CN116003530B - 一种针对白细胞介素-6的d-蛋白抑制剂及其应用 - Google Patents
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- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Abstract
本发明涉及一种针对白细胞介素‑6的D‑蛋白抑制剂及其应用。所述D‑蛋白抑制剂示例性地具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，其构成氨基酸除甘氨酸以外均为D构型。本发明的D‑蛋白抑制剂不易被体内蛋白酶水解，具有更好的热稳定性，同时显示出对白细胞介素‑6较好的抑制活性，可被开发成白细胞介素‑6介导的相关疾病的治疗药物。
Description
技术领域
本发明属于生物化学领域，具体地，涉及一种针对白细胞介素-6的D-蛋白抑制剂及其应用。
背景技术
多肽、抗体等生物大分子类药物相较于小分子类药物有着更好的生物活性和靶蛋白特异性，尤其在靶蛋白有大而平的疏水面时，小分子难以成药，只能由蛋白药物抑制。而多肽，蛋白类药物由L-氨基酸构成，也有着自身的诸多局限，如易被蛋白酶水解，且易引起免疫反应等。现亟需一种抗水解且不会引起免疫反应的蛋白类药物来填补L-蛋白类药物的空白。
D-蛋白类药物是与L-蛋白药物天然手性对称的蛋白，有不易引起免疫反应，无法被体内蛋白酶降解，易于化学修饰等特点，近年来受到关注，目前国外已有几款D-蛋白药物在临床试验有的已经上市。
自从1973年第一次白细胞介素-6被发现以来，近50年的研究表明白细胞介素-6参与多种生物学事件，比如免疫调节、肿瘤生长、造血、应急反应等。而破坏白细胞介素-6与白细胞介素-6受体(IL-6receptor)和gp130形成六聚体是抑制白细胞介素-6信号通路的关键。然而这种六聚体的结合界面过于复杂和广泛，使得用小分子来抑制其形成极具挑战性。白细胞介素-6有三个位置参与了六聚体复合物的形成，分别为site I、site IIa和siteIIIa。其中site I是白细胞介素-6与白细胞介素-6受体结合的位点，其由A与C两根α-螺旋组成，site IIa是由白细胞介素-6的A与C两根α-螺旋组成的接合面，负责与gp130结合，site IIIa是白细胞介素-6的α-螺旋束顶端的平面，与gp130结合。
Siltuximab(美国强生，目前唯一被FDA批准的白细胞介素-6单抗)以及两个仍在临床试验的单克隆抗体Sirukumab和Clazakizumab都结合白细胞介素-6的site I，此类单克隆抗体可以有效的通过抑制白细胞介素-6与其受体结合进而阻断其与膜蛋白gp130的结合而抑制下游信号通路。但白细胞介素-6目前已知有三种信号传递途径，分别为经典信号途径(classical-signaling)，反式信号途径(trans-signaling)和反式呈递(trans-presentation)。由于转移呈递是其中一个细胞以白细胞介素-6受体结合着白细胞介素-6同时被呈递出来用以结合相邻细胞膜上的gp130，所以此途径不受白细胞介素-6site I结合抗体的干扰。而针对白细胞介素-6site IIIa(Olokizumab)，或者是针对白细胞介素-6受体(Tocilizumab，Sarilumab和Vobarilizumab.)，亦或者针对gp130(Olamkicept)都可以同时抑制此三条信号通路。截止2022年，尚未报道过有结合在白细胞介素-6site IIa的抗体。
由于白细胞介素-6参与众多免疫反应，因此每种针对抑制白细胞介素-6信号通路的药物都有一种或多种对应的治疗病症。例如最早开发的白细胞介素-6受体抑制药物Tocilizumab已通过临床试验的对症为：类风湿性关节炎，幼年特发性关节炎，多中心型Castleman病，巨细胞动脉炎，细胞因子释放综合征和高须动脉炎，另有成人Still综合症，Graves眼病，复发性多软骨炎以及强直性脊柱炎正处于第二至第三期临床。
