CN116004816A - Irf7在皮肤纤维瘤中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及IRF7的医药用途，具体涉及IRF7皮肤纤维瘤中的应用。本发明提供IRF7的表达水平的检测试剂制备辅助诊断皮肤纤维瘤疾病，本发明还提供IRF7抑制剂在制备用于治疗皮肤纤维瘤药物中的应用。提供了一种更加简单、有效地表明皮肤纤维瘤临床指标，为皮肤纤维瘤的发生提供早期依据。表明IRF7在皮肤纤维瘤发病过程中发挥重要作用，可以作为诊疗皮肤纤维瘤的新的分子标记和药物靶点。

Description

IRF7在皮肤纤维瘤中的应用

技术领域

本发明涉及IRF7的医药用途，具体涉及IRF7在皮肤纤维瘤中的应用。

背景技术

皮肤纤维瘤（dermatofibroma，DF），又名良性纤维组织细胞瘤（benign fibroushistiocytoma ，BFH），皮肤纤维瘤是成纤维细胞或组织细胞灶性增生引致的一种真皮内的良性肿瘤，是一种常见的皮肤病变，约占一个皮肤病理学实验室收到的皮肤病变标本的3%。 它的发生机制尚不明确，多认为是微小皮肤损伤所引起的一种反应性纤维增生。本病好发于中青年，女性多见，可见于身体任何部位，但以四肢较为多见，常表现为单发褐色皮肤结节，组织病理学上主要由成纤维细胞和组织细胞构成。典型皮肤纤维瘤易于诊断，但由于其在组织学上谱系广泛，且表现各异，这就给诊断带来了一定困难。该病的治疗方法以手术治疗和保守治疗为主。

IRF7（interferon regulatory factor 7）是干扰素调节因子家族的成员，在免疫***疾病中发挥重要作用。IRF7与Smad3相互作用以介导胶原蛋白生成中的TGF-β信号传导。IRF7基因敲除小鼠相较野生型不容易被博来霉素诱导产生纤维化皮肤。但IRF7在皮肤创伤愈合与皮肤纤维瘤形成方面的研究还未知。

本领域迫切需要寻求皮肤纤维瘤诊断标志物，以及将标志物抑制剂应用到皮肤纤维瘤医药中，这是亟需要解决的技术问题。

发明内容

本发明旨在提供干预IRF7表达或抑制其活性片段用于预防或治疗皮肤纤维瘤的医药用途。

为了实现上述目的，本发明提供了如下技术方案。

IRF7的表达水平的检测试剂制备辅助诊断皮肤纤维瘤产品中的应用。

进一步的，所述的皮肤纤维瘤产品以IRF7基因或IRF7蛋白作为诊断标记物。

进一步的，所述的IRF7表达水平在皮肤纤维瘤中表达上调。

进一步的，所述产品为芯片、制剂或试剂盒。

IRF7抑制剂在制备用于治疗皮肤纤维瘤药物中的应用。

进一步的，所述IRF7抑制剂抑制人成纤维细胞分化，所述IRF7抑制剂通过抑制IRF7基因表达达到抑制皮肤纤维瘤的发生和发展。

进一步的，所述IRF7抑制剂的包括shRNA干扰靶序列，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

进一步地，所述药物为任何药物治疗学上可接受的剂型。

进一步地，所述药物为任何药物治疗学上可接受的剂量。

与现有技术相比本发明的有益效果。

发明人通过大量实验发现，在人体皮肤纤维瘤皮肤组织中，IRF7表达明显上调。

细胞学水平发现，抑制IRF7表达后可以抑制成纤维细胞分化，进而抑制皮肤纤维瘤发生和发展。

以上结果表明，IRF7在皮肤纤维瘤过程中起重要调控作用。

附图说明

图1是人正常皮肤和皮肤纤维瘤组织中的 IRF7 mRNA表达水平。

图2是人正常皮肤和皮肤纤维瘤组织中的IRF7的蛋白表达水平。

图3是IRF7过表达，I型胶原蛋白（collagenI，Col1）、III型胶原蛋白（collagenIII，Col3）和纤连蛋白（fibronectin，Fn）的mRNA表达图。

图4是IRF7过表达，I型胶原蛋白（collagenI，Col1）、III型胶原蛋白（collagenIII，Col3）和纤连蛋白（fibronectin，Fn）的蛋白表达图。

图5是敲低IRF7，I型胶原蛋白（collagenI，Col1）、III型胶原蛋白（collagenIII，Col3）和纤连蛋白（fibronectin，Fn）的mRNA表达图。

