CN115998736B

CN115998736B - Y-27632在特异性抑制幻觉作用中的应用

Info

Publication number: CN115998736B
Application number: CN202310310112.6A
Authority: CN
Inventors: 苏瑞斌; 孙毅; 王劭文; 周亚男; 邱亚楠; 曲颖
Original assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Current assignee: Academy of Military Medical Sciences AMMS of PLA
Priority date: 2023-03-28
Filing date: 2023-03-28
Publication date: 2023-06-23
Anticipated expiration: 2043-03-28
Also published as: CN115998736A

Abstract

本发明公开了Y‑27632在特异性抑制幻觉作用中的应用，本发明首次发现Y‑27632能够用于降低经典致幻剂在治疗或改善抑郁症、焦虑症等其他精神类疾病时所产生的副作用和不良反应，尤其是在降低经典致幻剂所导致的幻觉作用方面具有良好的应用前景。

Description

Y-27632在特异性抑制幻觉作用中的应用

技术领域

本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及Y-27632在特异性抑制幻觉作用中的应用。

背景技术

Y-27632是一种高效的、细胞可渗透的、可逆的、选择性的Rho相关蛋白激酶抑制剂，Y-27632的CAS NO.为146986-50-7，分子式为C₁₄H₂₁N₃O·HCl，相对分子量为320.3，是一种高效的Rho相关的卷曲蛋白形成丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶（ROCK）家族的小分子特异性抑制剂，能够选择性的抑制ROCK1（p160ROCK）和ROCK2，IC50（半数有效浓度）值分别为140nmol和800 nmol；并且，Y-27632也能够抑制PRK2，其IC50为600 nmol/L。其抑制作用是通过与ATP竞争结合催化位点来实现的。现有技术表明，Y-27632的功能主要包括以下几个方面：（1）选择性地抑制平滑肌钙离子敏感性并阻断其收缩，阻止Rho诱导的、p160ROCK介导的细胞张力纤维的形成；（2）降低几种高血压大鼠模型的血压；（3）保护艾氏腹水癌小鼠免于肿瘤的形成；（4）阻止肝癌肝内转移。

经典致幻剂是一类作用于5-HT受体的精神活性物质，主要通过激活5-HT_2A受体诱导感觉和情绪的变化以及幻觉作用。从本世纪初开始，有临床前及临床研究表明经典致幻剂具有改善抑郁症、焦虑症及尼古丁成瘾的作用，其中，经典致幻剂对多种不同类型的抑郁症均有治疗潜能，如难治性抑郁症、伴随焦虑的抑郁、单向抑郁症、重度抑郁症、疾病引起的焦虑和抑郁以及进食障碍者的抑郁情绪。然而，经典致幻剂所诱导的幻觉现象为其临床应用的主要阻碍之一，因此，如何能在保证经典致幻剂治疗效果的基础上抑制或减轻幻觉作用的产生为本领域尚待解决的重要问题。目前，尚未有特异性地抑制幻觉作用的试剂的相关报道，且关于经典致幻剂激活5-HT_2A受体诱导幻觉作用的分子机制仍不明确，亟需发现经典致幻剂诱导幻觉作用的具体分子作用机制及作用靶点，从而特异性地抑制幻觉作用，开发能够用于特异性抑制幻觉作用的药物。

本发明首次发现Y-27632能够特异性抑制幻觉作用，国内外尚未有相关的报道。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了Y-27632的新用途，即Y-27632在制备特异性抑制幻觉作用的药物中的新用途。本发明意外地发现Y-27632能够特异性抑制幻觉作用。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明的第一方面提供了一种用于特异性抑制幻觉的药物组合物。

进一步，所述药物组合物包含治疗有效量的Y-27632。

进一步，所述幻觉为5HT_2A受体介导的幻觉。

进一步，所述药物组合物还包含药学上可接受的缓冲液、载体和/或赋形剂。

进一步，所述缓冲液包括Trizma、Bicine、Tricine、MOPS、MOPSO、MOBS、Tris、Hepes、HEPBS、MES、磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、柠檬酸盐、乙醇酸盐、乳酸盐、硼酸盐、ACES、ADA、酒石酸盐、AMP、AMPD、AMPSO、BES、CABS、卡可酸盐、CHES、DIPSO、EPPS、乙醇胺、甘氨酸、HEPPSO、咪唑、咪唑乳酸、PIPES、SSC、SSPE、POPSO、TAPS、TABS、TAPSO、TES。

