CN116003397B - 一种苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物及其应用 - Google Patents
一种苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物及其应用，所述苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物具有如下式I所示结构：
；其中，A环选自C5‑C8环二烯、C4‑C8环氧二烯或C6‑C10芳环中的任意一种；B环选自取代或未取代的C6‑C12芳基、取代或未取代的C4‑C12含氮杂芳基、取代或未取代的C4‑C12含氧杂芳基中的任意一种；R1、R2独立地选自氢、取代或未取代的C1‑C10直链烷基或支链烷基、取代或未取代的C7‑C10芳基烷基、取代的酰基、取代的磺酰基中的任意一种。本发明提供的苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物能够有效抑制COUP‑TFII和NRF2的活性，对***癌细胞的增殖也具有优秀的抑制效果。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域，具体涉及一种苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物及其应用，尤其涉及一种活性高的苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物及其应用。
背景技术
与调节机体的生长发育和细胞分化，从而影响体内多种生理和代谢过程。鸡卵清蛋白上游启动子转录因子2(chicken ovalbumin upstream promoter transcriptionfactor 2，COUP-TFII)是核受体家族的重要成员之一。COUP-TF家族包括两个高度同源亚型，即COUP-TFI和COUP-TFII，分别位于5和15号染色体上，同样被称作核受体2家族1和2(NR2F1和NR2F2)。由于尚未鉴定出其特异性结合的配体，因此目前认为COUP-TF属于孤儿核受体。
目前的研究表明COUP-TFI在神经发育方面和COUP-TFII在器官发育方面各自发挥重要作用。还有的研究则表明COUP-TFII在机体生理生长发育过程的各个方面扮演重要角色，能够调节多种信号通路，参与控制肿瘤生长、血管生成和机体组织或细胞的再生等。
值得一提的是，在胚胎发育阶段、组织再生和疾病等状态下，COUP-TFII的表达异常上调；而在正常组织或机体成熟阶段，COUP-TFII表达维持在较低水平。目前的研究结果也显示，成年小鼠中敲除COUP-TFII基因，小鼠未呈现出表型改变等异常生理现象。这就在一定程度上说明抑制COUP-TFII并不会产生毒副作用。所以，研发靶向结合并抑制调节COUP-TFII活性的小分子药物，即具有切实且极具潜力的可行性。
在肿瘤生长过程中，COUP-TFII是血管新生的必要条件，它的异常表达能够导致癌症的发生及转移。因此，COUP-TFII是潜在的治疗癌症的理想全新靶点。
NRF2 (nuclear factor E rythroid 2 related factor, 核因子E2相关因子)于1994年由Moi等作为结合在β珠蛋白基因启动子核因子E2重复序列的因子被克隆出。属于转录因子CNC家族,含有亮氨酸拉链结构。
NRF2 / Keap1（Kelch-like ECH-associated protein 1，Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1）- ARE (antioxidant response element, 抗氧化应答元件)信号通路是近年来发现的机体内源性抗氧化信号途径。
NRF2 /Keap 1-ARE通路的激活是抗肿瘤发生的重要机制之一。在肿瘤发生早期，NRF2的激活使癌细胞能够适应不利的微环境和高内源性ROS水平；而在快速增殖的细胞中，NRF2可通过促进核苷酸和氨基酸的生物合成来支持中间代谢。研究显示，低活性NRF2促进肿瘤发生，而持续的高活性NRF2可加速癌症进展及对治疗的耐受。
因此，开发能够对COUP-TFII和NRF2均具有抑制作用的化合物有着非常重要的实用价值，在肿瘤治疗上面有着广泛的使用前景。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物及其应用，尤其提供一种活性高的苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物及其应用。本发明提供的苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物能够有效抑制COUP-TFII和NRF2的活性，对***癌细胞的增殖也具有优秀的抑制效果。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供了一种苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物，所述苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物具有如下式I所示结构：
其中，A环选自C5-C8环二烯、C4-C8环氧二烯或C6-C10芳环中的任意一种。
B环选自取代或未取代的C6-C12芳基、取代或未取代的C4-C12含氮杂芳基、取代或未取代的C4-C12含氧杂芳基中的任意一种。
R1、R2独立地选自氢、取代或未取代的C1-C10直链烷基或支链烷基、取代或未取代的C7-C10芳基烷基、取代的酰基、取代的磺酰基中的任意一种。
上述特定结构的苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物能够有效抑制COUP-TFII和NRF2的活性，对***癌细胞的增殖也具有优秀的抑制效果。
优选地，所述C6-C12芳基、C4-C12含氮杂芳基或C4-C12含氧杂芳基的取代基独立地选自羟基、卤素、未取代或Ra取代的C1-C10直链烷基或支链烷基、未取代或Ra取代的C1-C10烷氧基、未取代或Rb取代的C6-C12芳基、未取代或Rb取代的C5-C12含氮杂芳基中的任意一种。
所述Ra选自卤素或氘，所述Rb选自C1-C10直链烷基或支链烷基、C1-C10卤代烷基、C1-C10烷氧基、
或-COORc中的任意一种，所述Rc选自氢、C1-C10直链烷基或支链烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10烷胺基或C1-C10杂环基中的任意一种。
优选地，所述直链烷基或支链烷基的取代基选自卤素、氢或氘。
优选地，所述酰基、磺酰基、C1-C10直链烷基或支链烷基、C7-C10芳基烷基的取代基独立地选自C1-C10直链烷基或支链烷基、C1-C10烷氧基、C1-C10卤代烷基、C3-C10环烷基、未取代或Rd取代的C6-C12芳基、未取代或Rd取代的C5-C12杂芳基中的任意一种；所述Rd选自卤素、氰基、C1-C10直链烷基或支链烷基中的任意一种。
优选地，所述A环选自苯环或者
，X选自-CH2-或-O-。
n选自0、1或2，n为0时表示此处基团不存在，X与另一端直接相连。
其中，
表示并环结构的连接位点。
优选地，所述B环选自
中的任意一种。
其中，Y选自-CH=或-N=，Z’选自-O-或-NH-。
R3、R4独立地选自-H、-OH、-OMe、-OCD3、-F、-Cl、-CF3、
中的任意一种。
Z选自-CH=或-N=。
Re选自-H、-CF3、-COORf或
中的任意一种。
所述Rf选自-H、-Me、-Et、-i-Pr、-n-Bu、-i-Bu、-CH2-CHEt2、-(CH2)2-OMe、-(CH2)2-NMe2或
中的任意一种；/>
表示基团的连接位点。
优选地，所述R1、R2独立地选自-H、-Me、-CD3、-Et、-i-Pr、-Bn、
中的任意一种。
其中，Rg选自-Me或MeOCH2-，Rh选自-Me、-Et、-n-Pr、-i-Bu、-CF3、-Bn、
或/>
中的任意一种；Ri选自-H、-Me、-F或-CN中的任意一种。
优选地，所述苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物选自如下式1-式58中的任意一种：
示例性地，式I所示化合物可由以下步骤制备得到：
起始化合物I-1经过两步取代得到化合物III，之后合环得到中间体M，中间体M经过缩合得到式I所示化合物。
第二方面，本发明提供了如上所述的苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物的立体异构体、其药学上可接受的盐或包含其的药物组合物。
优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的药用辅料。
第三方面，本发明提供了如上所述的苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物或如上所述的苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物的立体异构体、其药学上可接受的盐、包含其的药物组合物在制备用于治疗和/或预防与COUP-TFII活性过高或者与COUP-TFII过度表达有关的疾病的药物中的应用。
优选地，本发明提供了如上所述的苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物或如上所述的苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物的立体异构体、其药学上可接受的盐、包含其的药物组合物在制备用于非疾病的诊断或治疗为目的的COUP-TFII抑制剂的应用。
优选地，所述与COUP-TFII活性过高或者与COUP-TFII过度表达有关的疾病包括***癌。
