酸精氨酸与约150mM的蔗糖的组合。
在一些方案中，上述稳定剂为盐酸精氨酸与甘氨酸的组合。在一些方案中，上述稳定剂为约30～200mM盐酸精氨酸的与约30～200mM的甘氨酸的组合，优选约30～100mM的盐酸精氨酸与约50～150mM的甘氨酸的组合，优选约30～70mM的盐酸精氨酸与约80～120mM的甘氨酸的组合，上述稳定剂的非限制性实施例为约50mM的盐酸精氨酸与约100mM的甘氨酸的组合，或约50mM的盐酸精氨酸与约110mM的甘氨酸的组合。
在一些方案中，上述稳定剂为氯化钠与蔗糖的组合。在一些方案中，上述稳定剂为约30～200mM的氯化钠与约30～200mM的蔗糖的组合，优选约30～100mM的氯化钠与约100～180mM的蔗糖的组合，优选约30～70mM的氯化钠与约100～150mM的蔗糖的组合，上述稳定剂的非限制性实施例为约50mM的氯化钠与约120mM的蔗糖的组合，或约50mM的氯化钠与约130mM的蔗糖的组合。
在一些方案中，上述稳定剂为氯化钠与海藻糖的组合。在一些方案中，上述稳定剂为约30～200mM的氯化钠与约30～200mM的海藻糖的组合，优选约40～150mM的氯化钠与约40～180mM的海藻糖的组合，优选约40～100mM的氯化钠与约80～160mM的海藻糖的组合，上述稳定剂的非限制性实施例为约50mM的氯化钠与约120mM的海藻糖的组合，或约50mM的氯化钠与约140mM的海藻糖的组合。
在一些方案中，上述药物组合物还包括表面活性剂，所述表面活性剂选自聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20和泊洛沙姆188中的一种或多种。
在一些方案中，上述表面活性剂选自聚山梨醇酯80。
在一些方案中，上述表面活性剂选自聚山梨醇酯20。
在一些方案中，以w/v计算，上述表面活性剂浓度为约0.001％～0.1％，优选为约0.01％～0.1％，优选为约0.02％～0.08％，更优选约为0.02％～0.06％；作为非限制性实施例，上述表面活性剂的浓度为约0.02％，0.04％或0.08％，优选为约0.04％。
在一些方案中，药物组合物包含如下(1)～(8)中任一项所示的组分，或分别由(1)～(8)任一项所示的组分组成：
(1)(a)约150～250mg/mL的上述抗PD-1抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mM组氨酸缓冲液，pH为约5.5～6.5；(c)约120～220mM的精氨酸或精氨酸盐；以及(d)约0.01％～0.1％(w/v)的聚山梨醇酯80；或
(2)(a)约150～250mg/mL的上述抗PD-1抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mM组氨酸缓冲液，pH为约5.5～6.5；(c)稳定剂，所述稳定剂为浓度约30～100mM的盐酸精氨酸与浓度约100～180mM的蔗糖的组合；以及(d)约0.01％～0.1％(w/v)的聚山梨醇酯80；或
(3)(a)约150～250mg/mL的上述抗PD-1抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mM组氨酸缓冲液，pH为约5.5～6.5；(c)稳定剂，所述稳定剂为浓度约30～100mM的盐酸精氨酸与浓度约50～150mM的甘氨酸的组合；以及(d)约0.01％～0.1％(w/v)的聚山梨醇酯80；或
(4)(a)约150～200mg/mL的上述抗PD-1抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约5.5～6.0；(c)约130～180mM的精氨酸或盐酸精氨酸；以及(d)约0.02％～0.08％(w/v)的聚山梨醇酯80；或
(5)(a)约150～200mg/mL的上述抗PD-1抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约5.5～6.0；(c)稳定剂，所述稳定剂为浓度约30～70mM的盐酸精氨酸与约110～170mM的蔗糖的组合；以及(d)约0.02％～0.08％(w/v)的聚山梨醇酯80；或
(6)(a)约150～200mg/mL的上述抗PD-1抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约5.5～6.0；(c)稳定剂，所述稳定剂为浓度约30～70mM的盐酸精氨酸与约80～120mM的甘氨酸的组合；以及(d)约0.02％～0.08％(w/v)的聚山梨醇酯80；
(7)(a)约180mg/mL的抗PD-1抗体，所述抗PD-1抗体包含如SEQ ID NO:9所示的轻链氨基酸序列，和如SEQ ID NO:10所示的重链氨基酸序列；(b)约20mM组氨酸缓冲液，pH为约6.0；(c)约140mM的盐酸精氨酸；以及(d)约0.02％(w/v)的聚山梨醇酯80；或
(8)(a)约180mg/mL的抗PD-1抗体，所述抗PD-1抗体包含如SEQ ID NO:9所示的轻链氨基酸序列，和如SEQ ID NO:10所示的重链氨基酸序列；(b)约20mM组氨酸缓冲液，pH为约6.0；(c)约150mM的盐酸精氨酸；以及(d)约0.04％(w/v)的聚山梨醇酯80。
在一些方案中，本发明提供一种药物组合物，该药物组合物含有缓冲液、抗PD-1抗体或其抗原结合片段、稳定剂和表面活性剂；其中，所述抗PD-1抗体包含如SEQ ID NO:9所示的轻链氨基酸序列和如SEQ ID NO:10所示的重链氨基酸序列；所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为150～200mg/mL；所述药物组合物的pH为5.9～6.1，渗透压在260～320mOsm/kg、优选290～310mOsm/kg的范围内。优选地，所述药物组合物中，缓冲液为组氨酸缓冲液，其浓度为15～25mM，pH约为5.9～6.1，优选约6.0。优选地，所述药物组合物中，稳定剂为约140～160mM、优选约150mM的盐酸精氨酸。优选地，所述药物组合物中，表面活性剂为聚山梨醇酯80，其浓度优选为0.02～0.06％(w/v)，优选约为0.04％(w/v)。优选地，上述药物组合物在约25℃测得的粘度≤8.0cP，更优选≤7.0cP。
在一些方案中，本文任一实施方案所述的药物组合物为液体制剂或冻干制剂。
在一些方案中，所述药物组合物为液体制剂。
在一些方案中，上述液体制剂或冻干制剂于2～8℃稳定至少3个月，至少6个月，至少12个月，至少18个月或至少24个月。
在一些方案中，上述液体制剂或冻干制剂于40℃稳定至少7天，至少14天或至少28天。
本发明还提供了一种注射剂，其含有本文任一项方案中所述的药物组合物与氯化钠溶液或葡萄糖溶液；优选地，所述氯化钠溶液浓度为约0.85～0.9％(w/v)；优选地，所述葡萄糖溶液浓度为约5～25％(w/v)，更优选为约5～10％(w/v)；优选地，所述注射剂中，所述抗PD-1抗体的浓度为约0.5～50mg/mL，更优选为约0.5～20mg/mL；所述注射剂的pH为约5.0～6.5，优选为约5.5～6.2。
在一些方案中，上述药物组合物或注射剂，其经皮下注射施用。
本发明还提供了本文任一项方案中所述的药物组合物或注射剂在制备通过消除、抑制或降低PD-1活性来治疗疾病或病症的药物中的用途。
本发明还提供了本文任一项方案中所述的药物组合物或注射剂，其通过消除、抑制或降低PD-1活性来治疗疾病或病症。
本发明还提供了一种通过消除、抑制或降低PD-1活性来治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用如本文任一项方案中所述的药物组合物或注射剂。
在一些方案中，上述疾病或病症选自癌症或感染性疾病或炎症性疾病。
本发明还提供一种降低高浓度抗体药物制剂的粘度的方法，其中，所述抗体药物制剂中的抗体浓度≥150mg/mL，如在150～250mg/mL的范围内，所述方法包括使用盐酸精氨酸、氯化钠、或蔗糖与盐酸精氨酸做为稳定剂和使用组氨酸缓冲液做为缓冲液来制备该高浓度抗体药物制剂。优选地，盐酸精氨酸的用量使得其在所制备得到的抗体药物制剂中的浓度约为100～200mM，优选约为140～160mM。优选地，氯化钠的用量使得其在所制备得到的抗体药物制剂中的浓度约为100～200mM，优选约为140～160mM。优选地，在使用蔗糖与盐酸精氨酸的混合物做为稳定剂时，蔗糖的用量使得其在所制备得到的抗体药物制剂中的浓度约为100～180mM，优选约为110～150mM；盐酸精氨酸的用量使得其在所制备得到的抗体药物制剂中的浓度约为30～80mM，优选约为30～60mM。优选地，所用的组氨酸缓冲液的pH值为5.0～6.5，优选5.5～6.2，更优选5.9～6.1。优选地，所用的组氨酸缓冲液的量使得其在所制备得到的抗体药物制剂中的浓度为15～25mM，优选约20mM。优选地，所述抗体为本文任一实施方案所述的抗PD-1抗体。优选地，所述降低高浓度抗体药物制剂的粘度的方法可将所制备得到的抗体药物制剂的粘度降低至约8.0cP以下(约25℃测定)。在一些方案中，所述方法还包括在所述抗体药物制剂中添加本文任一实施方案所述的表面活性剂，优选为0.02～0.06％(w/v)的聚山梨醇酯80。
在一些方案中，本发明还提供做为稳定剂的盐酸精氨酸、氯化钠、或蔗糖与盐酸精氨酸与组氨酸缓冲液在降低高浓度抗体药物制剂的粘度中的应用，或在制备具有降低的粘度的高浓度抗体药物制剂中的应用。优选地，所述稳定剂和组氨酸缓冲液、抗体及抗体浓度如本文任一实施方案所述。优选地，所述应用能将高浓度抗体药物制剂的粘度降低至约8.0cP以下(约25℃测定)。
附图说明
图1：第一轮处方筛选—高温试验下SEC-HPLC纯度趋势图。
图2：第一轮处方筛选—高温试验下CEX-HPLC纯度趋势图。
图3：第二轮处方筛选—高温试验下SEC-HPLC纯度趋势图。
图4：第二轮处方筛选—高温试验下CEX-HPLC纯度趋势图。
图5：第三轮处方筛选—高温试验下SEC-HPLC纯度趋势图。
图6：第三轮处方筛选—高温试验下CEX-HPLC纯度趋势图。
图7：A、B两组平均血药浓度-时间变化曲线。
图8：皮下注射制剂对hPD-1人源化小鼠移植MC38肿瘤生长的抑制作用曲线。
具体实施方式
定义和说明
为了更容易理解本发明，以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义，本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。应理解本发明不限于具体的方法、试剂、化合物、组合物或生物***，当然可以对以上进行变化。还应理解本申请所用术语仅为了描述具体的实施方式，并不旨在进行限制。本文所引用的所有参考文献，包括专利、专利申请、论文、教科书诸如此类，以及其中所引用的参考文献，就其尚未被引用的程度而言，在此其全文通过引用并入。如果所并入的文献和类似材料中的一个或多个与本申请不同或矛盾，包括但不限于所定义的术语、术语用法、所描述的技术诸如此类，则以本申请为准。
