CN116004706A - 提高植物基因编辑中转基因成分分离效率的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种提高植物基因编辑中转基因成分分离效率的方法，属于植物分子育种技术领域。本发明所述的方法是通过构建具有抗潮霉素基因和显色标记基因的基因编辑载体，将该基因编辑载体转化植物组织，利用显色标记基因连锁潮霉素筛选基因，使含有转基因元件的植株和种子显色或呈现荧光反应，可以直接观察，进而提高转基因成分在编辑植株中的分离效率。

Description

提高植物基因编辑中转基因成分分离效率的方法

技术领域

本发明属于植物分子育种技术领域，具体涉及一种提高植物基因编辑中转基因成分分离效率的方法。

背景技术

水稻的农业性状改良离不开水稻的遗传多样性。传统农业在作物驯化和培育过程中，农人按照生产实践中长期积累的经验，选择具有符合生产生活需要的农艺特性的植株进行留种和杂交选育。在选育过程中，遗传学上的应用带来的基因层面的改变是基于育种目标对应的遗传位点的人为选择所带来的。然而，也由于农业生产对某一些性状的偏好，使得驯化的作物较它们的野生祖先在遗传多样性上是有损失的。因而，育种家也利用突变手段为驯化作物引入新的遗传变异。

在自然条件下，虽然作物也有基因突变的产生，然而这个过程太过漫长。为了使驯化的作物获得更丰富的遗传多样性，化学诱变、物理诱变等手段被应用于诱变育种。这类诱变方法产生很多突变体，育种家通过设置目标筛选条件，来选择有益性状，进而杂交培育新的品种。诱变育种的方法是行之有效的，然而它也有很多的不足之处。诱变育种产生的序列突变是随机的，产生的表型是无法控制的，并且有效突变位点的鉴定很耗时，在其后汇聚优质性状的过程更是往往需要几年甚至几十年的时间。这就使育种家渴望能够拥有更加精准和快速的方法来实现对作物基因组的改变和调控。基因编辑工具的发展，开启了作物的精准编辑改造之路。

在过去的三十年左右，使用可编程的序列特异性核酸酶SSNs作为基因编辑工具也经历了一系列的发展演化。从第一代的锌指核酸酶ZFNs，第二代的转录激活因子样效应物核酸酶TALENs，以及真正将基因编辑技术推向广泛应用的CRISPR/Cas9体系。这些基因编辑体系在水稻中的应用，最有效和便捷的方式，是利用农杆菌介导的水稻遗传转化，将基因编辑载体导入水稻的基因组中，在初代(即T0代)的发育初期开始，基因编辑载体作为转基因成份在水稻中活体表达，并产生靶向编辑的效果。从T1代开始，可以稳定遗传的靶向突变得以保留，同时转基因成份的基因编辑工具载体部分按照孟德尔法则开始分离。T1-T2代开始，可以获得纯合体的突变株，产生的最终产品，将不携带任何转基因成份。目前这个分离过程，往往依赖包括PCR、测序及DNA印迹法等分子手段，价格比较高，耗时相对较长。因此，使用更加便捷直观的方式，快速有效的分离转基因成份，对于实验室的工作，以及未来生产符合国家农业部要求的水稻产品，有着重大的意义。

发明内容

针对现有技术中存在的问题，本发明的目的在于提供一种提高植物基因编辑中转基因成分分离效率的方法。

为了达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种提高转基因成分在植物中分离效率的基因编辑载体，所述基因编辑载体是将抗潮霉素基因和显色标记基因构建到植物基因编辑的载体中获得，其中所述的植物基因编辑的载体为CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas13a、TALEN、ZNF中的任意一种，在一个具体的实施例中，所述的植物基因编辑的载体为CRISPR/Cas9。

在一个具体的实施例中，所述抗潮霉素基因携带有起始密码子但不具有终止密码子，通过P2A信号蛋白连接不具有起始密码子但具有终止密码子的显色标记基因；所述的抗潮霉素基因与显色标记基因也可以不通过P2A信号蛋白连接，两者各自使用各自的启动子和终止子来进行表达。