第四方面，本发明还提供了如上所述的苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物或如上所述的苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物的立体异构体、其药学上可接受的盐、包含其的药物组合物在制备用于治疗和/或预防与NRF2活性过高或者与NRF2过度表达有关的疾病的药物中的应用。
优选地，所述与NRF2活性过高或者与NRF2过度表达有关的疾病包括NASH、药物肝损伤等肝脏疾病，肺损伤、肺纤维化等呼吸道疾病以及肺癌、胰腺癌、肝癌、结直肠癌、***癌等恶性肿瘤。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明提供了一种特定结构的苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物，其能够有效抑制COUP-TFII和NRF2的活性，对***癌细胞的增殖也具有优秀的抑制效果。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。
术语“药学上可接受的盐”是指化合物可以通过传统的方法转化为相应的盐，其在化学上或物理上与构成某药物剂型的其它成分相兼容，并在生理上与受体相兼容。该盐可以为化合物与无机和/或有机酸和/或与无机和/或有机碱形成的酸式和/或碱式盐，也包括两性离子盐（内盐），还包括季铵盐，例如烷基铵盐。这些盐可以是在化合物的最后分离和纯化中直接得到。也可以是通过将本发明的化合物或其立体异构体或溶剂合物，与一定数量的酸或碱适当混合而得到的。这些盐可能在溶液中形成沉淀而以过滤方法收集，或在溶剂蒸发后回收而得到，或在水介质中反应后冷却干燥制得。具体地，盐优选为水溶性的药学上可接受的无毒酸加成盐，实例为氨基与无机酸(如盐酸、氢溴酸、磷酸、硫酸以及高氯酸)或与有机酸(如乙酸、草酸、顺丁烯二酸、酒石酸、柠檬酸、琥珀酸或丙二酸)形成的盐，或通过使用本领域中传统的其他方法(例如离子交换法)形成的盐。
术语“烷基”是指包含伯（正）碳原子、或仲碳原子、或叔碳原子、或季碳原子、或其组合的饱和烃。包含该术语的短语，例如，“C1-C3烷基”是指包含1~3个碳原子的烷基，每次出现时，可以互相独立地为C1烷基、C2烷基、C3烷基。合适的实例包括但不限于：甲基(Me、-CH3)、乙基(Et、-CH2CH3)、1-丙基(n-Pr、n-丙基、-CH2CH2CH3)、2-丙基(i-Pr、i-丙基、-CH(CH3)2)。
术语“杂环烷基”是指构成环的一个或多个原子是杂原子且其余为碳的非芳香环状基团，所述的杂原子包括而不限于氮原子、氧原子和硫原子等。优选的杂环烷基为3-10元饱和杂环烷基。除非本说明书中另外特别指明，否则杂环烷基可以是单环的（"单环的杂环烷基"），或者是双环、三环或更多环的杂环状体系，其可包括并环的（稠合的）、桥联的（桥环的）或螺的环***（例如二环***（“二环的杂环烷基”）。杂环烷基二环的环***可以在一个或两个环中包括一个或多个杂原子；并且是饱和的。杂环烷基基团包括但不限于，氮杂环丁烷基，环氧丙烷基，硫杂环丁烷基，氧杂环丁基，四氢呋喃基、四氢吡咯基，四氢吡喃基，或者其同分异构体和立体异构体；方案中，“杂环烷基”为4-6元杂环烷基，其中杂原子选自Ν、O和S中的一种或多种，杂原子数为1、2或3个。
术语“烷氧基”是指具有-O-烷基的基团，即如上所定义的烷基经由氧原子连接至母核结构。包含该术语的短语，例如，“C1-C3烷氧基”是指烷基部分包含1~3个碳原子。
术语“芳基”是指在芳香环化合物的基础上除去一个氢原子衍生的芳族烃基，可以为单环芳基、或稠环芳基、或多环芳基，对于多环的环种，至少一个是芳族环系。优选的芳基为6-10元芳基，作为实例可以选自苯基和萘基。
术语“杂芳基”是指含有杂原子的芳基，可为单环或稠合环，所述杂原子独立地选自N、O和S，优选为5-12元杂芳基，包括但不限于吡咯基、呋喃基、噻吩基、咪唑基、噁唑基、异噁唑基、吡唑基、吡啶基、嘧啶基、吡嗪基、哒嗪基、喹啉基、异喹啉基、***基、四氢吡咯基。在某一方案中，典型地含1个或多个独立选自N、O和S的杂原子的5-6元单环杂芳基。如“5-元杂芳基”除非另外说明，包含一个杂原子的示例性5-元杂芳基基团包括但不限于，吡咯基、呋喃基以及噻吩基；包含两个杂原子的示例性5-元杂芳基基团包括但不限于，咪唑基、吡唑基、噁唑啉基、异噁唑啉基、噻唑基以及异噻唑基；包含三个杂原子的示例性5-元杂芳基基团包括但不限于，***基、噻二唑基；包含四个杂原子的示例性5-元杂芳基基团包括但不限于，四唑基。
在本发明的各部分，描述了连接取代基。当该结构清楚地需要连接基团时，针对该基团所列举的马库什变量应理解为连接基团。例如，如果该结构需要连接基团并且针对该变量的马库什基团定义列举了“烷基”或“芳基”，则应该理解，该“烷基”或“芳基”分别代表连接的亚烷基基团或亚芳基基团。在一些具体的结构中，当烷基基团清楚地表示为连接基团时，则该烷基基团代表连接的亚烷基基团，例如，基团“-C1-C3卤代烷基”中的烷基应当理解为亚烷基。
此外，术语“包括”是开放性限定并非封闭式，即包括本发明所指明的内容，但并不排除其他方面的内容。
除非另有说明，本发明采用质谱、核磁等传统方法鉴定化合物，各步骤和条件可参照本领域常规的操作步骤和条件。
本领域技术人员可以理解，根据本领域中使用的惯例，本申请描述基团的结构式中所使用的“
”是指，相应的基团通过该位点与化合物中的其它片段、基团进行连接。在不违背本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。
术语“卤代”、“卤素”、“卤”是指卤素原子或被卤素原子取代，所述卤素原子包括氟原子、氯原子、溴原子或碘原子。
术语“环二烯”是指具有两个双键的环烷烃，例如环戊二烯、环己二烯、环庚二烯或环壬二烯；术语“环氧二烯”是指在术语“环二烯”的基础上至少一个碳原子被氧原子取代的结构。
本发明所用试剂和原料均市售可得。
中间体M-a的合成：
步骤M-1：将化合物I-a（8.0 g，49.6 mmol）和吡啶（4.31 g，54.56 mmol）加入到二氯甲烷（20 mL）中，冰浴条件下缓慢加入甲磺酰氯（5.68 g，49.6 mmol），然后20℃搅拌过夜。反应结束之后，加入1.0 M氢氧化钠溶液调节体系pH值为11-12之间，然后用二氯甲烷和水萃取，所得水相部分再用1.0 M盐酸调节pH值到5-6，过滤、干燥即得黄色固体化合物II-a（9.7g，收率82%）。LCMS [M+H]+ = 240.1。
步骤M-2：将化合物II-a（9.7 g，40.7 mmol）和碳酸钾（11.2 g，81.4 mmol）加入到N,N-二甲基甲酰胺（20 mL）中，冰浴条件下缓慢加入碘甲烷（6.9 g，48.7 mmol）和N,N-二甲基甲酰胺（10 mL）的混合溶液，然后20℃搅拌过夜。反应结束之后，将反应溶液加入到足量水中继续搅拌30分钟，过滤、干燥即得黄色固体化合物III-a(10.1 g，收率99%)。LCMS [M+H]+ = 254.1。
步骤M-3：将化合物III-a（3.0 g，11.86 mmol）和碘单质（4.5 g，17.79 mmol）加入到乙醇（20mL）中，95 oC条件下搅拌30分钟，然后加入硫脲 (1.80 g，23.72 mmol)，95 oC条件下搅拌过夜，反应结束之后，加入1.0 M氢氧化钠溶液淬灭反应并调节体系pH值为10-11，加入水（20 mL）20℃搅拌30分钟，过滤、干燥即得咖啡色固体中间体M-a (2.38 g，收率64%)。LCMS [M+H]+ = 310.1。
实施例1：
合成路线：
将中间体M-a (92.7 mg，0.3 mmol)，原料化合物1-a (60 mg，0.3 mmol)，N,N-二异丙基乙胺(116 mg, 0.9 mmol)以及2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(171 mg，0.45 mmol)加入到N,N-二甲基甲酰胺（1.5 mL）中，然后20℃搅拌过夜。反应结束之后，使用反相柱层析纯化得到黄色固体化合物1 (27 mg，收率18%)。 LCMS [M+H]+ =491.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.81 (s, 1H), 8.71 (s, 1H), 8.26-8.21(m, 4H), 8.09 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.92 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.72 (d, J = 6.0Hz, 1H), 7.41 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.33-7.30 (m, 2H), 3.23 (s, 3H), 3.02-2.98(m, 4 H), 2.95 (s, 3H)。
实施例2：
合成路线：
将中间体M-a (927 mg，3 mmol)，原料化合物2-a (600 mg，3 mmol)，N,N-二异丙基乙胺(1.16 g，9 mmol)以及2-(7-偶氮苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(1.71 g，4.5 mmol)加入到N,N-二甲基甲酰胺（15 mL）中，然后20℃搅拌过夜。反应结束之后，使用反相柱层析纯化得到粉红色固体化合物2-b (840 mg，收率57%)。 LCMS [M+H]+ =493.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.79 (s, 1H), 8.03 (d, J = 6.0 Hz, 2H),7.74 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.70 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.31 (d, J = 6.0 Hz, 2H),3.22 (s, 3H), 3.02-2.97 (m, 4H), 2.95 (s, 3H).