除非该内容被另外明确说明，否则本说明书以及所附权利要求中所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代。因此，例如，提及“一种多肽”包括了两种或更多种多肽等的组合。
术语“药物组合物”或“制剂”表示含有一种或多种本文所述抗体与其他组分的混合物，所述其他组分例如生理学可药用的载体和赋形剂。药物组合物的目的是促进对生物体的给药，利于活性成分的吸收进而发挥生物活性。
术语“液体制剂”是指处于液体状态下的制剂，且不意图指称重悬浮的冻干制剂。本发明的液体制剂在储存时稳定，并且其稳定性不依赖于冻干(或其他状态改变方法，例如喷雾干燥)。
术语“水性液体制剂”是指使用水作为溶剂的液体制剂。在一些方案中，水性液体制剂是不需冻干、喷雾干燥和/或冷冻来维持稳定性(例如化学和/或物理稳定性和/或生物活性)的制剂。
术语“赋形剂”是指可以向制剂添加以提供所需特性(例如稠度、提高的稳定性)和/或调节渗透压的试剂。常用赋形剂的实例包括但不限于糖类、多元醇、氨基酸、表面活性剂和聚合物。
本申请所用的“约”在指代可测量数值(如量、持续时间等)时意在涵盖相对于具体数值±20％或±10％的变化，包括±5％、±1％和±0.1％，因为这些变化适于进行所公开的方法。
术语“缓冲液pH为约5.0～6.5”是指这样的试剂，通过其酸/碱共轭组分的作用使得包含该试剂的溶液能抵抗pH变化。本发明的制剂中使用的缓冲液可具有约5.0至约6.5范围内的pH、或约5.5至约6.5范围内的pH、或约5.0至约6.0范围内的pH。
在本文中，将pH控制在该范围内的“缓冲液”实例包括醋酸、醋酸盐(例如醋酸钠)、琥珀酸、琥珀酸盐(例如琥珀酸钠)、葡萄糖酸、组氨酸、组胺酸盐(例如组氨酸盐酸盐)、甲硫氨酸、柠檬酸(枸橼酸)、柠檬酸盐(枸橼酸盐)、磷酸盐、柠檬酸盐/磷酸盐、咪唑、其组合和其他有机酸缓冲剂。
“组氨酸缓冲液”为包含组氨酸离子的缓冲液。组氨酸缓冲液的实例包括组氨酸和组氨酸的盐，如组氨酸盐酸盐、组氨酸乙酸盐、组氨酸磷酸盐和组氨酸硫酸盐等，如含有组氨酸与组氨酸盐酸盐的组氨酸缓冲液；本发明的组氨酸缓冲液也包括含有组氨酸和醋酸盐(如钠盐或钾盐)的组氨酸缓冲液。
“柠檬酸缓冲液”，又称“枸橼酸缓冲液”，是包括柠檬酸根离子的缓冲液。柠檬酸盐缓冲液的实例包括柠檬酸-柠檬酸钠、柠檬酸-柠檬酸钾、柠檬酸-柠檬酸钙、柠檬酸-柠檬酸镁等。优选的柠檬酸盐缓冲液为柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液。
“醋酸缓冲液”是包括醋酸根离子的缓冲液。醋酸盐缓冲液的实例包括醋酸-醋酸钠、醋酸-醋酸钾、醋酸-醋酸钙、醋酸-醋酸镁等。优选的醋酸盐缓冲液为醋酸-醋酸钠缓冲液。
“琥珀酸缓冲液”是包括琥珀酸根离子的缓冲液。琥珀盐缓冲液的实例包括琥珀酸-琥珀酸钠、琥珀-琥珀酸钾、琥珀酸-琥珀酸钙、琥珀酸-琥珀酸镁等。优选的琥珀酸盐缓冲液为琥珀-琥珀酸钠缓冲液。
术语“稳定剂”表示药学上可接受的赋形剂，其在制造，储存和应用过程中保护活性药物成分和/或制剂免受化学和/或物理降解。稳定剂包括但不限于如以下定义的糖，氨基酸，盐，多元醇和他们的代谢产物，例如氯化钠、氯化钙、氯化镁、甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、精氨酸或其盐(如盐酸精氨酸)、甘氨酸、丙氨酸(α-丙氨酸、β-丙氨酸)、甜菜碱、亮氨酸、赖氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、4-羟基脯氨酸、肌氨酸、γ-氨基丁酸(GABA)、奥品类(opines)、丙氨奥品、章鱼碱、甘氨奥品(strombine)和三甲胺的N-氧化物(TMAO)、人血清白蛋白(hsa)、牛血清白蛋白(BSA)、α-酪蛋白、球蛋白、α-乳白蛋白、LDH、溶菌酶、肌红蛋白、卵清蛋白和RNAase A。部分稳定剂，如氯化钠、氯化钙、氯化镁、甘露醇、山梨醇、蔗糖等也可起到控制渗透压的作用。在本发明中具体地使用的稳定剂选自多元醇、氨基酸、盐、糖中的一种或一种以上。优选的盐为氯化钠，优选的糖为蔗糖和海藻糖，优选的多元醇为山梨醇和甘露醇。优选的氨基酸为精氨酸、甘氨酸、脯氨酸，氨基酸可以以其D-和/或L-型存在，但典型是L-型，氨基酸可以任何合适的盐存在，例如盐酸盐，如盐酸精氨酸。优选的稳定剂为氯化钠、甘露醇、山梨醇、蔗糖、海藻糖、盐酸精氨酸、甘氨酸、脯氨酸、氯化钠-山梨醇、氯化钠-甘露醇、氯化钠-蔗糖、氯化钠-海藻糖、盐酸精氨酸-甘露醇、盐酸精氨酸-蔗糖。
术语“表面活性剂”一般包括保护蛋白质例如抗体免受空气/溶液界面诱导的应力、溶液/表面诱导的应力的影响以减少抗体的聚集或使制剂中颗粒物的形成最小化的试剂。示例性的表面活性剂包括但不限于非离子型表面活性剂例如聚氧乙烯脱水山梨醇脂肪酸酯(如聚山梨醇酯20和聚山梨醇酯80)、聚乙烯-聚丙烯共聚物、聚乙烯-聚丙烯二醇、聚氧乙烯-硬脂酸酯、聚氧乙烯烷基醚、例如聚氧乙烯单月桂基醚、烷基苯基聚氧乙烯醚(Triton-X)、聚氧乙烯-聚氧丙烯共聚物(泊洛沙姆，Pluronic)、十二烷基硫酸钠(SDS)。本文中，如无特别说明，术语“聚山梨醇酯20的浓度”和“聚山梨醇酯80的浓度”均是指质量体积浓度(w/v)，如“约0.04％聚山梨醇酯80”中“0.04％”即指“100mL液体中含有0.04g的聚山梨醇酯80”。
本文所用的术语“粘度”可以是“运动粘度”或“绝对粘度”。“运动粘度”是对流体在重力影响下所产生的抵抗性流动的一种测量指标。“绝对粘度”，有时称为动态粘度或简单粘度，是运动粘度与流体密度的乘积(绝对粘度＝运动粘度X密度)。运动粘度的量纲是L2/T，其中L是长度，T是时间。通常，运动粘度以厘沲(cSt)表示。运动粘度的国际单位制单位是mm2/s，即lcSt。绝对粘度以厘泊(cP)单位表示。绝对粘度的国际单位制单位是毫帕斯卡·秒(mPa·s)，其中1cP＝lmPa·s。
对于本发明的液体型制剂，本文所用的术语“低水平粘度”将表示低于约15厘泊(cP)的绝对粘度。例如，如果当使用标准粘度测量技术测量时，该制剂展示的绝对粘度为约15cP、约14cP、约13cP、约12cP、约11cP、约10cP、约9cP、约8cP，或更低，则本发明液体型制剂将被认为是具有“低粘度”。对于本发明液体型制剂，本文所用的术语“中等水平粘度”将表示介于约35cP和约15cP之间的绝对粘度。例如，如果当使用标准粘度测量技术测量时，该制剂展示的绝对粘度为约34cP、约33cP、约32cP、约31cP、约30cP、约29cP、约28cP、约27cP、约26cP、约25cP、约24cP、约23cP、约22cP、约21cP、约20cP、约19cP、18cP、约17cP、约16cP，或约15cP，则本发明液体型制剂将被认为是具有“中等粘度”。本发明药物组合物在某些实施方式中可展示约7cP或以下的超低水平的粘度。在一些实施方式中，不同辅料粘度对比发现，精氨酸或其盐可以获得的粘度、稳定性和药效明显优于其它辅料。在一些实施方式中，从缓冲体系方面对比发现，组氨酸缓冲体系的粘度、稳定性和药效明显优于其它缓冲体系。
术语“等渗”是指该制剂具有与人血液基本相同的渗透压。等渗制剂一般具有约250至350mOsm的渗透压。可使用蒸汽压或冰点下降式的渗透压计测量等渗性。
术语“稳定的”制剂是其中的抗体在制造过程期间和/或储存时基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物活性的制剂。即使所含的抗体在经过一定时间储存之后未能保持其100％的化学结构或生物功能，医药制剂也可以是稳定的。在某些情况下，在经过一定时间储存之后，能维持约90％、约95％、约96％、约97％、约98％或约99％的抗体结构或功能，也可被认为是“稳定的”。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本技术领域中是可得的，并综述在《肽和蛋白质药物递送》(Peptide and Protein Drug Delivery)247～301，Vincent Lee主编，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991)，和Jones，A.(1993)Adv.Drug Delivery Rev.10：29～90中(二者引入作为参考)。
制剂在一定温度下经过一定时间的储存之后，通过测定其中剩余的天然抗体的百分比(及其它方法)，可以测量其稳定性。除其它方法外，天然抗体的百分比可以通过尺寸排阻色谱法(例如尺寸排阻高效液相色谱法[SEC-HPLC])来测量，“天然的”指未聚集的和未降解的。在一些方案中，蛋白质的稳定性按照具有低百分比的降解(例如片段化)和/或聚集蛋白质的溶液中单体蛋白质的百分数来确定。在一些方案中，制剂可以在室温、约25～30℃或40℃下稳定储存至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月，或更长，最多不超过约6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％，或0.1％聚集形式的抗体。
通过测定在离子交换期间在此抗体主馏分(“主要荷电形式”)较为酸性的馏分中迁移的抗体(“酸性形式”)的百分比(及其它方法)，可以测量稳定性，其中稳定性与酸性形式抗体的百分比成反比。除其它方法外，“酸化”抗体的百分比可以通过离子交换色谱法(例如阳离子交换高效液相色谱法[CEX-HPLC])来测量。在一些实施方式中，可接受程度的稳定性意为当制剂在一定温度下经过一定时间的储存之后，其中可检测出的酸性形式的抗体最多不超过约49％、45％、40％、35％、30％、25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.1％。在测量稳定性之前储存的一定时间可以是至少2周、至少28天、至少1个月、至少2个月、至少3个月、至少4个月、至少5个月、至少6个月、至少7个月、至少8个月、至少9个月、至少10个月、至少11个月、至少12个月、至少18个月、至少24个月，或更长。当评估稳定性时，容许储存医药制剂的一定温度可以是约-80℃至约45℃范围内的任何温度，例如储存于约-80℃、约-30℃、约-20℃、约0℃、约2～8℃、约5℃、约25℃，或约40℃。
如果抗体在颜色和/或澄清度目测检查时或通过UV光散射或通过孔径排阻层析测量时基本上不显示出例如聚集、沉淀和/或变性的迹象，则所述抗体在该药物组合物中“保持其物理稳定性”。聚集是单个分子或复合物共价或非共价缔合以形成聚集体的过程。聚集可以进行到形成可见沉淀物的程度。