所述提高转基因成分在植物中分离效率的基因编辑载体中，所述的显色标记基因可为红荧光、绿荧光、黄荧光、番茄红素中的至少一种，也可以是其它带有颜色的基因标记，在一个具体的实施例中，采用的是红荧光蛋白。

在一个具体的实施例中，当采用的显色标记基因为红荧光蛋白时，所述通过P2A信号蛋白连接表达的抗潮霉素基因和红荧光蛋白基因的核酸序列如SEQ ID NO：1所示。

一种提高转基因成分在水稻中分离效率的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法，步骤如下：

以CRISPR/Cas9质粒为模板，采用引物Hyg-RsrII-F和Hyg-P2A-R扩增，获得第一个PCR片段；

以红荧光编码序列片段为模板，采用引物P2A-DsRed-F和DsRed-AtoG-R扩增，获得第二个PCR片段；

以红荧光编码序列片段为模板，采用引物DsRed-AtoG-F和DsRed-polyA-R扩增，获得第三个PCR片段；

以获得的第一个PCR片段、第二个PCR片段和第三个PCR片段为模板，采用引物Hyg-RsrII-F和BsaI-dsred-R1进行重叠延伸PCR，获得融合片段，标记为PCR-1_2_3；

以CRISPR/Cas9质粒为模板，采用引物BsaI-polyA-F1和Backbone-RsrII-R扩增，获得第四个PCR片段；

将CRISPR/Cas9质粒用RsrII进行酶切，PCR-1_2_3和第四个PCR片段进行RsrII和BsaI双酶切；回收酶切片段，并使用T4 DNA连接酶对回收的片段进行连接，即得所述提高转基因成分在水稻中分离效率的CRISPR/Cas9基因编辑载体；

所述引物Hyg-RsrII-F和Hyg-P2A-R的核酸序列如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示；

所述引物P2A-DsRed-F和DsRed-AtoG-R的核酸序列如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10所示；

所述引物DsRed-AtoG-F和DsRed-polyA-R的核酸序列如SEQ ID NO：11、SEQ IDNO：12所示；

所述引物BsaI-dsred-R1的核酸序列如SEQ ID NO：13所示；

所述引物BsaI-polyA-F1和Backbone-RsrII-R的核酸序列如SEQ ID NO：14、SEQID NO：15所示。

上述CRISPR/Cas9基因编辑载体在提高水稻基因编辑中转基因成分分离效率中的应用。

一种提高水稻基因编辑中转基因成分分离效率的方法，将上述方法构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体转化水稻，T0代采用潮霉素筛选并采用Cas9特异性引物筛选，PCR扩增阳性植株即为具有T-DNA的转化株，提取具有T-DNA的转化株的DNA，通过桑格测序法对靶位点区间进行测序，将测序结果在靶点附近呈现清晰双峰信号的样品所对应的植株，进行保留、生长至结实出T1代种子；

筛选出T1代种子中不具有红荧光的种子进行种植，出苗后，采用Cas9特异性引物进行PCR测定，Cas9特异性引物扩增阴性的样品对应的植株为T-DNA阴性植株；对T1代苗T-DNA为阴性的植株，进行桑格测序，选择其中编辑位点为纯合型的植株进行留种。

在一个具体的实施例中，所述Cas9特异性引物的核酸序列如SEQ ID NO：23、SEQID NO：24所示，应当理解的是，此处的引物仅仅是为了检测基因编辑后的植株是否存在转基因载体上的Cas9序列，因而，只要是能够达到相同的目的，所采用的引物序列也可以是扩增基因编辑载体上的其它序列的特异性引物。

上述提高水稻基因编辑中转基因成分分离效率的方法，所述CRISPR/Cas9基因编辑载体和靶点sgRNA转化水稻时，将携带靶点的sgRNA表达盒***CRISPR/Cas9基因编辑载体中Cas9表达盒的下游，然后转化水稻，或将CRISPR/Cas9基因编辑载体与携带靶点的sgRNA载体共转化。

