CN116004921A - 重组腺相关病毒载体制品中rcAAV含量测定方法及检测试剂盒 - Google Patents
重组腺相关病毒载体制品中rcAAV含量测定方法及检测试剂盒 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及重组腺相关病毒载体样品中rcAAV含量的检测方法,所述方法的特征在于:使用4至5mL容量的细胞培养瓶培养细胞并在不损失rcAAV的情形下对细胞进行三轮或以上感染,然后使用SEQ ID NO:1和2所示的rep2基因特异性引物和SEQ ID NO:3所示的Taqman探针对第一轮和最后一轮的感染收获的超滤浓缩液实施定量PCR检测,由此获得重组腺相关病毒载体样品中rcAAV含量。本发明还涉及用于实施本发明的重组腺相关病毒载体样品中rcAAV含量的检测方法的试剂盒。
Description
技术领域
本发明涉及重组腺相关病毒载体制品的质量检测领域。具体而言,本发明涉及重组腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体制品中rcAAV含量的测定方法以及用于测定rcAAV含量的检测试剂盒。
背景技术
腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)载体无致病性,免疫原性低,安全性好,能转导种类众多的组织细胞,并能长期稳定地表达其携带的基因,这些特性使其十分适合于作为体内基因转移的工具。重组腺相关病毒(recombinant AAV,rAAV)载体是一种具有高靶向性和良好安全性的病毒载体,在基因治疗中得到了较为广泛的应用。
目前构建重组AAV载体通常使用目的基因替换野生型腺相关病毒基因组中的rep基因、cap基因,再将重组基因组包装到有感染性的病毒颗粒中。重组AAV载体通过AAV ITR与反式存在于辅助成分或生产细胞中的rep基因和cap基因序列之间的同源或非同源重组的机制,在重组AAV载体生产期间可能形成复制型腺相关病毒(Replication CompetentAAV,rcAAV)。近期的动物实验表明,rcAAV中cap基因在体内的表达会引发严重的免疫反应,且包装有其他DNA杂质的rcAAV还具有致瘤性或引入抗生素抗性的潜在风险。因此,重组AAV载体生产的组件应设计为可以消除rcAAV产生的可能,并且临床使用的rAAV载体产品需要对rcAAV进行检测,以严格控制rAAV载体制品中rcAAV的污染。
rcAAV作为rAAV载体制品生产过程中的产品相关杂质,对其限度尚未有明确的标准要求。重组AAV-2/人凝血因子IX注射液质量标准中规定:在1E+06vg的rAAV-hFIX中,rcAAV颗粒数(即,基因组拷贝数)不超过1个,检测方法为PCR法(《生物技术药物研究开发和质量控制(第三版)》)。
随着基因治疗技术的发展,研究者开发出qPCR法检测rcAAV基因组拷贝数,但是qPCR法扩增的rcAAV基因组不一定具有复制或感染活性。因此qPCR法无法真正的确定rcAAV含量。此外,qPCR法检出限受rAAV制品浓度限制,无法检测低浓度rAAV制品中残余rcAAV基因组拷贝数,例如用于生产过程中对中间产品的质量控制。
对于AAV2血清型载体,可以使用感染中心测定法(infectious center assay)进行具有复制活性的rcAAV残余检测。由于大多数非AAV2血清型载体制品中的rcAAV观察到对于体外培养细胞的感染效率较低,开发非AAV2血清型载体制品中的rcAAV测定是一个挑战。
Wright和Zelenaia(“Vector Characterization Methods for Quality ControlTesting of Recombinant Adeno-Associated Viruses”,Viral Vectors for GeneTherapy,第11章,Otto-Wilhelm Merten编著)公开了一种使用AAV2制品通过2轮细胞感染后,收集细胞上清液进行点杂交来检测AAV2制品中rcAAV含量的方法,该方法对rcAAV的检出限为1rcAAV/1E+06vg rAAV样品。具体地,该方法第一轮对HEK293细胞的感染在15×100mm培养皿中进行,第二轮对HEK293细胞的感染在6孔板中进行。在需要加入新鲜培养基补充细胞培养过程中的营养的情况下,加入的感染病毒液体体积有限,因此该方法第二轮感染材料为250μL第一轮收获上清液(其中,第一轮收获上清液共10mL),仅为收获液体之体积的0.25%,使得rcAAV检出灵敏度有限。其用于检测rcAAV颗粒的点杂交法是将靶标DNA吸附结合到硝酸纤维膜或尼龙膜上后,采用标记的不同序列特异性探针与rcAAV***的DNA片段杂交结合,最后通过荧光或显色的方式测定。由于杂交溶液中一些成分会干扰基因组DNA与硝酸纤维膜或尼龙膜结合等因素,导致其实验之间的差异性较高。
Allay J.A.等人(“Good Manufacturing Practice Production of Self-Complementary Serotype 8Adeno-Associated Viral Vector for a Hemophilia BClinical Trial”,Human Gene Therapy,Vol.22,No.5,2011)公开了一种检测AAV8制品中rcAAV含量的方法:使用AAV8制品对293T细胞实施三轮感染,后收获上清液进行qPCR检测,该方法rcAAV检出限为1rcAAV/2.25E+06vg rAAV样品。所述方法自第二轮细胞感染起,使用的接种物为上一轮收获的培养物(共20mL)中的1mL细胞上清,仅占收获总液体的5%,接种至20mL新鲜培养基中。3轮感染结束后,最终收获上清液利用ArchivePure DNA分离试剂盒(5PRIME,Gaithersburg,MD)分离基因组DNA,后采用qPCR检测每一轮次样品中rcAAV浓度,并统计Ct值,绘制折线图,其中当Ct值有下降趋势时,认为检测到rcAAV。但该方法的检测过程中三个轮次的感染每次均损失95%rcAAV,并将该1mL收获的细胞上清加入20mL新鲜培养液中,使rcAAV浓度被稀释20倍,大大降低其在新一轮细胞感染中对细胞的感染效率,极大增加了假阴性检测结果的可能,导致检测灵敏度有限。另外,实施该方法的培养容器为15×100mm培养皿,所需培养液体积较大,为20mL,这使得检测rcAAV的成本提高。
由于AAV9通过与细胞表面糖蛋白的天冬酰胺糖链上的末端半乳糖结合才能感染病入侵细胞,然而大多数体外培养的细胞类型只表达较少的末端半乳糖而高表达唾液酸残基,丰富的唾液酸残基对末端半乳糖起到遮蔽作用,这导致AAV9病毒体外感染细胞转导效率很差。现有技术中未有研究显示检测rAAV9制品中rcAAV9含量的方法。由于rAAV9对细胞的敏感性低于AAV8,更远低于AAV2,且qPCR法又无法区分具有复制能力的rcAAV9,因此检测rAAV9制品中rcAAV9含量一直是本领域的一个难题。
本领域急需要建立了一种检测重组腺相关病毒载体制品中rcAAV含量(尤其是rcAAV9含量)的测定方法以及用于测定rcAAV含量的检测试剂盒。
发明内容
本发明人通过研究,开发了一种检测重组腺相关病毒载体制品中rcAAV含量的高灵敏度检测方法。该方法能够通过qPCR法检测经多轮(例如,三轮、四轮或以上)感染后Ct值与第一轮感染后Ct值相比是否有降低,来判断受试样品中是否含有rcAAV。本发明的方法通过设置阳性对照组中rcAAV最低可检测的加入量,来确定对rcAAV的检测限度。
在第一方面,本发明提供了一种重组腺相关病毒载体样品中的rcAAV含量检测方法,包括如下步骤:
(1)使用约4至5mL容量的细胞培养瓶,例如T25培养瓶,培养细胞;
(2)将以下各组接种物加入至分别的所述细胞培养瓶中,进行细胞的第一轮感染:
i)阳性对照组(PC):为辅助病毒和rcAAV标准品,其中,辅助病毒用于rcAAV标准品的复制,且rcAAV标准品为约1E+3vg至4E+5vg rcAAV,例如,1E+4vg,2E+4vg,4E+4vg,6E+4vg,8E+4vg,1E+5vg,2E+5vg rcAAV;
ii)加标组(Spike):为辅助病毒和rcAAV标准品,以及受检样品,其中,辅助病毒用于rcAAV标准品的复制,且rcAAV标准品为约1E+3vg至4E+5vg rcAAV,例如,1E+4vg,2E+4vg,4E+4vg,6E+4vg,8E+4vg,1E+5vg,2E+5vg rcAAV;受检样品为约1E+08vg至1E+11vg AAV,例如,1E+08vg,1E+09vg,1E+10vg,1E+11vg AAV;