将化合物2-b (150 mg，0.3mmol)，化合物2-c (74 mg，0.36mmol)，[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯二氯甲烷络合物 (25 mg，0.03 mmol)以及碳酸钠（63.6 mg，0.6mmol）加入到1,4-二氧六环（5 mL）和水（0.5 mL）的混合溶剂中，氮气保护下加热到100℃反应过夜。反应结束之后，加入乙酸乙酯（20mL）稀释，过滤，萃取，将有机相浓缩之后柱层析纯化得到黄色固体化合物2 (104 mg，收率70%)。 LCMS [M+H]+ = 491.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.83 (s, 1H), 8.68-8.66 (m, 2H), 8.25(d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.98 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.81-7.79 (m, 2H), 7.72 (d, J= 6.0 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 3.23 (s, 3H), 3.04-2.98 (m, 4 H),2.96 (s, 3H)。
实施例3：
合成路线：
参考实施例2，将化合物2-c替换为等量的化合物3-a，即可合成得到黄色固体化合物3 (27 mg，收率18%)。 LCMS [M+H]+ = 491.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.81 (s, 1H), 8.99 (s, 1H), 8.62-8.61(m, 1H), 8.24 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 8.18 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.92 (d, J = 6.0Hz, 2H), 7.72 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.53-7.50 (m, 1H), 7.32 (d, J = 6.0 Hz,2H), 3.23 (s, 3H), 3.03-2.98 (m, 4 H), 2.96 (s, 3H)。
实施例4：
合成路线：
将化合物2（20 mg，0.04 mmol）和2,3-二氯-5,6-二氰基苯醌(14 mg，0.06 mmol)加入到1,2-二氯乙烷（3 mL）中，氮气保护下加热到60℃反应过夜。反应结束之后，加入N,N-二甲基甲酰胺（5mL）稀释，经过反相柱层析纯化得到黄色固体化合物4 (12 mg，收率61%)。LCMS [M+H]+ = 489.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.22 (s, 1H), 8.69 - 8.66 (m, 2H), 8.58(d, J = 6.8 Hz, 1H), 8.32 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 8.14 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 8.09(s, 1H), 8.02 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.86 (d, J = 6.8 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 4.4Hz, 2H), 7.74 - 7.71 (m, 1 H), 3.36 (s, 3H), 3.01 (s, 3H)。
实施例5：
合成路线：
参考实施例2，将化合物2-a替换为等量5-a，化合物2-c替换为等量3-a，即可合成得到黄色固体化合物5 (100 mg，收率91%)。 LCMS [M+H] + =521.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.95 (s, 1H), 9.02 (s, 1H), 8.63 (d, J =3.3 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.69 (d, J =6.0 Hz, 1H), 7.55 - 7.52 (m, 2H), 7.45 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.32 - 7.30 (m,2H), 4.06 (s, 3H), 3.24 (s, 3H), 3.03 - 2.99 (m, 4H), 2.96 (s, 3H)。
实施例6：
合成路线：
将化合物II-a（2.0 g，8.37 mmol）和碘单质（2.1 g，8.37 mmol）加入到乙醇（20mL）中，95℃条件下搅拌30分钟，然后加入硫脲 (1.3 g，16.7 mmol)，95℃条件下搅拌过夜，反应结束之后，浓缩，利用反相柱层析纯化得到黄色固体化合物6-a (2.1 g，收率85%)。LCMS: [M+H]+ = 296.1。
将化合物6-a（2.1 g，7.12 mmol）和碳酸钾(1.96 g，14.2 mmol)加入到N,N-二甲基甲酰胺（20mL）中，然后加入二碳酸二叔丁酯(1.7 g，7.83 mmol)，40℃条件下搅拌过夜，反应结束之后，加入水（100 mL）稀释，乙酸乙酯萃取后，将有机相浓缩，经过柱层析纯化得到灰色固体化合物6-b (2 g，收率71.4%)。LCMS: [M+H]+ = 396.1。
然后参照实施例2，将化合物2-a替换成等量化合物6-c、化合物M-a替换成等量6-b、化合物2-c替换成等量6-e，得到化合物6-f，脱保护即可合成得到黄色固体化合物6 (700mg，收率83.8%)。LCMS: [M+H]+ = 507.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.93 (s, 1H), 9.73 (s, 1H), 9.02 (s,1H), 8.63 (d, J = 4.8 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 8.0 Hz,1H), 7.64 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.55 - 7.52 (m, 2H), 7.45 (d, J = 8.4 Hz, 1H),7.13 - 7.11 (m, 2H), 4.06 (s, 3H), 3.00 - 2.94 (m, 7H)。
实施例7：
合成路线：
参照中间体M-a的合成方法，将碘甲烷替换为等量三氘代碘甲烷，得到中间体M-b，然后参照实施例2，将化合物2-a替换成等量化合物7-a、化合物M-a替换成等量M-b、化合物2-c替换成等量7-c，即可合成得到黄色固体化合物7（80 mg，收率40%）。LCMS [M+H]+ =524.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.95 (s, 1H), 9.01 (s, 1H), 8.63 (d, J =3.0 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.83 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.69 (d, J =5.7 Hz, 1H), 7.54 - 7.52 (m, 2H), 7.45 (d, J = 5.7 Hz, 1H),7.32 - 7.29 (m,2H), 4.05 (s, 3H), 3.02 - 2.98 (m, 4H), 2.96 (s, 3H)。
实施例8：
合成路线：
参照中间体M-a的合成方法，将碘甲烷替换为等量碘乙烷，得到中间体M-c，然后参照实施例2，将化合物2-a替换成等量化合物8-a、化合物M-a替换成等量M-c、化合物2-c替换成等量8-c，即可合成得到黄色固体化合物8（10.4 mg，收率41%）。LCMS [M+H]+ = 535.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.95 (s, 1H), 9.01 (s, 1H), 8.63 (d, J =4.8 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.84 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.71 (d, J =8.0 Hz, 1H), 7.55 - 7.52 (m, 2H), 7.45 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.27 (d, J = 9.6Hz, 2H), 4.06 (s, 3H), 3.66 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.04 - 2.99 (m, 7H), 1.02(t, J = 7.2 Hz, 3H)。
实施例9：
合成路线：
参照中间体M-a的合成方法，将碘甲烷替换为等量2-碘丙烷，得到中间体M-d，然后参照实施例2，将化合物2-a替换成等量化合物9-a、化合物M-a替换成等量M-d、化合物2-c替换成等量9-c，即可合成得到黄色固体化合物9（10.4 mg，收率41%）。LCMS [M+H]+ = 549.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.95 (s, 1H), 9.01 (s, 1H), 8.63 (d, J =4.0 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 7.2 Hz, 1H), 7.85 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.72 (d, J =8.4 Hz, 1H), 7.55 - 7.52 (m, 2H), 7.46 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.18 (d, J = 7.2Hz, 2H), 4.36 - 4.29 (m, 1H), 4.06 (s, 3H), 3.07 - 3.00 (m, 7H), 1.10 (d, J =6.8 Hz, 6H)。
实施例10：
合成路线：
参照中间体M-a的合成方法，将碘甲烷替换为等量苄基碘，得到中间体M-e，然后参照实施例2，将化合物2-a替换成等量化合物10-a、化合物M-a替换成等量M-e、化合物2-c替换成等量10-c，即可合成得到黄色固体化合物10（23.2 mg，收率51%）。LCMS [M+H]+ =597.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.93 (s, 1H), 9.01 (s, 1H), 8.62 (d, J =4.8 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.82 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.61 (d, J =8.4 Hz, 1H), 7.54 - 7.51 (m, 2H), 7.44 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.31 - 7.25 (m,6H), 7.21 (q, J = 4.4 Hz, 1H), 4.86 (s, 2H), 4.04 (s, 3H), 3.10 (s, 3H), 2.99- 2.92 (m, 4H)。
实施例11：
合成路线：
参照实施例2，将化合物2-a替换成等量化合物11-a、化合物2-c替换成等量11-c，即可合成得到黄色固体化合物11（50 mg，收率22%）。LCMS [M+H]+ = 527.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 11.93 (s, 1H), 9.01 (s, 1H), 8.63 (d, J =2.7 Hz, 1H), 8.20 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.84 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.69 (d, J =6.0 Hz, 1H), 7.54-7.51 (m, 2H), 7.45 (d, J = 5.7Hz, 1H), 7.32 - 7.29 (m, 2H),3.02 - 2.98 (m, 4H), 2.96 (s, 3H)。