进一步，所述载体包括等渗试剂、抗氧化剂、悬浮剂、分散剂、乳化剂、螯合剂、增稠剂、增溶剂。

进一步，所述赋形剂包括碳水化合物、聚合物、脂质、矿物。

在本发明中，所述Y-27632为一种Rho相关蛋白激酶抑制剂，在本发明的具体实施方案中，所述Y-27632优选为购自于上海陶术生物科技有限公司、货号为T1725的Y-27632。

在本发明中，所述幻觉为5HT_2A受体介导的幻觉，即经典致幻剂作用于5-HT受体，通过激活5-HT_2A受体诱导产生的幻觉作用。所述经典致幻剂包括但不限于：2,5-二甲氧基-4-甲基***（DOM）、赛洛西滨（Psilocybin）、赛洛辛（Psilocin）、2,5-二甲氧基-4-碘***（DOI）、麦角酰二乙胺（LSD）、N,N-二甲基色胺（DMT）。此外，所述幻觉作用并不局限于经典致幻剂诱导产生的幻觉作用，其他致幻剂（例如，酒精、***、***等）诱导产生的病理性的幻觉作用均在本发明所述的经典致幻剂的保护范围内。

进一步，在本发明的具体实施方案中，本发明以经典致幻剂DOM或Psilocin诱导的甩头小鼠模型为例，代表性地研究了本发明所述的Y-27632对致幻剂诱导的幻觉作用的影响，所述致幻剂并不局限于本发明所列出的具体致幻剂，只要是能够引起幻觉作用的致幻剂均在本发明的保护范围内。在本发明的具体实施方案中，所述致幻剂优选为作用于5-HT受体通过激活5-HT_2A受体诱导产生幻觉作用的经典致幻剂。

进一步，本发明所采用的甩头小鼠模型是目前本领域最常用的研究致幻行为的动物模型。甩头反应（HTR）是一种头部快速的左右旋转行为，在给予大鼠和小鼠5-羟色胺能致幻剂或其他5-HT_2A激动剂后出现，甩头反应被广泛用作5-HT_2A受体激活的行为测定。小鼠的甩头反应效果和人类致幻效果之间存在很强的正相关性，也即甩头反应能够指征幻觉行为的产生。

进一步，所述药学上可接受的缓冲液、载体和/或赋形剂在Remington'sPharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)中有详细的记载，这些物质根据需要用于帮助药物的稳定性或有助于提高药物中的有效活性成分的活性，在这种药物组合物中可以使用的有效成分可以是其原始化合物本身的形式，或任选地使用其药物学可接受的盐的形式，如此配制的药物组合物根据需要可选择本领域技术人员已知的任何适当的方式将药物组合物进行给药。

进一步，药学上可接受的缓冲液、载体和/或赋形剂可另外含有液体，诸如水、生理盐水、甘油和乙醇。另外，诸如湿润剂或乳化剂或pH缓冲物质的辅助物质可存在于所述组合物中。这些载剂使得药物组合物能够配制成片剂、丸剂、糖衣丸、胶囊、液体、凝胶、糖浆、浆液和悬浮液，以便患者摄入。

进一步，合适的施用形式包括适用于肠胃外施用的形式，例如通过注射或输注，例如通过快速注射或连续输液、静脉内、可吸入或皮下形式。在产品用于注射或输注的情况下，其可采用在油性或水性媒介物中的悬浮液、溶液或乳液的形式并且其可含有配制试剂，诸如悬浮剂、防腐剂、稳定剂和/或分散剂。可替代地，根据本发明所述的药物组合物可呈干燥形式，用于在使用之前用合适的无菌液体重构。还可制备适于在注射前溶解或悬浮于液体媒介物中的固体形式。

进一步，所述药物组合物可以方便地以单位剂量形式存在，并且可以通过制药领域熟知的任何方法制备。可与载体材料组合产生单一剂型的活性成分的量将根据被治疗的受试者以及特定的给予方式而变化。可与载体材料组合产生单一剂型的活性成分的量通常为产生治疗效果的Y-27632的量。通常，在100%中，该量的范围将为约1%至约90%的活性成分，优选约5%至约70%，最优选约10%至约30%。

