CN116003425B - 一种用于检测铜离子的荧光探针及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于检测铜离子的荧光探针及其制备方法与应用，属有机荧光探针领域和细胞检测分析技术领域。本发明的荧光探针能够快速且高灵敏的检测水体中或活细胞中的铜离子。该荧光探针表现出了较好的铜离子选择性和抗其他金属离子干扰性。本发明的荧光探针具有较好的细胞通透性、较好的稳定性、较好的溶解性和生物兼容性，能够对细胞内的铜离子分布进行显微成像，且能够对活细胞内的铜离子进行在线实时的检测。

Description

一种用于检测铜离子的荧光探针及其制备方法与应用

技术领域

本发明属有机荧光探针领域和细胞检测分析技术领域，具体涉及一种含罗丹明结构的有机小分子荧光探针的设计及其制备方法，以及作为荧光探针在环境水体或活细胞中铜离子检测中的应用。

背景技术

正常情况下人体内，除了铁和锌，铜离子是第三种最丰富的必需微量元素，成人体内总铜含量一般是70～80毫克。铜离子是动物和人体内重要的微量元素之一，广泛存在于细胞内，在人体细胞基因表达、新陈代谢、神经传递和机体免疫等活动中有重要的作用。然而，当人体内铜离子的浓度过高时也会引起和加剧与衰老和疾病相关的氧化应激和损害事件，包括严重的神经退行性疾病等。为了研究疾病的起源并评估潜在药物临床应用，诸如铜离子的细胞浓度和分布等信息是至关重要的信息。因此，开发操作简单、选择性好、灵敏度高和成本低的铜离子探针有着非常重要的意义。

目前关于Cu²⁺荧光探针的研究中，大多是基于单波长荧光发射强度改变的荧光探针，比如荧光淬灭或荧光增强。这些基于单波长发射的荧光探针易受一些因素的影响，比如：光漂白、探针分子的浓度、周围的微环境和光照射下的稳定性等。而比率荧光探针能够克服上述因素的影响。比率荧光探针是通过记录两个荧光发射峰的比率来实现对金属离子的检测的，它有利于增加响应范围，减少环境因素的影响。

目前，铜离子的检测手段主要分为两类：直接法和间接法。直接法是一类直接利用铜离子自身物理、化学性质对其进行分析检测的方法，包括原子吸收、发射光谱法和离子选择性电极法；间接法是一类利用铜离子和指示剂他可称为化学分子探针)之间的特异性化学反应或超分子作用产生的信号变化对铜离子进行分析检测的方法，包括传统的铜离子指示剂和近年来研宄较热的铜离子荧光分子探针。但是，综合分析目前的铜离子荧光探针主要存在以下不足：第一，为了提高选择性大多数铜离子探针在有机溶剂中或含有机溶剂的组分中检测，对环境检测的实用性大大降低；第二，铜离子探针的检测都是根据某一特定波长的变化来进行，容易受外界因素的干扰；第三，多数铜离子探针在细胞中对铜离子的识别都是在某一特定荧光通道下进行成像不能实现双通道同时成像。基于此，开发新型铜离子探针，给出检测曲线判断铜离子水平，有着重要的研宄价值。

现有检测铜离子的技术缺少灵敏度和选择性。本发明检测快速、选择性好、灵敏度高、操作简单，且检测条件温和，旨在为铜离子的荧光检测技术提供更多的技术支持。

发明内容

本发明的目的在于克服已有技术的不足，提供一种选择性好、灵敏度高、能够快速且高效识别环境水体或活细胞内铜离子的罗丹明类荧光探针。

一种用于检测铜离子的荧光探针，化学结构式如下：

该探针在对水体中铜离子的检测过程中呈现出明显的颜色变化，当加入铜离子水溶液后，溶液颜色由无色变为淡***，随着铜离子浓度的增大，溶液颜色不断加深。

本发明还提供了所述用于检测铜离子的铜离子荧光探针的制备方法，反应路线如下：

(1)将式I化合物罗丹明B与水合肼溶于溶剂后进行回流反应，反应后脱除溶剂得到式II化合物；

(2)将步骤(1)中得到的式II化合物与2-羟基-4-乙氧基苯甲醛溶于溶剂中进行回流反应，反应结束后得到目标化合物。

进一步地，所述溶剂为无水甲醇、无水乙醇和无水乙腈中的至少一种。

所述式I化合物罗丹明B与水合肼的摩尔比为1∶1-2。所述式II化合物与2-羟基-4-乙氧基苯甲醛的摩尔比为1∶0.8-2。

进一步地，所述回流反应的温度为80℃。

本发明还提供了所述用于检测铜离子的荧光探针在用于水环境或生物细胞体系中铜离子的传感检测中的应用。所述传感检测包含荧光检测，目视定性检测，细胞成像检测。

本发明还提供了一种用于水环境中铜离子检测的方法，向待测样本溶液中加入所述用于检测铜离子的铜离子荧光探针，若变为***，则说明待测样本溶液中含有铜离子。

本发明还提供了一种用于生物细胞体系中铜离子检测的方法，向生物细胞体系中加入所述用于检测铜离子的铜离子荧光探针，培养后生物细胞体系中若出现荧光，则说明生物细胞体系中含有铜离子。

