CN116004761A

CN116004761A - 一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒及其制备方法

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Publication number: CN116004761A
Application number: CN202211333848.7A
Authority: CN
Inventors: 王伊琳; 王贤理; 池万余; 苗准
Original assignee: Zhejiang Erkn Biological Technology Co ltd
Current assignee: Zhejiang Erkn Biological Technology Co ltd
Priority date: 2022-10-28
Filing date: 2022-10-28
Publication date: 2023-04-25
Anticipated expiration: 2042-10-28
Also published as: CN116004761B

Abstract

本发明公开了一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒及其制备方法。该检测试剂盒包括第一滤膜、第二滤膜、第一试剂和第二试剂。第一滤膜包括负载高铁***的离子交换纤维膜，第二滤膜包括负载核苷酸的离子交换纤维膜，第一试剂包括长链二元酸盐，第二试剂包括丙三醇。本发明通过添加特定的稳定剂组合物提高检测试剂的保存稳定性，通过特制的膜组合去除血红蛋白、样本中NADPH和NADH等物质，以消除测定干扰，通过加入长链二元酸、长链二元酸盐减轻谷胱甘肽还原酶多聚体的影响，提高检测试剂盒的测定结果的准确性。

Description

一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒及其制备方法

技术领域

本发明涉及临床医学参数检测技术领域，具体涉及一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒及其制备方法。

背景技术

谷胱甘肽还原酶(GR)是人体氧化还原体系中较为重要的酶之一，是维持细胞中还原型谷胱甘肽(GSH)浓度的主要生物酶，在谷胱甘肽还原酶催化下，氧化型谷胱甘肽与还原型辅酶II(NADPH)反应，生成还原型谷胱甘肽，在防止血红蛋白的氧化分解、维持巯基蛋白的活性、保证巯基蛋白的还原性及细胞的完整性等方面具有重要的作用。

因此，血清中谷胱甘肽还原酶的活性具有重要临床价值。如在以下几个方面具有明显的指示作用：(1)判断早期肝脏损伤的指标，其中早期损伤可分为生理性损伤如运动导致和病理性损伤，如急性肝炎、药物性肝损、中毒性肝炎、肝癌、肝硬化早期等；(2)血清谷胱甘肽还原酶活性明显升高时可用于指示原发性肝细胞癌和广泛转移性肝肿瘤；(3)在肝脏疾病治疗过程中，GR与丙氨酸氨基转移酶和天门冬氨酸氨基转移酶联合使用可以对肝脏受损状态进行动态监测；(4)恶性黄疸的鉴别诊断指标之一。

目前，测定谷胱甘肽还原酶活性的方法主要有Elisa法和紫外酶法。Elisa法需要手工操作，耗时较长，步骤繁琐，成本较高；紫外酶法步骤简单，成本较低，被广泛推广应用。紫外酶法的检测原理在于：谷胱甘肽还原酶(GR)催化氧化型谷胱甘肽(GSSG)还原成还原型谷胱甘肽(GSH)，同时还原型辅酶(NADPH)被氧化成为辅酶(NADP+)。NADPH在波长340nm有特异吸收峰，其氧化的速率与血清中GR的活性成正比，在340nm处测定NADPH吸光度下降的速率，即可计算出谷胱甘肽还原酶的活性。

但现有的紫外酶法测定谷胱甘肽还原酶活性存在试剂稳定性差，抗血红蛋白等物质的干扰能力差，无法消除谷胱甘肽还原酶多聚体影响的问题，因此需要开发一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒。

发明内容

有鉴于此，本发明提供一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒及其制备方法，通过添加特定的稳定剂组合物提高检测试剂的保存稳定性，通过特制的膜组合去除血红蛋白、样本中NADPH和NADH等物质，以消除测定干扰，通过加入长链二元酸、长链二元酸盐减轻谷胱甘肽还原酶多聚体的影响。

为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：

第一方面，本发明提供一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，所述检测试剂盒包括第一滤膜、第二滤膜、第一试剂和第二试剂；

所述第一滤膜包括负载高铁***的离子交换纤维膜；

所述第二滤膜包括负载核苷酸的离子交换纤维膜，所述核苷酸包括胸腺嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸中的一种或者两种；