其中，结合在白细胞介素-6上的单抗Siltuximab已通过FDA认证的是多中心型Castleman病，其用于治疗多发性骨髓瘤和淀粉样蛋白轻链淀粉样变性病的开发正处于临床二期试验，另有对症实体瘤，***癌，转移性肾细胞癌和转移性肾癌均在临床一至二期试验。Sirukumab，olokizumab和Clazakizumab分别处于类风湿性关节炎临床试验的第三，第三和第二期。结合在gp130上的单抗Olamkicept则对症炎症性肠病，目前处于临床二期试验。
发明内容
本发明的技术目的是提供一种针对白细胞介素-6(IL-6)的D-蛋白抑制剂。
本发明的另一技术目的是提供一种药物组合物，其包含本申请的所述D-蛋白抑制剂。
本发明的另一技术目的是提供所述D-蛋白抑制剂在药物制备中的应用。
一方面，本发明提供一种针对白细胞介素-6的D-蛋白抑制剂，其氨基酸序列选自以下情形(1)-(4)：
(1)SEQ ID No:1所示的氨基酸序列；
(2)SEQ ID No:1所示的氨基酸序列中，选自第35，36，38，39，41，42，43，45，46，47，49，50，51，53，56，59，60，63，64，65位氨基酸中的任意1-10个氨基酸被各自的同类氨基酸取代所得到的具有相同功能的氨基酸序列；
(3)SEQ ID No:1所示的氨基酸序列中，除第35，36，38，39，41，42，43，45，46，47，49，50，51，53，56，59，60，63，64，65位氨基酸以外的其他氨基酸中的任何一个或多个氨基酸被各自的同类氨基酸取代所得到的具有相同功能的氨基酸序列；以及
(4)SEQ ID No:1所示的氨基酸序列经上述情形(2)中的取代与上述情形(3)中的取代的任意组合取代所得到的具有相同功能的氨基酸序列，
其中，所述同类氨基酸是指被取代的氨基酸与取代的氨基酸按氨基酸侧链基团分类同属一类，以及
所述相同功能是指经取代得到的氨基酸序列与未经取代的氨基酸序列同样具有与白细胞介素-6结合的功能。
SEQ ID No:1所示的氨基酸序列中，所述第35，36，38，39，41，42，43，45，46，47，49，50，51，53，56，59，60，63，64，65位氨基酸位于D-蛋白抑制剂与白细胞介素-6的结合面。
在一些实施方式中，本发明的针对白细胞介素-6的D-蛋白抑制剂的氨基酸序列为SEQ ID No:1所示的氨基酸序列中第35，36，38，39，41，42，43，45，46，47，49，50，51，53，56，59，60，63，64，65位氨基酸中的1-5个，例如1，2，3，4，5个氨基酸被各自的同类氨基酸取代所得到的具有相同功能的氨基酸序列。
在具体实施方式中，所述D-蛋白抑制剂的氨基酸序列为SEQ ID No:1。
在具体实施方式中，所述D-蛋白抑制剂的二级结构如下：其由4条α-螺旋构成，第一条α-螺旋序列为SEQ ID No:2，第二条α-螺旋序列为SEQ IDNo:3，第三条α-螺旋序列为SEQ ID No:4，第四条α-螺旋序列为SEQ ID No:5。
在具体实施方式中，所述D-蛋白抑制剂的二级结构序列为LHHHHHHHHHHHHLLLHHHHHHHHHHHHHHHHHLLLHHHHHHHHHH HHHHHLLHHHHHHHHHHHL。
另一方面，本发明提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的上述D-蛋白抑制剂以及药学上可接受的载体。
另一方面，本发明提供上述D-蛋白抑制剂及上述药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途。