实施例12：
合成路线：
将化合物5（50 mg，0.1 mmol）加入到二氯甲烷（3 mL）中，冰浴下加入三溴化硼（0.2 mL），然后20℃搅拌30分钟，反应结束之后加入甲醇淬灭反应，浓缩，利用反相柱层析纯化得到黄色固体化合物12（20 mg，收率39.5%）。LCMS [M+H]+ = 507.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.08 (s, 1H), 8.93 (s, 1H), 8.63 (s,1H), 8.16 - 8.11 (m, 2H), 7.43 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.54 - 7.51 (m, 1H), 7.39- 7.31 (m, 4H), 3.24 (s, 3H), 3.04 - 2.99 (m, 4H), 2.97 (s, 3H)。
实施例13：
合成路线：
参照实施例12，将化合物5替换为等量化合物7，即可合成得到黄色固体化合物13（200 mg，收率93%）。LCMS [M+H]+ = 510.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.25 (s, 1H), 9.13 (s, 1H), 8.80 (d, J =3.6 Hz,1H), 8.57 (d, J = 6.6 Hz,1H), 8.17 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.89 (t, J =5.7 Hz, 1H), 7.71 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.45-7.41 (m, 2H), 7.33 - 7.31 (m,2H), 3.03 - 2.98 (m, 4H), 2.96 (s, 3H)。
实施例14：
合成路线：
参照实施例2，将化合物2-b替换为等量14-a（即5-b）、化合物2-c替换为等量14-b，即可合成得到黄色固体化合物14（201 mg，收率89.5%）。LCMS [M+H]+ = 589.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.05 (s, 1H), 9.33 (s, 1H), 9.04 (s,1H), 8.62 (s, 1H), 7.84 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.70 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.64(s, 1H), 7.58 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.33 - 7.31 (m, 2H), 4.08 (s, 3H), 3.24(s, 3H), 3.04 - 3.00 (m, 4H), 2.97 (s, 3H)。
实施例15：
合成路线：
参照实施例2，将化合物2-b替换为等量15-a（即7-b）、化合物2-c替换为等量15-b，即可合成得到黄色固体化合物15（60 mg，收率37.6%）。LCMS [M+H]+ = 592.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.00 (s, 1H), 9.31 (s, 1H), 9.01 (s,1H), 8.60 (s, 1H), 7.83 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.62(s, 1H), 7.56 (d, J = 5.6 Hz, 1H), 7.31 - 7.29 (m, 2H), 4.06 (s, 3H), 3.02 -2.98 (m, 4H), 2.95 (s, 3H)。
实施例16：
合成路线：
参照实施例2，将化合物M-a替换为等量M-b、化合物2-a替换为等量16-a、化合物2-c替换为等量16-c，即可合成得到黄色固体化合物16（55.9 mg，收率24.5%）。 LCMS [M+H]+ =566.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.85 (s, 1H), 9.14 (s, 1H), 8.46 – 8.35(m, 1H), 8.28 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.15 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.01 (d, J = 8.4Hz, 2H), 7.73 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.34 - 7.31 (m, 2H), 4.37 (q, J = 7.2 Hz,2H), 3.05 - 2.97 (m, 7H), 1.35 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。
实施例17：
合成路线：
将化合物17-a (即16-b，690 mg, 1.39 mmol)，联硼酸频那醇酯 (708 mg，2.79mmol)，[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯(102 mg，0.14 mmol)以及醋酸钾(273 mg，2.79 mmol)加入到1,4-二氧六环（10 mL）中，10℃搅拌6个小时，反应结束之后，浓缩并经过柱层析纯化得到红色油状物化合物17-b (750 mg，收率99.4%)，LCMS: [M+H]+ = 543.1。
将化合物17-b (120 mg，0.22 mmol)，化合物17-c (72 mg，0.33 mmol)，[1,1'-双(二苯基膦)二茂铁]二氯化钯 (24 mg，0.022 mmol)以及碳酸钾（92 mg，0.66 mmol）加入到1,4-二氧六环（4 mL）和水（0.5 mL）的混合溶剂中，95℃搅拌过夜，反应结束之后，浓缩并经过柱层析纯化得到黄色固体化合物17 (24.2 mg，收率19.8%)，LCMS: [M+H]+ = 552.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.84 (s, 1H), 9.20 (s, 1H), 8.46 – 8.35(m, 1H), 8.33 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.27 (d, J = 8.4 Hz, 3H), 7.73 (d, J = 8.0Hz, 1H), 7.34 - 7.31 (m, 2H), 3.91 (s, 3H), 3.04 - 2.97 (m, 7H)。
实施例18：
合成路线：
参照实施例2，将化合物M-a替换成等量M-b、化合物2-a替换成等量18-a、化合物2-c替换成等量18-c，即可合成得到黄色固体化合物18（57.1 mg，收率13.6%）。 LCMS [M+H]+ =566.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.08 (s, 1H), 9.14 (s, 1H), 8.46 (d, J =8.4 Hz, 1H), 8.28 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.11 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.02 (d, J =8.0 Hz, 2H), 7.75 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.34 - 7.32 (m, 2H), 4.36 (q, J = 7.2Hz, 2H), 3.06 - 3.01 (m, 4H), 2.97 (s, 3H), 1.35 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。
实施例19：
合成路线：
将化合物18（100 mg，0.18 mmol)加入到四氢呋喃（2mL）和乙醇（2mL）的混合溶液中，然后再加入氢氧化钠（35 mg，0.88 mmol）的水溶液（1mL），45℃搅拌过夜，反应结束之后，浓缩并经过柱层析纯化得到黄色固体化合物19 (31.1 mg, 收率32.7%)，LCMS: [M+H]+ = 538.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.88 (s, 1H), 8.32 (d, J = 8.4 Hz, 1H),8.19 – 8.03 (m, 4H), 7.97 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.73 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.64(d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.27 - 7.23 (m, 2H), 3.00 - 2.94 (m, 5H), 2.88 - 2.84(m, 2H)。
实施例20：
合成路线：
参照实施例2，将化合物2-c替换为等量的20-c，即可合成得到黄色固体化合物20（346 mg，收率76%）。 LCMS [M+H]+ = 562.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.80 (s, 1H), 8.24 (d, J = 6.0 Hz, 2H),8.05 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.91 (d, J = 6.0 Hz, 4H), 7.72 (d, J = 6.0 Hz, 1H),7.32 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 4.38 – 4.27 (m, 2H), 3.24 (s, 3H), 3.02 - 2.98 (m,4H), 2.96 (s, 3H), 1.33 (t, J = 5.6 Hz, 3H)。
实施例21：
合成路线：
参照实施例2，将化合物2-c替换为等量的21-c，即可合成得到黄色固体化合物21（100 mg，收率46.7%）。 LCMS [M+H]+ = 565.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.78 (s, 1H), 8.24 (d, J = 6.0 Hz, 2H),8.06 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 7.92 (d, J = 6.0 Hz, 4H), 7.73 (d, J = 6.4 Hz, 1H),7.32 (d, J = 5.6 Hz, 2H), 4.36 - 4.31 (m, 2H), 3.03 - 2.98 (m, 4H), 2.96 (s,3H), 1.33 (t, J = 5.6 Hz, 3H)。
实施例22：
合成路线：
参照中间体M-a合成，将化合物I-a替换成等量的5-氨基-2,3-二氢-1H-茚-1-酮得到中间体M-f，再参照实施例2，将化合物M-a替换为等量M-f、化合物2-c替换为等量22-c得到化合物22-d，之后参考实施例19将化合物18替换为等量22-d，即可合成得到黄色固体化合物22（10.2 mg，收率26%）。 LCMS [M+H]+ = 520.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.95 (s, 1H), 8.26 (d, J = 8.4 Hz, 2H),8.05 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.92 (t, J = 8.4 Hz, 4H), 7.64 (s, 1H), 7.57 (d, J= 8.0 Hz, 1H), 7.41 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 3.96 (s, 2H), 3.27 (s, 3H), 2.97 (s,3H)。
实施例23：
合成路线：