iii)受检样品组(Test):为辅助病毒和受检样品,其中,受检样品为约1E+08vg至1E+11vg AAV,例如,1E+08vg,1E+09vg,1E+10vg,1E+11vg AAV;
(3)第一轮感染结束后,将所述各培养瓶中的细胞及上清冻融,并将各培养瓶中的全部细胞及上清转移至分别的离心管中,56℃灭活后,超滤浓缩至1mL;取约500μL浓缩液于≤-70℃保存,用于qPCR检测;另约500μL浓缩液作为下一轮感染接种液;
(4)将第一轮感染后获得的各约500μL浓缩液加入约4mL新鲜的培养基中,进行第二轮细胞感染,与步骤(3)同样地,各培养瓶获得1mL超滤浓缩液,全部用于下一轮感染;
(5)第三轮感染(任选地,第四轮感染)与第二轮感染操作相同;在第三轮感染(任选地,第四轮感染)结束后,各培养瓶获得1mL超滤浓缩液全部用于qPCR检测;
(6)完成三轮(任选地,四轮)感染后,自第一轮和最后一轮感染收获的超滤浓缩液提取DNA,作为实施qPCR的DNA模板,以Rep基因为模板设计特异性引物以及Taqman探针,进行qPCR检测;
(7)结果分析及判定:
如果阳性对照组(PC):第一轮Ct均值>最后一轮Ct均值;
加标组(Spike):第一轮Ct均值>最后一轮Ct均值;
且受检样品组(Test):第一轮Ct均值<最后一轮Ct均值,则受检样品中rcAAV含量为:<rcAAV标准品加入量/AAV样品加入量(vg);
如果阳性对照组(PC):第一轮Ct均值>最后一轮Ct均值;
加标组(Spike):第一轮Ct均值>最后一轮Ct均值;
且受检样品组(Test):第一轮Ct均值>最后一轮Ct均值,则需进一步稀释受检样品并实施步骤(1)至(6)的检测,直至检测到受检样品组(Test):第一轮Ct均值<最后一轮Ct均值,则受检样品中rcAAV含量为:rcAAV标准品加入量/稀释的AAV样品加入量(vg)。
在一个实施方案中,本发明的重组腺相关病毒载体样品中的rcAAV含量检测方法包括如下步骤:
(1)使用约4至5mL容量的细胞培养瓶,例如T25培养瓶,培养细胞;
(2)将以下各组接种物加入至各2瓶所述细胞培养瓶中,进行细胞的第一轮感染:
i)阳性对照组(PC):为辅助病毒和rcAAV标准品,其中,辅助病毒用于rcAAV标准品的复制,且rcAAV标准品为约1E+3vg至4E+5vg rcAAV,例如,1E+4vg,2E+4vg,4E+4vg,6E+4vg,8E+4vg,1E+5vg,2E+5vg rcAAV;
ii)加标组(Spike):为辅助病毒和rcAAV标准品,以及受检样品,其中,辅助病毒用于rcAAV标准品的复制,且rcAAV标准品为约1E+3vg至4E+5vg rcAAV,例如,1E+4vg,2E+4vg,4E+4vg,6E+4vg,8E+4vg,1E+5vg,2E+5vg rcAAV;受检样品为约1E+08vg至1E+11vg AAV,例如,1E+08vg,1E+09vg,1E+10vg,1E+11vg AAV;
iii)受检样品组(Test):为辅助病毒和受检样品,其中,受检样品为约1E+08vg至1E+11vg AAV,例如,1E+08vg,1E+09vg,1E+10vg,1E+11vg AAV;
(3)第一轮感染结束后,将各组的2瓶所述培养瓶中的细胞及上清冻融,并将各培养瓶中的全部细胞及上清转移至分别的离心管中,56℃灭活后,每瓶中的细胞及上清超滤浓缩至1mL;将1瓶所述培养瓶的浓缩液于≤-70℃保存,用于qPCR检测;将另1瓶所述培养瓶的浓缩液作为下一轮感染接种液;
(4)将第一轮感染后获得的各约1mL浓缩液加入约4mL新鲜的培养基中,进行各组1瓶约4至5mL容量的细胞培养瓶中细胞的第二轮感染,与步骤(3)同样地,各培养瓶获得1mL超滤浓缩液,全部用于下一轮感染;
(5)第三轮感染(任选地,第四轮感染)与第二轮感染操作相同;在第三轮感染(任选地,第四轮感染)结束后,各培养瓶获得1mL超滤浓缩液全部用于qPCR检测;
(6)完成三轮(任选地,四轮)感染后,自第一轮和最后一轮感染收获的超滤浓缩液提取DNA,作为实施qPCR的DNA模板,以Rep基因为模板设计特异性引物以及Taqman探针,进行qPCR检测;
(7)结果分析及判定:
如果阳性对照组(PC):第一轮Ct均值>最后一轮Ct均值;
加标组(Spike):第一轮Ct均值>最后一轮Ct均值;
且受检样品组(Test):第一轮Ct均值<最后一轮Ct均值,则受检样品中rcAAV含量为:<rcAAV标准品加入量/AAV样品加入量(vg);
如果阳性对照组(PC):第一轮Ct均值>最后一轮Ct均值;
加标组(Spike):第一轮Ct均值>最后一轮Ct均值;
且受检样品组(Test):第一轮Ct均值>最后一轮Ct均值,则需进一步稀释受检样品并实施步骤(1)至(6)的检测,直至检测到受检样品组(Test):第一轮Ct均值<最后一轮Ct均值,则受检样品中rcAAV含量为:rcAAV标准品加入量/稀释的AAV样品加入量(vg)。
在一个实施方案中,本发明方法中所使用的感染细胞选自Vero、HEK-293、Hela和BHK-21细胞。
在一个实施方案中,本发明的方法对细胞进行四轮或以上的感染,例如,进行五轮、六轮、七轮、八轮感染,由此,进一步降低可检出rcAAV的含量。
在一个实施方案中,本发明的方法所检测的重组腺相关病毒载体样品是不同血清型的AAV病毒载体样品,例如,AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9、AAVDJ病毒载体样品。
在一些实施方案中,本发明的方法中培养细胞所使用的培养基是包含10%胎牛血清的RPMI1640、DMEM培养基,但不限于此。
在一些实施方案中,本发明的方法中使用的辅助病毒是腺病毒或单纯疱疹病毒,以MOI=2~5感染细胞。
在一些实施方案中,本发明的方法使用SEQ ID NO:1和2所示的特异性引物和SEQIDNO:3所示的Taqman探针实施qPCR。
在第二方面,本发明提供了用于检测重组腺相关病毒载体样品中的rcAAV含量的试剂盒,其包含:
(1)辅助病毒,例如,AdV-EGFP;
(2)rcAAV标准品;
(3)SEQ ID NO:1和2所示的rep2基因特异性引物和SEQ ID NO:3所示的Taqman探针。
在一些实施方案中,本发明的用于检测重组腺相关病毒载体样品中的rcAAV含量的试剂盒还包含:
(4)AAV载体敏感细胞,例如BHK-21细胞、HEK-293、Hela、Vero和/或A549细胞。
发明的效果
本发明具有如下方面的有益技术效果:
其一,本发明的rcAAV检测方法使用培养容器为例如T25培养瓶,所需培养液体积约为4mL至5mL,大大降低了检测rcAAV所需rAAV制品的量和培养基的量,有效地节约了检测成本。
其二,在Allay J.A.等人的检测方法中,自第二轮细胞感染起,接种物为上一轮细胞培养上清(共20mL)中的1mL上清,这使得rcAAV在此过程中损失了95%;此外,将该1mL上清加入20mL新鲜培养液中,又使得rcAAV浓度被稀释20倍,降低了rcAAV对细胞的感染效率;而本发明优选的第二轮及以后轮次的细胞感染接种物均为全部细胞培养上清的浓缩液(共1mL),rcAAV理论上不存在损失。本发明将该1mL浓缩液加入约4mL新鲜细胞培养液中,rcAAV浓度仅稀释5倍。这从根本上解决了现有技术在多轮细胞感染过程中的rcAAV损失问题,提高了对rcAAV的检测灵敏度,且可通过增加感染轮数无限提高检测灵敏度。
在一个实施方案中,本发明实施了四轮感染,检出限为2rcAAV9/1E+07vg rAAV9样品,与已报道的细胞法检测rcAAV2、rcAAV8达到相当水平。并且理论上继续增加扩增轮数,可进一步提高检出限度。此外,增加初始接种T25瓶数量可进一步降低可检出rcAAV的含量,由此,提高检测灵敏度。
其三,本发明设计了以rep2基因为模板的qPCR引物及探针,适用于所有不同外壳血清型,但均为rep2的rAAV载体制品中rcAAV含量的测定。
其四,本发明的检测方法使用了多轮细胞感染使得rcAAV实现扩增,然后再利用qPCR对rcAAV进行检测。与仅使用qPCR的方法相比,能检测到具有复制能力rcAAV,这对于临床rAAV载体药物的安全性评价具有更重要的意义。
其五,本发明的方法将标准品rcAAV替换为相应血清型的标准品rcAAV后,同样适用于其他AAV血清型中rcAAV残余含量的检测。
具体实施方式
除非另外限定,否则本文中所用的全部技术与科学术语具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。本文所提及的全部出版物、专利申请、专利和其他参考文献通过引用的方式完整地并入。此外,本文中所述的材料、方法和例子仅是说明性的并且不意在是限制性的。本发明的其他特征、目的和优点将从本说明书和后附的权利要求书中显而易见。