在具体实施方式中，所述疾病为白细胞介素-6介导的相关疾病。
在具体实施方式中，所述疾病选自类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、多中心型Castleman病、巨细胞动脉炎、细胞因子释放综合征、高须动脉炎、成人Still综合症、Graves眼病、复发性多软骨炎、强直性脊柱炎和新型冠状病毒感染。
又一方面，本发明提供上述D-蛋白抑制剂及上述药物组合物在制备白细胞介素-6体内示踪剂中的用途。
有益效果
1：本发明的D-蛋白抑制剂解决了L-蛋白易于被体内蛋白酶水解的问题。
2:本发明的D-蛋白抑制剂有着更好的热稳定性，有利于药物的运输和保存。
3.本发明的D-蛋白抑制剂显示出对白细胞介素-6较好的抑制活性，具备开发成白细胞介素-6免疫相关疾病的治疗药物的潜力。
附图说明
图1：D-25367的化学合成，A为RP-HPLC洗脱曲线，B为D-25367质谱图，显示其测量分子量为7329.67，与计算分子量7330.48。
图2：D-25367热变温CD光谱图。
图3：D-25367与白细胞介素-6在分子筛Superdex 200Increase 10/300column共迁移曲线(A)，以及SDS-PAGE胶图(B)，图中，上：D-25367单独；中：白细胞介素-6单独；下：D-25367和白细胞介素-6以1.1:1摩尔比的混合物。
图4：采用生物膜干涉实验测定D-25367与白细胞介素-6的结合常数。
图5：采用生物膜干涉实验研究分别在D-25367的结合界面设计点突变(A)以及在白细胞介素-6的结合界面设计点突变(B)对于蛋白间相互作用的影响。
图6：采用HEK-293T细胞验证D-25367对于由白细胞介素-6介导的下游信号通路表达的影响。图中每个柱状图的柱高为每三组实验的平均值，并用突出于柱高的细线显示每三组数据的方差。
图7：L-25367和D-25367的蛋白酶解实验的SDS-PAGE胶图。
具体实施方式
术语
在本申请中，术语“D-蛋白抑制剂”是指构成所述蛋白的所有氨基酸除甘氨酸以外，均为D构型。
在本申请中，在二级结构序列中，字母“L”表示无规则区域，字母“H”表示α-螺旋。
在本申请中，术语“药学上可接受的载体”是指本领域技术人员已知的任何种类的固体、半固体或惰性流体赋形剂、填充剂、封装或配方辅助材料。
在本申请中，术语“治疗有效量”是指药物组合物中所含的本发明的D-蛋白抑制剂的量足以达到预期目的。
下文中通过具体实施例来详细描述本发明以使本领域的技术人员更好地理解本发明，然而这些实施例并不用于限制本发明的范围。
制备实施例1
以下通过具体实施例来详细描述本申请的针对白细胞介素-6的D-蛋白抑制剂(下文命名为D-25367)的制备过程。
D-25367通过标准Fmoc固相肽合成(Fmoc SPPS)制备，并由Liberty blue微波多肽合成仪(CEM Corporation)自动合成。实验所用Rink Amide AM树脂(载量为0.27mmol/g或0.55mmol/g，采购自天津南开和成科技有限公司。实验所用的氨基酸衍生物购买江苏申琅生物科技有限公司(中国南通)。N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、三异丙基硅烷(TIPS)、三氟乙酸(TFA)和硫代茴香醚购自J&K Scientific Ltd.(北京)。N,N-二异丙基碳二亚胺(DIC)和2-肟氰乙酸乙酯(Oxyma)购自上海泰坦科技有限公司。1,2-乙二硫醇(EDT)购自TCI(Shanghai,China)Development Co.,Ltd。哌啶购自国药化学试剂有限公司，***购自现代东方(北京)科技发展有限公司，乙腈购自Mallinckrodt Baker,Inc.。