图6是敲低IRF7，I型胶原蛋白（collagenI，Col1）、III型胶原蛋白（collagenIII，Col3）和纤连蛋白（fibronectin，Fn）的蛋白表达图。

具体实施方式

实施例1。

1、皮肤组织或细胞中总RNA提取及qRT-PCR。

1.1、组织中总RNA提取。

向装有组织的Ep管中加入1mlTrizol裂解液，使用低温组织匀浆仪充***解组织至均一状态。冰上静置组织10min等待进一步裂解充分。向EP管中加入200μL氯仿，使用涡旋机充分震荡15s将液体混匀，静置于冰上10min。之后使用低温离心机按12000g离心10min，取上层透明液体于新的EP管中，并加等体积异丙醇，上下颠倒混匀，静置于冰上10min。之后使用低温离心机按12000g离心10min。弃上清，加入1ml 75%乙醇清洗沉淀，使用低温离心机按7000g离心5min，弃上清。使用滤纸吸干乙醇并置于通风橱将残留液体挥发。使用去RNA酶水溶沉淀，进行后续实验。

1.2、RNA定量、逆转录，实时荧光定量PCR。

RNA定量：用 NanoDrop 2000分光光度计检测 RNA 在260mm 和 280mm 处的吸光度，获得比值，若A260/A 280位于1.8-2.0，表示RNA的纯度较好，测得的RNA浓度可以用于后续实验。

RNA逆转录：将RNA反转录成为cDNA，按照以下步骤进行。

表1 去基因组DNA反应体系。

。

反应条件：42℃加热 2 min；降温至4℃。反应体积：10μL。

表2 cDNA合成反应体系。

。

反应条件： 37℃ 15min；85℃ 5 s；降温至4℃。反应体积：20μL

反转录结束后进行实时荧光定量PCR，以下是反应体系。

表3 PCR反应体系。

。

反应条件：第一阶段，预变性：95℃，5min；第二阶段，循环反应：95℃，15s；60℃，45s（40循环）；第三阶段，溶解曲线：95℃，15s；60℃，60s，95℃，15s。

表4 PCR引物序列。

。

试验结论：如图1所示，IRF7 mRNA在皮肤纤维瘤患者的皮肤组织中均显著增加。

2、Western blot方法检测细胞纤维瘤中irf7表达情况。

Western-Blot实验：实验组为皮肤纤维瘤组织，对照组为正常皮肤。

蛋白提取和定量：将待检测样本置于冰上，以1：100配置PMSF与RIPA混合溶液，根据细胞和组织的量和大小酌情加入混合液。私用组织研磨仪和超声破碎组织，低温置于冰上30min。按照4℃，15000g离心25min样本。去上层清液于新的EP管中，标记好样品名称。按照BCA试剂盒配置并检测总蛋白浓度，按照比例配置蛋白混合溶液并加入6xloadingbuffer混匀，95℃加热5min，进行后续实验或-20℃保存。

配胶：按试剂盒说明书配置浓缩胶和分离胶，先将分离胶快速加入玻璃板槽内，使用去离子水压齐胶上层平面。20min左右会看到胶体与水面间出现明显分界，弃上层水，使用滤纸吸干残留液体。将浓缩胶加入槽中，将梳子延槽壁从左往右水平***，挤出多余气泡。待胶体完全凝固后，进行后续阶段实验。

电泳：将配好的胶放入电泳槽中，使用1x电泳液，拔梳子，按照所需蛋白量加入对应的体积，前后两端加入marker标记位置。浓缩胶电压初始为80V，后转为100V进行分离，至溴酚蓝跑出分离胶底部可停止。

转印：取出电泳后的凝胶，使用1x转印液，采用“湿转法”进行转印，“黑胶白膜”一一对应组装湿转装置，固定在转印槽中。按照90V恒压转印1h左右，转印时使用冰对转印槽进行降温。

一抗孵育：将转印后的PVDF膜取出，使用TBST洗3次，按照目的条带位置裁剪膜，使用目的基因的抗体于孵育盒中孵育，4℃摇床孵育过夜。

二抗孵育和化学发光：隔日回收一抗，TBST于摇床上清洗膜3次，每次10min，配置对应二抗室温孵育1-2h。使用TBST于摇床上洗膜3次，每次10min。使用发光液进行曝光成像，保存图片后进行分析。蛋白的表达情况采用相对光密度来表示，以GAPDH为内参，保证实验结果独立重复3次以上。

试验结论；如图2所示，人类皮肤纤维瘤组织中irf7的蛋白表达明显增加。

实施例2。

1、细胞转染。

将人皮肤成纤维细胞（Humanskinfibroblastscells，HSDFs）接种到6孔板中（每孔约1×10⁵个细胞）并在转染前培养至适宜密度。IRF7 CDS序列如SEQ ID NO.1所示。