本发明技术方案的优点

本发明构建的基因编辑载体能够提高基因编辑转基因成份在水稻中分离效率，利用红荧光蛋白基因连锁潮霉素筛选基因，使含有转基因元件的水稻苗呈现红色荧光反应，可以直接观察。

附图说明

图1提高转基因成分在水稻中分离效率的基因编辑载体图；

图2含有OsU3启动子以及sgRNA骨架序列的双链片段图；

图3桑格测序法对靶位点区间进行测序结果；

图4含转基因成分和不含转基因成分的水稻种子在激发光源下的发光情况对比；

图5 T1代种子在激发光源下的发光情况。

具体实施方式

在本发明中所使用的术语，除非有另外说明，一般具有本领域普通技术人员通常理解的含义。

下面结合具体实施例，并参照数据进一步详细的描述本发明。以下实施例只是为了举例说明本发明，而非以任何方式限制本发明的范围。

一种提高转基因成分在水稻中分离效率的基因编辑载体，是将抗潮霉素基因和红荧光蛋白基因构建到CRISPR/Cas9载体中获得，所述抗潮霉素基因携带有起始密码子但不具有终止密码子，通过P2A信号蛋白连接不具有起始密码子但具有终止密码子的红荧光蛋白。

用于植物基因编辑的载体，除了供细菌生长繁殖的载体骨架之外，通常还包括：抗生素抗性筛选元件和基因编辑元件两大部分(例如CRISPR/Cas9，CRISPR/Cas12a，CRISPR/Cas13a，TALEN，ZNF等)。

其中，所述通过P2A信号蛋白连接表达的抗潮霉素基因和红荧光蛋白基因的核酸序列(5’-3’)如下：

以下实施例以CRISPR/Cas9体系为例进行说明，该方法同样适用于其它基因编辑体系，其中采用的CRISPR/Cas9载体是按照现有文献合成而得，所述现有文献为Ma X,ZhangQ,Zhu Q,et al.A robust CRISPR/Cas9 system for convenient,high-efficiencymultiplex genome editing in monocot and dicot plants[J].Mol Plant,2015,8(8):1274-1284，该载体的潮霉素表达盒两侧各具有一个TypeIIS型限制性内切酶RsrII酶切位点，且整个载体只有这两个RsrII酶切位点，同时这两个酶切位点切割后的粘性末端彼此不同，均具有特异性，且该CRISPR/Cas9载体同时具有卡那霉素抗性基因。

以下实施例以来源于珊瑚(Discosoma sp.)的红荧光蛋白为例，其它荧光蛋白同样适用于该类型改造。

实施例1

一种提高转基因成分在水稻中分离效率的CRISPR/Cas9基因编辑载体由以下方法构建而成：

第一个PCR片段(标记为PCR-1)的合成：使用引物Hyg-RsrII-F和Hyg-P2A-R，以未改造的CRISPR/Cas9质粒为模板，其中Hyg-RsrII-F位于一个RsrII酶切位点的上游，Hyg-P2A-R包括了潮霉素编码序列除终止密码子之外的最末端、GSG连接序列(GGAAGCGGC)和一半的P2A信号蛋白编码序列，所扩增的PCR-1的核酸序列(5’-3’)如下所示：

第二个PCR片段(标记为PCR-2)的合成：使用引物P2A-DsRed-F和DsRed-AtoG-R，以实验室的红荧光编码序列片段为模板，其中P2A-DsRed-F包括P2A信号蛋白编码序列和红荧光蛋白编码序列除起始密码子之外的最前端序列，DsRed-AtoG-R位于红荧光蛋白编码序列包括一个位点的突变以去除红荧光蛋白原有编码序列的BsaI识别位点，所扩增的PCR-2的核酸序列(5’-3’)如下所示：

第三个PCR片段(标记为PCR-3)的合成：使用引物DsRed-AtoG-F和DsRed-polyA-R，以红荧光蛋白编码序列片段为模板，其中DsRed-AtoG-F包含与DsRed-AtoG-R对应的单碱基突变，所扩增的PCR-3的核酸序列(5’-3’)如下所示：