首先，将Rink Amide AM树脂在90℃下用含有10％哌啶和0.1M Oxyma的DMF溶液去除Fmoc(9-芴甲氧羰基)保护基团1分钟。然后，用DMF洗涤树脂3次。将树脂(0.25mmol)，4倍当量Fmoc保护的氨基酸(0.2mM，5ml，溶于DMF)，4倍当量Oxyma(1mM，1ml，溶于DMF)，以及4倍当量DIC(0.5mM，2ml，溶解在DMF中)混合并在微波加热下在90℃下偶联2分钟。在程序结束时，以切割液(TFA/TIPS/硫代茴香醚/水/EDT，体积比为82.5:5:5:5:2.5，vol/vol/vol/vol)切割3小时，从树脂上裂解肽段。然后将溶液在氮气搅拌下浓缩，用冷的***沉淀，然后离心并倒出上清液，重复3次。所得沉淀物是粗肽，随后以HPLC(高效液相色谱)进一步提纯得到D-25367(氨基酸序列：GEEEVKEYLTRKFKDDPELVRLLREAIEVLLKAGEDPELVLSLIESLIHITGDPRAAVKLAKEFG(SEQ ID No:1))。反相HPLC在Shimadzu ProminenceHPLC上进行。A泵流动相为乙腈(0.1％TFA)，B泵流动相为去离子水(0.1％TFA)。将粗制的多肽溶于含50％乙腈和0.1％TFA的水中，用0.22μm的过滤器过滤，纯化后的溶液冻干，得到纯的多肽粉末，将其命名为D-25367。D-25367的HPLC和质谱检测结果如图1所示。
测试实施例1：D-25367的结构鉴定
D-25367的二级结构由圆二色光谱仪(Chirascan V100/AppliedPhotophysics)测得。CD光谱测试了260至180nm区间，分别测试开始时25℃，升温至95℃和降回25℃时的三条CD曲线，升温幅度为2℃/min。D-25367测试浓度为0.2 mg/ml溶解于PBS缓冲液(pH 7.4)。
结果如图2所示。结果表明，在25℃，95℃和重回25℃时均能显示出在208和222 nm处有负峰，为典型的α-螺旋二级结构。经进一步分析，D-25367由4根α-螺旋构成，第一条α-螺旋序列为SEQ ID No:2(EEEVKEYLTRKF)，第二条α-螺旋序列为SEQ ID No:3(PELVRLLREAIEVLLKA)，第三条α-螺旋序列为SEQ ID No:4(PELVLSLIESLIHIT)，第四条α-螺旋序列为SEQ ID No:5(PRAAVKLAKEF)，因此其二级结构序列为LHHHHHHHHHHHHLLLHHHHHHHHHHHHHHHHHLLLHHHHHHHHHHHHHHHLLHHHHHHHHHHHL。
此实验结果还证明了D-25367有良好的热稳定性。
测试实施例2：D-25367与白细胞介素-6的结合分析
D-25367与白细胞介素结合分析分别使用了分析型分子筛色谱柱共迁移实验和生物膜干涉技术。
分析型分子筛色谱柱法
将D-25367和白细胞介素-6单独或两者摩尔比为1.1:1混合物，以同等物质的量的蛋白过柱(Superdex 200Increase 10/300column)，然后洗脱样品经SDS-PAGE跑胶验证D-25367与作为靶蛋白的白细胞介素-6发生共迁移。
结果如图3所示。从图3可以看出，当白细胞介素-6与D-25367混合后，复合物的出峰位置要先于各单体出峰，意味着复合物的体积更大。且从胶图可以对应复合物处峰为二者的复合物。
生物膜干涉技术(Octet RED96e/ForteBio)
生物膜干涉技术使用Octet仪器，使用特异性结合生物素的SA(链霉亲和素)探针来结合生物素化的L-或D-白细胞介素-6。对于D-白细胞介素-6，在合成的时候，在蛋白的氨基端连接一个生物素分子。而L-白细胞介素-6的生物素化是基于氨基端的一个Avi标签，通过生物素连接酶将生物素与L-白细胞介素-6连接。
实验流程为：
(1)基线1：SA探针浸于含有万分之二Tween-20的磷酸生理盐水缓冲液，pH7.4(以下简写成PBST)60秒，