SEQ ID NO.1序列：IRF7 CDS(Human,NM_004031)：

5-ATGCCAGTCCCCGAGCGCCCTGCAGCCGGCCCTGACTCTCCGCGGCCGGGCACCCGCAGGGCAGCCCCACGCGTGCTGTTCGGAGAGTGGCTCCTTGGAGAGATCAGCAGCGGCTGCTATGAGGGGCTGCAGTGGCTGGACGAGGCCCGCACCTGTTTCCGCGTGCCCTGGAAGCACTTCGCGCGCAAGGACCTGAGCGAGGCCGACGCGCGCATCTTCAAGGCCTGGGCTGTGGCCCGCGGCAGGTGGCCGCCTAGCAGCAGGGGAGGTGGCCCGCCCCCCGAGGCTGAGACTGCGGAGCGCGCCGGCTGGAAAACCAACTTCCGCTGCGCACTGCGCAGCACGCGTCGCTTCGTGATGCTGCGGGATAACTCGGGGGACCCGGCCGACCCGCACAAGGTGTACGCGCTCAGCCGGGAGCTGTGCTGGCGAGAAGGCCCAGGCACGGACCAGACTGAGGCAGAGGCCCCCGCAGCTGTCCCACCACCACAGGGTGGGCCCCCAGGGCCATTCCTGGCACACACACATGCTGGACTCCAAGCCCCAGGCCCCCTCCCTGCCCCAGCTGGTGACAAGGGGGACCTCCTGCTCCAGGCAGTGCAACAGAGCTGCCTGGCAGACCATCTGCTGACAGCGTCATGGGGGGCAGATCCAGTCCCAACCAAGGCTCCTGGAGAGGGACAAGAAGGGCTTCCCCTGACTGGGGCCTGTGCTGGAGGCCCAGGGCTCCCTGCTGGGGAGCTGTACGGGTGGGCAGTAGAGACGACCCCCAGCCCCGGGCCCCAGCCCGCGGCACTAACGACAGGCGAGGCCGCGGCCCCAGAGTCCCCGCACCAGGCAGAGCCGTACCTGTCACCCTCCCCAAGCGCCTGCACCGCGGTGCAAGAGCCCAGCCCAGGGGCGCTGGACGTGACCATCATGTACAAGGGCCGCACGGTGCTGCAGAAGGTGGTGGGACACCCGAGCTGCACGTTCCTATACGGCCCCCCAGACCCAGCTGTCCGGGCCACAGACCCCCAGCAGGTAGCATTCCCCAGCCCTGCCGAGCTCCCGGACCAGAAGCAGCTGCGCTACACGGAGGAACTGCTGCGGCACGTGGCCCCTGGGTTGCACCTGGAGCTTCGGGGGCCACAGCTGTGGGCCCGGCGCATGGGCAAGTGCAAGGTGTACTGGGAGGTGGGCGGACCCCCAGGCTCCGCCAGCCCCTCCACCCCAGCCTGCCTGCTGCCTCGGAACTGTGACACCCCCATCTTCGACTTCAGAGTCTTCTTCCAAGAGCTGGTGGAATTCCGGGCACGGCAGCGCCGTGGCTCCCCACGCTATACCATCTACCTGGGCTTCGGGCAGGACCTGTCAGCTGGGAGGCCCAAGGAGAAGAGCCTGGTCCTGGTGAAGCTGGAACCCTGGCTGTGCCGAGTGCACCTAGAGGGCACGCAGCGTGAGGGTGTGTCTTCCCTGGATAGCAGCAGCCTCAGCCTCTGCCTGTCCAGCGCCAACAGCCTCTATGACGACATCGAGTGCTTCCTTATGGAGCTGGAGCAGCCCGCC-3’。

IRF7过表达质粒和对照 (IRF7&pcDNA)构建由辽宁百昊生物合成。使用JetPRIME试剂转染，在每孔2 mL培养基中用1.8μg质粒转染HSFs。6小时候换液，累积培养48h后收获细胞。

荧光实时定量PCR（Real-time PCR）方法检测检测IRF7过表达对标志物I型胶原蛋白（collagenI，Col1）、III型胶原蛋白（collagenIII，Col3）和纤连蛋白（fibronectin，Fn）表达的影响。

提取试验组和对照组皮肤成纤维细胞中总RNA，比较IRF7表达对人成纤维细胞在细胞纤维瘤形成过程中的影响，实验组为人皮肤成纤维细胞（HSFs）转染 IRF7 过表达质粒，对照组为人皮肤成纤维细胞（HSFs）转染空白对照。