PCR-1、PCR-2、PCR-3融合片段(标记为PCR-1_2_3)的合成：使用引物Hyg-RsrII-F与BsaI-dsred-R1，以上述方法获得的PCR片段PCR-1、PCR-2、PCR-3作为模板进行重叠延伸PCR，获得PCR-1、PCR-2、PCR-3融合片段，标记为PCR-1_2_3，反向引物BsaI-dsred-R1的尾部添加了BsaI识别序列和保护碱基(小写字母部分)，所获得的PCR-1_2_3的核酸序列(5’-3’)如下所示：

第四个PCR片段(标记为PCR-4)的合成：使用引物BsaI-polyA-F1和Backbone-RsrII-R，以未改造的CRISPR/Cas9质粒为模板，其中BsaI-polyA-F1的尾部添加了BsaI识别序列和保护碱基(小写字母部分)，Backbone-RsrII-R位于一个RsrII酶切位点的下游，所获得的PCR-4的核酸序列(5’-3’)如下：

将未改造的CRISPR/Cas9质粒用RsrII进行酶切，在1％的agarose胶上跑胶纯化收集15685bp的片段；将片段PCR-1_2_3进行RsrII和BsaI双酶切，在1％的agarose胶上跑胶纯化收集1358bp的片段；将片段PCR-4进行RsrII和BsaI双酶切，在1％的agarose胶上跑胶纯化收集1523bp的片段。

将上述酶切后的片段PCR-1_2_3、PCR-4与酶切后的CRISPR/Cas9质粒片段使用T4DNA连接酶进行连接。

将上述连接后的质粒15ng加入在冰上解冻的原储存于-80℃的肠杆菌dH5α感受态细胞，轻轻摇匀后在冰上静置30分钟。而后在42℃水中热击60秒后，立刻置于冰上冷却5分钟。加入1mL不含抗生素的LB液体培养基，在37℃的摇床上以200rpm进行1小时的培养。而后取1μL均匀平涂于含有50mg/L卡那霉素的LB固体培养基，菌液完全被培养基吸收后，倒置培养皿，37℃培养16小时。

挑取单个菌落，使用DsRed-AtoG-F和DsRed-polyA-R进行菌落PCR。

挑取阳性(214bp)菌落接种于10mL含有50mg/L的LB液体培养基37℃培养16小时后提取质粒，送测序确认。测序正确的即为构建的提高转基因成分在水稻中分离效率的基因编辑载体，所获得的基因编辑载体如图1所示

上述步骤中所采用的的引物序列如表1所示：

表1

实施例2

本实施例中是先将sgRNA表达盒***CRISPR/Cas9基因编辑载体中Cas9表达盒的下游，然后通过农杆菌介导转化水稻，在实际操作中，也可以将CRISPR/Cas9基因编辑载体与sgRNA载体共转化。

本实施例中，sgRNA的表达使用水稻的U3启动子，在实际操作中，也可以采用其他的启动子。

另外，以下使用的是水稻成熟胚诱导产生愈伤组织进行转化，其它例如幼胚农杆菌介导法等也适用于本发明。

使用实施例1中的CRISPR/Cas9基因编辑载体提高水稻基因编辑中转基因成分分离效率的方法，步骤如下：

1、将sgRNA表达盒***CRISPR/Cas9基因编辑载体中Cas9表达盒的下游：

(1)构建含有OsU3启动子以及sgRNA骨架序列的双链片段，并在双链片段的两端设置BsaI核酸内切酶酶切位点，如图2所示。其中，正义链的核酸序列(5’-3’)如SEQ ID NO：16所示，反义链的核酸序列(5’-3’)如SEQ ID NO：17所示。

(2)设计靶点gRNA，并通过一对可以反向互补的引物的退火，形成与含有OsU3启动子以及sgRNA骨架序列的双链片段两端互补的粘性末端(两端带有BsaI核酸内切酶酶切位点序列)。将退火形成的双链小片段与519bp片段进行连接，形成环形片段作为下一步PCR的模板。其中，本实施例中所采用的反向互补的引物的核酸序列如下：