参照中间体M-a合成和实施例22，将碘甲烷替换为等量三氘代碘甲烷得到中间体M-g，再参照实施例2，将化合物M-a替换为等量M-g、化合物2-c替换为等量23-c，即可合成得到黄色固体化合物23（10 mg，收率14%）。 LCMS [M+H]+ = 551.1。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.19 (s, 1H), 8.14 (d, J = 6.0 Hz, 2H),8.06 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.54 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.66 (d, J = 6.0 Hz, 2H),7.56 (s, 1H), 7.50 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.29 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.45 - 7.39(m, 2H), 3.90 (s, 2H), 2.84 (s, 3H), 1.14 (t, J = 5.2 Hz, 3H)。
实施例24：
合成路线：
参照中间体M-a合成，将化合物I-a替换成等量的2-氨基-6,7,8,9-四氢-5H-苯并[7]环烯-5-酮、碘甲烷替换为等量三氘代碘甲烷得到中间体M-h，再参照实施例2，将化合物M-a替换为等量M-h、化合物2-c替换为等量24-c，即可合成得到黄色固体化合物24（3.3 mg，收率18.4%）。 LCMS [M+H]+ = 579.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.71 (s, 1H), 8.24 (d, J = 8.4 Hz, 2H),8.07 - 8.04 (m, 3H), 7.97 – 7.89 (m, 4H), 7.42 – 7.31 (m, 1H), 7.29 (s, 1H),4.34 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.01 - 2.97 (m, 5H), 2.82 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 2.12- 2.06 (m, 2H), 1.34 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。
实施例25：
合成路线：
参照中间体M-a合成，将化合物I-a替换成等量的7-氨基铬-4-酮、碘甲烷替换为等量三氘代碘甲烷得到中间体M-i，再参照实施例2，将化合物M-a替换为等量M-i、化合物2-c替换为等量25-c，得到化合物25-d，之后参照实施例19，将化合物18替换为等量化合物25-d，即可合成得到黄色固体化合物25（2.5 mg，收率26%）。 LCMS [M+H]+ = 539.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 8.23 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.04 (d, J =8.0 Hz, 2H), 7.90 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.85 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.62 (d, J =8.4 Hz, 1H), 7.08 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.00 (s, 1H), 5.53 (s, 2H), 2.95 (s,3H)。
实施例26：
合成路线：
参照实施例2，将化合物M-a替换为等量M-b、化合物2-a替换为等量26-a、化合物2-c替换为等量26-c，之后参照实施例19，将化合物18替换为等量26-d，即可合成得到白色固体化合物26（51.2 mg，收率77%）。 LCMS [M+H]+ = 540.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.33 (s, 1H), 8.03 (d, J = 8.0 Hz, 2H),7.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.64 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.47 (d, J = 4.0 Hz, 1H),7.32 - 7.30 (m, 2H), 6.41 (d, J = 4.0 Hz, 1H), 3.90 (s, 3H), 3.02 - 2.96 (m,7H)。
实施例27：
合成路线：
参照实施例2，将化合物2-b替换为等量27-a（即16-b）、将化合物2-c替换为等量27-b，即可合成得到黄色固体化合物27（50 mg，收率50.5%）。 LCMS [M+H]+ = 551.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.80 (s, 1H), 8.25 (d, J = 6.0 Hz, 2H),8.07 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 7.95 - 7.92 (m, 4H), 7.73 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.33- 7.31 (m, 2H), 3.88 (s, 3H), 3.05 - 2.98 (m, 4H), 2.96 (s, 3H)。
实施例28：
合成路线：
参照实施例2，将化合物2-b替换为等量28-a（即16-b）、将化合物2-c替换为等量28-b，即可合成得到黄色固体化合物28（80 mg，收率76.9%）。 LCMS [M+H]+ = 579.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.80 (s, 1H), 8.25 (d, J = 6.4 Hz, 2H),8.05 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 7.94 - 7.91 (m, 4H), 7.73 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.33- 7.30 (m, 2H), 5.19 - 5.13 (m, 1H), 3.05 - 2.98 (m, 4H), 2.96 (s, 3H), 1.34(d, J = 4.8 Hz, 6H)。
实施例29：
合成路线：
参照实施例2，将化合物2-b替换为等量29-a（即16-b）、将化合物2-c替换为等量29-b，即可合成得到黄色固体化合物29（60 mg，收率56.3%）。 LCMS [M+H]+ = 593.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ12.80 (s, 1H), 8.25 (d, J = 6.4 Hz, 2H),8.06 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.93 - 7.90 (m, 4H), 7.73 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.33- 7.31 (m, 2H), 4.30 (t, J = 4.8 Hz, 2H), 3.05-2.99 (m, 4H), 2.96 (s, 3H),1.74 - 1.67 (m, 2H), 1.48 - 1.39 (m, 2H), 0.94 (t, J = 5.4 Hz, 3H)。
实施例30：
合成路线：
参照实施例2，将化合物2-b替换为等量30-a（即16-b）、将化合物2-c替换为等量30-b，即可合成得到黄色固体化合物30（55 mg，收率51.6%）。 LCMS [M+H]+ = 593.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ12.82 (s, 1H), 8.25 (d, J = 8.4 Hz, 2H),8.08 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.96 – 7.89 (m, 4H), 7.73 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.33(d, J = 7.6 Hz, 1H), 4.10 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 3.08 – 2.98 (m, 4H), 2.97 (s,3H), 2.12 – 1.99 (m, 1H), 0.99 (d, J = 6.8 Hz, 6H)。
实施例31：
合成路线：
参照实施例2，将化合物2-b替换为等量31-a（即16-b）、将化合物2-c替换为等量31-b，即可合成得到黄色固体化合物31（80mg，收率71.7%）。 LCMS [M+H]+ = 621.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ12.80 (s, 1H), 8.25 (d, J = 6.0 Hz, 2H),8.05 (d, J = 6.0 Hz, 2H), 7.95 - 7.91 (m, 4H), 7.73 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.33- 7.31 (m, 2H), 4.24 (d, J = 4.2 Hz, 2H), 3.05 - 2.98 (m, 4H), 2.96 (s, 3H),1.68 - 1.62 (m, 1H), 1.46 - 1.38 (m, 4H), 0.92 (t, J = 5.6 Hz, 6H)。
实施例32：
合成路线：
参照实施例2，将化合物2-b替换为等量32-a（即16-b）、将化合物2-c替换为等量32-b，即可合成得到黄色固体化合物32（78mg，收率70.2%）。 LCMS [M+H]+ = 595.1。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.99 (s, 1H), 8.18 (d, J = 8.0 Hz, 2H),8.03 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.76 – 7.66 (m, 5H), 7.23 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 4.55– 4.48 (m, 2H), 3.79 – 3.74 (m, 2H), 3.46 (s, 3H), 3.10 – 3.01 (m, 4H), 2.86(s, 3H)。
实施例33：
合成路线：
参照实施例2，将化合物2-b替换为等量33-a（即16-b）、将化合物2-c替换为等量33-b，即可合成得到黄色固体化合物33（43mg，收率66.2%）。 LCMS [M+H]+ = 609.1。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 9.97 (s, 1H), 8.18 (d, J = 8.0 Hz, 2H),8.03 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.78 – 7.65 (m, 5H), 7.23 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 4.57– 4.47 (m, 2H), 3.84 – 3.77 (m, 2H), 3.61 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.11 – 2.99(m, 4H), 2.86 (s, 3H), 1.26 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。
实施例34：
合成路线：
参照实施例2，将化合物2-b替换为等量34-a（即16-b）、将化合物2-c替换为等量34-b，即可合成得到黄色固体化合物34（27mg，收率31%）。 LCMS [M+H]+ = 650.1。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 8.15 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.08 (d, J = 8.0Hz, 2H), 7.82 – 7.67 (m, 5H), 7.27 (s, 2H), 4.57 – 4.46 (m, 2H), 3.75 (s, br,4H), 3.15 – 2.99 (m, 4H), 2.87 (s, 3H), 2.83 (s, 2H), 2.62 (s, 4H)。
实施例35：
合成路线：