I.定义
为了解释本说明书,将使用以下定义,并且只要适当,以单数形式使用的术语也可以包括复数,并且反之亦然。要理解,本文所用的术语仅是为了描述具体的实施方案,并且不意欲是限制性的。
术语“约”在与数字数值联合使用时意为涵盖具有比指定数字数值小5%的下限和比指定数字数值大5%的上限的范围内的数字数值。
如本文所用,术语“和/或”意指可选项中的任一项或可选项的两项或多项。
在本文中,当使用术语“包含”或“包括”时,除非另有指明,否则也涵盖由所述及的要素、整数或步骤组成的情形。
术语“重组腺相关病毒载体”、“腺相关病毒载体”、“AAV载体”和“rAAV载体”在本文中可互换地使用,是人们随着对AAV病毒生活周期及其相关分子生物学机制的了解,将野生型AAV病毒改造成的一种高效的外源基因转移工具。病毒载体包含载体基因组和蛋白质衣壳。病毒载体衣壳可由领域内已知的任何AAV血清型提供,包括目前所鉴定的人和非人AAV血清型及有待鉴定的AAV血清型(参见:Choi VW等人2005,Schmidt等人2008)。病毒衣壳可与其他载体组分混合并匹配以形成杂交病毒载体,例如病毒载体的ITR和衣壳可来自不同的AAV血清型。在一个方面,ITR可来自AAV2血清型,而衣壳来自例如AAV2或AAV9血清型。另外,本领域技术人员应认识到,载体衣壳也可以是镶嵌型衣壳(例如:由来自不同血清型的衣壳蛋白质的混合物构成的衣壳)或甚至是嵌合衣壳(例如:含有用于产生标志物和/或改变组织向性的外来或不相关蛋白质序列的衣壳蛋白质)。
术语“复制型腺相关病毒(Replication Competent AAV,rcAAV)”是指在辅助病毒例如腺病毒、单纯疱疹病毒等存在下,具有复制能力的腺相关病毒。在重组AAV载体制品生产过程中,AAV ITR与反式存在于辅助成分或生产细胞中的rep基因和cap基因序列之间通过同源或非同源重组的机制,可能形成作为杂质的rcAAV。
术语“载体基因组(vector genomes,vg)”是指包装在rAAV衣壳内形成rAAV载体的核酸序列。AAV载体基因组中只包含AAV病毒的ITR序列和携带待转运的外源基因表达框。AAV病毒包装需要的Rep和Cap蛋白通过其他外源质粒或辅助病毒等提供,由此降低了rep和cap基因包装入AAV载体可能带来的危害。进一步地,AAV病毒本身不具有致病性,这使得AAV载体成为公认的最安全的病毒载体之一。删除AAV病毒的一侧ITR序列中的D序列和trs序列还能够使包装得到的重组腺相关病毒载体所携带基因组自我互补,形成双链,显著提高AAV载体的体内外转导效率(Wang Z等人,Gene Ther.2003;10(26):2105-2111;McCarty DM等人,Gene Ther.2003;10(26):2112-2118)。包装得到的病毒成为scAAV(self-complementary AAV)病毒,即所谓的双链AAV病毒。它不同于双侧ITR均未突变的ssAAV(single-stranded AAV),即传统的AAV病毒。
scAAV病毒载体的包装容量更小,仅为ssAAV病毒载体包装容量的一半,约为2.2kb-2.5kb,但感染细胞后转导效率更高。
如本文所用,术语“ITR”或“反向末端重复序列”是指存在于AAV和/或rAAV中的可以形成T形回文结构的核酸序列,其通常是完成AAV的裂解和潜伏生命周期所必需的。
如本文所用,术语“rep基因产物”和“Rep蛋白”可互换地使用。AAV的rep基因区编码Rep78、Rep68、Rep52和Rep40四种Rep蛋白。Rep蛋白对于AAV病毒的复制、整合、拯救和包装都具有重要作用。其中Rep78和Rep68与ITR中的末端解链位点trs和GAGY重复基序特异性结合,启动AAV基因组由单链向双链的复制过程。ITR中trs和GAGC重复基序和/或GAGY重复基序是AAV基因组复制的中心,因此虽然在各种血清型的AAV病毒中ITR序列都不尽相同,但是都能形成发卡结构和存在Rep结合位点。
如本文所用,术语“cap基因产物”和“Cap蛋白”可互换地使用。AAV的cap基因编码AAV病毒的衣壳蛋白VP1、VP2和VP3。其中,VP3分子量最小,但数量最多,在成熟的AAV颗粒中VP1、VP2、VP3的比例大致为1:1:10。VP1是形成有感染性的AAV所必需的;VP2协助VP3进入细胞核;VP3是组成AAV颗粒的主要蛋白。
术语“感染复数(Multiplicity of infection;MOI)”的概念起源于噬菌体感染细菌的研究,最初是指每个细菌的平均噬菌体数。通过将添加的噬菌体数除以添加的细菌数来确定MOI。MOI给出的是每个细菌的平均噬菌体数量,每个细菌中的平均噬菌体数量可以是0.1、1、2、10等,具体数值取决于实验设计。现在,MOI广义地指感染时病毒数量和细胞数量的比值。例如,将1千万个病毒添加到1百万个细胞中,则MOI为10。
术语“空斑形成单位(plaque forming unit;PFU)”又称蚀斑形成单位,是计量病毒(或噬菌体)的一种单位,但只限于用在有产生空斑能力的病毒。其原理是:用少量有破坏宿主细胞能力的病毒去感染已形成致密单层状态的宿主细胞群体时,经过一定培养时间使每个感染细胞周围的细胞逐渐感染崩溃,形成肉眼可见的空斑(噬菌体时可直接观察,病毒时则需借助于活体染色的方法)。在理论上,一个病毒体就可以形成一个空斑。用PFU计量病毒的方法叫作PFU法。空斑形成单位数或感染中心数通常就是指PFU的数值。
病毒滴度即病毒悬液的浓度,又称病毒的效价、毒力或毒价。感染滴度的单位一般表示为PFU/ml。
在一些实施方案中,MOI值=病毒滴度(PFU/mL)×病毒体积(mL)/细胞个数。
循环阈值(Cycle Threshold;Ct)定义为qPCR扩增过程中,扩增产物的荧光信号达到设定的荧光阈值时的所对应的扩增循环数。qPCR中的基因经过一定的循环数被指数扩增而积累。Ct值的范围为15-35。Ct值小于15,认为扩增在基线期范围内,未达到荧光阈值。理想情况下,Ct值与模板起始拷贝数的对数存在线性关系,也就是标准曲线。起始模板量浓度越高,Ct值越小;起始模板量浓度越低,Ct值越大。通过标准曲线,扩增效率为100%时,计算出基因单个拷贝数定量的Ct值在35左右,若大于35,理论上模板起始拷贝数小于1,可认为无意义。
II.本发明的重组腺相关病毒载体制品中rcAAV含量测定方法
表达治疗基因产物的基于腺相关病毒(AAV)的载体显示出对人类基因治疗的巨大前景。将该有前景的研究转化为临床开发的主要挑战是建立适当的质量控制(QC)测试方法来表征临床级别AAV载体。本发明的方法用于AAV载体制品的质量控制测试,有助于评估AAV载体的安全性。
在重组AAV载体生产期间,重组AAV载体通过AAV ITR与反式存在于辅助成分或生产细胞中的rep基因和cap基因序列之间的同源或非同源重组的机制,可能形成复制型腺相关病毒(Replication Competent AAV,rcAAV)。近期的动物实验表明,rcAAV中cap基因在体内的表达会引发严重的免疫反应,且包装有其他DNA杂质的rcAAV还具有致瘤性或引入抗生素抗性的潜在风险。因此,需要严格控制rAAV载体制品中rcAAV的污染。
对于AAV2型载体制品,可以使用感染中心测定法(infectious center assay)进行具有复制活性的rcAAV残余检测。由于大多数非AAV2血清型载体制品中的rcAAV观察到对于体外培养细胞的感染效率较低,开发非AAV2血清型的rcAAV测定是一个挑战。
本发明提供了检测非AAV2血清型的rcAAV测定方法,即使对培养细胞的感染效率最低的rcAAV9,本发明的方法也能达到2rcAAV/1E+07vg rAAV9样品的检测灵敏度。
在一个实施方案中,本发明提供了一种AAV9制品中rcAAV9含量的相对定量检测方法,包括如下步骤:
(1)将对数生长期的HEK293细胞以1.2E+6个细胞/瓶接种于T25细胞培养瓶中,在4mL含10%胎牛血清的DMEM培养基中,5%CO2、37℃培养过夜。第二天细胞密度达到90%汇片时,弃去培养上清,更换为4mL新鲜含10%胎牛血清的DMEM培养基。
(2)将以下各组接种物加入至分别的T25培养瓶中,进行细胞的第一轮感染:
i)阴性对照组1(NC1):AdV-EGFP(MOI=2.5),无rcAAV9
ii)阴性对照组2(NC2):无AdV-EGFP,rcAAV9 1E+5vg
iii)阳性对照组(PC):AdV-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 1E+5vg
iv)加标对照组(Spike):AdV-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 1E+5vg,AAV9样品1E+11vg