制剂的稳定性例如物理稳定性可以通过本技术领域中公知的方法来评估，包括测量样品的表观消光度(吸光度或光密度)。这样的消光测量与制剂的浊度相关。制剂的浊度部分地是溶解在溶液中的蛋白质的固有性质，并且通常通过比浊法来测量，并用比浊法浊度单位(NTU)来量度。
随着例如溶液中一种或多种组分的浓度(例如蛋白质和/或盐浓度)而变化的浊度水平也被称为制剂的“乳浊”或“乳浊外观”。浊度水平可以参照使用已知浊度的悬液产生的标准曲线来计算。用于测定药物组合物的浊度水平的参比标准品可以基于《欧洲药典》标准(《欧洲药典》(European Pharmacopoeia)，第四版，“欧洲药品质量委员会指令”(Directorate for the Quality of Medicine of the Council of Europe)(EDQM)，Strasbourg，France)。根据《欧洲药典》标准，澄清溶液被定义为浊度低于或等于按照《欧洲药典》标准具有约3的参比悬液的浊度的溶液。比浊法的浊度测量可以检测在不存在缔合或非理想效应的情况下的瑞利散射，其通常随浓度线性变化。用于评估物理稳定性的其他方法在本技术领域中是公知的。
如果抗体在给定时间点的化学稳定性使得抗体被认为仍保持如下文中所定义的其生物活性，则所述抗体在药物组合物中“保持其化学稳定性”。可以通过例如检测或定量抗体的化学改变的形式来评估化学稳定性。化学改变可以包括尺寸改变(例如剪短)，其可以使用例如孔径排阻层析、SDS-PAGE和/或基质辅助的激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI/TOF MS)来评估。其他类型的化学改变包括电荷改变(例如作为脱酰胺或氧化的结果而发生)，其可以通过例如离子交换层析来评估。
如果药物组合物中的抗体对于其预期目的来说是生物活性的，则所述抗体在药物组合物中“保持其生物活性”。例如，如果制剂于例如5℃、25℃、45℃等温度下储存一定时间(例如1至12个月)之后，该制剂所含抗PD-1抗体与PD-1结合的亲和力为所述储存之前抗体结合亲和力的至少90％、95％或以上，则可认为本发明之制剂是稳定的。结合亲和力也可用例如ELISA或等离子共振技术测定。
在本发明的情形中，在药理学意义上，抗体的“治疗有效量”或“有效量”是指在抗体可以有效治疗的障碍的症状的预防或治疗或减轻方面有效的量。本发明中，药物的“治疗有效量”或“治疗有效剂量”是当单独使用或与另一种治疗剂组合使用时保护受试者免于疾病发作或促进疾病消退的任何量的药物，所述疾病消退通过疾病症状的严重性的降低，疾病无症状期的频率和持续时间的增加，或由疾病痛苦引起的损伤或失能的预防来证明。药物促进疾病消退的能力可以使用本领域技术人员已知的多种方法来评价，比如在临床试验期间的人受试者中，在预测人类功效的动物模型***中，或通过在体外测定法中测定所述药剂的活性。药物治疗有效量包括“预防有效量”，即当单独或如与其它治疗药物组合给与处于患病风险的受试者或患病复发的受试者时，抑制疾病的发展或复发的任何量的药物。
术语“受试者”或“患者”意图包括哺乳动物生物体。受试者/患者的实例包括人类和非人类哺乳动物，例如非人类灵长动物、狗、奶牛、马、猪、绵羊、山羊、猫、小鼠、兔、大鼠和转基因非人类动物。在本发明的特定实施方式中，受试者是人类。
术语“施用”、“给与”及“处理”是指采用本领域技术人员已知的各种方法或递送***中的任意一种将包含治疗剂的组合物引入受试者。抗PD-1抗体的给药途径包括静脉内、肌内、皮下、腹膜、脊髓或其他胃肠外给药途径，比如注射或输注。“胃肠外给药”是指除了肠内或局部给药以外的通常通过注射的给药方式，包括但不限于静脉内、肌内、动脉内、鞘内、淋巴内、损伤内、囊内、框内、心内、皮内、腹膜内、经气管、皮下、表皮下、关节内、囊下、蛛网膜下、脊柱内、硬膜内和胸骨内注射和输注以及经体内电穿孔。
抗PD-1抗体
本文所用的术语“抗体”应被理解为包括完整抗体分子及其抗原结合片段。本文所用的术语抗体的“抗原结合部分”或“抗原结合片段”(或简称为“抗体部分”或“抗体片段”)是指抗体中保持了与人PD-1或其表位特异性结合能力的一个或多个片段。因此，其以最广义使用，具体包括但不限于单克隆抗体(包括全长单克隆抗体)、多克隆抗体、多特异性抗体(例如双特异性抗体)、人源化抗体、全人抗体、嵌合抗体和骆驼源化单结构域抗体。
术语“分离的抗体”是指结合化合物的纯化状态，且在这种情况下意指该分子基本不含其它生物分子，例如核酸、蛋白质、脂质、糖或其它物质例如细胞碎片和生长培养基。术语“分离(的)”并非意指完全不存在这类物质或不存在水、缓冲液或盐，除非它们以明显干扰本文所述结合化合物的实验或治疗应用的量存在。
术语“单克隆抗体”是指获自基本均质抗体群的抗体，即组成该群的各个抗体除可少量存在的可能天然存在的突变之外是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单一抗原表位。相比之下，常规(多克隆)抗体制备物通常包括大量针对不同表位(或对不同表位有特异性)的抗体。修饰语“单克隆”表明获自基本均质抗体群的抗体的特征，且不得解释为需要通过任何特定方法产生抗体。
术语“鼠源抗体”或“杂交瘤抗体”在本公开中为根据本领域知识和技能制备的抗人PD-1的单克隆抗体。制备时用PD-1抗原注射试验对象，然后分离表达具有所需序列或功能特性的抗体的杂交瘤。
术语“嵌合抗体”是具有第一抗体的可变结构域和第二抗体的恒定结构域的抗体，其中第一抗体和第二抗体来自不同物种。通常，可变结构域获自啮齿动物等的抗体(“亲代抗体”)，而恒定结构域序列获自人抗体，使得与亲代啮齿动物抗体相比，所得嵌合抗体在人受试者中诱导不良免疫应答的可能性较低。
术语“人源化抗体”是指含有来自人和非人(例如小鼠、大鼠)抗体的序列的抗体形式。一般而言，人源化抗体包含基本所有的至少一个、通常两个可变结构域，其中所有或基本所有的超变环相当于非人免疫球蛋白的超变环，而所有或基本所有的构架(FR)区是人免疫球蛋白序列的构架区。人源化抗体任选可包含至少一部分的人免疫球蛋白恒定区(Fc)。
术语“全长抗体”或“完整抗体分子”指包含四条肽链的免疫球蛋白分子，两条重(H)链(全长时约50～70kDa)和两条轻(L)链(全长时约25kDa)通过二硫键互相连接。每一条重链由重链可变区(在本文中缩写为VH)和重链恒定区(在本文中缩写为CH)组成。重链恒定区由3个结构域CH1、CH2和CH3组成。每一条轻链由轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。VH和VL区可被进一步细分为具有高可变性的互补决定区(CDR)和其间隔以更保守的称为框架区(FR)的区域。每一个VH或VL区由按下列顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4从氨基末端至羧基末端排列的3个CDR和4个FR组成。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。抗体的恒定区可介导免疫球蛋白对宿主组织或因子(包括免疫***的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体***的第一组分(Clq)的结合。
术语“CDR”是指抗体可变序列内的互补决定区。在重链和轻链的各个可变区中存在3个CDR，其对于各个重链和轻链可变区被命名为HCDR1、HCDR2和HCDR3或LCDR1、LCDR2和LCDR3。这些CDR的准确边界按照不同的***有不同的定义。
本发明的所述抗体的可变区CDR的精确氨基酸序列边界可使用许多公知的方案的任何方案来确定，包括基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia(Chothia等人.(1989)Nature 342:877-883，Al-Lazikani等人,“Standard conformations for thecanonical structures of immunoglobulins”,Journal of Molecular Biology,273,927-948(1997)基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat等人,Sequences of Proteins ofImmunological Interest,第4版,U.S.Department of Health and Human Services,National Institutes of Health(1987),AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际ImMunoGeneTics database(IMGT)(1999NucleicAcids Research,27,209-212)，以及基于利用大量晶体结构的近邻传播聚类(affinitypropagation clustering)的North CDR定义。本发明抗体的CDR可以由本领域的技术人员根据本领域的任何方案(例如不同的指派***或组合)确定边界。
本文所使用的“抗原结合片段”包括抗体的片段或其衍生物，通常包括亲代抗体的抗原结合区或可变区(例如一个或多个CDR)的至少一个片段，其保持亲代抗体的至少一些结合特异性。抗原结合片段的实例包括但不限于Fab，Fab'，F(ab')2和Fv片段；双抗体；线性抗体；单链抗体分子，例如sc-Fv；由抗体片段形成的纳米抗体(nanobody)和多特异性抗体。当抗体的结合活性在摩尔浓度基础上表示时，结合片段或其衍生物通常保持亲代抗体抗原结合活性的至少10％。优选结合片段或其衍生物保持亲代抗体的抗原结合亲和力的至少20％、50％、70％、80％、90％、95％或100％或更高。还预期抗体的抗原结合片段可包括不明显改变其生物活性的保守或非保守氨基酸取代(称为抗体的“保守变体”或“功能保守变体”)。
本发明所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包括申请号为CN201310258289.2中描述的任意一个抗PD-1抗体或其抗原结合片段，本文将其所公开的全部内容以引入的方式纳入本文。在一些方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗体的CDR序列包括来自于CN201310258289.2中描述的人源化抗体克隆38。
在一些方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。