参照实施例2，将化合物2-b替换为等量35-a（即16-b）、将化合物2-c替换为等量35-b，即可合成得到黄色固体化合物35（47mg，收率53.4%）。 LCMS [M+H]+ = 608.1。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ10.23 (s, 1H), 8.15 (d, J = 8.0 Hz, 2H),8.02 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.82 – 7.58 (m, 5H), 7.28 – 7.08 (m, 2H), 4.48 (t,J = 5.6 Hz, 2H), 3.16 – 2.97 (m, 4H), 2.85 (s, 3H), 2.78 (t, J = 5.6 Hz, 2H),2.38 (s, 6H)。
实施例36：
合成路线：
参照中间体M-a合成，将甲磺酰氯替换为等量乙酰氯、将碘甲烷替换为等量三氘代碘甲烷，得到中间体M-j，再参照实施例2，将化合物M-a替换为等量M-j、将化合物2-c替换为等量36-c，即可合成得到黄色固体化合物36（290 mg，收率83.8%）。 LCMS [M+H]+ = 529.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.81 (s, 1H), 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H),8.06 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.98 – 7.89 (m, 4H),7.76 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.26(s, 1H), 7.22 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.34 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.05 - 2.98 (m,4H), 1.82 (s, 3H), 1.34 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。
实施例37：
合成路线：
参照中间体M-a合成，将甲磺酰氯替换为等量1-甲氧基乙酰氯、将碘甲烷替换为等量三氘代碘甲烷，得到中间体M-k，再参照实施例2，将化合物M-a替换为等量M-k、将化合物2-c替换为等量37-c，即可合成得到黄色固体化合物37（33.7 mg，收率58.8%）。 LCMS [M+H]+ = 559.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.81 (s, 1H), 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H),8.07 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.98 – 7.88 (m, 4H), 7.75 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.27(s, 1H), 7.23 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 4.34 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.84 (s, 2H),3.21 (s, 3H), 3.04 - 3.00 (m, 4H), 1.34 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。
实施例38：
合成路线：
参照中间体M-a合成，将甲磺酰氯替换为等量乙基磺酰氯、将碘甲烷替换为等量三氘代碘甲烷，得到中间体M-l，再参照实施例2，将化合物M-a替换为等量M-l、将化合物2-c替换为等量38-c，即可合成得到黄色固体化合物38（3 mg，收率12.5%）。 LCMS [M+H]+ =579.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.82 (s, 1H), 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H),8.07 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.98 – 7.89 (m, 4H), 7.72 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.34- 7.32 (m, 2H), 4.34 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.16 (q, J = 7.6 Hz, 2H), 3.05 -2.97 (m, 4H), 1.34 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.22 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。
实施例39：
合成路线：
参照中间体M-a合成，将甲磺酰氯替换为等量丙基磺酰氯、将碘甲烷替换为等量三氘代碘甲烷，得到中间体M-m，再参照实施例2，将化合物M-a替换为等量M-m、将化合物2-c替换为等量38-c，即可合成得到黄色固体化合物39（3 mg，收率12.5%）。 LCMS [M+H]+ =593.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.82 (s, 1H), 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H),8.07 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.98 – 7.87 (m, 4H), 7.72 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.34- 7.32 (m, 2H), 4.34 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.12 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.05 -2.97 (m, 4H), 1.74 - 1.65 (m, 2H), 1.34 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.97 (t, J = 7.2Hz, 3H)。
实施例40：
合成路线：
参照中间体M-a合成，将甲磺酰氯替换为等量异丁基磺酰氯、将碘甲烷替换为等量三氘代碘甲烷，得到中间体M-n，再参照实施例2，将化合物M-a替换为等量M-n、将化合物2-c替换为等量40-c，即可合成得到黄色固体化合物40（15.2 mg，收率17.4%）。 LCMS [M+H]+ =607.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.82 (s, 1H), 8.25 (d, J = 8.4 Hz, 2H),8.07 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.98 – 7.89 (m, 4H), 7.72 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.34- 7.31 (m, 2H), 4.35 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.12 (t, J = 7.6 Hz, 2H), 3.05 -2.97 (m, 6H), 2.15 - 2.08 (m, 1H), 1.35 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 1.02 (s, 3H),1.00 (s, 3H)。
实施例41：
合成路线：
参照中间体M-a合成，将甲磺酰氯替换为等量三氟甲基磺酰氯、将碘甲烷替换为等量三氘代碘甲烷，得到中间体M-o，再参照实施例2，将化合物M-a替换为等量M-o、将化合物2-c替换为等量41-c，即可合成得到黄色固体化合物41（31.9 mg，收率41.8%）。 LCMS [M+H]+ = 619.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.85 (s, 1H), 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H),8.07 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.04 – 7.85 (m, 4H), 7.78 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.43- 7.38 (m, 2H), 4.34 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.06 - 3.01 (m, 4H), 1.34 (t, J =7.2 Hz, 3H)。
实施例42：
合成路线：
参照中间体M-a合成，将甲磺酰氯替换为等量环丙基磺酰氯、将碘甲烷替换为等量三氘代碘甲烷，得到中间体M-p，再参照实施例2，将化合物M-a替换为等量M-p、将化合物2-c替换为等量42-c，即可合成得到黄色固体化合物42（31.9 mg，收率41.8%）。 LCMS [M+H]+ =591.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.81 (s, 1H), 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H),8.06 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.97 – 7.89 (m, 4H), 7.73 (d, J = 8.8 Hz, 1H), 7.36- 7.34 (m, 2H), 4.34 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 3.05 - 2.98 (m, 4H), 2.73 - 2.66(m, 1H), 1.34 (t, J = 7.2 Hz, 3H), 0.99 - 0.95 (m, 2H), 0.86 - 0.82 (m, 2H)。
实施例43：
合成路线：
参照实施例42，将化合物42-c替换为等量43-b（化合物42-b与43-a为同一化合物），即可合成得到黄色固体化合物43（72.4 mg，收率60.8%）。 LCMS [M+H]+ = 676.1。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.25 (s, 1H), 8.14 (d, J = 7.6 Hz, 2H),8.02 (d, J = 7.2 Hz, 2H), 7.72 - 7.65 (m, 5H), 7.27 - 7.24 (m, 2H), 4.51 (t,J = 5.6 Hz, 2H), 3.74 (t, J = 4.0 Hz, 4H), 3.08 - 3.01 (m, 4H), 2.82 (t, J =5.6 Hz, 2H), 2.60 (t, J = 4.0 Hz, 4H), 2.40 - 2.33 (m, 1H), 1.12 - 1.08 (m,2H), 0.95 - 0.90 (m, 2H)。
实施例44：
合成路线：
参照中间体M-a合成，将甲磺酰氯替换为等量6-磺酰氯苯并[d]噻唑、将碘甲烷替换为等量三氘代碘甲烷，得到中间体M-q，再参照实施例2，将化合物M-a替换为等量M-q、将化合物2-c替换为等量44-c，即可合成得到黄色固体化合物44（47.9 mg，收率68.5%）。 LCMS[M+H]+ = 684.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.81 (s, 1H), 9.64 (s, 1H), 8.57 (s,1H), 8.28 – 8.15 (m, 3H), 8.06 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.04 – 7.85 (m, 4H), 7.65(d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.63 – 7.52 (m, 1H), 7.07 (s, 1H), 7.04 – 6.91 (m, 1H),4.34 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.95 (s, 4H), 1.34 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。
实施例45：
合成路线：