本发明的有益效果为：

1.本发明的荧光探针能够快速且高灵敏的检测水体中或活细胞中的铜离子。该荧光探针表现出了较好的铜离子选择性和抗其他金属离子干扰性。

2.本发明的荧光探针具有较好的细胞通透性、较好的稳定性、较好的溶解性和生物兼容性，能够对细胞内的铜离子分布进行显微成像，且能够对活细胞内的铜离子进行在线实时的检测。

附图说明

图1是荧光探针对不同金属离子的荧光光谱变化图。

图2是荧光探针在不同浓度铜离子下的荧光光谱变化图。

图3是荧光探针对水体中铜离子检测的照片。

图4是荧光探针对MDA-MB-231人乳腺癌细胞内铜离子检测的照片。

图5是荧光探针的对细胞活力分析图。

具体实施方式

下面结合具体实施例来对本发明进一步说明，但并不将本发明局限于这些具体实施方式。本领域技术人员应该认识到，本发明涵盖了权利要求书范围内所可能包括的所有备选方案，改进方案和等效方案。

实施例1：重要中间体的制备

反应路线如下：

分别将罗丹明B(4.79g，10mmol)、水合肼(5ml)和无水乙醇(20ml)加入至100ml单口反应瓶中，80℃下加热回流反应，薄层色谱(TLC)分析反应完成后，冷却到室温，旋蒸脱除溶剂，乙醇重结晶，并用冰水和冰乙醇洗涤数次，干燥后得到3.52g淡粉色固体，收率为77.1％。

核磁共振氢谱结果如下：¹H NMR(400MHz，CDCl₃)δ(ppm)：7.91-7.95(m，1H)，7.42-7.47(m，2H)，7.08-7.12(m，1H)，6.46(d，J＝8Hz，2H)，6.41(d，J＝4Hz，2H)，6.30(d，J＝2Hz，1H)，6.27(d，J＝4Hz，1H)，3.61(s，2H)，3.33(q，J＝8Hz，4Hz，8H)，1.16(t，J＝8Hz，12H).HR-MS：(M+Na)⁺，C₂₈H₃₂N₄O₂Na⁺，calculated：479.2417，found：479.2420。

实施例2：荧光探针的制备

反应路线如下：

1.分别将实施例1制备的中间体(0.46g，1mmol)、2-羟基-4-乙氧基苯甲醛(0.20g，1.2mmol)和无水乙醇(5ml)加入至25ml单口反应瓶中，80℃下加热回流反应，TLC分析反应完成后，冷却到室温，旋蒸脱除溶剂，用硅胶柱分离纯化(正己烷∶乙酸乙酯＝86％∶14％)得到0.53g白色固体，收率为87.9％。

2.分别将实施例1制备的中间体(150.7mg，0.33mmol)、2-羟基-4-乙氧基苯甲醛(49.9mg，0.3mmol)和无水乙醇(5ml)加入至25ml单口反应瓶中，80℃下加热回流反应，TLC分析反应完成后，冷却到室温，旋蒸脱除溶剂，用硅胶柱分离纯化(正己烷∶乙酸乙酯＝86％∶14％)得到145.1mg白色固体，收率为80.0％。

3.分别将实施例1制备的中间体(137.0mg，0.3mmol)、2-羟基-4-乙氧基苯甲醛(99.7mg，0.6mmol)和无水乙醇(5ml)加入至25ml单口反应瓶中，80℃下加热回流反应，TLC分析反应完成后，冷却到室温，旋蒸脱除溶剂，用硅胶柱分离纯化(正己烷∶乙酸乙酯＝86％∶14％)得到137.7mg白色固体，收率为75.9％。