进一步，制备上述这些药物组合物的方法包括将Y-27632与载体和任选的一种或多种辅助成分结合的步骤。通常，药物组合物可通过将Y-27632与液体载体或细分固体载体或两者均匀紧密结合，然后在必要时成型产品而制备。其中，适合于口服给予的药物组合物可以是胶囊剂、扁囊剂、香囊剂、丸剂、片剂、锭剂（使用矫味基料，通常为蔗糖和***胶或黄蓍胶）、散剂、颗粒剂、或水性或非水性液体中的溶液剂或混悬剂、或水包油或油包水液体乳剂、或酏剂或糖浆剂、或含片剂（使用惰性基质，例如明胶和甘油、或蔗糖和***胶）和/或漱口等形式，每种形式均含有预定量的Y-27632作为活性成分。

在本发明中，所述治疗有效量是指提供一种或多种化合物被施用的特定药理作用的剂量。需要强调的是，治疗有效量在实现给定受试者中预期效果中并不总是有效的，即使该剂量被本领域技术人员认为是治疗有效量。仅为方便起见，在本发明的实施例中仅以动物模型为例提供了示例性剂量。本领域技术人员可以根据治疗具体受试者所需要的标准实践调整这样的量。治疗有效量可以基于施用途径和剂型、受试者的年龄和体重，和/或受试者病症的严重程度而变化。例如，本领域技术人员将理解，对于治疗小个体的治疗有效量可以与治疗大个体的治疗有效量不同。在治疗幻觉的背景下，幻觉的类型和促进幻觉的任何潜在的病理生理学可与治疗有效所需的剂量有关。

进一步，在一些实施方案中，所述药物组合物还可与另外的活性成分联合用于抑制幻觉中，所述另外的活性成分是指用于治疗幻觉的物质，所述物质选自典型抗精神病药，诸如氯丙嗪、氟奋乃静、氟哌啶醇、奋乃静、硫利达嗪、替沃噻吨和三氟拉嗪；非典型抗精神病药，诸如阿立哌唑、月桂酰阿立哌唑、阿塞那平、氯氮平、伊潘立酮、鲁拉西酮、奥氮平、帕潘立酮、喹硫平、利培酮、匹莫范色林和齐拉西酮。

本发明的第二方面提供了Y-27632在制备用于特异性抑制幻觉的药物中的应用。

进一步，所述幻觉为5HT_2A受体介导的幻觉。

进一步，所述药物包含治疗有效量的Y-27632。

进一步，所述药物还包含药学上可接受的缓冲液、载体和/或赋形剂。

此外，本发明还提供了一种治疗幻觉的方法，所述方法包括如下步骤：给有需要的受试者施用有效量的Y-27632或本发明第一方面所述的药物组合物以特异性地抑制幻觉作用。

进一步，所述受试者、患者或个体是指任何受试者、患者或个体，诸如患有幻觉或处于患幻觉风险的受试者，所述幻觉优选为5HT_2A受体介导的幻觉，并且这些术语本文中可互换使用。所述受试者、患者或个体包括哺乳动物，在本发明的具体实施方案中，所述受试者优选为人。

在本发明中，所述治疗、改善或减轻是指用于获得有益的或期望的结果的方法，在本文中可以互换使用，所述有益的或期望的结果包括但不限于：治疗益处和/或预防益处。治疗益处意为正在治疗的潜在紊乱的根除或改善。此外，用与潜在紊乱有关的生理症状中的一种或更多种的根除或改善实现治疗益处，使得尽管患者仍可能患有潜在紊乱，但是在患者中观察到改善。为了预防益处，可以将药物和/或药物组合物施用至处于发展特定疾病的风险中的患者，或施用至报告疾病的生理症状中的一种或更多种的患者，即使此疾病的诊断可能还未完成。

本发明相对于现有技术具有的优点和有益效果如下：

本发明意外地发现Y-27632能够特异性抑制幻觉作用，可用于降低经典致幻剂在治疗或改善抑郁症、焦虑症等其他精神类疾病时所产生的副作用和不良反应，尤其是在降低经典致幻剂所导致的幻觉作用方面具有良好的应用前景。

附图说明

图1为经典致幻剂DOM和Psilocin、非致幻型5-HT_2A受体激动剂Lisuride和TBG腹腔给药小鼠后大脑皮层中Nogo-A和RhoA蛋白表达量变化的结果图；