v)受检样品(Test):AdV-EGFP(MOI=2.5),AAV9样品1E+11vg
在加入上述各组接种物后将细胞在5%CO2,37℃培养48小时。
(3)第一轮感染结束后,将T25培养瓶用封口膜封口,进行3次冻融后将全部细胞及上清裂解后转移至分别的离心管中,56℃灭活1小时,4000g离心10min后,上清经5mL100KD超滤管4000g离心约30min,浓缩至1mL。取500μL浓缩液于≤-70℃保存,用于qPCR检测。另500μL浓缩液作为下一轮感染接种液。
(4)第二轮感染:将对数生长期的HEK293细胞以1.2E+6个细胞/瓶接种于T25细胞培养瓶中,在4mL含10%胎牛血清的DMEM培养基中,5%CO2、37℃培养过夜。第二天细胞密度达到90%。
将第一轮感染后获得的500μL浓缩液加入4mL新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基中。加入细胞密度达到90%的HEK293细胞中,5%CO2、37℃培养48小时,进行第二轮细胞感染。与步骤(3)同样地,各培养瓶获得1mL超滤浓缩液,全部用于下一轮感染;
(5)第三、四轮感染与第二轮感染操作相同;在第四轮感染结束后,各培养瓶获得1mL超滤浓缩液全部用于qPCR检测;
(6)完成四轮感染后,自第一、四轮感染收获的超滤浓缩液提取DNA,作为实施qPCR的DNA模板,以Rep基因为模板设计特异性引物以及Taqman探针,进行qPCR检测;
(7)结果分析及判定:
a)阴性对照组1(NC1):第一、四轮检测Ct值均呈阴性
b)阴性对照组2(NC2):第一轮Ct均值<第四轮Ct均值
c)阳性对照组(PC):第一轮Ct均值>第四轮Ct均值
d)加标对照组1(Spike 1):第一轮Ct均值>第四轮Ct均值
如同时满足a)-d),且Test组第一轮Ct均值<第四轮Ct均值,则受检样品中rcAAV含量为:<1rcAAV/1E+6vg AAV样品;
如同时满足a)-d),且Test组第一轮Ct均值>第四轮Ct均值,则需进一步稀释AAV样品重新检测,直至检测到Test组第一轮Ct均值<第四轮Ct均值,则受检样品中rcAAV含量为:1E+5rcAAV/稀释的AAV样品加入量(vg)。
又在一个实施方案中,本发明提供了一种AAV9制品中rcAAV9含量的相对定量检测方法,包括如下步骤:
(1)将对数生长期的HEK293细胞以1.2E+6个细胞/瓶接种于T25细胞培养瓶中,在4mL含10%胎牛血清的DMEM培养基中,5%CO2、37℃培养过夜。第二天细胞密度达到90%汇片时,弃去培养上清,更换为4mL新鲜含10%胎牛血清的DMEM培养基。
(2)将以下各组接种物加入至各2瓶T25培养瓶中,进行细胞的第一轮感染:
i)阴性对照组1(NC1):AdV-EGFP(MOI=2.5),无rcAAV9
ii)阴性对照组2(NC2):无AdV-EGFP,rcAAV9 2E+4vg
iii)阳性对照组(PC):AdV-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 2E+4vg
iv)加标对照组(Spike):AdV-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 2E+4vg,AAV9样品1E+11vg
v)受检样品(Test):AdV-EGFP(MOI=2.5),AAV9样品1E+11vg
在加入上述各组接种物后将细胞在5%CO2,37℃培养48小时。
(3)第一轮感染结束后,将各组的2瓶T25培养瓶用封口膜封口,进行3次冻融后将全部细胞及上清裂解后转移至分别的离心管中,56℃灭活1小时,4000g离心10min后,上清经5mL 100KD超滤管4000g离心约30min,浓缩至1mL。将1瓶T25培养瓶的浓缩液于≤-70℃保存,用于qPCR检测;将另1瓶T25培养瓶的浓缩液作为下一轮感染接种液。
(4)第二轮感染:将对数生长期的HEK293细胞以1.2E+6个细胞/瓶接种于T25细胞培养瓶中,在4mL含10%胎牛血清的DMEM培养基中,5%CO2、37℃培养过夜。第二天细胞密度达到90%。
将第一轮感染后获得的各约1mL浓缩液加入4mL新鲜的含10%胎牛血清的DMEM培养基中。加入细胞密度达到90%的HEK293细胞中,5%CO2、37℃培养48小时,进行第二轮细胞感染。与步骤(3)同样地,各培养瓶获得1mL超滤浓缩液,全部用于下一轮感染;
(5)第三、四轮感染与第二轮感染操作相同;在第四轮感染结束后,各培养瓶获得1mL超滤浓缩液全部用于qPCR检测;
(6)完成四轮感染后,自第一、四轮感染收获的超滤浓缩液提取DNA,作为实施qPCR的DNA模板,以Rep基因为模板设计特异性引物以及Taqman探针,进行qPCR检测;
(7)结果分析及判定:
a)阴性对照组1(NC1):第一、四轮检测Ct值均呈阴性
b)阴性对照组2(NC2):第一轮Ct均值<第四轮Ct均值
c)阳性对照组(PC):第一轮Ct均值>第四轮Ct均值
d)加标对照组1(Spike 1):第一轮Ct均值>第四轮Ct均值
如同时满足a)-d),且Test组第一轮Ct均值<第四轮Ct均值,则受检样品中rcAAV含量为:<2rcAAV/1E+07vg AAV样品;
如同时满足a)-d),且Test组第一轮Ct均值>第四轮Ct均值,则需进一步稀释AAV样品重新检测,直至检测到Test组第一轮Ct均值<第四轮Ct均值,则受检样品中rcAAV含量为:2E+4rcAAV/稀释的AAV样品加入量(vg)。
在一些实施方案中,所述用于检测AAV9制品中rcAAV9含量的方法可以用于检测其他血清型的AAV病毒载体样品中相应的rcAAV含量。其他血清型的AAV病毒载体样品包括但不限于例如,AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9、AAVDJ病毒载体样品。
III.本发明的试剂盒
本发明还提供了一种用于检测重组腺相关病毒载体样品中的rcAAV含量的试剂盒,其包含:
(1)辅助病毒,例如,AdV-EGFP;
(2)rcAAV标准品;
(3)SEQ ID NO:1和2所示的rep2基因特异性引物和SEQ ID NO:3所示的Taqman探针。
在一个实施方案中,本发明的用于检测重组腺相关病毒载体样品中的rcAAV含量的试剂盒还包含:
(4)AAV载体敏感细胞,例如BHK-21细胞、HEK-293、Hela、Vero、A549细胞。
所述试剂盒能够实施本发明的用于检测重组腺相关病毒载体样品中的rcAAV含量的方法。
实施例
材料和方法
病毒
rAAV9载体样品(也简称为“rAAV9”样品):如CN111088284所述,用两个杆状病毒共感染Sf9细胞来包装生产rAAV9,其中,一个杆状病毒携带AAV的rep2和cap9基因表达框,另一个杆状病毒携带rAAV载体的ITR序列和外源目的基因表达框。Bac-to-AAV***为美国Virovek公司专利。两个杆状病毒共感染Sf9细胞后约72h,离心收集上清液。用细胞裂解液裂解Sf9细胞,离心去除细胞沉淀后,与上清液合并,进行两轮CsCl密度梯度超速离心后,提取rAAV9载体条带,进行切向流超滤浓缩换液,获得rAAV9载体制品。
rAAV5载体样品(也简称为“rAAV5”样品):类似rAAV9载体样品的制备。用两个杆状病毒共感染Sf9细胞来包装生产rAAV5,其中,一个杆状病毒携带AAV的rep2和cap5基因表达框,另一个杆状病毒携带rAAV载体的ITR序列和外源目的基因表达框。Bac-to-AAV***为美国Virovek公司专利。两个杆状病毒共感染Sf9细胞后约72h,离心收集上清液。用细胞裂解液裂解Sf9细胞,离心去除细胞沉淀后,与上清液合并,进行两轮CsCl密度梯度超速离心后,提取rAAV5载体条带,进行切向流超滤浓缩换液,获得rAAV5载体制品。
rAAV2-EGFP、rAAV5-EGFP、rAAV8-EGFP、及rAAV9-EGFP载体样品:通过三质粒法制备所述重组AAV病毒载体样品。具体而言,AAV载体质粒(pAAV2neo-EGFP)、辅助质粒(pHelper)(AAV Helper Free System,Agilent Technologies)和AAV2、AAV5、AAV8、AAV9血清型相应的Rep及Cap蛋白表达质粒(pAAV-RC)分别按照1:1:1的摩尔比混匀后,采用PEI法转染悬浮的HEK293T细胞,转染约48h后,收获细胞和培养上清,按照吴小兵等报道的AAV载体纯化方法进行纯化(Wu,X.等人,A novel method for purification of recombinantadenoassociated virus vectors on a large scale.Chinese Science Bulletin,2001.46(6):p.485-488),获得重组AAV病毒载体样品rAAV2-EGFP、rAAV5-EGFP、rAAV8-EGFP、及rAAV9-EGFP。