在一些方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗PD-1抗体或其抗原结合片段选自鼠源抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段，优选为人源化抗体或其抗原结合片段。
在一些方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:7所示的轻链可变区，和如SEQ ID NO:8所示的重链可变区。
在一些方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗PD-1抗体包含如SEQ ID NO:9所示的轻链氨基酸序列，和如SEQ ID NO:10所示的重链氨基酸序列。
在一些方案中，在本文实施例中所用的非限制性、示范性抗体为Toripalimab(一种具有WHO Drug Information(第32卷，第2期，第372～373页(2018))中所述的结构且包含序列SEQ ID NO：9和10所示的重链及轻链氨基酸序列的人源化IgG4 mAb。
本文提及的SEQ ID NO：1-10的氨基酸序列如下表所示：
Figure BDA0003773451990000191
Figure BDA0003773451990000201
在一些实施方案中，在本发明的方法和组合物中使用的抗PD-1抗体或其抗原结合片段为人源化抗体或嵌合抗体，且可包括人恒定区。在一些实施方式中，恒定区是选自人IgG1、IgG2、IgG3及IgG4恒定区组成的组；优选地，适用于本发明所述的方法和组合物的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含人IgG1或IgG4同种型的重链恒定区，更优选是人IgG4恒定区。在一些实施方式中，抗PD-1抗体或其抗原结合片段的IgG4重链恒定区的序列包含S228P突变，其用IgG1同种型抗体的相应位置处通常存在的脯氨酸残基替代铰链区中的丝氨酸残基。
在一些实施方式中，本发明提供了一种用于制备如本文所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的方法，所述方法包括在适合于所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下在本文所述的宿主细胞中表达所述抗体或其抗原结合片段，并从所述宿主细胞回收所表达的抗体或其抗原结合片段。
本发明提供用于表达本发明的重组抗体的哺乳动物宿主细胞，包括可获自美国典型培养物保藏中心(ATCC)的许多永生化细胞系。这些尤其包括中国仓鼠卵巢(CHO)细胞、NS0、SP2/0细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、猴肾细胞(COS)、人肝细胞癌细胞、A549细胞、293T细胞和许多其它细胞系。哺乳动物宿主细胞包括人、小鼠、大鼠、狗、猴、猪、山羊、牛、马和仓鼠细胞。通过测定哪种细胞系具有高表达水平来选择特别优选的细胞系。
在一个实施方式中，本发明提供制备抗PD-1抗体的方法，其中所述方法包括，将表达载体导入哺乳动物宿主细胞中时，通过将宿主细胞培养足够的一段时间，以允许抗体在宿主细胞中表达，或者更优选抗体分泌到宿主细胞生长的培养基中,来产生抗体。可采用标准蛋白质纯化方法从培养基中回收抗体。
很可能由不同细胞系表达或在转基因动物中表达的抗体彼此具有不同的糖基化。然而，由本文提供的核酸分子编码的或包含本文提供的氨基酸序列的所有抗体是本发明的组成部分，而不论抗体的糖基化如何。同样，在某些实施方式中，非岩藻糖基化抗体是有利的，因为它们通常在体外和体内具有比其岩藻糖基化对应物更强力的功效，并且不可能是免疫原性的，因为它们的糖结构是天然人血清IgG的正常组分。
医药制剂
本发明所述的药物组合物是一种含有与PD-1特异性结合的抗体的高浓度、高稳定性、超低粘度的药物组合物。对于>100mg/mL高剂量蛋白质药物的皮下(SC)给药的临床需求通常引入关于制造、分析测试、稳定性和递送方面的额外的技术开发挑战。高浓度蛋白制剂的常见属性为高粘度，这是直接由蛋白的可逆自缔合导致的。由于高注射力(注射位点疼痛的增加)，高粘度也可引起额外的临床开发挑战，并还会改变药物的药代动力学性质。因此，产品开发工作的一个重要因素就是寻求鉴定具有低粘度的制剂。本发明通过选择适当的缓冲体系和pH，优化稳定剂和表面活性剂，并进行药代动力学和药效研究，开发得到的高浓度抗体制剂可用于皮下给药剂型，且长期稳定、无聚集、超低粘度。
本发明提供了一种药物组合物，包含：(1)缓冲液；(2)抗PD-1抗体或其抗原结合片段。
本发明所述药物组合物中的抗PD-1抗体或其抗原结合片段如本申请“抗PD-1抗体”部分任一实施方案所述。
例如，本发明所述药物组合物中的抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3。优选地，上述抗PD-1抗体或其抗原结合片段选自鼠源抗体或其抗原结合片段、嵌合抗体或其抗原结合片段、人源化抗体或其抗原结合片段，优选为人源化抗体或其抗原结合片段。优选地，上述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:7所示的轻链可变区，和如SEQ ID NO:8所示的重链可变区。更优选地，上述抗PD-1抗体包含如SEQ ID NO:9所示的轻链氨基酸序列，和如SEQ ID NO:10所示的重链氨基酸序列。
本发明所述药物组合物中的抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约100～250mg/mL，优选为约150～250mg/mL，更优选为约150～200mg/mL。
本发明所述药物组合物的pH为约5.0～6.5，优选为约5.5～6.2，更优选为约6.0。
本发明所述药物组合物中的缓冲液选自醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液和组氨酸缓冲液中的一种或多种；优选地，所述缓冲液为组氨酸缓冲液。优选地，组氨酸缓冲液选自组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液或组氨酸-组氨酸醋酸盐缓冲液，优选组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液。优选地，缓冲液的浓度为约5～100mM，优选为约10～50mM，优选为约10～30mM；优选为约15～25mM。优选地，缓冲液的pH为约5.0～6.5，优选为约5.5～6.5，优选为约5.5～6.2。
因此，本发明的药物组合物可含有：pH约为5.5～6.5的组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液，其在药物组合物中的浓度约为10～30mM；和约150～250mg/mL的前文任一实施方案所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，尤其是本文所述的人源化抗体克隆38或其抗原结合片段。
在一些方案中，本发明所述药物组合物还包括稳定剂，所述稳定剂选自精氨酸、精氨酸盐、氯化钠、甘露醇、山梨醇、蔗糖、甘氨酸和海藻糖中的一种或多种；优选地，上述精氨酸盐为盐酸精氨酸。优选地，上述稳定剂的浓度为约10～400mM，优选为约100～250mM，优选为约120～220mM，优选为约130～180mM。优选地，上述稳定剂为浓度约120～220mM的精氨酸或精氨酸盐；或上述稳定剂为浓度约30～100mM的盐酸精氨酸与浓度约100～180mM的蔗糖的组合；或上述稳定剂为浓度约30～100mM的盐酸精氨酸与浓度约50～150mM的甘氨酸的组合；优选地，上述稳定剂为浓度约130～180mM的精氨酸或精氨酸盐；或上述稳定剂为浓度约30～70mM的盐酸精氨酸与约110～170mM的蔗糖的组合；或上述稳定剂为浓度约30～70mM的盐酸精氨酸与约80～120mM的甘氨酸的组合；优选地，上述精氨酸盐为盐酸精氨酸。
因此，本发明的药物组合物可含有：pH约为5.5～6.5的组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液，其在药物组合物中的浓度约为10～30mM；约150～250mg/mL的前文任一实施方案所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，尤其是本文所述的人源化抗体克隆38或其抗原结合片段；以及约100～250mM的稳定剂，优选地，所述稳定剂选自精氨酸、精氨酸盐、氯化钠、甘露醇、山梨醇、蔗糖、甘氨酸和海藻糖中的一种或多种，优选地，上述精氨酸盐为盐酸精氨酸。优选地，上述稳定剂为浓度约120～220Mm的精氨酸或精氨酸盐；或上述稳定剂为浓度约30～100mM的盐酸精氨酸与浓度约100～180mM的蔗糖的组合；或上述稳定剂为浓度约30～100mM的盐酸精氨酸与浓度约50～150mM的甘氨酸的组合。
在一些方案中，上述药物组合物还包括表面活性剂，所述表面活性剂选自聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20和泊洛沙姆188中的一种或多种。优选地，以w/v计算，上述表面活性剂浓度为约0.001％～0.1％，优选为约0.01％～0.1％，优选为约0.02％～0.08％。
因此，本发明的药物组合物可含有：pH约为5.5～6.5的组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液，其在药物组合物中的浓度约为10～30mM；约150～250mg/mL的前文任一实施方案所述的抗PD-1抗体或其抗原结合片段，尤其是本文所述的人源化抗体克隆38或其抗原结合片段；约100～250mM的稳定剂，优选地，上述稳定剂为浓度约120～220Mm的精氨酸或精氨酸盐；或上述稳定剂为浓度约30～100mM的盐酸精氨酸与浓度约100～180mM的蔗糖的组合；或上述稳定剂为浓度约30～100mM的盐酸精氨酸与浓度约50～150mM的甘氨酸的组合；以及以w/v计，约0.01％～0.1％的聚山梨醇酯80。
本发明的药物组合物为液体制剂或冻干制剂。
本发明的药物组合物的渗透压在260～320mOsm/kg的范围内，优选在290～310mOsm/kg的范围内。
本发明的药物组合物在约25℃测得的粘度≤8.0cP。
医药用途和方法
本发明还提供了本文任一项方案中所述的药物组合物或注射剂在制备通过消除、抑制或降低PD-1活性来治疗疾病或病症的药物中的用途。
本发明还提供了本文任一项方案中所述的药物组合物或注射剂，其通过消除、抑制或降低PD-1活性来治疗疾病或病症。
本发明还提供了一种通过消除、抑制或降低PD-1活性来治疗疾病或病症的方法，其包括向有需要的受试者施用如本文任一项方案中所述的药物组合物或注射剂。