图2为经典致幻剂DOM和Psilocin、非致幻型5-HT_2A受体激动剂Lisuride和TBG腹腔给药小鼠后大脑皮层中Nogo-A和RhoA蛋白磷酸化变化的结果图；

图3为Y-27632对经典致幻剂DOM诱导的小鼠甩头行为的影响结果图，其中，每组n=8-10，数据表示为平均值±SEM，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，数据使用单因素方差分析（One way ANOVA）和Dunnett's检验进行分析；

图4为Y-27632对经典致幻剂Psilocin诱导的小鼠甩头行为的影响结果图，其中，每组n=8-10，数据表示为平均值±SEM，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，数据使用单因素方差分析（One way ANOVA）和Dunnett's检验进行分析；

图5为P75 NTR抑制剂TAT-Pep5对经典致幻剂DOM诱导的小鼠甩头行为的影响结果图，其中，每组n=6，数据表示为平均值±SEM，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001，****P<0.0001，数据使用单因素方差分析（One way ANOVA）和Dunnett's检验进行分析。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1 Western Blot检测致幻剂作用后Nogo-A、RhoA的变化

1、实验材料

本实施例中使用到的实验试剂、实验抗体和实验仪器分别见下表1-3。

本实施例中主要试剂配置：

10×电泳液running buffer：将电泳液：双蒸水按1：9配置。

10×电转液transfer buffer：将电转液：甲醇：双蒸水按1：2：7配置。

10×TBST：将TBST：双蒸水按1：9配置。

5%脱脂奶粉：取2 g脱脂奶粉，加40 mL的1×TBST充分溶解。

5% BSA：取2 g BSA，加40 mL的1×TBST充分溶解。

过硫酸铵：取1.00g过硫酸铵，溶于10 mL双蒸水中。

2、Western Blot检测致幻剂作用后Nogo-A、RhoA的变化

本实施例所采用的样品为经典致幻剂DOM（1 mg/kg）和Psilocin（0.5 mg/kg）和非致幻型5-HT_2A受体激动剂Lisuride（T61065-上海陶术生物科技有限公司）（0.1 mg/kg）和TBG（军事医学研究院毒物药物研究所合成）（20 mg/kg）腹腔给药小鼠（斯贝福(北京)生物技术有限公司，C57，雄性，18-22 g，6-8周）后10 min时大脑皮层的蛋白提取物。采用Western Blot实验检测上述样品中Nogo-A和RhoA蛋白的表达量变化。具体Western Blot实验方法如下：

（1）制胶

①选下缘平滑的玻璃板，清洗玻璃板和梳子后使用蒸馏水冲洗并吹干。

②厚、薄两块玻璃板对齐后放入夹中卡紧，垂直卡在架子。操作时要使两块玻璃板下边缘对齐，以免漏胶。

③按聚丙烯酰胺凝胶配方配制所需的分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。10%分离胶配方见下表4，5%浓缩胶的配方见下表5。

（2）灌胶与上样

①灌胶时，用枪沿玻璃板一侧加入，待胶面升到距离短板上沿15 mm左右即可。然后加一层水，液封后的胶面凝的更快。灌胶时开始可快一些，胶面快达所需高度时要放慢速度。胶水液封是要很慢并且从左到右均匀一层，否则胶会被冲变型。

②当水和胶之间有一条折线时（室温下，大约20 min），说明胶已凝。再等3 min使胶充分凝固就可倒去上层水并用滤纸吸干。

③按聚丙烯酰胺凝胶配方配制5%的浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间从一侧加入灌满浓缩胶然后将梳子***浓缩胶中。插梳子要使梳子一侧先插下去，再缓慢将另一侧插下，最后检查梳子是否水平。

④胶凝后，用蒸馏水冲洗一下凝胶，将其放入电泳槽中。薄玻璃板在内侧，厚玻璃板在外侧。若只跑一块胶，电泳槽的另一边要放置一块替代玻璃板的塑料板。

⑤将内槽加满新的电泳液后开始准备上样，内槽电泳液至少要没过内侧玻璃板，外槽加约3 cm高电泳液没过玻璃板下沿即可。两手分别捏住梳子的两边垂直向上轻轻将其拔岀，用l mL移液枪对加样孔进行吹打冲洗，加样是用移液器吸取样品，枪尖插至加样孔上方两板间隙处缓慢加入样品。未加样的孔需用1×loading buffer补齐。