所述第一试剂包括第一缓冲液、EDTA、氧化型谷胱甘肽、抗坏血酸氧化酶、胆红素氧化酶、第一表面活性剂、第一抑菌剂、第一稳定剂、长链二元酸盐；

所述第二试剂包括第二缓冲液、NADPH、第二抑菌剂、第二表面活性剂、第二稳定剂、负载半胱氨酸的固体吸附剂、丙三醇。

优选地，所述第一滤膜由负载钾离子的阳离子交换纤维和负载铁氰根配离子的阴离子交换纤维组成。

优选地，所述第二滤膜由负载核苷酸的阴离子交换纤维组成。

优选地，所述第一稳定剂包括烷基糖苷、低聚海藻糖、乙酸镁中的一种或者两种。

优选地，所述长链二元酸盐包括八碳二元酸、九碳二元酸、十碳二元酸、十一碳二元酸的钠盐、钾盐中的至少一种。

优选地，所述负载半胱氨酸的固体吸附剂包括吸附半胱氨酸的中等极性吸附树脂。

第二方面，本发明提供一种如上所述谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：

制备第一滤膜：将阳离子交换纤维和阴离子交换纤维按照一定的质量比混合、梳理，使阳离子交换纤维与阴离子交换纤维混合均匀，压成第一片状膜，然后使用超声焊接装置，将第一片状膜进一步压缩，并在超声振动的作用下使相邻纤维粘接，得到第一稳定滤膜，再使用高铁***溶液浸泡第一稳定滤膜一定时间，最后使用水洗涤，干燥，得到第一滤膜；

制备第二滤膜：将阴离子交换纤维梳理，压成第二片状膜，然后使用超声焊接装置，将第二片状膜进一步压缩，并在超声振动的作用下使相邻纤维粘接，得到第二稳定滤膜，再使用核苷酸的溶液浸泡第二稳定滤膜一定时间，最后使用水洗涤，干燥，得到第二滤膜；

配制第一试剂：根据需要配制第一试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料，第一缓冲液100mmol/L－220mmol/L、EDTA5mmol/L－10mmol/L、氧化型谷胱甘肽10mmol/L－20mmol/L、抗坏血酸氧化酶2kU/L－8kU/L、胆红素氧化酶1kU/L－5kU/L、第一表面活性剂20mmol/L－36mmol/L，第一抑菌剂40mg/L－60mg/L，第一稳定剂20mmol/L－40mmol/L，长链二元酸盐15mg/L－60mg/L，溶解于相应体积的去离子水中，并用2mol/L～5mol/L的盐酸将pH值调节到7.0～7.3，得到第一试剂；

配制第二试剂：根据需要配制第二试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料，第二缓冲液80mmol/L－130mmol/L，NADPH1mmol/L－3mmol/L，第二抑菌剂50－80mg/L，第二表面活性剂27mmol/L－30mmol/L，第二稳定剂30mmol/L－38mmol/L，负载半胱氨酸的固体吸附剂0.6g/L－1.5g/L，丙三醇2g/L－5g/L，溶解于相应体积的去离子水中，并用氢氧化钠将pH调节到9.3－9.8，得到第二试剂。

优选地，所述超声焊接装置的工作频率为40kHz－100kHz。

优选地，所述第一试剂和第二试剂配制时的搅拌速度为200转/分钟～340转/分钟。

相对于现有技术，本发明具有以下有益技术效果：①通过添加丙三醇，酶稳定剂(多糖类、烷基糖苷类等)，吸附还原物质的固体吸附剂等物质，提高检测试剂的储存稳定性；②在检测试剂盒中增加离子交换纤维膜，消除血红蛋白、NADPH、NADH等的影响，提高检测准确性；③针对谷胱甘肽还原酶多聚体的影响：增加长链二元酸，和/或，长链二元酸盐(八碳、九碳、十碳、十一碳)，促进二聚体解聚。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细描述。

需说明的是，在不冲突的情况下，以下实施例及实施例中的特征可以相互组合；并且，基于本公开中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本公开保护的范围。