参照实施例44，将化合物44-c替换为等量45-b（化合物44-b与45-a为同一化合物），即可合成得到黄色固体化合物43（64.2 mg，收率55.8%）。 LCMS [M+H]+ = 769.1。
1H NMR (400 MHz, CDCl3) δ 10.07 (s, 1H), 9.20 (s, 1H), 8.27 (s, 1H),8.18 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 8.14 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.03 (d, J = 8.0 Hz, 2H),7.73 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.69 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 7.57 (d, J = 8.4 Hz, 1H),7.07 (s, 1H), 6.81 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 4.50 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 3.74 (t, J= 4.8 Hz, 4H), 3.01 (s, 4H), 2.81 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 2.60 (t, J = 4.4 Hz,4H)。
实施例46：
合成路线：
参照中间体M-a，将甲磺酰氯替换为等量苯磺酰氯、将碘甲烷替换为等量三氘代碘甲烷，合成得到中间体M-r，再参照实施例2，将化合物M-a替换为等量M-r、将化合物2-c替换为等量46-c，即可合成得到黄色固体化合物46（60.2 mg，收率77.9%）。 LCMS [M+H]+ =627.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.81 (s, 1H), 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H),8.07 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 8.02 – 7.85 (m, 4H), 7.71 (t, J = 7.2 Hz, 1H), 7.65(d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.61 - 7.53 (m, 4H), 7.04 (s, 1H), 7.01 – 6.85 (m, 1H),4.34 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.96 (s, 4H), 1.34 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。
实施例47：
合成路线：
参照中间体M-a合成，将甲磺酰氯替换为等量对甲苯磺酰氯、将碘甲烷替换为等量三氘代碘甲烷，得到中间体M-s，再参照实施例2，将化合物M-a替换为等量M-s、将化合物2-c替换为等量47-c，即可合成得到黄色固体化合物47（52.6 mg，收率72.9%）。 LCMS [M+H]+ =641.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.81 (s, 1H), 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H),8.07 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.04 – 7.85 (m, 4H), 7.65 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.44- 7.38 (m, 4H), 7.06 (s, 1H), 7.01 – 6.85 (m, 1H), 4.34 (q, J = 7.2 Hz, 2H),2.97 (s, 4H), 2.39 (s, 3H), 1.34 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。
实施例48：
合成路线：
参照中间体M-a合成，将甲磺酰氯替换为等量对氟苯磺酰氯、将碘甲烷替换为等量三氘代碘甲烷，得到中间体M-t，再参照实施例2，将化合物M-a替换为等量M-t、将化合物2-c替换为等量48-c，即可合成得到黄色固体化合物48（47.5 mg，收率72%）。 LCMS [M+H]+ =645.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.81 (s, 1H), 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H),8.07 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 8.04 – 7.85 (m, 4H), 7.66 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.62- 7.58 (m, 2H), 7.44 (t, J = 8.4 Hz, 2H), 7.06 (s, 1H), 7.01 – 6.85 (m, 1H),4.34 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.97 (s, 4H), 1.34 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。
实施例49：
合成路线：
参照中间体M-a合成，将甲磺酰氯替换为等量3-氰基-4-氟苯磺酰氯、将碘甲烷替换为等量三氘代碘甲烷，得到中间体M-u，再参照实施例2，将化合物M-a替换为等量M-u、将化合物2-c替换为等量49-c，即可合成得到黄色固体化合物49（47.4 mg，收率69%）。 LCMS[M+H]+ = 670.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.81 (s, 1H), 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H),8.23 – 8.11 (m, 1H), 8.07 (d, J = 8.4 Hz, 2H), 7.99 – 7.89 (m, 4H), 7.83 -7.78 (m, 1H), 7.72 (t, J = 8.0 Hz, 1H), 7.68 (d, J = 8.0 Hz, 1H), 7.09 (s,1H), 7.05 – 6.79 (m, 1H), 4.34 (q, J = 7.2 Hz, 2H), 2.98 (s, 4H), 1.34 (t, J= 7.2 Hz, 3H)。
实施例50：
合成路线：
参照中间体M-a合成，将甲磺酰氯替换为等量苄基磺酰氯、将碘甲烷替换为等量三氘代碘甲烷，得到中间体M-v，再参照实施例2，将化合物M-a替换为等量M-v、将化合物2-c替换为等量50-c，即可合成得到黄色固体化合物50（59.2 mg，收率37.7%）。 LCMS [M+H]+ =641.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.81 (s, 1H), 8.25 (d, J = 8.0 Hz, 2H),8.07 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.99 – 7.89 (m, 4H), 7.68 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.41-7.36 (m, 5H), 7.25 – 7.13 (m, 4H),, 7.09 (s, 1H), 4.55 (s, 2H), 4.34 (q, J =7.2 Hz, 2H), 2.98 (s, 4H), 1.34 (t, J = 7.2 Hz, 3H)。
实施例51：
合成路线：
参照实施例1，将化合物1-a替换成等量51-a，即可合成得到黄色固体化合物51（35mg，收率30%）。 LCMS [M+H]+ = 448.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.79 (s, 1H), 8.11 (d, J = 6.0 Hz, 2H),7.70 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.60 (d, J = 6.8 Hz, 2H), 7.32-7.29 (m, 2H), 3.22(s, 3H), 3.03-2.97 (m, 4H), 2.95 (s, 3H)。
实施例52：
合成路线：
参照实施例1，将化合物1-a替换成等量52-a，即可合成得到黄色固体化合物52（84mg，收率54%）。 LCMS [M+H]+ = 482.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.98 (s, 1H), 8.49 (s, 1H), 8.38 (d, J =6.0 Hz, 1H), 7.99 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.78 (t, J = 6.0 Hz, 1H), 7.71 (d, J =6.0 Hz, 1H), 7.32 (d, J = 4.4 Hz, 1H), 3.23 (s, 3H), 3.02-2.98 (m, 4H), 2.95(s, 3H)。
实施例53：
合成路线：
参照实施例1，将化合物1-a替换成等量53-a，即可合成得到黄色固体化合物53（70mg，收率45%）。 LCMS [M+H]+ = 432.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.72 (s, 1H), 8.20-8.17 (m, 2H), 7.71(d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.37 (t, J = 6.0 Hz, 2H), 7.32-7.29 (m, 2H), 3.23 (s,3H), 3.02-2.97 (m, 4H), 2.95 (s, 3H)。
实施例54：
合成路线：
参照实施例19，将化合物18替换成等量20，即可合成得到黄色固体化合物54（38mg，收率51%）。 LCMS [M+H]+ = 534.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.80 (s, 1H), 8.24 (d, J = 6.4 Hz, 2H),8.05 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 7.92 - 7.89 (m, 4H), 7.73 (d, J = 6.0 Hz, 1H), 7.32(d, J = 6.4 Hz, 2H), 3.24 (s, 3H), 3.05 - 2.99 (m, 4H), 2.96 (s, 3H)。
实施例55：
合成路线：
参照实施例4，将化合物2替换成等量54，即可合成得到黄色固体化合物55（20 mg，收率52.3%）。 LCMS [M+H]+ = 532.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 13.19 (s, 1H), 8.59 (d, J = 6.4 Hz, 1H),8.31 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 8.15 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 8.10 (s, 1H), 8.06 (d, J= 6.0 Hz, 2H), 7.97 - 7.91 (m, 4H), 7.87 (d, J = 6.4 Hz, 1H), 7.73 (d, J =6.8 Hz, 1H), 3.37 (s, 3H), 3.02 (s, 3H)。
实施例56：
合成路线：
参照实施例19，将化合物18替换成等量21，即可合成得到黄色固体化合物56（17mg，收率35.2%）。 LCMS [M+H]+ = 537.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.79 (s, 1H), 8.24 (d, J = 6.0 Hz, 2H),8.05 (d, J = 6.4 Hz, 2H), 7.91 (t, J = 5.6 Hz, 4H), 7.73 (d, J = 6.4 Hz, 1H),7.33 - 7.31 (m, 2H), 3.03 - 2.99 (m, 4H), 2.96 (s, 3H)。
实施例57：
合成路线：