(2)固化：将生物素化的白细胞介素-6在PBST中稀释，终浓度为10μg/ml，将SA探针浸于此溶液120秒；
(3)封闭：(封闭液为10μg/ml生物素的PBST溶液)，将SA探针浸于封闭液60秒，
(4)基线2：浸于PBST 60秒，
(5)结合：浸于由PBST稀释的D-25367溶液，分别在不同浓度250，125，62.5，31.1，15.6nM下180秒(单点突变时所用时长，图5)，或300秒(测结合常数时所用时长，图4)，
(6)解离：浸于PBST 180秒，
(7)测得结合常数为28.3±0.3nM(参见图4)。
另外，分别在D-25367或白细胞介素-6的结合界面设计点突变，以验证这些点突变对于蛋白互作性能的影响。
结果请参见图5。从图5可以看出了D-25367与白细胞介素-6的结合界面与设计的保持一致。
测试实施例3：D-25367细胞活性实验
白细胞介素-6介导的JAK-STAT信号通路已经被证明可以使用的测量人胎盘分泌型碱性磷酸酶(SEAP)表达来定量的测定信号通路。
在本实验中，将含有PhCMV-h白细胞介素-6R-pA(40ng)、PhCMV-hSTAT3-pA(40ng)和PhSTAT3-SEAP-pA(20ng)转染进1×104个HEK-293T细胞中表达SEAP以感应胞外白细胞介素-6。将转染的细胞与不同浓度的D-25367和人白细胞介素-6在含有10％胎牛血清(FBS)的Dulbecco's Modified Eagle Medium(DMEM)培养基中，在37℃和5％二氧化碳的培养箱中孵育48小时。之后将细胞培养上清液热灭活(65℃，30分钟)，并将80μl上清液与120μl底物溶液[100μl两倍浓度的SEAP检测缓冲液，其含有20mmol高精氨酸，1mmol氯化镁，21％(体积/体积)二乙醇胺pH 9.8以及20μl含有120mmol对硝基苯磷酸的底物溶液]混合。通过测量细胞培养基中SEAP的产生来评估白细胞介素-6信号传导。使用Synergy H1混合多模酶标仪(BioTek仪器公司)在405nmol(37℃)处记录吸光度，单位为酶活单位/L。
结果如图6所述，从图中可以看出D-25367可以显著抑制白细胞介素-6介导的信号通路。
测试实施例4：D-25367蛋白酶的水解实验
在蛋白酶解实验中，蛋白浓度为0.2mg/ml，分别在胰蛋白酶和胃蛋白酶溶液中37℃孵育，同时以D-25367的手性镜像多肽L-25367(氨基酸序列相同但由L-氨基酸构成)为对照。实验中，胰蛋白酶和胃蛋白酶的最终浓度分别为2.2和0.22mg/ml，并在孵育6和20小时时取样，用SDS-PAGE跑胶验证。
结果请见图7。从图7可以看出，本申请的D-25367不易被蛋白酶水解，显示出良好的体内稳定性。
Claims (4)
1. 一种针对白细胞介素-6的D-蛋白抑制剂，其氨基酸序列为SEQ ID No:1。
2. 根据权利要求1所述的D-蛋白抑制剂，其中，所述D-蛋白抑制剂由4条α-螺旋构成，第一条α-螺旋序列为SEQ ID No:2，第二条α-螺旋序列为SEQ ID No:3，第三条α-螺旋序列为SEQ ID No:4，第四条α-螺旋序列为SEQ ID No:5。
3.一种药物组合物，其包含治疗有效量的如权利要求1或2所述的D-蛋白抑制剂以及药学上可接受的载体。
4.如权利要求1或2所述的D-蛋白抑制剂或如权利要求3所述的药物组合物在制备用于治疗疾病的药物中的用途，其中，所述疾病为白细胞介素-6介导的相关疾病，并且所述疾病选自类风湿性关节炎、幼年特发性关节炎、多中心型Castleman病、巨细胞动脉炎、细胞因子释放综合征、高须动脉炎、成人Still综合症、Graves眼病、复发性多软骨炎和强直性脊柱炎。
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