需要说明的是，下文描述在所附权利要求书的范围内的实施例的各种方面。应显而易见，本文中所描述的方面可体现于广泛多种形式中，且本文中所描述的任何特定结构及/或功能仅为说明性的。基于本公开，所属领域的技术人员应了解，本文中所描述的一个方面可与任何其它方面独立地实施，且可以各种方式组合这些方面中的两者或两者以上。举例来说，可使用本文中所阐述的任何数目各方面来实施设备及/或实践方法。

需要说明的是，本申请文件中所编序号本身，例如“第一”、“第二”、“第三”等，仅区分所描述的对象，不具有任何顺序或技术含义。

本发明所提供的一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒及其制备方法，通过添加特定的稳定剂组合物提高检测试剂的保存稳定性，通过特制的膜组合去除血红蛋白、样本中NADPH和NADH等物质，以消除测定干扰，通过加入长链二元酸、长链二元酸盐减轻谷胱甘肽还原酶多聚体的影响。

本发明提供一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，该检测试剂盒包括第一滤膜、第二滤膜、第一试剂和第二试剂；

第一滤膜包括负载高铁***的离子交换纤维膜；

第二滤膜包括负载核苷酸的离子交换纤维膜，核苷酸包括胸腺嘧啶核苷酸、尿嘧啶核苷酸中的一种或者两种；

第一试剂包括第一缓冲液、EDTA、氧化型谷胱甘肽、抗坏血酸氧化酶、胆红素氧化酶、第一表面活性剂、第一抑菌剂、第一稳定剂、长链二元酸盐；

第二试剂包括第二缓冲液、NADPH、第二抑菌剂、第二表面活性剂、第二稳定剂、负载半胱氨酸的固体吸附剂、丙三醇。

优选地，第一滤膜由负载钾离子的阳离子交换纤维和负载铁氰根配离子的阴离子交换纤维组成。

进一步优选地，负载钾离子的阳离子交换纤维包括强酸性阳离子交换纤维，其基体材质包括聚烯烃、聚丙烯腈、聚乙烯醇，功能基团为磺酸基；负载铁氰根配离子的阴离子交换纤维包括强碱性阴离子交换纤维，其基体材质包括聚氯乙烯、聚乙烯醇，功能基团为季胺基。

优选地，第二滤膜由负载核苷酸的阴离子交换纤维组成。

进一步优选地，负载核苷酸的阴离子交换纤维包括弱碱性阴离子交换纤维，其基体材质为聚烯烃，功能基团包括伯胺、仲胺、叔胺中至少一种。

进一步优选地，离子交换纤维的直径为0.01－0.2mm。

进一步优选地，离子交换纤维的交换容量为0.2－0.9mmol/g。

优选地，第一稳定剂包括烷基糖苷、低聚海藻糖、乙酸镁中的一种或者两种。

进一步优选地，烷基糖苷包括烷基葡糖苷，由脂肪醇与葡萄糖在催化剂的作用下生成。

进一步优选地，低聚海藻糖包括4－9个海藻糖单体聚合而成的低聚糖。

优选地，长链二元酸盐包括八碳二元酸、九碳二元酸、十碳二元酸、十一碳二元酸的钠盐、钾盐中的至少一种。

优选地，负载半胱氨酸的固体吸附剂包括吸附半胱氨酸的中等极性吸附树脂。

进一步优选地，中等极性吸附树脂包括含有酯基的大孔吸附树脂，具体包括NKA、NKA－2。

进一步优选地，第一缓冲液包括磷酸缓冲液。

进一步优选地，第一表面活性剂非离子型表面活性剂，具体包括月桂酰二乙醇胺。

进一步优选地，第一抑菌剂包括叠氮钠

进一步优选地，第二缓冲液包括甘氨酸缓冲液。

进一步优选地，第二抑菌剂包括庆大霉素

进一步优选地，第二表面活性剂包括吐温60、吐温80。

进一步优选地，第二稳定剂包括山梨酸钾、EDTA。

需要说明的是，添加丙三醇，酶稳定剂(多糖类、烷基糖苷类)，添加吸附还原物质的固体吸附剂(半胱氨酸)的作用是提高NADPH，NADP+、谷胱甘肽还原酶等物质的稳定性，增加检测试剂的稳定性。