参照实施例19，将化合物18替换成等量42，即可合成得到黄色固体化合物57（18.6mg，收率17.8%）。 LCMS [M+H]+ = 563.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.82 (s, 1H), 8.24 (d, J = 8.4 Hz, 2H),8.05 (d, J = 8.0 Hz, 2H), 7.93 - 7.90 (m, 4H), 7.73 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.36- 7.34 (m, 2H), 3.06 - 2.97 (m, 4H), 2.73 - 2.66 (m, 1H), 1.00 - 0.95 (m,2H), 0.86 - 0.82 (m, 2H)。
实施例58：
合成路线：
参照实施例19，将化合物18替换成等量44，即可合成得到黄色固体化合物58（2.8mg，收率2.6%）。 LCMS [M+H]+ = 656.1。
1H NMR (400 MHz, DMSO-d6) δ 12.83 (s, 1H), 9.64 (s, 1H), 8.58 (s,1H), 8.24 (d, J = 8.0 Hz, 3H), 8.05 (d, J = 7.6 Hz, 2H), 7.91 (t, J = 7.2 Hz,3H), 7.64 (d, J = 8.4 Hz, 1H), 7.59 (d, J = 7.6 Hz, 1H), 7.07 (s, 1H), 6.99(d, J = 8.0 Hz, 1H), 2.95 (s, 4H)。
COUP抑制剂对***癌细胞增殖活性的影响
1.方法
将***癌细胞LNCaP、PC-3、DU-145以1.5×104/well的密度接种于96孔板，置于5% CO2、37℃培养过夜。第二天，将化合物以100 uM为最高浓度，以3倍梯度稀释，共分10个浓度加入细胞培养液中继续处理24 h，共分2个复孔。
细胞经化合物处理24 h后，按照CellTiter 96® AQueous One Solution CellProliferation Assay试剂盒（Promega，G3580）说明书测定细胞活力，方法简述如下：每孔加入20 μL MTS试剂，混匀之后置于培养箱内37℃孵育1小时，用MD i3x多功能酶标仪测定吸光值，波长为490 nM。
以细胞活力评价化合物对细胞增殖的影响，使用GraphPad Prism8.0软件以三参数拟合剂量-反应曲线，计算IC50值。细胞活力=（样品的信号值-培养基对照的信号值)/(DMSO对照的信号值-培养基对照的信号值）×100%。抑制率=（1-细胞活力）×100%。
2.结果
*： IC50 > 10μM； **：10μM ≥ IC50 > 1μM； ***：1μM ≥ IC50 > 0.1μM； ****：0.1μM ≥ IC50
†：30 ≥ Max；††：50 ≥Max > 30；†††：70 ≥Max > 50；††††： Max > 70
总结：本发明提供的化合物对***癌细胞增殖普遍具有较好的抑制活性。
基于报告基因活性检测的方法检测化合物对COUP-TF II的抑制活性
1.方法
1.1 质粒共转染HEK293T细胞及化合物处理
质粒转染前一天将HEK293T细胞以1×104/well的密度接种于96孔板。按照转染试剂FμgENE® HD（Promega，# E2311）的说明书进行细胞转染。主要步骤为：以单孔为例，将质粒pCR3.1-COUP-TFII和pXP2-NGFIA-Luc按20ng和5 ng的比例加入10 μL的Opti-MEM™ I培养基（Gibco，#11058021）中混匀；再加入0.2 μL的FμgENE® HD，混匀后20℃静置5 min；再将此10 μL混合物加入至含100 μL培养液的细胞孔中。细胞共转染后6 h，将化合物以100uM为最高浓度，以半对数稀释倍数进行梯度稀释，共分10个浓度加入细胞培养液中进行处理24 h，共分2个复孔。
1.2 One-Glo Luciferase检测
细胞经化合物处理24 h后，按ONE-Glo® Luciferase Assay System（Promega，#E6120）说明书进行检测。主要步骤为：每孔吸弃50 μL培养液，再加入50 μL ONE-Glo®Luciferase试剂，20℃振荡10 min；取80 μL裂解反应液至白色不透光optiPlate-96孔板，用MD i3x多功能酶标仪检测萤火虫萤光素酶（Firefly luciferase）的发光信号值（Firefly-Luc）。以Firefly-Luc信号值作为化合物对COUP-TF II的抑制活性，并以溶剂DMSO组的比值进行归一化处理，使用GraphPad Prism8.0软件以三参数拟合剂量-反应曲线，计算EC50值。并以下列公式计算抑制率，抑制率=（1-化合物处理样本的Luc/DMSO组的Luc）×100%。使用VCT-8作为阳性对照化合物（WO2019/222134）。
2.结果
实验数据见下表。
*：20μM ≥ EC50 > 5μM； **：5μM ≥ EC50 > 1μM； ***：1μM ≥ EC50 > 0.1μM；
****：0.1μM ≥ EC50
†：20 ≥ Max；††：40 ≥ Max > 20；†††：70 ≥Max > 40；††††： Max > 70
总结：本发明提供的化合物对COUP-TFII普遍具有较好的抑制活性。
基于报告基因活性检测的方法检测化合物对NRF2的抑制活性
1.方法
1.1 质粒共转染HEK293T细胞及化合物处理
pGL4.37[luc2P/ARE]（Promega，#E3641）和pRL-TK（Promega，#E2241）质粒购自Promega；利用CaCl2法将质粒转化DH5α大肠杆菌，进一步培养扩增后用质粒抽提试剂盒（TIANGEN，#D107）纯化获得相应质粒DNA。质粒转染前一天将HEK293T细胞以1×104/well的密度接种于96孔板。按照转染试剂FμgENE® HD（Promega，# E2311）的说明书进行细胞转染。主要步骤为：以单孔为例，将质粒pGL4.37[luc2P/ARE]和pRL-TK按80ng和8 ng的比例加入10 μL的Opti-MEM™ I培养基（Gibco，#11058021）中混匀；再加入0.2 μL的FμgENE® HD，混匀后20℃静置5 min；再将此10 μL混合物加入至含100 μL培养液的细胞孔中。细胞共转染后6 h，将化合物以100 uM为最高浓度，以半对数稀释倍数进行梯度稀释，共分10个浓度加入细胞培养液中进行处理24 h，共分2个复孔。
1.2 Dual-Glo Luciferase检测
细胞经化合物处理24 h后，按Dual-Glo® Luciferase Assay System（Promega，#E2940）说明书进行检测。主要步骤为：每孔吸弃50 μL培养液，再加入50 μL Dual-Glo®Luciferase试剂，20℃振荡10 min；取80 μL裂解反应液至白色不透光optiPlate-96孔板，用MD i3x多功能酶标仪检测萤火虫萤光素酶（Firefly luciferase）的发光信号值（Firefly-Luc）；再加入40 μL Dual-Glo® Stop & Glo® 试剂，20℃振荡10 min；再用MDi3x多功能酶标仪检测海肾萤光素酶（Renilla luciferase）的发光信号值（Renilla-Luc）。以Firefly-Luc/Renilla-Luc的比值作为化合物对NRF2的抑制活性，并以溶剂DMSO组的比值进行归一化处理，使用GraphPad Prism8.0软件以三参数拟合剂量-反应曲线，计算EC50值。并以下列公式计算抑制率（inhibition ratio），抑制率=（1-化合物处理样本的Firefly-Luc/Renilla-Luc的比值/DMSO组的Firefly-Luc/Renilla-Luc的比值）×100%。
2.结果
实验数据见下表：
*： EC50 > 20μM； **：20μM ≥ EC50 > 10μM； ***：10μM ≥ EC50 > 1μM；****：1μM ≥ EC50；
†：20 ≥ Max；††：40 ≥ Max > 20；†††：70 ≥Max > 40；††††： Max > 70
总结：本发明提供的化合物对NRF2也具有较好的抑制活性。
药代动力学评价
在小鼠体内，评价化合物的生物利用度和药代动力学行为。选择6只体重相近的雄性ICR小鼠，其中3只小鼠单次灌胃给药10 mg/kg，3只小鼠以5 mg/kg的单剂量静脉内给药。在给药后5分钟（静脉给药）、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和7小时的时间点采集血样，通过LC-MS/MS分析血浆样品的浓度，并用PKSolver免费工具和非房室模型（NCA）软件分析化合物的药代动力学参数。
实验方案：
实验动物：每个化合物测试组包括6只健康雄性ICR小鼠，18-25 g，自CharlesRiver购买，随机分成2组，每组3只。
制剂制备：称取一定量的化合物，加入2% DMSO+15% Solutol+83%生理盐水中，制成澄清溶液。
剂量：ICR小鼠禁食过夜，并以10 mg/kg的灌胃剂量或5 mg/kg静脉内给药的剂量给予化合物。灌胃和静脉给药的给药体积分别为10 mL/kg和5 mL/kg。给药后2小时统一进食。
样本采集：给药后5分钟（静脉给药）、15分钟、30分钟、1小时、2小时、4小时和7小时通过大隐静脉采集约30 μL血液。将血液放入含有K2-EDTA的市售试管中，然后在4℃、4600rpm下将血液样品离心5分钟来获得血浆样品，然后将所有血浆样品在干冰上快速冷冻并保持在-70℃直到进行LC-MS/MS分析。
样品制备：吸取10 μL血浆样品，用含有50 nmol/L 的α-萘黄酮（内标）甲醇溶液进行沉淀，将混合物充分混合并在4℃以14000 rpm离心5分钟，然后取75 μL上清液与75 μL甲醇混合，用于LC-MS/MS分析。
药代动力学参数结果见表1。
表1
结论：此类化合物在小鼠体内吸收较好，消除适宜，暴露高，生物利用度较高，可供进一步研究。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
Claims (7)
1.一种苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物具有如下式I所示结构：
其中，A环选自苯环或者
，X选自-CH2-或-O-，n选自0、1或2，n为0时表示此处基团不存在，X与另一端直接相连，/>
表示并环结构的连接位点；
B环选自
中的任意一种；
R1选自自-H、-Me、-CD3、-Et、-i-Pr或-Bn中的任意一种；
R2选自
；
Y选自-CH=或-N=；
R3选自-H、-OH、-OMe、-OCD3、-F、-Cl或-CF3中的任意一种；
R4选自
中的任意一种；
Z选自-CH=或-N=；
Re选自-H、-CF3或-COORf中的任意一种；
Rf选自-H、-Me、-Et、-i-Pr、-n-Bu、-i-Bu、-CH2-CHEt2、-(CH2)2-OMe、-(CH2)2-NMe2或
中的任意一种；
Rg选自-Me或MeOCH2-，Rh选自-Me、-Et、-n-Pr、-i-Bu、-CF3、-Bn、
或/>
中的任意一种；Ri选自-H、-Me、-F或-CN中的任意一种；/>
表示基团的连接位点。
2.根据权利要求1所述的苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物选自如下式1-式58中的任意一种：
3.一种包含权利要求1或2所述的苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物或其药学上可接受的盐的药物组合物。
4.根据权利要求3所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的药用辅料。
5.一种根据权利要求1或2所述的苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物或其药学上可接受的盐或根据权利要求3或4所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防与COUP-TFII活性过高或者与COUP-TFII过度表达有关的疾病的药物中的应用。
6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述与COUP-TFII活性过高或者与COUP-TFII过度表达有关的疾病为***癌。
7.一种根据权利要求1或2所述的苯并多元环噻唑啉酰胺类化合物或其药学上可接受的盐或根据权利要求3或4所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防与NRF2活性过高或者与NRF2过度表达有关的疾病的药物中的应用。
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