rcAAV9病毒标准品(也简称为“rcAAV9”):通过二质粒共转染HEK-293T细胞制备。将AAV的Rep2及Cap9基因序列***pAAV-MCS(AAV Helper Free Systeme AgilentTechnologies)中获得AAV载体质粒pAAV-rep2-cap9,将pAAV-rep2-cap9与辅助质粒pHelper(AAV Helper Free Systeme Agilent Technologies)共转染悬浮的HEK-293T细胞,转染48h后,收获细胞和培养上清,通过PEG/NaCl沉淀、氯仿抽提的方法纯化获得rcAAV9病毒。
rcAAV2病毒标准品(也简称为“rcAAV2”):通过二质粒共转染HEK-293T细胞制备。将AAV的Rep2及Cap2基因序列***pAAV-MCS(AAV Helper Free Systeme AgilentTechnologies)中获得AAV载体质粒pAAV-rep2-cap2,将pAAV-rep2-cap2与辅助质粒pHelper(AAV Helper Free Systeme Agilent Technologies)共转染悬浮的HEK-293T细胞,转染约48h后,收获细胞和培养上清,通过PEG/NaCl沉淀、氯仿抽提的方法纯化获得rcAAV2病毒。
AdV5-EGFP辅助病毒:通过AdMAX腺病毒***(加拿大Microbix Biosystems Inc.,包含pBHGlox(delta)E13Cre和pDC316质粒)制备。首先将EGFP基因(EGFP:增强型绿色荧光蛋白)***穿梭质粒pDC316获得pDC316-EGFP,再将腺病毒基因组骨架质粒pBHGlox(delta)E13Cre和穿梭质粒pDC316-EGFP共感染HEK293细胞,获得AdV5-EGFP腺病毒毒种。毒种在悬浮的HEK293细胞中扩增获得AdV5-EGFP病毒。
单纯疱疹病毒(Herpes simplex virus type,HSV)-EGFP辅助病毒:对数生长期的Vero细胞以2.5×106个细胞/ml接种于T25培养瓶。在含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养约24h后,将HSV-EGFP毒种以MOI=1感染Vero细胞,继续培养48h-72h后收取细胞和培养上清,反复冻融3次,离心,收取上清。阴离子交换层析法粗纯及浓缩,再用分子筛法进行精纯并分装,保存在-80℃冰箱。HSV-EGFP毒种由北京五加和分子医学研究所吴小兵教授赠送。
细胞
Vero细胞、HEK-293细胞、Hela细胞和BHK-21细胞均来自美国ATCC细胞库。
试剂
胎牛血清:购自Excell Bio(依科赛生物),货号:FCS500
细胞裂解液:0.05% Tween20 1mL,蛋白酶K缓冲液2mL,10mg/mL蛋白酶K 400μL,胆酸盐125μL加入纯水5.675mL。
DNA提取试剂盒:DNeasy Blood&Tissue Kit,购自QIAGEN,Cat.69504
上游、下游引物及探针:GQP-6-F:GTTTACGCACCCGTAGAAG(SEQ ID NO:1);GQP-6-R:AACTACCGGGAAGACCAAC(SEQ ID NO:2);GQP-6-P:TCGCGGAGGCCATAGCCCACA(SEQ ID NO:3)。
实施例1:检测rAAV5样品中的rcAAV5杂质含量的初步优化方法
由于AAV2和AAV5感染HEK293细胞的敏感性相当,因此本实施例利用初步优化的方法,以加入“rcAAV2标准品和AdV5-EGFP”的组为阳性对照,对rAAV5样品进行rcAAV5杂质残留量检测。
根据“材料和方法”中所述,制备了AdV5-EGFP(AD001)批号:A2012031301B,基因组滴度为1E+12vg/mL,5E+9PFU/mL;制备了rcAAV2标准品(MH119)批号:A2019122801,2.76E+11vg/mL;制备了AAV5样品批号:2021032202,4E+13vg/mL。
将对数生长期的HEK293细胞以1.2E+6个细胞/瓶接种于5个T25细胞培养瓶中,在约4mL含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养过夜。第二天细胞密度达到90%汇片时,弃去细胞培养上清,更换为约4mL新鲜含10%胎牛血清的DMEM培养基,根据以下分组加入约1mL各接种物:
i)阴性对照组1(NC1):仅有AdV5-EGFP(MOI=2.5),无rcAAV2
ii)阴性对照组2(NC2):无AdV5-EGFP,仅有rcAAV2 1E+3vg
iii)阳性对照组(PC):AdV5-EGFP(MOI=2.5),rcAAV2 1E+3vg
vi)加标组(Spike):AdV5-EGFP(MOI=2.5),rcAAV2 1E+3vg,rAAV5样品1E+11vgv)受检样品组(Test):AdV5-EGFP(MOI=2.5),rAAV5样品1E+11vg
将加样后的5个T25细胞培养瓶于37℃,5% CO2培养箱中培养48h。培养结束后,将T25培养瓶用封口膜封口,进行3次冻融后将全部细胞及上清转移至分别的离心管中,3000g离心10min。
取约2mL上清于≤-70℃保存待用,将剩余的约2mL上清于56℃1.5h灭活辅助病毒后,取1mL作为第二轮感染接种物重复以上过程。
同样地,在第二轮感染接种后于37℃,5% CO2培养箱中培养48h,取2mL上清于≤-70℃保存待用,将剩余的2mL上清于56℃1.5h灭活辅助病毒,取1mL作为第三轮感染接种物重复以上过程。第三轮感染接种并培养后,将3次收获的上清液同时使用细胞裂解液(0.05% Tween20 1mL,蛋白酶K缓冲液2mL,10mg/mL蛋白酶K 400μL,胆酸盐125μL加入纯水5.675mL)进行裂解:取50μL上清液加入42.5μL细胞裂解液,37℃1h;55℃2h;95℃30min,后作为DNA模板。以Rep基因为模板设计的特异性引物GQP-6-F、GQP-6-R以及Taqman探针GQP-6-P进行qPCR反应。
qPCR检测Ct平均值的结果如表1所示,结果表明,本实施例使用优化了培养体积、通过使用细胞裂解液获得DNA、和使用qPCR引物、探针序列的方法进行rcAAV检测时,实验设计的重复性良好,rcAAV5检出限为1rcAAV5/1E+08vg rAAV5样品。
表1 3次重复实验检测rcAAV5含量
实施例2.用于检测rAAV病毒载体感染滴度的细胞
由于不同细胞对不同血清型rAAV病毒载体的敏感性不同,为提高检测结果的灵敏度,检测rAAV载体的感染滴度时使用较敏感细胞是有利的。
选取“材料和方法”中的AAV血清型2、5、8和9且带有增强型绿色荧光蛋白基因的重组AAV病毒载体样品rAAV2-EGFP、rAAV5-EGFP、rAAV8-EGFP、rAAV9-EGFP以MOI=2×105vg/细胞分别感染Vero、HEK-293、Hela和BHK-21细胞。在72小时观察绿色荧光蛋白表达情况,筛选对各血清型AAV病毒载体的敏感细胞。
结果如表2所示,以上血清型AAV病毒载体样品均可感染这四种细胞。选择其中的HEK293细胞进行进一步的实验。
表2病毒载体样品rAAV2-EGFP、rAAV5-EGFP、rAAV8-EGFP和rAAV9-EGFP感染不同细胞后,表达绿色荧光蛋白的细胞比例
注:以上计数荧光比例均是在相同参数下拍照并计数而获得的。
实施例3:依赖辅助病毒复制的rcAAV9最低加入量的测试
采用实施例1的初步优化方法,测试实施例2选择的HEK293细胞可检测到rcAAV9复制的最低rcAAV9含量。
根据“材料和方法”中所述,制备了AdV5-EGFP(AD001)批号:A2012031301B,基因组滴度为1E+12vg/mL,5E+9PFU/mL;制备了rcAAV9(MH120)批号:A2019122802,9.71E+12vg/mL。
将对数生长期的HEK293细胞以1.2E+6个细胞/瓶接种于5个T25细胞培养瓶中,在约4mL含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养过夜。第二天细胞密度达到90%汇片时,弃去培养上清,更换为约4mL新鲜含10%胎牛血清的DMEM培养基,根据以下分组加入约1mL各接种物:
i)阴性对照组1(NC1):AdV5-EGFP(MOI=2.5),无rcAAV9
ii)阴性对照组2(NC2):无AdV5-EGFP,仅有rcAAV9 4E+6vg
iii)阳性对照组1(PC1):AdV5-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 4E+4vg
iv)阳性对照组2(PC2):AdV5-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 4E+5vg
v)阳性对照组3(PC3):AdV5-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 4E+6vg
将加样后的5个T25细胞培养瓶于37℃,5% CO2培养箱中培养约48h。培养结束后,将T25培养瓶用封口膜封口,进行3次冻融后将全部细胞及上清转移至分别的离心管中,3000g离心10min。
取上清约2mL于≤-70℃保存待用,将剩余的约2mL上清于56℃1.5h灭活辅助病毒后,取1mL作为第二轮感染接种物重复以上过程。
同样地,取2mL上清于≤-70℃保存待用,将剩余的2mL上清于56℃1.5h灭活AdV5-EGFP辅助病毒后,取1mL作为第三轮感染接种物重复以上过程。第三轮感染后,将3次收获的上清液同时使用细胞裂解液(0.05% Tween20 1mL,蛋白酶K缓冲液2mL,10mg/mL蛋白酶K400μL,胆酸盐125μL加入纯水5.675mL)进行裂解:取50μL上清液加入42.5μL细胞裂解液,37℃1h;55℃2h;95℃30min,后作为DNA模板。以Rep基因为模板设计的特异性引物GQP-6-F,GQP-6-R以及Taqman探针GQP-6-P进行qPCR反应。
结果如表3所示,当rcAAV9至少加入量为4E+5vg/瓶时,Ct值经过三轮感染呈现下降趋势,检测到了在这个过程中rcAAV9的复制。因此,在该条件下,rcAAV9阳性对照最低加入量为4E+5vg。
表3不同rcAAV9加入量三轮感染后qPCR检测Ct平均值
分组 | 第一轮 | 第二轮 | 第三轮 |
NC 1 | 33.91 | 33.91 | 34.32 |
NC 2 | 29.74 | 31.94 | 33.55 |
PC 1 | 32.71 | 33.95 | 34.17 |
PC 2 | 30.38 | 28.53 | 25.57 |
PC 3 | 25.12 | 23.55 | 20.31 |
实施例4:受检样品中rAAV9最高存在量的测试
由于待检测样品为rAAV9制品,因此检测样品中rcAAV9杂质含量时,样品中大量的rAAV9对宿主细胞也存在感染性,可能对rcAAV9的复制形成竞争性抑制。本实施例优化了检测方法中的样品rAAV9最高存在量。
根据“材料和方法”中所述,制备了AdV5-EGFP(AD001)批号:A2012031301B,基因组滴度为1E+12vg/mL,5E+9PFU/mL;制备了rcAAV9(MH120)批号:A2019122802,9.71E+12vg/mL;制备了rAAV9样品,批号A202005001,基因组滴度为2E+14vg/mL。
将对数生长期的HEK293细胞以1.2E+6个细胞/瓶接种于5个T25细胞培养瓶中,在约4mL含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养过夜。第二天细胞密度达到90%汇片时,弃去培养上清,更换为约4mL新鲜含10%胎牛血清的DMEM培养基,根据以下分组加入约1mL各接种物:
i)阴性对照组1(NC1):仅有AdV5-EGFP(MOI=2.5),无rcAAV9
ii)阴性对照组2(NC2):无AdV5-EGFP,仅有rcAAV9 1E+6vg
iii)阳性对照组(PC):AdV5-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 4E+5vg
iv)加标组1(Spike 1):AdV5-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 4E+5vg,rAAV9样品1E+11vg
v)加标组2(Spike 2):AdV5-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 4E+5vg,rAAV9样品1E+9vgvi)加标组3(Spike 3):AdV5-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 4E+5vg,rAAV9样品1E+8vg
与实施例3同样地实施三轮感染。结果如表4所示,阳性对照组(PC)三轮感染检测Ct值呈下降趋势,rAAV9样品加入量为1E+11vg、1E+9vg、1E+8vg的加标组(Spike1~3)均可检测到Ct值呈下降趋势。
表4不同AAV9样品加入量,三轮感染后qPCR检测Ct平均值
分组 | 第一轮 | 第二轮 | 第三轮 |
NC 1 | 34.199 | 34.334 | 33.845 |
NC 2 | 29.402 | 32.489 | 33.852 |
PC | 27.621 | 26.935 | 23.804 |
Spike 1 | 26.249 | 27.423 | 25.343 |
Spike 2 | 27.891 | 26.971 | 25.011 |
Spike 3 | 27.495 | 26.989 | 23.078 |
进一步根据以下分组设置更高的rAAV9样品加入量:
i)阴性对照组1(NC1):仅有AdV5-EGFP(MOI=2.5),无rcAAV9
ii)阴性对照组2(NC2):无AdV5-EGFP,无rcAAV9
iii)阳性对照组(PC):AdV5-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 4E+5vg
iv)加标组1(Spike 1):AdV5-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 4E+5vg,AAV9样品1E+13vgv)加标组2(Spike 2):AdV5-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 4E+5vg,AAV9样品1E+12vgvi)加标组3(Spike 3):AdV5-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 4E+5vg,AAV9样品1E+11vg
与实施例3同样地实施前三轮感染后,取2mL上清于≤-70℃保存待用,将剩余的2mL上清于56℃1.5h灭活AdV5-EGFP辅助病毒后,取1mL作为第四轮感染接种物重复以上过程。第四轮感染后,将4次收获的上清液同时使用细胞裂解液(0.05% Tween20 1mL,蛋白酶K缓冲液2mL,10mg/mL蛋白酶K 400μL,胆酸盐125μL加入纯水5.675mL)进行裂解:取50μL加入42.5μL细胞裂解液,37℃1h;55℃2h;95℃30min,后作为DNA模板。以Rep基因为模板设计的特异性引物GQP-6-F,GQP-6-R以及Taqman探针GQP-6-P进行qPCR反应。
结果如表5所示,在rAAV9样品加入量为1E+11vg/T25瓶时,四轮感染检测Ct值成下降趋势,但当rAAV9加入量提高为1E+12vg、1E+13vg时,四轮感染检测Ct值呈上升趋势,表明此时可能rAAV9加入量过高,对rcAAV9感染宿主细胞的复制过程形成了竞争性抑制,因此,该条件下rAAV9样品最高存在量为1E+11vg。
表5不同rAAV9样品加入量四轮感染后qPCR检测Ct平均值
分组 | 第一轮 | 第二轮 | 第三轮 | 第四轮 |
NC 1 | 34.197 | 34.374 | 33.726 | 34.300 |
NC 2 | 32.375 | 33.457 | 33.662 | 34.159 |
PC | 27.281 | 25.048 | 22.718 | 20.367 |
Spike 1 | 18.846 | 21.453 | 23.923 | 26.227 |
Spike 2 | 22.175 | 24.868 | 27.401 | 29.464 |
Spike 3 | 25.787 | 25.730 | 23.512 | 20.971 |