需要说明的是，第一滤膜的作用原理是利用第一滤膜上的钾离子和亚铁氰酸根去除血红蛋白中的二价铁(和/或，将铁去除)，以消除血红蛋白的干扰。

需要说明的是，第二滤膜的作用原理是利用吸附在第二滤膜上的核苷酸T、U，特异性地吸附待测样品中原有的NADPH、NADH，消除其对测定结果的影响。

需要说明的是，添加长链二元酸，和/或，长链二元酸盐的作用是促进谷胱甘肽还原酶多聚体的解聚，提高检测结果的准确性。

本发明还提供一种如上所述谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的制备方法，该制备方法包括以下步骤：

制备第二滤膜：将阴离子交换纤维梳理，压成第二片状膜，然后使用超声焊接装置，将第二片状膜进一步压缩，并在超声振动的作用下使相邻纤维粘接，得到第二稳定滤膜，再使用核苷酸溶液浸泡第二稳定滤膜一定时间，最后使用水洗涤，干燥，得到第二滤膜；

优选地，超声焊接装置的工作频率为40kHz－100kHz。

优选地，第一试剂和第二试剂配制时的搅拌速度为200转/分钟－340转/分钟。

进一步优选地，高铁***溶液的浓度为0.1－1.0mol/L之间的任意数值。

进一步优选地，核苷酸溶液的浓度为0.5－0.9mol/L之间的任意数值，各种核苷酸的比例范围为T：U＝1：2－2：1。

进一步优选地，第一滤膜和第二滤膜的面密度为0.1－0.3g/cm²。

进一步优选地，超声振动的功率为6－30瓦，超声振动时间为3－18s。

在一个具体实施方式中，脂蛋白相关磷脂酶A2的检测试剂的应用过程如下：

(1)取新鲜血液，制成样本液；

(2)使用第一滤膜过滤样本液，得到第一滤液；

(3)使用第二滤膜过滤第一滤液，得到第二滤液；

(4)向第二滤液中加入第一试剂混合均匀，得混合液；

(5)将混合液置于生化分析仪内，调节温度为32－39℃，孵育200－400秒；

(6)加入第二试剂，调节温度为35－40℃，孵育45－80秒；

(7)用全自动生化分析仪测定反应后的吸光度差值(主波长340nm，副波长405nm)，测定方法为两点终点法，定标曲线的方式为两点定标；

(8)根据吸光度变化值计算出样本中谷胱甘肽还原酶的浓度。

为了进一步了解本发明，下面结合实施例对本发明的技术方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限定。

实施例1-6

按照如下步骤和条件制备本发明的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒。

制备第一滤膜：将阳离子交换纤维和阴离子交换纤维按照一定的质量比混合、梳理，使阳离子交换纤维与阴离子交换纤维混合均匀，压成第一片状膜，然后使用超声焊接装置，将第一片状膜进一步压缩，并在超声振动的作用下使相邻纤维粘接，得到第一稳定滤膜，再使用高铁***溶液浸泡第一稳定滤膜一定时间，最后使用水洗涤，干燥，得到第一滤膜，离子交换纤维直径、交换容量、两种离子交换纤维的质量比、超声振动的频率、功率、时间、高铁***溶液的浓度、浸泡时间、第一滤膜的面密度等参数如表1所示。

优选地，超声焊接装置的工作频率为40kHz－100kHz。

表1制备本发明的第一滤膜的各参数

制备第二滤膜：将阴离子交换纤维梳理，压成第二片状膜，然后使用超声焊接装置，将第二片状膜进一步压缩，并在超声振动的作用下使相邻纤维粘接，得到第二稳定滤膜，再使用核苷酸溶液浸泡第二稳定滤膜一定时间，最后使用水洗涤，干燥，得到第二滤膜，超声振动的频率、功率、时间、核苷酸溶液的浓度、核苷酸种类的组成、浸泡时间、第二滤膜的面密度等参数如表2所示。