核磁共振氢谱结果如下：¹H NMR(600MHz，CDCl₃)δ(ppm)：11.03(s，1H)，9.21(s，1H)，7.96(d，J＝12Hz，1H)，7.49-7.53(m，2H)，7.16(d，J＝6Hz，1H)，6.99(d，J＝6Hz，1H)，6.47-6.50(m，4H)，6.34-6.36(m，2H)，6.26(d，J＝12Hz，2H)，3.94-3.98(m，2H)，3.30-3.34(m，8H)，1.36(t，J＝12Hz，3H)，1.15(t，J＝6Hz，12H).¹³C NMR(150MHz，CDCl₃)δ(ppm)：164.20，162.03，160.84，153.86，153.77，150.88，149.28，133.44，132.80，130.60，128.74，128.37，124.34，123.42，112.30，108.32，107.13，105.86，102.03，98.24，66.70，63.73，44.58，14.88，12.85.HR-MS：(M+H)⁺，C₃₇H₄₁N₄O₄，calculated：605.3122，found：605.3122。

实施例3：一种含有罗丹明结构的铜离子荧光探针的应用

本应用试验采用实施例2中步骤1制备的荧光探针进行。

1.金属离子选择性测定

取实施例2中步骤1制备的荧光探针化合物，溶解到乙腈溶液中，配置成100μM的荧光探针母溶液和100μM的不同金属离子(Cu²⁺、K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺)水溶液，以及25mM的HEPES缓冲液，分别取200μL探针溶液(10μM)、200μL不同金属离子溶液(10μM)和1.6mL的HEPES缓冲液(20mM)，取配置的溶液200μL用酶标仪进行荧光光谱测定(激发波长为555nm，发射波长为587nm)。如图1所示，除铜离子外，其它金属离子对荧光探针的荧光光谱几乎没有影响，即此探针表现出较好的铜离子选择性和响应性。

2.铜离子荧光滴定

往荧光探针的缓冲液中分别加入不同量(0、1.2、2.4、4.9、9.8、19.5、39.1、78.1、156.2、312.5、625、1250、2500、5000、10000、25000、50000nM)的铜离子，分别进行荧光光谱测定(激发波长为555nm，发射波长为587nm)。如图2所示，该探针具有较低的检测限。

3.水中铜离子的检测

将荧光探针分别加入到含有不同金属离子(依次为空白对照、Cu²⁺、K⁺、Na⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Fe³⁺、Fe²⁺、Zn²⁺、Mn²⁺)的水溶液中。如图3所示，含有铜离子的水由无色变为淡***，其他金属离子的水溶液依旧呈现无色。

4.荧光显微成像

向含有活细胞MDA-MB-231人乳腺癌细胞株的培养皿中，加入浓度为100μg/mL的探针溶液(千分之一的DMSO水溶液)，与细胞培养液混合均匀，培养4小时后将培养皿置于共聚焦显微镜下进行观察。如图4所示，染有荧光探针的MDA-MB-231人乳腺癌细胞中呈现出明显的荧光，实验结果表明，荧光探针具有较好的细胞通透性、较好的稳定性、较好的溶解性和生物兼容性，能够对活细胞内的铜离子分布进行显微成像。

5.细胞活力分析

将不同浓度(0、10、20、40、80、160μg/mL)的探针溶液加入至含MDA-MB-231人乳腺癌细胞的培养皿中，在6h和24h时分别观察细胞状态。如图5所示，该探针几乎无细胞毒性。

Claims (5)

1.一种用于检测铜离子的荧光探针，其特征在于，化学结构式如下：

所述用于检测铜离子的铜离子荧光探针的制备方法，步骤如下：

(1)将式Ⅰ化合物罗丹明B与水合肼溶于溶剂后进行回流反应，反应后脱除溶剂得到式Ⅱ化合物；

(2)将步骤(1)中得到的式Ⅱ化合物与2-羟基-4-乙氧基苯甲醛溶于溶剂中进行回流反应，反应结束后得到目标化合物；

所述溶剂为无水甲醇、无水乙醇和无水乙腈中的至少一种；

所述式Ⅰ化合物罗丹明B与水合肼的摩尔比为1∶1-2；

所述式Ⅱ化合物与2-羟基-4-乙氧基苯甲醛的摩尔比为1∶0.8-2；

所述回流反应的温度为80℃。

2.如权利要求1所述用于检测铜离子的荧光探针在用于水环境或生物细胞体系中铜离子的传感检测中的应用。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述传感检测包含荧光检测，目视定性检测，细胞成像检测。

4.一种用于水环境中铜离子检测的方法，其特征在于，向待测样本溶液中加入权利要求1所述用于检测铜离子的铜离子荧光探针，若变为***，则说明待测样本溶液中含有铜离子。

5.一种用于生物细胞体系中铜离子检测的方法，其特征在于，向生物细胞体系中加入权利要求1所述用于检测铜离子的铜离子荧光探针，培养后生物细胞体系中若出现荧光，则说明生物细胞体系中含有铜离子。