根据实施例3、实施例4的结果可见,以AdV-EGFP(MOI=2.5)为辅助病毒,HEK293为宿主细胞,感染三~四轮后,以Rep特异性引物和探针通过qPCR检测每轮样品Ct值,可以检测rAAV9制品中的rcAAV9含量,检测限为1rcAAV9/2.5E+5vg rAAV9样品。与文献中报导的对rAAV8制品中rcAAV含量的检测限相差近10倍。这与rAAV9对体外培养细胞的低敏感度有关,因此需要更加灵敏的方法检测rAAV9制品中的rcAAV9。
实施例5:检测方法的灵敏度优化之一
在三轮感染过程中,后2轮感染接种物为上一轮4mL培养基中取1mL,因此会有3/4的损失,当rcAAV9含量较低时可能会因此而不能被检测到。另一方面,直接增大接种物体积,接种物中包含的用过的培养基中物质可能对细胞扩增及状态有不利影响,因此,本实施例进一步优化了提高检测rcAAV9含量的灵敏度的方法。
根据“材料和方法”中所述,制备了AdV5-EGFP(AD001)批号:A2012031301B,基因组滴度为1E+12vg/mL,5E+9PFU/mL;制备了rcAAV9(MH120)批号:A2019122802,9.71E+12vg/mL;制备了AAV9样品,批号GP202007001,基因组滴度为2E+14vg/mL。
将对数生长期的HEK293细胞以1.2E+6个细胞/瓶接种于12个T25细胞培养瓶中,在约4mL含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养过夜。第二天细胞密度达到90%汇片时,弃去培养上清,更换为约4mL新鲜含10%胎牛血清的DMEM培养基,根据以下分组加入约1mL各接种物:
A.方法一
i)阳性对照组1(PC1):AdV5-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 4E+5vg
ii)加标组(Spike):AdV5-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 4E+5vg,AAV9样品1E+11vg
B.方法二
iii)阳性对照组1(PC1):AdV5-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 4E+5vg
iv)阳性对照组2(PC2):AdV5-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 1E+5vg
v)阳性对照组3(PC3):AdV5-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 1E+4vg
vi)加标组(Spike):AdV5-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 4E+5vg,AAV9样品1E+11vg
方法一,共2组,如实施例3、实施例4所述,第一轮感染结束后3次冻融后将全部细胞及上清转移至分别的离心管中,3000g离心10min后,上清取1mL于≤-70℃保存用于qPCR检测,剩余3mL上清于56℃1.5h灭活辅助病毒后,取1mL作为第二轮感染接种物重复以上过程,共进行四轮感染。
方法二,共4组,第一轮感染结束后,将T25培养瓶用封口膜封口,进行3次冻融后将全部细胞及上清转移至分别的离心管中,56℃灭活1小时,4000g离心10min后,上清经5mL100KD超滤管(PALL,Cat.MCP100C46)4000g离心约30min,浓缩至1mL,取500μL用于qPCR检测,另500μL作为下一轮感染接种液。第二、三轮感染重复以上操作,将上清液浓缩至1mL后全部用于下一轮感染,无需qPCR留样。第四轮感染结束后,3次冻融,然后将全部细胞及上清转移至分别的离心管中,56℃灭活1小时,4000g离心10min后,上清经超滤管4000g离心约30min,浓缩至1mL,1mL全部用于qPCR检测。qPCR留样样品用DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN,Cat.69504)提取,获得DNA用100μL洗脱液洗脱,作为qPCR检测DNA模板,以Rep基因为模板设计的特异性引物GQP-6-F,GQP-6-R以及Taqman探针GQP-6-P进行qPCR反应。
结果如表6和表7所示,方法二较方法一相比,阳性对照中rcAAV9加入量显著降低,可低至1E+5vg/瓶,因此该方法检测限为1rcAAV9/1E+6vg AAV9,较方法一相比灵敏度提高。
表6.进行四轮感染后qPCR检测Ct平均值(方法一)
表7.进行四轮感染后qPCR检测Ct平均值(方法二)
实施例6:检测方法的灵敏度优化之二
本实施例进一步优化了实验方案,将第一轮感染T25瓶增加为每组感染2个T25瓶,其中一个T25瓶感染完成后收获用于qPCR检测,一个T25瓶感染完成后收获全部细胞及上清用于下一轮感染。在一个方法中,使用了与AdV不同的辅助病毒。
将对数生长期的HEK293细胞以1.2E+6个细胞/瓶接种于26个T25细胞培养瓶中,在约4mL含10%胎牛血清的DMEM培养基中培养过夜。第二天细胞密度达到90%汇片时,弃去培养上清,更换为约4mL新鲜含10%胎牛血清的DMEM培养基,根据以下分组,每组2个T25瓶加入各接种物:
A.方法一
i)阳性对照组1(PC1):AdV-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 1E+5vg
ii)阳性对照组2(PC2):AdV-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 2E+4vg
iii)加标组1(Spike 1):AdV-EGFP(MOI=2.5),rcAAV9 1E+5vg,AAV9样品1E+11vg
B.方法二
iv)阳性对照组1(PC1):HSV-EGFP(MOI=5),rcAAV9 1E+5vg
v)阳性对照组2(PC2):HSV-EGFP(MOI=5),rcAAV9 2E+4vg
vi)阳性对照组3(PC3):HSV-EGFP(MOI=5),rcAAV9 4E+3vg
vii)阳性对照组4(PC4):HSV-EGFP(MOI=5),rcAAV9 2E+3vg
viii)加标组1(Spike 1):HSV-EGFP(MOI=5),rcAAV9 1E+5vg,AAV9样品1E+11vgix)加标组2(Spike 2):HSV-EGFP(MOI=5),rcAAV9 2E+4vg,AAV9样品1E+11vgx)加标组3(Spike 3):HSV-EGFP(MOI=5),rcAAV9 4E+3vg,AAV9样品1E+11vgxi)加标组4(Spike4):HSV-EGFP(MOI=5),rcAAV9 2E+3vg,AAV9样品1E+11vgxii)阴性组1(NC1):HSV-EGFP(MOI=5),无rcAAV9
xiii)阴性组2(NC2):无HSV-EGFP,rcAAV9 1E+5vg
其中AdV-EGFP(AD001)批号:A2012031301B,基因组滴度为1E+12vg/mL,5E+9PFU/mL;rcAAV9(MH120)批号:A2019122802,9.71E+12vg/mL;rAAV9样品,批号GP202007001,基因组滴度为2E+14vg/mL。HSV-EGFP:滴度:2.11×107PFU/mL。
第一轮感染结束后,将T25培养瓶用封口膜封口,进行3次冻融后将全部细胞及上清转移至分别的离心管中,56℃灭活1小时,4000g离心10min后,上清经5mL 100KD超滤管(PALL,Cat.MCP100C46)4000g离心约30min,浓缩至1mL,每组2个T25瓶所收集1mL病毒浓缩液,其中1mL于≤-70℃保存,用于qPCR检测;另外1mL作为下一轮感染接种液。三轮感染重复以上操作,将上清液浓缩至1mL后全部用于下一轮感染,无需qPCR留样。第四轮感染结束后,3次冻融,然后将全部细胞及上清转移至分别的离心管中,56℃灭活1小时,4000g离心10min后,上清经超滤管4000g离心约30min,浓缩至约1mL,1mL全部用于qPCR检测。qPCR留样样品用DNeasy Blood&Tissue Kit(QIAGEN,Cat.69504),获得DNA用100μL洗脱液洗脱,作为qPCR检测用DNA模板,以Rep基因为模板设计的特异性引物GQP-6-F,GQP-6-R以及Taqman探针GQP-6-P进行qPCR反应。检测结果如表8所示,与实施例5相比,改进初始培养瓶数量后,当使用AdV5为辅助病毒时,可显著提高方法灵敏度至2rcAAV/1E+07vg rAAV9样品。
表8进行四轮感染后qPCR检测Ct平均值
将第一轮感染T25瓶由每组1个T25瓶增加为每组2个T25瓶,在第二轮感染时增加了上清液感染总量,由此,进一步提高了检测方法灵敏度。