正向引物：5’-GGCAACATGGTGGTTGTCTAGCTG-3’(SEQ ID NO：18)；

反向引物：5’-AAACCAGCTAGACAACCACCATGT-3’(SEQ ID NO：19)；

在实际操作中，上述反向互补的引物对序列可以根据实际选择的靶点序列进行变化，实际采用的酶切位点也不限于BsaI核酸内切酶酶切位点。

(3)使用上述环形片段作为PCR模板，使用引物组合sgRNA-F和sgRNA-R进行PCR扩增。扩增产物标记为PCR-sgRNA。sgRNA-F和sgRNA-R两端各携带BsaI识别位点，形成的粘性末端，引物序列为：

sgRNA-F：5’-TTCAGAGGTCTCTCTCGACTAGTATGGAATCGGCAGCAAAGG-3’(SEQ ID NO：20)；

sgRNA-R：5’-AGCGTGGGTCTCGACCGACGCGTATCCATCCACTCCAAGCTC-3’(SEQ ID NO：21)。

所获得的PCR-sgRNA的核酸序列(5’-3’)如下：

使用BsaI对pSR-YLCRISPR_ZmUbi-Cas9-HRed进行酶切，并纯化17669bp片段，与BsaI酶切后的PCR-sgRNA进行连接，形成用于水稻转化的工作载体，即***sgRNA表达盒的CRISPR/Cas9基因编辑载体。

2、将上述成功构建的***sgRNA表达盒的CRISPR/Cas9基因编辑载体使用农杆菌介导法转化水稻，获得T0代。

T0代组织培养过程中经过两次50mg/L的潮霉素筛选，并采用Cas9特异性引物对T0代幼苗叶片组织DNA进行PCR测定，PCR扩增阳性植株即为具有T-DNA的转化株，提取具有T-DNA的转化株的DNA，通过桑格测序法对靶位点区间进行测序，序列结果在靶点附近呈现清晰双峰信号(图3)；将该样品所对应的植株，进行保留、生长至结实出T1代种子。

T1代种子进行通过LUYOR-3415RG荧光蛋白激发光源510-540nm激发光和600nm滤色片配套使用，筛选出不具有红荧光的种子进行种植，由于本实施例中的CRISPR/Cas9基因编辑载体含有红荧光蛋白基因，因而，可以通过荧光筛选不含转基因成分的水稻种子，其中，含转基因成分和不含转基因成分的水稻种子在激发光源和自然光下的发光情况如图4所示，左图为激发光源下的发光情况，右图为自然光下的发光情况。采用激发光源筛选T1代种子的结果如图5所示。其中，在激发光源下不发射荧光的种子即为筛选的T1代种子，将其种植，出苗至第五叶时，采用Cas9特异性引物进行PCR测定，并使用Cas9阳性苗DNA做阳性对照PCR以及无DNA的样品做阴性对照PCR。

Cas9特异性引物扩增阴性的样品对应的植株为T-DNA阴性植株，确认T-DNA为阴性的，将DNA进行靶位区间的桑格测序，优先选择纯合体的编辑株。

上述采用的Cas9特异性引物序列如下：

引物名称        引物核酸序列(5’-3’)       编号

Cas9-F：         GACATCAACAGGCTTTCTGACT    SEQ ID NO：23

Cas9-R：         CTTGGTGTTCATCCTAGAATCG    SEQ ID NO：24

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对本发明作其它形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或改型为等同变化的等效实施例。但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种提高转基因成分在植物中分离效率的基因编辑载体，其特征在于，所述基因编辑载体是将抗潮霉素基因和显色标记基因构建到植物基因编辑的载体中获得。

2.根据权利要求1所述提高转基因成分在植物中分离效率的基因编辑载体，其特征在于，所述抗潮霉素基因携带有起始密码子但不具有终止密码子，通过P2A信号蛋白连接不具有起始密码子但具有终止密码子的显色标记基因。