表2制备本发明的第二滤膜的各参数

配制第一试剂：根据需要配制第一试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料，第一缓冲液100mmol/L－220mmol/L、EDTA5mmol/L－10mmol/L、氧化型谷胱甘肽10mmol/L－20mmol/L、抗坏血酸氧化酶2kU/L－8kU/L、胆红素氧化酶1kU/L－5kU/L、第一表面活性剂20mmol/L－36mmol/L，第一抑菌剂40mg/L－60mg/L，第一稳定剂20mmol/L－40mmol/L，长链二元酸盐15mg/L－60mg/L，溶解于相应体积的去离子水中，并用2mol/L～5mol/L的盐酸将pH值调节到7.0～7.3，在一定速度下搅拌，得到第一试剂，各实施例所采用的参数如表3所示。

表3制备本发明的第一试剂物质组成及参数设置

配制第二试剂：根据需要配制第二试剂的体积，按照如下配比计算并称取配料，第二缓冲液80mmol/L－130mmol/L，NADPH1mmol/L－3mmol/L，第二抑菌剂50－80mg/L，第二表面活性剂27mmol/L－30mmol/L，第二稳定剂30mmol/L－38mmol/L，负载半胱氨酸的固体吸附剂0.6g/L－1.5g/L，丙三醇2g/L－5g/L，溶解于相应体积的去离子水中，并用氢氧化钠将pH调节到9.3－9.8，在一定速度下搅拌，得到第二试剂，各实施例所采用的参数如表4所示。

表4制备本发明的第二试剂的各组分配比及参数

采用如下检测方法，对实施例1～6得到的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒进行测试：

(1)取新鲜血液，制成样本液；

(2)使用第一滤膜过滤样本液，得到第一滤液；

(3)使用第二滤膜过滤第一滤液，得到第二滤液；

(4)向第二滤液中加入第一试剂混合均匀，得混合液；

(5)将混合液置于生化分析仪内，调节温度为37℃，孵育300秒；

(6)加入第二试剂，调节温度为37℃，孵育60秒；

(8)根据吸光度变化值计算出样本中谷胱甘肽还原酶的浓度。

使用每个实施例对应的检测试剂盒对用一批待测样品进行多次检测，计算得到的检测限、精密度、准确性结果如表5所示。测定结果的检测限、精密度、稳定性计算方法采用现有技术的方法进行，稳定性是指在检测试剂开封后的前2天，每隔3小时检测同一待测样品的测定结果偏离平均值的程度。

表5本发明的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒测试结果

本发明的脂谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的储存稳定测试采用如下方法进行：将同一批次制备的检测试剂避光储存在2～4℃冰箱中，分别在第0、2、4、6、8、10、12、14个月取出一份并开封测定其空白吸光度，空白吸光度的测定步骤与测定待测样品的步骤相同，使用去离子水代替相同体积的样品，可以看出本发明的检测试剂在合适条件下的储存期超过14个月。

Claims

1.一种谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒包括第一滤膜、第二滤膜、第一试剂和第二试剂；

所述第一滤膜包括负载高铁***的离子交换纤维膜；

2.根据权利要求1所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，其特征在于，所述第一滤膜由负载钾离子的阳离子交换纤维和负载铁氰根配离子的阴离子交换纤维组成。

3.根据权利要求1所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，其特征在于，所述第二滤膜由负载核苷酸的阴离子交换纤维组成。

4.根据权利要求1所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，其特征在于，所述第一稳定剂包括烷基糖苷、低聚海藻糖、乙酸镁中的一种或者两种。

5.根据权利要求1所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，其特征在于，所述长链二元酸盐包括八碳二元酸、九碳二元酸、十碳二元酸、十一碳二元酸的钠盐、钾盐中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒，其特征在于，所述负载半胱氨酸的固体吸附剂包括吸附半胱氨酸的中等极性吸附树脂。

7.一种如权利要求1-6任一项所述谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：

8.根据权利要求7所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述超声焊接装置的工作频率为40kHz－100kHz。

9.根据权利要求7所述的谷胱甘肽还原酶检测试剂盒的制备方法，其特征在于，所述第一试剂和第二试剂配制时的搅拌速度为200转/分钟～340转/分钟。