其他可进一步增加灵敏度的优化方法,如增加感染轮数等。本发明方法不存在感染过程中接种物的损失,因此增加感染轮数,理论上可增加rcAAV扩增代数。
以上描述了本发明的示例性实施方案,本领域技术人员应当理解的是,这些公开内容仅是示例性的,在本发明的范围内可以进行各种其它替换、适应和修改。因此,本发明不限于文中列举的具体实施方案。
Claims (8)
1.重组腺相关病毒载体样品中的rcAAV含量检测方法,包括如下步骤:
(1)使用约4至5mL容量的细胞培养瓶,例如T25培养瓶,培养细胞;
(2)将以下各组接种物加入至分别的所述细胞培养瓶中,进行细胞的第一轮感染:
i)阳性对照组(PC):为辅助病毒和rcAAV标准品,其中,辅助病毒用于rcAAV标准品的复制,且rcAAV标准品为约1E+3vg至4E+5vg rcAAV,例如,1E+4vg,2E+4vg,4E+4vg,6E+4vg,8E+4vg,1E+5vg,2E+5vg rcAAV;
ii)加标组(Spike):为辅助病毒和rcAAV标准品,以及受检样品,其中,辅助病毒用于rcAAV标准品的复制,且rcAAV标准品为约1E+3vg至4E+5vg rcAAV,例如,1E+4vg,2E+4vg,4E+4vg,4E+4vg,6E+4vg,8E+4vg,1E+5vg,2E+5vg rcAAV;受检样品为约1E+08vg至1E+11vgAAV,例如,1E+08vg,1E+09vg,1E+10vg,1E+11vg AAV;
iii)受检样品组(Test):为辅助病毒和受检样品,其中,受检样品为约1E+08vg至1E+11vg AAV,例如,1E+08vg,1E+09vg,1E+10vg,1E+11vg AAV;
(3)第一轮感染结束后,将所述各培养瓶中的细胞及上清冻融,并将各培养瓶中的全部细胞及上清转移至分别的离心管中,56℃灭活后,超滤浓缩至1mL;取约500μL浓缩液于≤-70℃保存,用于qPCR检测;另约500μL浓缩液作为下一轮感染接种液;
(4)将第一轮感染后获得的各约500μL浓缩液加入约4mL新鲜的培养基中,进行第二轮细胞感染,与步骤(3)同样地,各培养瓶获得1mL超滤浓缩液,全部用于下一轮感染;
(5)第三轮感染(任选地,第四轮感染)与第二轮感染操作相同;在第三轮感染(任选地,第四轮感染)结束后,各培养瓶获得1mL超滤浓缩液全部用于qPCR检测;
(6)完成三轮(任选地,四轮)感染后,自第一轮和最后一轮感染收获的超滤浓缩液提取DNA,作为实施qPCR的DNA模板,以Rep基因为模板设计特异性引物以及Taqman探针,进行qPCR检测;
(7)结果分析及判定:
如果阳性对照组(PC):第一轮Ct均值>最后一轮Ct均值;
加标组(Spike):第一轮Ct均值>最后一轮Ct均值;
且受检样品组(Test):第一轮Ct均值<最后一轮Ct均值,则受检样品中rcAAV含量为:<rcAAV标准品加入量/AAV样品加入量(vg);
如果阳性对照组(PC):第一轮Ct均值>最后一轮Ct均值;
加标组(Spike):第一轮Ct均值>最后一轮Ct均值;
且受检样品组(Test):第一轮Ct均值>最后一轮Ct均值,则需进一步稀释受检样品并实施步骤(1)至(6)的检测,直至检测到受检样品组(Test):第一轮Ct均值<最后一轮Ct均值,则受检样品中rcAAV含量为:rcAAV标准品加入量/稀释的AAV样品加入量(vg)。
2.重组腺相关病毒载体样品中的rcAAV含量检测方法,包括如下步骤:
(1)使用约4至5mL容量的细胞培养瓶,例如T25培养瓶,培养细胞;
(2)将以下各组接种物加入至各2瓶所述细胞培养瓶中,进行细胞的第一轮感染:
i)阳性对照组(PC):为辅助病毒和rcAAV标准品,其中,辅助病毒用于rcAAV标准品的复制,且rcAAV标准品为约1E+3vg至4E+5vg rcAAV,例如,1E+4vg,2E+4vg,4E+4vg,6E+4vg,8E+4vg,1E+5vg,2E+5vg rcAAV;
ii)加标组(Spike):为辅助病毒和rcAAV标准品,以及受检样品,其中,辅助病毒用于rcAAV标准品的复制,且rcAAV标准品为约1E+3vg至4E+5vg rcAAV,例如,1E+4vg,2E+4vg,4E+4vg,4E+4vg,6E+4vg,8E+4vg,1E+5vg,2E+5vg rcAAV;受检样品为约1E+08vg至1E+11vgAAV,例如,1E+08vg,1E+09vg,1E+10vg,1E+11vg AAV;
iii)受检样品组(Test):为辅助病毒和受检样品,其中,受检样品为约1E+08vg至1E+11vg AAV,例如,1E+08vg,1E+09vg,1E+10vg,1E+11vg AAV;
(3)第一轮感染结束后,将各组的2瓶所述培养瓶中的细胞及上清冻融,并将各培养瓶中的全部细胞及上清转移至分别的离心管中,56℃灭活后,每瓶中的细胞及上清超滤浓缩至1mL;将1瓶所述培养瓶的浓缩液于≤-70℃保存,用于qPCR检测;将另1瓶所述培养瓶的浓缩液作为下一轮感染接种液;
(4)将第一轮感染后获得的各约1mL浓缩液加入约4mL新鲜的培养基中,进行各组1瓶约4至5mL容量的细胞培养瓶中细胞的第二轮感染,与步骤(3)同样地,各培养瓶获得1mL超滤浓缩液,全部用于下一轮感染;
(5)第三轮感染(任选地,第四轮感染)与第二轮感染操作相同;在第三轮感染(任选地,第四轮感染)结束后,各培养瓶获得1mL超滤浓缩液全部用于qPCR检测;
(6)完成三轮(任选地,四轮)感染后,自第一轮和最后一轮感染收获的超滤浓缩液提取DNA,作为实施qPCR的DNA模板,以Rep基因为模板设计特异性引物以及Taqman探针,进行qPCR检测;
(7)结果分析及判定:
如果阳性对照组(PC):第一轮Ct均值>最后一轮Ct均值;
加标组(Spike):第一轮Ct均值>最后一轮Ct均值;
且受检样品组(Test):第一轮Ct均值<最后一轮Ct均值,则受检样品中rcAAV含量为:<rcAAV标准品加入量/AAV样品加入量;
如果阳性对照组(PC):第一轮Ct均值>最后一轮Ct均值;
加标组(Spike):第一轮Ct均值>最后一轮Ct均值;
且受检样品组(Test):第一轮Ct均值>最后一轮Ct均值,则需进一步稀释受检样品并实施步骤(1)至(6)的检测,直至检测到受检样品组(Test):第一轮Ct均值<最后一轮Ct均值,则受检样品中rcAAV含量为:rcAAV标准品加入量/稀释的AAV样品加入量(vg)。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中,细胞选自Vero、HEK-293、Hela和BHK-21细胞;优选地,对细胞进行四轮或以上的感染,例如,进行五轮、六轮、七轮、八轮感染。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法,其中,重组腺相关病毒载体样品是不同血清型的AAV病毒载体样品,例如,AAV1、AAV2、AAV5、AAV8、AAV9、AAVDJ病毒载体样品。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法,其中,所述培养基是包含10%胎牛血清的RPMI1640、DMEM培养基,且使用辅助病毒以MOI=2~5感染细胞,例如,所述辅助病毒是腺病毒或单纯疱疹病毒。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的方法,其中,特异性引物如SEQ ID NO:1和2所示;Taqman探针如SEQ ID NO:3所示。
7.用于检测重组腺相关病毒载体样品中的rcAAV含量的试剂盒,其包含:
(1)辅助病毒,例如,AdV-EGFP;
(2)rcAAV标准品;
(3)SEQ ID NO:1和2所示的rep2基因特异性引物和SEQ ID NO:3所示的Taqman探针。
8.根据权利要求7所述的用于检测重组腺相关病毒载体样品中的rcAAV含量的试剂盒,其还包含:
(4)AAV载体敏感细胞,例如BHK-21细胞、HEK-293、Hela、Vero、A549细胞。
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Cited By (1)
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- 2022-12-30 CN CN202211723118.8A patent/CN116004921A/zh active Pending
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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