（3）电泳

①选择恒压80V进行电泳，样品进入分离胶后可将电压调至120V加快速度。电泳至溴酚蓝跑到胶的下边缘即可终止电泳。

（4）转膜

①准备一块PVDF膜，面积略大于所要转印的胶面面积。转印一块胶需要8张薄滤纸或4张厚滤纸（8×10 cm）。如果是PVDF膜，使用前需用甲醇活化30-60 s且转膜液中配方含甲醇。

②在加有电转液的玻璃大皿里放入转膜用的夹子、两块海绵、滤纸和膜。将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵纸，用手按压海绵，赶出气泡，使电转液浸透海绵。在垫子上垫两层厚滤纸，一手固定滤纸一手赶去其中的气泡。

③将玻璃板撬掉后剥，切除下边缘由于挤压变形的胶，将浓缩胶剥离干净。小心剥离分离胶盖于滤纸上，轻轻用手赶去气泡，将膜盖于胶上，盖下后不可移动。再盖上滤纸，海绵，将夹子夹好。

④将夹子放入电转槽中，胶在负极，膜在正极（黑-黑，红-白）。利用冰块使电转体系处于低温环境中，200 mA恒流转移2 h。

⑤转完后用镊子将膜取出，用TBST冲洗1次，从边上倒，防止冲走蛋白。

（5）抗体孵育

①首先将膜置于封闭液（5%脱脂牛奶或BSA）中常温摇动1-4 h或4℃过夜。

②用5%的BSA将一抗按一定比例稀释。加入一抗稀释液，常温摇动1-4 h或4℃过夜。

③回收一抗，用TBST溶液常温下洗膜3-4次，每次5 min。

④用5%的牛奶将二抗按一定比例稀释（常用1：5000），加入二抗稀释液，常温摇床孵育1 h。

⑤弃二抗，用TBST洗3-4次，5 min/次。

（6）显影

①将膜蛋白面朝上置于黑板上，显影液A/B液1：1混匀（换枪头）后滴加在膜上，充分覆盖。

②将黑板放入曝光机器中，在白光条件下拍摄Marker，在自发光条件下曝光目的条带。

（7）数据统计

使用Photoshop、ImageJ以及GraphPad Prism进行数据分析。

3、实验结果

经典致幻剂DOM（1 mg/kg）和Psilocin（0.5 mg/kg）、非致幻型5-HT_2A受体激动剂Lisuride（0.1 mg/kg）和TBG（20 mg/kg）腹腔给药小鼠后10 min时大脑皮层的蛋白提取物中Nogo-A和RhoA蛋白的表达量变化结果见图1，结果显示，Nogo-A蛋白的变化量不明显，DOM和Psilocin给药后RhoA蛋白的量呈上调趋势。表明RhoA蛋白在经典致幻剂的急性作用中可能通过改变蛋白量而发挥作用，而Nogo-A蛋白可能不是通过改变蛋白量而发挥作用，而是可能通过蛋白修饰或其他形式的变化而发挥作用。

实施例2 Phos-tag凝胶电泳检测致幻剂作用后Nogo-A、RhoA的变化

1、实验材料

本实施例中使用到的实验试剂、实验抗体和实验仪器分别见下表6-8。

本实施例中的主要试剂配置：

1×电泳液running buffer：将电泳液：双蒸水按1：9配置。

1×电转液transfer buffer：将电转液：甲醇：双蒸水按1：2：7配置。

1×TBST：将TBST：双蒸水按1：9配置。

5%脱脂奶粉：取2 g脱脂奶粉，加40 mL的1×TBST充分溶解。

5% BSA：取2 g BSA，加40 mL的1×TBST充分溶解。

过硫酸铵：取1.00 g过硫酸铵，溶于10 mL双蒸水中。

Phosbind：10 mg Phosbind溶于0.10 mL甲醇和3.2 mL蒸馏水中。

10 mmol/L Mncl²⁺：10 mg溶于5 mL蒸馏水。

10 mmol/L EDTA：350 mg EDTA溶于120 mL电转液中。

2、实验方法

本实施例所采用的样品为经典致幻剂DOM（1 mg/kg）和Psilocin（0.5 mg/kg）和非致幻型5-HT_2A受体激动剂Lisuride（T61065-上海陶术生物科技有限公司）（0.1 mg/kg）和TBG（军事医学研究院毒物药物研究所合成）（20 mg/kg）腹腔给药小鼠（斯贝福(北京)生物技术有限公司，C57，雄性，18-22 g，6-8周）后10 min时大脑皮层的蛋白提取物。采用Phos-tag凝胶电泳检测上述样品中Nogo-A和RhoA蛋白的磷酸化变化。具体Phos-tag凝胶电泳检测实验方法如下：