在一些方案中，上述疾病或病症选自癌症或感染性疾病或炎症性疾病：所述癌症优选选自结肠癌、神经内分泌瘤、食管癌、鼻咽癌、肉瘤、黑素瘤、尿路上皮癌和非小细胞肺癌。
实施例
下文将以具体实施例的方式阐述本发明。应理解，这些实施例仅仅是阐述性的，并非意图限制本发明的范围。本文已经详细描述了本发明，其中也公开了其具体实施方式。对本领域的技术人员而言，在不脱离本发明精神和范围的情况下，针对本发明具体实施方式进行各种变化和改进将是显而易见的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。实施例中所用到的方法和材料，除非另有说明，否则为本领域的常规方法和材料。
实施例中所用的检测方法包括：
(1)外观
采用目检法来检测外观。确保澄明度检测仪的光照强度保持在1000lx～1500lx之间。将样品保持在眼睛的同一水平面，轻轻摇晃或颠倒以避免产生气泡。分别在黑色背景和白色背景前进行目检。从颜色，乳光和可见异物三个方面记录结果。
(2)蛋白含量
蛋白浓度使用Nanodrop和SoloVPE检测。使用Nanodrop时，将百分比消光系数(E1％)设定在1.416(mg/mL)-1cm-1。用超纯水清洗检测器三次，再向检测孔中加入3μL超纯水，点击校正，以超纯水作为空白校正。空白校正后测定样品，向检测孔中加入3μL样品，点击“检测”按键，并记录仪器检测数据。每个样品平行测定3份溶液，每份溶液测定1次。
使用SoloVPE检测时，将百分比消光系数(E1％)设定在1.416(mg/mL)-1cm-1。用超纯水作为空白校正后测定样品，向比色皿中加入120μL样品，点击“检测”按键，并记录仪器检测数据。
(3)SEC-HPLC纯度
SEC-HPLC纯度采用安装了SEC色谱柱(TSK gel G3000SWXL,7.8*300mm,5μm)的HPLC(Waters e2695仪器)进行检测。流动相组成为50mM磷酸盐，300mM Na2SO4，pH 7.0±0.2。采用峰面积归一化对结果进行定量分析。分别计算单体、聚体和片段的峰面积百分比，以单体的峰面积百分比作为样品的纯度，聚体和片段的峰面积百分比作为聚体和片段的含量。色谱参数见下表1。
表1：SEC-HPLC色谱参数
色谱条件 色谱参数
色谱柱 TSK gel G3000SWXL,7.8*300mm,5μm
检测器波长 280nm
自动进样器温度 5±3℃
柱温 25±2℃
流速 0.5mL/min
进样体积 25μL
运行模式 等度洗脱
洗脱时间 30min
(4)R-CE-SDS纯度
抗体制剂还原CE-SDS电泳法纯度检测以高压直流电场为驱动力，以毛细管为分离通道。预先填充的凝胶会在毛细管内形成分子筛，十二烷基硫酸钠可消除不同蛋白质分子的电荷效应，还原剂β-巯基乙醇可切除样品中的二硫键，分子大小不同的样品在毛细管内移动速度不同，因而可进行分离。用上样缓冲液(SDS-MW Sample Buffer)将样品稀释至1mg/mL；取上样缓冲液(SDS-MW Sample Buffer)95μL，加入β-巯基乙醇5μL，涡旋混匀后作为空白对照。取供试品(1mg/mL)95μL，加入β-巯基乙醇5μL，3000rpm室温离心30sec，70±2℃孵育15±2min，冷却至室温，6000rpm室温离心1min，分离时间40min，使用毛细管电泳仪(Beckman)检测。计算重链(HC)，非糖基化重链(NGHC)和轻链(LC)的纯度，三者之和即为样品的纯度。
(5)NR-CE-SDS纯度
抗体制剂非还原CE-SDS电泳法纯度检测以高压直流电场为驱动力，以毛细管为分离通道。预先填充的凝胶会在毛细管内形成分子筛，用十二烷基硫酸钠处理样品以消除不同蛋白质分子的电荷效应，使分子大小不同而在毛细管内移动速度不同的样品进行分离。供试品溶液中加入烷基化试剂，能够有效减小组分扩散，使所得峰型尖锐，分离效率高，且可以保证样品保持非还原状态。用上样缓冲液(SDS-MW Sample Buffer)将样品稀释至1mg/mL；取上样缓冲液(SDS-MW Sample Buffer)95μL，加入0.8M碘乙酰胺溶液5μL，涡旋混匀后作为空白对照；取供试品(1mg/mL)95μL，加入0.8M碘乙酰胺溶液5μL，3000rpm室温离心30sec，70±2℃孵育5±1min，冷却至室温，6000rpm室温离心1min，使用毛细管电泳仪(Beckman)检测。
(6)CEX-HPLC纯度
CEX-HPLC纯度采用安装了色谱柱(ProPac WCX-10,4*250mm)的HPLC(Waterse2695仪器)进行检测。流动相组成为A相：10mM二水合磷酸二氢钠溶液(pH4.7±0.2)；B相：10mM十二水合磷酸氢二钠溶液(pH9.2±0.2)。采用峰面积归一化法计算主峰、酸性峰、碱性峰百分比，如果采用自动积分无法获得合理的积分结果，则采用手动积分。详细色谱参数见下表2。
表2：CEX-HPLC色谱参数
Figure BDA0003773451990000261
Figure BDA0003773451990000271
(7)细胞活性
在本方法中，使用PD-1Jurkat T细胞作为效应细胞，将过度表达PD-L1的CHO工程细胞作为靶细胞。Jurkat效应细胞上的T细胞抗原受体可与CHO靶细胞上抗原结合，可抑制NFAT萤光素酶报告基因表达。PD-1单抗可与Jurkat T细胞上PD-1结合，.从而阻断Jurkat T细胞上PD-1与CHO靶细胞上PD-LI相互作用并促进T细胞活化，使NFAT萤光素酶报告基因激活。加入Lueiferase检测试剂，用酶标仪化学发光法检测T细胞-Jurkat细胞内NFAT-Luciferase表达萤光素酶所产生信号强弱来考察PD-1单抗结合PD-1分子的能力。
(8)结合活性
本方法采用间接法，用人PD-1作为抗原包被到96孔板上，PD-1单抗可与人PD-1结合，生物素标记的抗体(Biotinylated Mouse Anti-Human IgG4)可与结合到固相抗原(人PD-1)上的PD-1单抗特异性结合，辣根过氧化物酶标记链霉亲和素(Peroxidase-conjugated Streptavidin)可与生物素标记的抗体(Biotinylated Mouse Anti-HumanIgG4)结合，辣根过氧化物酶标记链霉亲和素在过氧化氢作用下可催化TMB显蓝色，蓝色深浅与辣根过氧化物酶标记链霉亲和素结合量呈正相关，用2M盐酸终止后变为黄色。用酶标仪在450nm/620nm波长下测定吸光度(OD值)，通过标准曲线的有效结合活性(EC50)来考察PD-1单抗结合PD-1的能力。
(9)MFI亚可见颗粒检测
MFI亚可见颗粒检测采用微粒检测仪(MFI5100)进行检测。由于样品为高浓度样品，上样前需将进行一定稀释，稀释后轻轻充分混匀避免气泡后于超净台中用无热原枪头取样1.3mL至上样板中，上样板以洁净的锡箔纸覆盖严密，从超净台移至仪器对应工作板块后，将上样位置输入仪器，运行检测序列，样品流经流通池时，其中亚可见颗粒由***头拍照并进行计数。
(10)HIAC亚可见颗粒检测
亚可见颗粒检测采用HIAC进行检测。将样品轻轻充分混匀避免气泡后置于样品槽，仪器机械臂自动取样，样品流经感应器时，其中亚可见颗粒由光阻法进行计数。
(11)粘度
粘度检测采用粘度计(厂家：RheoSense，型号：MicroVisc)，测试温度为约25℃，剪切速率为约1000-2000s-1。
以下实施例中的缩写说明：“hr”表示小时，“W”表示周，“M”表示月，“C”表示冻融循环的次数，“FT”表示冻融循环，“RT”表示室温，“T0”表示处方样品经放样处理前的起始测试。
实施例1：缓冲液体系和稳定剂初步筛选实验
液体型药物组合物中，缓冲液体系和pH密切影响抗体的稳定性，每种具有独特理化性质的抗体都具有最适宜的缓冲液的种类和pH。本实施例旨在初步筛选出最佳缓冲液体系和稳定剂，使本发明公开的抗PD-1抗体具有最佳的稳定性以适宜临床应用。
1.1实验步骤
本实施例以抗体toripalimab进行。样品使用Millipore Pellicon3 0.11m2膜进行UF/DF超滤浓缩至浓度约180mg/mL，再将样品透析至对应的如表3所示的处方中，将最终浓度调至约180mg/mL，再加入对应浓度的聚山梨醇酯80(Ⅱ)。在超净台无菌灌装到2R西林瓶，2.0mL/瓶，进行稳定性放样和检测。
表3：第一轮处方筛选-缓冲液体系和稳定剂初步筛选实验中的处方信息
Figure BDA0003773451990000291
注“/”表示无。
1.2实验结果
1.2.1外观和粘度结果
根据表4的结果，所有处方在T0时均未发现明显可见异物，无明显乳光。经冻融三次和五次后，样品外观均未出现显著变化；经高温和长期条件下放置1个月，外观均未出现显著变化；FS1-1、FS1-3和FS1-6处方粘度较大。
表4：第一轮处方筛选—样品外观数据
Figure BDA0003773451990000292
1.2.2SEC纯度结果
根据图1中的SEC-HPLC纯度趋势图与表5中的SEC-HPLC纯度结果，所有处方经高温条件下放置1个月(1M)，FS1-4处方纯度明显下降，聚体均明显增加，其余处方纯度未见显著变化。经长期条件放置下放置1M和反复冻融5次，所有处方SEC纯度均未出现显著变化。
表5：第一轮处方筛选—SEC-HPLC数据
Figure BDA0003773451990000301
1.2.3R-CE-SDS纯度结果
根据表6中R-CE-SDS纯度结果，经高温条件下放置1M，所有样品R-CE-SDS纯度均有下降。所有样品经长期放置1M及冻融五次后R-CE-SDS纯度均未出现显著变化。
表6：第一轮处方筛选—R-CE-SDS数据
Figure BDA0003773451990000302
Figure BDA0003773451990000311
1.2.4NR-CE-SDS纯度结果
根据表7中的NR-CE-SDS纯度结果，经高温条件下放置1M，所有样品NR-CE-SDS纯度均显著降低，其中FS1-4和FS1-5处方纯度降低相对较快；所有样品经长期放置1M及冻融五次后NR-CE-SDS纯度均未出现显著变化。
表7：第一轮处方筛选—NR-CE-SDS数据
Figure BDA0003773451990000312
1.2.5CEX-HPLC纯度结果
根据图2中的CEX-HPLC纯度趋势图和表8中的CEX-HPLC纯度结果，经高温条件下放置1M，所有处方纯度均显著下降，均出现显著的酸峰增加。FS1-3处方纯度下降最快；所有样品经长期放置1M及经冻融五次后，所有处方均未出现CEX纯度的显著降低。
表8：第一轮处方筛选—CEX-HPLC数据
Figure BDA0003773451990000313
Figure BDA0003773451990000321
1.2.6结合活性结果
根据表9中结合活性结果，经高温或长期条件下放置1M及冻融五次后结合活性均未出现显著变化。