3.根据权利要求2所述提高转基因成分在植物中分离效率的基因编辑载体，其特征在于，所述的显色标记基因为红荧光、绿荧光、黄荧光、番茄红素中的至少一种。

4.根据权利要求3所述提高转基因成分在植物中分离效率的基因编辑载体，其特征在于，所述通过P2A信号蛋白连接表达的抗潮霉素基因和显色标记基因的核酸序列如SEQ IDNO：1所示。

5.根据权利要求1-4任一项所述提高转基因成分在植物中分离效率的基因编辑载体，其特征在于，所述植物基因编辑的载体为CRISPR/Cas9、CRISPR/Cas12a、CRISPR/Cas13a、TALEN、ZNF中的任意一种。

6.一种提高转基因成分在水稻中分离效率的CRISPR/Cas9基因编辑载体的构建方法，其特征在于，步骤如下：

以CRISPR/Cas9质粒为模板，采用引物Hyg-RsrII-F和Hyg-P2A-R扩增，获得第一个PCR片段；

以红荧光编码序列片段为模板，采用引物P2A-DsRed-F和DsRed-AtoG-R扩增，获得第二个PCR片段；

以红荧光编码序列片段为模板，采用引物DsRed-AtoG-F和DsRed-polyA-R扩增，获得第三个PCR片段；

以获得的第一个PCR片段、第二个PCR片段和第三个PCR片段为模板，采用引物Hyg-RsrII-F和BsaI-dsred-R1进行重叠延伸PCR，获得融合片段，标记为PCR-1_2_3；

以CRISPR/Cas9质粒为模板，采用引物BsaI-polyA-F1和Backbone-RsrII-R扩增，获得第四个PCR片段；

将CRISPR/Cas9质粒用RsrII进行酶切，PCR-1_2_3和第四个PCR片段进行RsrII和BsaI双酶切；回收酶切片段，并使用T4 DNA连接酶对回收的片段进行连接，即得所述提高转基因成分在水稻中分离效率的CRISPR/Cas9基因编辑载体；

所述引物Hyg-RsrII-F和Hyg-P2A-R的核酸序列如SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：8所示；

所述引物P2A-DsRed-F和DsRed-AtoG-R的核酸序列如SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：10所示；

所述引物DsRed-AtoG-F和DsRed-polyA-R的核酸序列如SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：12所示；

所述引物BsaI-dsred-R1的核酸序列如SEQ ID NO：13所示；

所述引物BsaI-polyA-F1和Backbone-RsrII-R的核酸序列如SEQ ID NO：14、SEQ IDNO：15所示。

7.权利要求6所述CRISPR/Cas9基因编辑载体在提高水稻基因编辑中转基因成分分离效率中的应用。

8.一种提高水稻基因编辑中转基因成分分离效率的方法，其特征在于，将权利要求6所述方法构建的CRISPR/Cas9基因编辑载体和靶点sgRNA转化水稻，T0代采用潮霉素筛选并采用Cas9特异性引物筛选，PCR扩增阳性植株即为具有T-DNA的转化株，提取具有T-DNA的转化株的DNA，通过桑格测序法对靶位点区间进行测序，将测序结果在靶点附近呈现清晰双峰信号的样品所对应的植株，进行保留、生长至结实出T1代种子；

筛选出T1代种子中不具有红荧光的种子进行种植，出苗后，采用Cas9特异性引物进行PCR测定，Cas9特异性引物扩增阴性的样品对应的植株为T-DNA阴性植株；对T1代苗T-DNA为阴性的植株，进行桑格测序，选择其中编辑位点为纯合型的植株进行留种。

9.根据权利要求8所述提高水稻基因编辑中转基因成分分离效率的方法，其特征在于，所述Cas9特异性引物的核酸序列如SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：24所示。

10.根据权利要求8所述提高水稻基因编辑中转基因成分分离效率的方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9基因编辑载体和靶点sgRNA转化水稻时，将携带靶点的sgRNA表达盒***CRISPR/Cas9基因编辑载体中Cas9表达盒的下游，然后转化水稻，或将CRISPR/Cas9基因编辑载体与携带靶点的sgRNA载体共转化。

Images