（1）制胶

②厚、薄两块玻璃板对齐后放入夹中卡紧,垂直卡在架子。操作时要使两块玻璃板下边缘对齐，以免漏胶。

③按聚丙烯酰胺凝胶配方配制所需的分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。10%分离胶配方见下表9，5%浓缩胶的配方见下表10。

（2）灌胶与上样

（3）电泳

（4）洗膜

电泳后，转膜之前，需要使用螯合剂（EDTA）从凝胶中除去锰离子（Mn²⁺）。此步骤可提高磷酸化和非磷酸化蛋白转移到PVDF膜上的转移效率。

①电泳后，将凝胶在含有1-10 mmol/L EDTA的普通转移缓冲液中浸泡至少10分钟，同时轻轻摇动。（10分钟×1-3次）。根据凝胶厚度等调整EDTA缓冲液的处理时间和温度（例如：1.5 mm厚：处理20分钟×两次）。

②将凝胶在不含EDTA的普通转移缓冲液中浸泡10分钟，同时轻轻摇动（10分钟×1次）。

（5）转膜

②在加有电转液的玻璃大皿里放入转膜用的夹子、两块海绵、滤纸和膜。将夹子打开使黑的一面保持水平。在上面垫一张海绵纸，用手按压海绵，赶出气泡，使电转液浸透海绵。在垫子上垫两层厚滤纸，一手固定滤纸一手赶去其中的气泡

（6）抗体孵育

①首先将膜置于封闭液（5%脱脂牛奶或BSA）中常温摇动1-4h或4℃过夜。

③回收一抗，用TBST溶液常温下洗膜3-4次，每次5 min。

④用5%的牛奶将二抗按一定比例稀释（常用1:5000)，加入二抗稀释液，常温摇床孵育1 h。

⑤弃二抗，用TBST洗3-4次，5 min/次。

（7）显影

（8）数据统计

使用Photoshop、ImageJ以及GraphPad Prism进行数据分析。

3、实验结果

根据Phos-Tag实验原理，如同一种蛋白出现两条距离相近的条带，则上条带为发生磷酸化修饰的蛋白量，下条带为未发生磷酸化修饰的蛋白量。上、下两条条带为总的该蛋白的蛋白量。

检测经典致幻剂DOM（1 mg/kg）和Psilocin（0.5 mg/kg）、非致幻型5-HT2A受体激动剂Lisuride（0.1 mg/kg）和TBG（20 mg/kg）腹腔给药小鼠后，10分钟时小鼠大脑皮层的蛋白提取物样品中Nogo-A和RhoA蛋白的磷酸化变化结果图见图2，结果显示，Nogo-A蛋白仅检测到一条条带，则Nogo-A蛋白的磷酸化变化不明显。RhoA蛋白检测到两条条带，上面为发生磷酸化的蛋白量，下条带为未发生磷酸化变化的蛋白量，可以得到Psilocin组的RhoA磷酸化变化呈下降趋势。表明RhoA蛋白在经典致幻剂的急性作用中可能通过改变蛋白量以及发生磷酸化修饰而发挥作用。而Nogo-A蛋白可能不是通过磷酸化修饰而发挥作用。

实施例3 Y-27632对经典致幻剂诱导的幻觉作用的抑制研究

1、实验材料

实验动物：SPF级C57小鼠，雄性，体重20-22 g；由斯贝福（北京）生物技术有限公司提供，实验动物生产许可证，SCXK(京)2019-0010。实验动物饲养于军事医学研究院行为中心，8-10只/笼。12 h昼夜交替室温（22±2℃），湿度（40±20℃）%，自由饮水摄食，实验前适应环境三天。