表9：第一轮处方筛选—结合活性数据
Figure BDA0003773451990000322
1.2.7细胞活性结果
根据表10中细胞活性结果，所有样品经高温或长期条件下放置1M及冻融五次后细胞活性均未出现显著变化。
表10：第一轮处方筛选—细胞活性数据
Figure BDA0003773451990000323
1.2.8亚可见颗粒结果
根据表11中的亚可见颗粒检测结果，经高温条件下放置1M后所有处方均未出现亚可见颗粒显著增加；经长期条件下放置1M及反复冻融5次，所有处方亚可见颗粒数均无显著变化。
表11：第一轮处方筛选—亚可见颗粒数据
Figure BDA0003773451990000331
1.3第一轮处方筛选结论
从外观结果来看，各处方未出现显著差异。从粘度结果来看，FS1-1、FS1-3和FS1-6处方粘度较大。从SEC-HPLC结果来看，处方FS1-4产生较多聚体。从NR-CE-SDS纯度结果来看，处方FS1-4和FS1-5纯度结果较低。从CEX-HPLC纯度结果来看，FS1-3处方CEX纯度下降较快。R-CE-SDS纯度、结合活性和细胞活性结果中均未体现处方差异；从亚可见颗粒结果来看，处方FS1-4结果出现较多的亚可见微粒，其他处方无显著差异。
综上所述，处方FS1-2和FS1-5整体表现较优，因此选择蔗糖和盐酸精氨酸作为稳定剂进入下一轮筛选实验。
实施例2：pH、辅料筛选和低浓度处方对比研究
为了进一步探究不同辅料对抗体稳定性影响，我们选取氯化钠、蔗糖、盐酸精氨酸、甘氨酸或甘露醇之一的辅料进行了比较测试。考察pH6.0、20mM组氨酸缓冲体系，pH5.5、20mM组氨酸缓冲体系和pH6.0、20mM柠檬酸缓冲体系，抗体toripalimab浓度180mg/mL条件下，上述不同辅料对稳定性的影响。
2.1实验步骤
本实施例以抗体toripalimab进行。样品使用Millipore Pellicon3 0.11m2膜进行UF/DF超滤浓缩至浓度约180mg/mL，再将样品透析至对应的如表12所示的处方中，将最终浓度调至约180mg/mL，再加入对应浓度的聚山梨醇酯80(Ⅱ)。在超净台无菌灌装到2R西林瓶，2.0mL/瓶，进行稳定性放样和检测。
表12：第二轮处方筛选-pH、辅料筛选和低浓度处方对比研究实验中的处方信息
Figure BDA0003773451990000341
注“/”表示无。
2.2实验结果
2.2.1外观和浓度结果
根据表13中的结果，经高温条件和长期条件下放置1M，所有样品的蛋白含量均未出现显著变化；经高温、加速或长期条件下放置1M，样品均未发现明显可见异物，均无明显乳光；FS2-2和FS2-6处方粘度结果较优。
表13：第二轮处方筛选—蛋白含量数据
Figure BDA0003773451990000342
Figure BDA0003773451990000351
2.2.2SEC-HPLC纯度结果
根据图3中的SEC-HPLC纯度趋势图和表14中的SEC-HPLC纯度结果，所有样品经高温条件下放置1M，SEC纯度均有下降，FS2-4、FS2-5和FS2-7处方SEC纯度下降较快；所有样品经加速条件或长期条件下放置1M，均未出现SEC纯度的显著变化。
表14：第二轮处方筛选—SEC-HPLC纯度数据
Figure BDA0003773451990000352
Figure BDA0003773451990000361
2.2.3R-CE-SDS纯度结果
根据表15中的R-CE-SDS纯度结果，经高温40℃条件下放置1M，样品纯度均有下降；加速25℃条件或长期条件下放置1M，所有样品纯度均未出现显著变化。样品无组间差异。
表15：第二轮处方筛选—R-CE-SDS纯度数据
Figure BDA0003773451990000362
2.2.4NR-CE-SDS纯度结果
根据表16中的NR-CE-SDS纯度结果，经高温40℃条件、加速25℃条件或长期条件下放置1M，所有样品纯度均未出现显著变化。
表16：第二轮处方筛选—NR-CE-SDS纯度数据
Figure BDA0003773451990000363
Figure BDA0003773451990000371
2.2.5CEX-HPLC纯度结果
根据图4中的CEX-HPLC纯度趋势图和表17中的CEX-HPLC结果，经高温条件下放置1M，所有样品CEX-HPLC纯度均有下降，FS2-4处方纯度下降较快；经加速和长期条件下放置1M，所有样品CEX-HPLC纯度均无显著变化。
表17：第二轮处方筛选—CEX-HPLC纯度数据
Figure BDA0003773451990000372
Figure BDA0003773451990000381
2.2.6细胞活性结果
根据表18中的细胞活性结果，经高温、加速条件和长期条件下放置1M及冻融三次和五次循环，所有样品均未出现细胞活性显著变化。
表18：第二轮处方筛选—细胞活性数据
Figure BDA0003773451990000382
2.2.7结合活性结果
根据表19中的结合活性结果，经高温、加速条件和长期条件下放置1M及冻融三次和五次循环，所有样品结合活性均未出现显著变化。
表19：第二轮处方筛选—结合活性数据
Figure BDA0003773451990000383
2.2.8亚可见颗粒结果
根据表20中的亚可见颗粒结果，经加速条件或长期条件下放置1M，所有样品亚可见颗粒均未出现显著变化。
表20：第二轮处方筛选—亚可见颗粒数据
Figure BDA0003773451990000384
Figure BDA0003773451990000391
2.3第二轮处方筛选结论
从蛋白含量、外观、R-CE-SDS纯度结果、NR-CE-SDS纯度结果、CEX-HPLC纯度结果、细胞活性、结合活性结果和亚可见颗粒结果来看，各处方之间未出现显著差异。从粘度结果来看，FS2-2和FS2-6处方较优；从SEC-HPLC纯度结果来看，FS2-4、FS2-5和FS2-7处方纯度下降较快，其中FS2-4为原静脉注射制剂(CN申请号201610628048.6)确定的低浓度处方，经实验发现并不适用于高浓度抗体制剂。
综上所述，最终选择FS2-2(20mM组氨酸缓冲液，pH6.0，含140mM盐酸精氨酸)处方，为使渗透压处于300mOsm/kg左右，更好的用于皮下注射剂，因此对处方进行进一步调整，将盐酸精氨酸的含量提高至150mM，并对此处方的吐温浓度进行进一步考察。
实施例3：表面活性剂筛选实验
液体制剂中添加表面活性剂常用于保护蛋白质例如抗体在储存过程中免受空气/溶液界面诱导的应力、溶液/表面诱导的应力的影响以减少抗体的聚集或使制剂中颗粒物的形成最小化的试剂，其利于抗体理化性质的稳定。在含有20mM组氨酸缓冲液和180mg/mL的抗体toripalimab的制剂中分别不同浓度的聚山梨醇酯80，考察上述不同浓度表面活性剂对稳定性的影响。
3.1实验步骤
本实施例以抗体toripalimab进行。样品使用Millipore Pellicon3 0.11m2膜进行UF/DF超滤浓缩至浓度约180mg/mL，再将样品透析至对应的如表21所示的处方中，将最终浓度调至约180mg/mL，再加入对应浓度的聚山梨醇酯80(Ⅱ)。在超净台无菌灌装到1mL预充针中，1.1mL瓶，进行稳定性放样和检测。
表21：第三轮筛选-表面活性剂筛选实验中的处方信息
Figure BDA0003773451990000401
3.2实验结果
3.2.1外观和浓度结果
根据表22中的结果，所有样品的蛋白含量均未出现显著变化；所有样品的外观均未发现明显可见异物，无明显乳光。
表22：第三轮处方筛选—蛋白含量及外观数据
Figure BDA0003773451990000402
3.2.2SEC-HPLC纯度结果
根据图5中的SEC-HPLC纯度趋势图和表23中的SEC-HPLC纯度结果，所有样品均未出现纯度的显著变化。
表23：第三轮处方筛选—SEC-HPLC纯度数据
Figure BDA0003773451990000403
Figure BDA0003773451990000411
3.2.3R-CE-SDS结果
根据表24中的R-CE-SDS纯度结果，所有样品均未出现显著变化。
表24：第三轮处方筛选—R-CE-SDS纯度数据
Figure BDA0003773451990000412
3.2.4NR-CE-SDS结果
根据表25中的NR-CE-SDS纯度结果，所有样品均未出现显著变化。
表25：第二轮处方筛选—NR-CE-SDS纯度数据
Figure BDA0003773451990000413
3.2.5CEX-HPLC纯度结果
根据图6中的CEX-HPLC纯度趋势图和表26中的CEX-HPLC纯度结果，所有样品均未出现纯度的显著变化。
表26：第三轮处方筛选—CEX-HPLC纯度数据
Figure BDA0003773451990000414
3.2.6结合活性结果
根据表27中的结合活性结果，所有样品均未出现活性的显著变化。
表27：第三轮处方筛选—结合活性数据
Figure BDA0003773451990000421
3.2.7细胞活性结果
根据表28中的细胞活性结果，所有样品均未出现活性的显著变化。
表28：第三轮处方筛选—细胞活性数据
Figure BDA0003773451990000422
3.2.8亚可见颗粒结果
根据表29中的亚可见颗粒结果，所有样品均未出现显著变化。
表29：第三轮处方筛选—亚可见颗粒数据
Figure BDA0003773451990000423
3.3第三轮处方筛选结论
样品外观、浓度、纯度、活性及亚可见颗粒均未出现显著差异，处方表现出较好的稳定性。吐温能促进溶解度，对于高浓度制剂，吐温浓度提高能有效缓解亚可见颗粒数量的增加，所以最终选择0.04％处方。
实施例4：影响因素实验
4.1实验步骤
本实施例以抗体toripalimab进行。样品使用Millipore Pellicon3 0.11m2膜进行超滤浓缩至浓度约180mg/mL，再将样品透析至对应的如表21所示的处方2中，将最终浓度调至约180mg/mL，再加入对应浓度的聚山梨醇酯80(Ⅱ)。在超净台无菌灌装到1mL预充针中，1.1mL/瓶，进行影响因素实验，具体方案见表30。
表30：影响因素实验方案
Figure BDA0003773451990000431
4.2实验结果
4.2.1水平振摇实验结果汇总
根据表31中的结果，所有样品的蛋白浓度、外观、SEC-HPLC纯度、R-CE-SDS纯度、NR-CE-SDS纯度、CEX-HPLC纯度、结合活性及细胞活性均未发现显著变化。
表31：振摇实验结果汇总
Figure BDA0003773451990000432
Figure BDA0003773451990000441
4.2.2冻融实验结果