试验过程同实施例1。

结果见图3：过表达IRF7后，I型胶原蛋白（collagenI，Col1）、III型胶原蛋白（collagenIII，Col3）和纤连蛋白（fibronectin，Fn）的转录水平明显高于对照组， IRF7的过表达可增加皮肤纤维瘤形成。

3、Western blot检测IRF7过表达对标志物I型胶原蛋白（collagenI，Col1）、III型胶原蛋白（collagenIII，Col3）和纤连蛋白（fibronectin，Fn）表达的影响。

蛋白提取和定量：将实验组和对照组样本置于冰上，实验组为人皮肤成纤维细胞（HSFs）转染 IRF7 过表达质粒，对照组为人皮肤成纤维细胞（HSFs）转染空白对照。

试验过程同实施例1。

结果见图4：与对照组相比，过表达干扰的皮肤成纤维细胞中，与皮肤纤维瘤和组织纤维化呈正相关的各种细胞外基质包括I型胶原蛋白（collagenI，Col1）、III型胶原蛋白（collagenIII，Col3）和纤连蛋白（fibronectin，Fn）的表达均增加，表明成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的活力增加。体外实验表明IRF7过表达可增加皮肤纤维瘤形成。

实施例3。

1、IRF7低表达皮肤成纤维细胞模型的建立。

通过shRNA干扰技术敲低质粒和对照，shRNA干扰靶序列：SEQ ID NO.2：IRF7shRNA(Human)： GCTGGACGTGACCATCATGTA。shRNA干扰实验中使用的siRNA购自辽宁百昊生物合成，具体步骤如下。

使用JetPRIME试剂转染，在每孔2 mL培养基中用1.8μg质粒转染HSFs。6小时候换液，累积培养48h后收获细胞。

荧光实时定量PCR（Real-time PCR）方法检测检测IRF7低表达对标志物I型胶原蛋白（collagenI，Col1）、III型胶原蛋白（collagenIII，Col3）和纤连蛋白（fibronectin，Fn）表达的影响。

提取试验组和对照组皮肤成纤维细胞中总RNA，比较IRF7表达对人成纤维细胞在细胞纤维瘤形成过程中的影响，实验组为人皮肤成纤维细胞（HSFs）转染 IRF7 敲低质粒，对照组为人皮肤成纤维细胞（HSFs）转染空白对照。

试验过程同实施例1。

结果见图5：敲低IRF7后，I型胶原蛋白（collagenI，Col1）、III型胶原蛋白（collagenIII，Col3）和纤连蛋白（fibronectin，Fn）的转录水平明显低于对照组，抑制IRF7的表达可减少皮肤纤维瘤形成。

3、Western blot检测IRF7低表达对标志物I型胶原蛋白（collagenI，Col1）、III型胶原蛋白（collagenIII，Col3）和纤连蛋白（fibronectin，Fn）表达的影响。

蛋白提取和定量：将实验组和对照组样本置于冰上，实验组为人皮肤成纤维细胞（HSFs）转染 IRF7 敲低质粒，对照组为人皮肤成纤维细胞（HSFs）转染空白对照。

试验过程同实施例1。

结果见图6：与对照组相比，shRNA干扰的皮肤成纤维细胞中，与皮肤纤维瘤和组织纤维化呈正相关的各种细胞外基质包括I型胶原蛋白（collagenI，Col1）、III型胶原蛋白（collagenIII，Col3）和纤连蛋白（fibronectin，Fn）的表达均下降，表明成纤维细胞向肌成纤维细胞分化的活力下降。体外实验表明抑制IRF7的表达可抑制皮肤纤维瘤形成。

Claims (9)

1.IRF7的表达水平的检测试剂制备辅助诊断皮肤纤维瘤产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的IRF7的表达水平的检测试剂制备辅助诊断皮肤纤维瘤产品中的应用，其特征在于，所述的皮肤纤维瘤产品以IRF7基因或IRF7蛋白作为诊断标记物。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的IRF7表达水平在皮肤纤维瘤中表达上调。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品为芯片、制剂或试剂盒。

5.IRF7抑制剂在制备用于治疗皮肤纤维瘤药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述IRF7抑制剂抑制人成纤维细胞分化，所述IRF7抑制剂通过抑制IRF7基因表达达到抑制皮肤纤维瘤的发生和发展。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述IRF7抑制剂的包括shRNA干扰靶序列，所述shRNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物为任何药物治疗学上可接受的剂型。

9.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述药物为任何药物治疗学上可接受的剂量。

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