实验试剂：本实施例中使用到的实验试剂见下表11。

实验器材：本实施例中使用到的实验器材见下表12。

本实施例中的主要试剂配置：

DOM溶液配置：称取适量样品溶于生理盐水，配置成0.1 mg/mL，适用于小鼠腹腔注射。

Psilocin溶液配置：称取适量样品溶于1% DMSO和99%生理盐水，配置成0.5 mg/mL，使用生理盐水稀释成0.05 mg/mL，适用于小鼠腹腔注射。

Rho激酶（ROCK）抑制剂Y-27632溶液配置：称取适量样品溶于生理盐水，配置成1mg/mL，梯度稀释成0.5 mg/mL和0.25 mg/mL，用于小鼠侧脑室注射。

P75 NTR抑制剂TAT-Pep5溶液配制：称取适量样品溶于生理盐水，配置成1 mg/mL，梯度稀释成0.2 mg/mL和0.04 mg/mL，用于小鼠侧脑室注射。

2、甩头反应实验验证Y-27632对经典抑制剂诱导的幻觉作用的抑制效果

（1）Y-27632对经典抑制剂诱导的幻觉作用的影响

甩头反应（HTR）是一种头部快速的左右旋转行为，在给予大鼠和小鼠5-羟色胺能致幻剂或其他5-HT_2A激动剂后出现，甩头反应被广泛用作5-HT_2A受体激活的行为测定。在经典致幻剂研究中，甩头反应是目前最常用的动物模型。小鼠的甩头反应效果和人类致幻效果之间存在很强的正相关性，也即甩头反应能够指征幻觉行为的产生。

本实施例中所述实验小鼠首先使用上述工具药物（Y-27632）进行侧脑室给药。等待30分钟后，腹腔注射经典致幻剂DOM或Psilocin。注射完毕后立即放入透明箱中进行甩头反应行为的观察并进行人工计数，行为测试进行15或30分钟。

其中，DOM的药物剂量为1 mg/kg，使用腹腔注射的方式进行注射；Psilocin的剂量为0.5 mg/kg，使用腹腔注射的方式进行注射。工具药物（Y-27632）选择低（1 nmol/5 μL）、中（10 nmol /5 μL）、高（20 nmol/5 μL）三个剂量，均使用侧脑室注射的方式进行注射，在致幻剂给药前30 min进行注射。侧脑室注射给药体积为5 μL，腹腔注射给药体积为0.2 mL/20 g。

（2）P75 NTR抑制剂TAT-Pep5对经典抑制剂诱导的幻觉作用的影响

本实施例进一步验证了P75 NTR抑制剂TAT-Pep5对经典致幻剂DOM诱导的小鼠甩头行为的影响。实验中DOM的药物剂量为1 mg/kg，使用腹腔注射的方式进行注射。TAT-Pep5选择低（0.2 μg/5 μL）、中（1 μg/5 μL）、高（5 μg/5 μL）三个剂量，均使用侧脑室注射的方式进行注射，在DOM给药前30 min进行注射。

3、实验结果

Y-27632对经典抑制剂诱导的幻觉作用的抑制效果见图3和图4，图3和图4中的左图显示Y-27632具有显著的甩头行为抑制作用，且呈现出剂量梯度式的变化，表明Y-27632能够显著抑制经典致幻剂诱导的小鼠甩头行为，也即本发明所述的Y-27632对经典致幻剂诱导的幻觉作用具有显著的抑制作用；图3和图4中的右图为甩头反应15或30分钟内的甩头次数变化，每5分钟累计计数一次，结果显示在致幻剂给药后大约5到10分钟时Y-27632给药组与对照组开始出现明显的甩头次数差异。以上结果进一步表明Y-27632能够应用于特异性抑制幻觉作用的药物的制备中。

P75 NTR抑制剂TAT-Pep5对经典致幻剂诱导的小鼠甩头行为影响的结果图见图5，图5中的左图显示低、中和高剂量的TAT-Pep对小鼠的甩头行为都没有明显的抑制或上调作用，表明在Nogo-A/RhoA信号通路中，P75 NTR受体及其下游的RhoA激活并不参与到幻觉效应中；图5中的右图为甩头实验30分钟内的甩头次数变化，每5分钟累计计数一次，可见四组的甩头次数曲线均没有明显的差异，也即并不是抑制Nogo-A/RhoA信号通路中的蛋白均能抑制幻觉作用。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims

1.Y-27632在制备用于特异性抑制致幻剂诱导产生的幻觉的药物中的应用，其特征在于，所述幻觉为5HT_2A受体介导的幻觉。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述药物包含治疗有效量的Y-27632。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述药物还包含药学上可接受的缓冲液、载体和/或赋形剂。