根据表32中的结果，所有样品的蛋白浓度、外观、SEC-HPLC纯度、R-CE-SDS纯度、NR-CE-SDS纯度、CEX-HPLC纯度、结合活性及细胞活性均未发现显著变化。
表32：冻融实验结果汇总
Figure BDA0003773451990000442
4.2.3光照射实验结果
根据表33中的结果，所有样品的蛋白浓度、外观、SEC-HPLC纯度、R-CE-SDS纯度、NR-CE-SDS纯度、CEX-HPLC纯度、结合活性及细胞活性均未发现显著变化。
表33：光照射实验结果汇总
Figure BDA0003773451990000443
Figure BDA0003773451990000451
综上所述，我们通过对不同缓冲体系，不同pH条件、不同抗体浓度和不同辅料组成进行考察，目标pH范围控制在5.9～6.1，渗透压范围在260～320mOsm/kg，确定了最优制剂配方：20mM组氨酸缓冲液(pH6.0)，150mM盐酸精氨酸和0.04％聚山梨醇酯80(Ⅱ)。
实施例5：制剂长期稳定性研究
含有治疗性抗体的液体药物制品通常需要储存在2-8℃条件下，所以制剂能在长期储存中保持高稳定性非常重要。根据上述的筛选结果，抗体toripalimab浓度约180mg/mL，20mM组氨酸缓冲液(pH6.0)，150mM盐酸精氨酸和0.04％聚山梨醇酯80(Ⅱ)。我们使用此处方进行后续的生产与长期稳定性考察。
选用2批次成品，放置2～8℃条件下6个月后，对各样品进行分析测试。通过以下参数评估稳定性：(a)目视外观；(b)pH；(c)CE-SDS(十二烷基硫酸钠毛细管电泳)法检测抗体的分子量；(d)SEC-HPLC测量抗体单体、聚体；(e)CEX-HPLC测量抗体主要电荷、酸性电荷或碱性电荷含量；(f)ELISA法检测抗体结合活性；(g)蛋白质含量。
结果显示，2批次成品在外观、pH值、蛋白质含量、纯度(SEC-HPLC(分子排阻高效液相色谱法)、CEX-HPLC(弱阳离子交换高效液相色谱法)、R-CE-SDS(还原电泳法)、NR-CE-SDS(非还原电泳法)和生物学活性均无显著变化，具体见表34。结果表明，上述2批次成品保存在2-8℃条件下，0-6月储存过程具有非常好的稳定性。
表34：制剂处方的长期稳定性数据
Figure BDA0003773451990000461
实施例6：制剂的加速稳定性研究
选用2批次成品，放置25±2℃，60±5％相对湿度(RH)条件下，0-6个月后，对各样品进行分析测试。制剂处方：抗体toripalimab浓度约180mg/mL，20mM组氨酸缓冲液(pH6.0)，150mM盐酸精氨酸和0.04％聚山梨醇酯80(Ⅱ)。
如表35所示，该成品制剂对抗蛋白质降解具有较高的稳定性，在25±2℃下测量的所得降解动力学参数满足室温环境储存长达6个月的要求。
表35：制剂处方的加速稳定性数据
Figure BDA0003773451990000471
实施例7：皮下和静脉制剂在食蟹猴体内药代动力学比较研究
7.1实验目的
食蟹猴皮下注射不同剂量JS001(toripalimab)皮下制剂，通过检测血清中药物浓度，评估JS001皮下制剂(处方为实施例2中的FS2-2)初步药代动力学特征；同时设定静脉给药组，JS001静脉制剂处方为：约40mg/mL JS001、约20mM枸橼酸盐缓冲液(pH约为6.0)、约150mM甘露醇、约50mM氯化钠、约0.02％聚山梨醇酯80，评估JS001不同给药途径的药代特征，及初步考察生物利用度。
7.2受试品的配制方法
根据食蟹猴最近体重，给药剂量和药物含量计算所需供试品的量，静脉制剂：在无菌下使用0.9％氯化钠注射液稀释至0.8mg/mL。本实验要求立即为受试动物静脉输注，输注时间为30分钟，建议采用恒速输液泵。皮下制剂：采用安慰剂(君盟自制)稀释至所需浓度，给药体积0.5mL/kg，后肢大腿外侧注射。
7.3动物选择、给药剂量设计及分组
本实验选用食蟹猴，随机分组，每组3只，动物体重为2.5-5kg。食蟹猴实验分组与给药情况见表36。其中B组为单次给药，给药剂量为4mg/kg，其中B组给药制剂为JS001皮下制剂；而A组给药制剂为JS001静脉制剂，给药剂量为4mg/kg。
表36：食蟹猴实验分组与给药情况
Figure BDA0003773451990000481
注：1.sc:皮下注射；2.iv:静脉注射；3.NA：无。
7.4血样采集及结果
全血样品(PK采血约1mL)自食蟹猴非给药肢静脉取出，血样采集后放入已标记样品管，置冰盒内，让血液自然凝固后，放置入2-8℃离心机1500×g离心10分钟，分离血清至已标记样本编号的EP管内，PK样本均分装2管，一管为检测样本，一管为备份样本。样本处理后置-60～-90℃冰箱保存。样品采集后，采用冷链物流运输至生物样品分析部门，随行有相关运输记录和温控记录；运输过程确保样品不解冻。采用WinNonlin v 6.4(PharsightInc.)软件的非房室模型计算药代参数。AUC(0-t)的计算方式为Linear Trapezoidal LinearInterpolation。报告消除速率常数Kel，半衰期t1/2，达峰时间Tmax，峰浓度Cmax，药物暴露量AUC(0-t)，表观分布容积Vd，***清除率CLs，平均滞留时间MRT等参数。两组的平均血清药物浓度见表37，两组的平均血药浓度-时间变化曲线见图7，两组的平均血清药代动力学结果见表38。
表37：A、B两组的平均血清药物浓度
Figure BDA0003773451990000491
注：NA表示未检测，hr表示小时。
表38：食蟹猴药代动力学参数(平均值±标准偏差)
Figure BDA0003773451990000492
Figure BDA0003773451990000501
注：NA表示无，hr表示小时；aa表示P<0.01，aaa表示P<0.001，组A vs B。
结果显示，食蟹猴单次皮下注射受试药物JS001，给药剂量为4mg/kg，AUC(0-t)为11800±700hr*μg/mL；单次静脉注射受试药物JS001，给药剂量为4mg/kg，AUC(0-t)为12300±1910hr*μg/mL；JS001皮下注射的生物利用度为95.9％；皮下注射和静脉注射受试药物JS001，两组的平均血药浓度-时间变化曲线趋势也基本一致；因此将JS001静脉制剂开发为皮下注射制剂药代效果相当，而皮下注射制剂可提高肿瘤患者的顺应性和给药便捷性。
实施例8：皮下注射制剂对hPD-1人源化小鼠移植MC38肿瘤生长的抑制作用
8.1测试目的
评价本发明JS001(toripalimab)皮下注射制剂(处方为实施例2中的FS2-2)在小鼠结肠癌MC38皮下移植模型中的抗肿瘤作用。
8.2测试过程
取6-7周龄雌性hPD-1人源化小鼠(百奥赛图江苏基因生物技术有限公司)，于右侧背部皮下接种1x 106MC38细胞(0.1ml/只)。待平均肿瘤体积约为134mm3时，挑选24只动物，根据肿瘤体积随机分为4组，每组6只动物。各组分别为给生理盐水的阴性对照组，以及分别给予1mg/kg、3mg/kg和10mg/kg的FS2-2制剂的JS001-FS2-2治疗组。
分组当天给药，所有组给药途径均为颈部皮下注射，每周给药2次，连续给药6次，末次给药3天后结束实验。每周测量肿瘤体积及体重2次，记录小鼠体重和肿瘤体积。实验结束时，将小鼠安乐死，计算肿瘤抑制率TGI％(TGI％＝[1-(Ti-T0)/(Vi-V0)]×100％)。(Ti：治疗组在给药第i天的肿瘤体积均值，T0：治疗组在给药第0天的肿瘤体积均值；Vi：阴性对照组在给药第i天的肿瘤体积均值，V0：阴性对照组在给药第0天的肿瘤体积均值)。
结果如图8所示。结果显示，在开始给药后第21天，阴性对照组平均肿瘤体积为1501±122mm3。JS001-FS2-2在1、3和10mg/kg的剂量下，平均肿瘤体积分别为661±108mm3，578±75mm3，531±184mm3，TGI％分别为61.5％、67.5％和71.0％。表明JS001-FS2-2在1、3和10mg/kg的剂量下，显著抑制hPD-1人源化小鼠移植MC38肿瘤体积增长，并呈现良好的剂量效应。

Claims (10)

1.一种药物组合物，包含：
(1)缓冲液；和
(2)抗PD-1抗体或其抗原结合片段；
其中所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2和SEQ ID NO:3所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3，和氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4、SEQID NO:5和SEQ ID NO:6所示的HCDR1、HCDR2和HCDR3；
优选地，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段的浓度为约100～250mg/mL，优选为约150～250mg/mL，更优选为约150～200mg/mL；
优选地，所述药物组合物的pH为约5.0～6.5，优选为约5.5～6.2，更优选为5.9～6.1；
优选地，所述药物组合物的渗透压在260～320mOsm/kg的范围内。
2.如权利要求1所述的药物组合物，其中所述缓冲液选自醋酸缓冲液、柠檬酸缓冲液和组氨酸缓冲液中的一种或多种；优选地，所述缓冲液为组氨酸缓冲液，所述组氨酸缓冲液选自组氨酸-组氨酸盐酸盐缓冲液或组氨酸-组氨酸醋酸盐缓冲液；优选地，所述缓冲液的浓度为约10～50mM；更优选地，所述缓冲液的浓度为约10～30mM；优选地，所述缓冲液的pH为约5.0～6.5，更优选为约5.5～6.2。
3.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包括稳定剂，所述稳定剂选自精氨酸、精氨酸盐、氯化钠、甘露醇、山梨醇、蔗糖、甘氨酸和海藻糖中的一种或多种；优选地，所述精氨酸盐为盐酸精氨酸；优选地，所述稳定剂的浓度为约100～250mM，优选为约120～220mM，优选为约130～180mM。
4.如权利要求3所述的药物组合物，其中所述稳定剂为浓度约120～220mM的精氨酸或精氨酸盐；或所述稳定剂为浓度约30～100mM的盐酸精氨酸与浓度约100～180mM的蔗糖的组合；或所述稳定剂为浓度约30～100mM的盐酸精氨酸与浓度约50～150mM的甘氨酸的组合；优选地，所述稳定剂为浓度约130～180mM的精氨酸或精氨酸盐；或所述稳定剂为浓度约30～70mM的盐酸精氨酸与约110～170mM的蔗糖的组合；或所述稳定剂为浓度约30～70mM的盐酸精氨酸与约80～120mM的甘氨酸的组合；优选地，所述精氨酸盐为浓度约130～180mM的盐酸精氨酸。
5.如权利要求1或2所述的药物组合物，其中所述药物组合物还包括表面活性剂，所述表面活性剂选自聚山梨醇酯80、聚山梨醇酯20和泊洛沙姆188中的一种或多种；优选地，以w/v计算，所述表面活性剂浓度为约0.01％～0.1％，更优选地，所述表面活性剂浓度为约0.02％～0.08％。
6.如权利要求1-5中任一项所述的药物组合物，其中，所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段包含如SEQ ID NO:7所示的轻链可变区，和如SEQ ID NO:8所示的重链可变区；优选地，所述抗PD-1抗体包含如SEQ ID NO:9所示的轻链氨基酸序列，和如SEQ ID NO:10所示的重链氨基酸序列。
7.如权利要求1-6中任一项所述的药物组合物，其分别包含如下(1)～(8)中任一项所示的组分：
(1)(a)约150～250mg/mL的所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mM组氨酸缓冲液，pH为约5.5～6.5；(c)约120～220mM的精氨酸或精氨酸盐；以及(d)约0.01％～0.1％的聚山梨醇酯80；或
(2)(a)约150～250mg/mL的所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mM组氨酸缓冲液，pH为约5.5～6.5；(c)稳定剂，所述稳定剂为浓度约30～100mM的盐酸精氨酸与浓度约100～180mM的蔗糖的组合；以及(d)约0.01％～0.1％的聚山梨醇酯80；或
(3)(a)约150～250mg/mL的所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mM组氨酸缓冲液，pH为约5.5～6.5；(c)稳定剂，所述稳定剂为浓度约30～100mM的盐酸精氨酸与浓度约50～150mM的甘氨酸的组合；以及(d)约0.01％～0.1％的聚山梨醇酯80；或
(4)(a)约150～200mg/mL的所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约5.5～6.0；(c)约130～180mM的精氨酸或盐酸精氨酸；以及(d)约0.02％～0.08％的聚山梨醇酯80；或
(5)(a)约150～200mg/mL的所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约5.5～6.0；(c)稳定剂，所述稳定剂为浓度约30～70mM的盐酸精氨酸与约110～170mM的蔗糖的组合；以及(d)约0.02％～0.08％的聚山梨醇酯80；或
(6)(a)约150～200mg/mL的所述抗PD-1抗体或其抗原结合片段；(b)约10～30mM醋酸缓冲液，pH为约5.5～6.0；(c)稳定剂，所述稳定剂为浓度约30～70mM的盐酸精氨酸与约80～120mM的甘氨酸的组合；以及(d)约0.02％～0.08％的聚山梨醇酯80；
(7)(a)约180mg/mL的抗PD-1抗体，所述抗PD-1抗体包含如SEQ ID NO:9所示的轻链氨基酸序列，和如SEQ ID NO:10所示的重链氨基酸序列；(b)约20mM组氨酸缓冲液，pH为约6.0；(c)约140mM的盐酸精氨酸；以及(d)约0.02％的聚山梨醇酯80；或
(8)(a)约180mg/mL的抗PD-1抗体，所述抗PD-1抗体包含如SEQ ID NO:9所示的轻链氨基酸序列，和如SEQ ID NO:10所示的重链氨基酸序列；(b)约20mM组氨酸缓冲液，pH为约6.0；(c)约150mM的盐酸精氨酸；以及(d)约0.04％的聚山梨醇酯80。
8.一种注射剂，其含有如权利要求1-7中任一项所述的药物组合物与氯化钠溶液或葡萄糖溶液；优选地，所述氯化钠溶液浓度为约0.85～0.9％(w/v)；优选地，所述葡萄糖溶液浓度为约5～25％(w/v)；优选地，所述注射剂中，所述抗PD-1抗体的浓度为约0.5～50mg/mL，更优选为约0.5～20mg/mL；优选地，所述注射剂的pH为约5.0～6.5，更优选为约5.5～6.2。
9.如权利要求1-7中任一项所述的药物组合物或如权利要求8所述的注射剂，其中所述药物组合物或注射剂经皮下注射施用。
10.如权利要求1-7中任一项所述的药物组合物或如权利要求8所述的注射剂在制备通过消除、抑制或降低PD-1活性来治疗疾病或病症的药物中的用途；优选地，所述疾病或病症选自癌症、感染性疾病或炎症性疾病。
CN202210929845.3A 2021-07-29 2022-07-29 抗pd-1抗体药物组合物及其用途 Pending CN116019907A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110863978 2021-07-29
CN2021108639780 2021-07-29

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116019907A true CN116019907A (zh) 2023-04-28

Family

ID=85086307

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202210929845.3A Pending CN116019907A (zh) 2021-07-29 2022-07-29 抗pd-1抗体药物组合物及其用途

Country Status (5)

Country Link
CN (1) CN116019907A (zh)
AR (1) AR126614A1 (zh)
AU (1) AU2022320670A1 (zh)
CA (1) CA3227991A1 (zh)
WO (1) WO2023006055A1 (zh)

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN104250302B (zh) * 2013-06-26 2017-11-14 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd‑1抗体及其应用
WO2018183459A1 (en) * 2017-03-29 2018-10-04 Celgene Corporation Formulations comprising pd-1 binding proteins and methods of making thereof
CA3062487A1 (en) * 2017-05-16 2018-11-22 Jiangsu Hengrui Medicine Co., Ltd. Pd-l1 antibody pharmaceutical composition and use thereof
CN111246886B (zh) * 2017-11-02 2022-03-15 正大天晴药业集团股份有限公司 一种抗pd-l1人源化单克隆抗体的药物组合物
CN112972675A (zh) * 2018-09-07 2021-06-18 上海君实生物医药科技股份有限公司 抗pd-1抗体在***中的用途
CN112741804A (zh) * 2019-10-31 2021-05-04 上海君实生物医药科技股份有限公司 含有抗pd-l1抗体的稳定制剂
EP4293045A1 (en) * 2021-01-14 2023-12-20 Shanghai Junshi Biosciences Co., Ltd. Anti-tigit antibody pharmaceutical composition and application thereof

Also Published As

Publication number Publication date
AU2022320670A1 (en) 2024-03-14
WO2023006055A1 (en) 2023-02-02
AR126614A1 (es) 2023-10-25
CA3227991A1 (en) 2023-02-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2844286B1 (en) Lyophilised and aqueous anti-cd40 antibody formulations
EP2648750B1 (en) Antibody formulation
CN114616249B (zh) 含有抗pd-l1抗体的稳定制剂
JP7475335B2 (ja) Ｃｓｆ－１ｒ抗体製剤
EP4095158A1 (en) Pharmaceutical composition containing anti-btla antibody and use thereof
CN113797333A (zh) 一种新型冠状病毒抗体的药物组合物及其用途
CN114762678B (zh) 抗tigit抗体药物组合物及其用途
WO2022184148A1 (zh) Il-21-抗白蛋白单域抗体融合蛋白药物组合物及其用途
CN113194993A (zh) 含高浓度抗vegf抗体的蛋白质溶液配制品
WO2023006055A1 (en) Anti-pd-1 antibody pharmaceutical composition and use thereof
EP3878467A1 (en) Stable formulation containing anti-pcsk9 antibody
WO2023134771A1 (zh) 抗ctla-4抗体药物组合物及其用途
CN111683681A (zh) 包含抗ox40抗体的制剂、其制备方法及其用途
CN116803420A (zh) 靶向PD-1和TGFβ的双功能蛋白药物组合物及其用途
WO2024027824A1 (zh) 抗cd112r抗体药物组合物及其用途
WO2024017241A1 (en) Stable pharmaceutical formulation comprising anti-gremlin1 antibody
CN116459335A (zh) 抗cldn-18.2抗体药物组合物及其用途
CN116725961A (zh) 抗cd39抗体药物组合物及其用途
TW202409078A (zh) 穩定之包含抗gremlin1抗體的藥物製劑
WO2022223028A1 (zh) 抗BLyS抗体、其药物组合物及其用途
CA3178853A1 (en) Formulation comprising anti-il-23p19 antibody, method for preparing same and use thereof
CN116725960A (zh) 新型冠状病毒抗体药物组合物及其用途

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination