CN115993412A

CN115993412A - 一种秋水仙碱杂质f的hplc检测方法

Info

Publication number: CN115993412A
Application number: CN202211561955.5A
Authority: CN
Inventors: 朱兵; 徐海燕; 陈小星
Original assignee: Nanjing Huawe Medicine Technology Group Co Ltd
Current assignee: Nanjing Huawe Medicine Technology Group Co Ltd
Priority date: 2022-12-07
Filing date: 2022-12-07
Publication date: 2023-04-21

Abstract

本发明公开了一种秋水仙碱杂质F(去甲秋水仙碱)的HPLC检测方法。本发明具有较高的***适用性，同时在专属性、定量限、检测限、线性范围以及重复性上表现出无可拟比的优势，具有较高的精密度。

Description

一种秋水仙碱杂质F的HPLC检测方法

技术领域

本发明属于化学药物分析检测领域，具体涉及一种秋水仙碱杂质F的HPLC检测方法。

背景技术

秋水仙碱(Colchicine)为百合科植物丽江山慈菇Iphigenia indica KunthetBenth.的球茎中提取得到的一种生物碱，主要用于抗痛风病。本品在中国药典、欧洲药典和美国药典中均有收载，且各国药典秋水仙碱原料药标准均收载了杂质F，都采用与三价铁显色法检查。结构式分别如下：

显色法方法专属性差，无法给出具体杂质含量数值，片剂中由于辅料干扰，无法采用该法测定杂质F；另采用药典有关物质检查色谱条件，杂质F峰形差，积分不准确。本发明采用HPLC法测定秋水仙碱中杂质F的含量。峰形良好，专属性强，不受其他杂质干扰，方法可靠，能计算出杂质具体含量值。

发明内容

发明目的：本发明的目的是提供一种秋水仙碱及其片剂中杂质F的HPLC检测方法，使其专属性、定量限、检测限、线性范围、重复性、准确度等方面完全符合标准并且具有较高的精密度。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种秋水仙碱杂质F的HPLC检测方法，其特征在于，通过液相色谱法检测秋水仙碱及其片剂中杂质F的含量；

所述杂质F为去甲秋水仙碱，化学名称为N-(10-羟基-1,2,3-三甲氧基-9-氧代-5,6,7,9-四氢苯并[a]庚二烯-7-基)乙酰胺，结构式如下：

具体地，该检测方法采用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，采用溶液A-甲醇的混合溶液作为样品溶液的稀释剂和流动相进行等度洗脱，所述溶液A为依地酸二钠(又称乙二胺四乙酸二钠或EDTA-2Na)-磷酸-水的混合液。

具体地，本发明所提供的一种秋水仙碱中杂质F的HPLC检测方法，包括如下步骤：

a)配制原料药供试品溶液

精密称取秋水仙碱原料药置量瓶中，用稀释剂制成每1ml中含0.25mg秋水仙碱原料药的供试品溶液；

b)配制片剂供试品溶液

取秋水仙碱片，研细，精密称定适量，置量瓶中，加稀释剂制成每1ml中含0.25mg秋水仙碱的片剂供试品溶液；

c)配制对照品溶液

取杂质F对照品适量，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含2.5μg的溶液；

d)分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，采用外标法以峰面积计算供试品溶液中杂质F的含量。

具体地，所述步骤a)、b)、c)中的稀释剂为：溶液A-甲醇(55∶45)。

具体地，所述步骤d)中计算公式为：

其中：

式中：f—响应因子；m_S—对照品溶液中杂质B的称样量；c_S—杂质B的含量；V_S—对照品溶液中杂质B总稀释体积；A_S—对照品溶液色谱图中杂质B的峰面积f_平均—响应因子的平均值；A_i—供试品中杂质B的峰面积；m_i—供试品称样量；V_i—供试品稀释体积。

优选的，所述液相色谱的检测条件为：

色谱柱：Welch Xtimate C8色谱柱，规格为150mm×4.6mm，5μm；

流动相：溶液A-甲醇(55∶45)；

洗脱方式：等度洗脱；

流速：1.0ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：245nm；

进样量：20μL。

具体地，所述溶液A的配制方法为，取依地酸二钠100mg和磷酸2.0ml，加水溶解并稀释至1000ml，摇匀。

优选的，该检测方法最低能定量检测供试品中0.01％的杂质F。

具体地，该方法适用于需要进行秋水仙碱杂质F检测的秋水仙碱及含秋水仙碱的相关制剂，优选为秋水仙碱片剂。

有益效果：(1)本发明在溶剂和流动相中添加了磷酸和依地酸二钠，优化了杂质F峰形，同时避免杂质F与溶剂及色谱***中污染的金属离子络合，使杂质F对照品标准曲线的回归系数大于0.999。(2)本发明在专属性、定量限、检测限、线性范围、准确性以及精密度上表现出无可拟比的优势。

附图说明

图1是杂质F在流动相1(水-甲醇)体系下色谱图；

图2是杂质F在流动相2(0.2％磷酸溶液-甲醇)体系下色谱图；

图3是杂质F在流动相3(溶液A-甲醇)体系下色谱图；

图4是杂质F对照品的标准曲线图。

具体实施方式

为了加深对本发明的理解，下面将结合实施例和附图对本发明作进一步详述，该实施例仅用于解释本发明，并不构成对本发明保护范围的限定。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

依照本发明所述检测方法，主要针对杂质F的检测，用外标法进行计算。

本发明所述检测方法在实施方式中采用的仪器与试剂信息见下表：

实施例1

本实施例提供一种秋水仙碱中杂质F的HPLC检测方法。

1、检测方法

(1)配制稀释剂

取依地酸二钠100mg和磷酸2.0ml，加水溶解并稀释至1000ml，摇匀，配制成溶液A，溶液A-甲醇(55：45)。

(2)配制原料药供试品溶液

取秋水仙碱约25mg，精密称定，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀。

(3)配制片剂供试品溶液

取本品25片(约相当于含秋水仙碱25mg)，置100ml量瓶中，加稀释剂溶解并稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液。

(4)配制对照品溶液

取杂质F对照品适量，加稀释剂溶解并定量稀释制成每1ml中约含2.5μg的溶液。

(5)分别精密量取供试品溶液和对照品溶液，注入液相色谱仪，记录色谱图，采用外标法以峰面积计算供试品溶液中杂质F的含量。

2、色谱条件：

色谱柱：Welch Xtimate C8色谱柱，规格为150mm×4.6mm，5μm；

流动相：溶液A-甲醇(55∶45)；

洗脱方式：等度洗脱；

流速：1.0ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：245nm；

进样量：20μL。

3、杂质F含量计算公式

(1)

式中：f—响应因子；

ms—对照品溶液中杂质F的称样量；

cs—杂质F的含量；

Vs—对照品溶液中杂质F总稀释体积；

As—对照品溶液色谱图中杂质F的峰面积。

(2)

式中：f平均—响应因子的平均值；

Ai—供试品中杂质F的峰面积；

mi—供试品称样量；

Vi—供试品稀释体积。

实施例2

本实施例提供一种秋水仙碱中杂质F在流动相中水相为纯水、0.2％磷酸和溶液A的谱图差异，同时考察与秋水仙碱分离情况。

1、色谱条件：

色谱柱：Welch Xtimate C8色谱柱(150mm×4.6mm，5μm)

流动相1：水-甲醇(65∶35)

流动相2：0.2％磷酸-甲醇(55∶45)

流动相3：溶液A-甲醇(55∶45)

流速：1.0ml/min

柱温：25℃

检测波长：245nm；

进样量：10μl

2、供试品溶液：取秋水仙碱和杂质F各适量，分别用流动相1和2溶解稀释制成每1ml中分别约含秋水仙碱0.25mg和杂质F适量的溶液。

3、杂质F对照品溶液：取杂质F对照品，分别用流动相2和流动相3配制浓度为0.125～3.75μg/ml的梯度浓度作为各线性溶液。

按照实施例1的三个色谱条件测定流动相1、流动相2和流动相3制备的溶液，记录色谱图，见说明书附图1～3和表2。

表2：杂质F在不同水相中差异

结果：1、在上述3个色谱条件下，主成分秋水仙碱均不干扰杂质F检出，专属性良好。

2、杂质F在流动相1条件下，杂质F保留时间较长，峰形不佳；分析为杂质F中含有烯醇基，显弱酸性，可能部分解离，影响了峰形。在流动相2中添加磷酸并同时提高有机相比例，杂质F保留时间缩短至约8分钟，峰形有较大改善，说明杂质F的酸性解离收到了抑制。但在流动相2的条件下，杂质F的标准曲线回归系数r仅约0.98，分析溶液中部分杂质F可能与溶剂或者色谱***中的金属离子发生络合，影响了峰面积。在流动相3中添加强络合剂依地酸二钠，竞争性抑制杂质F与金属离子的络合，结果，杂质F的标准曲线回归系数r为0.9995，符合不低于0.999的要求。

实施例3：定量限和检测限试验

检测限(LOD)和定量限(LOQ)根据信噪比法来确定。将对照品溶液逐级稀释，测出的信号与基线噪音进行比较，计算出能被可靠检出的最低浓度，信噪比约为10:1时浓度为定量限浓度；信噪比约为3:1时浓度为检测限浓度。结果见表3。

表3：定量限和检测限结果

注：灵敏度＝杂质F定量限或检测限浓度/供试品浓度(0.25mg/ml)

杂质F在原料药和片剂中质控限度分别为0.15％和1.0％，定量限、检测限灵敏度低于杂质F质控限度的1/10以下，证明本发明的灵敏度良好。

实施例4：线性及范围检测

取杂质F适量，精密称定，用溶剂溶解并稀释成适宜浓度，作为杂质F储备液；取杂质F储备液定量稀释，分别制成供试品浓度的0.05％、0.2％、0.6％、1.2％和1.5％的溶液，作为各线性梯度浓度的供试品溶液。线性关系以测得的峰面积对被分析物浓度的函数作图，用最小二乘法进行线性回归，要求该线性回归系数r的数值应不小于0.999，结果见表4及图4。

表4：线性测定结果

注：截距比＝线性方程截距/1.0％浓度峰面积

由上表结果可知，发明所述检测方法针对杂质F在相对于供试品浓度0.05％～1.5％范围内线性相关系数r为0.9995，证明呈良好线性关系。

实施例5：对照品溶液进样精密度检测

取杂质F对照品溶液，连续测定6次，考察峰面积相对标准偏差。结果见表5。

表5：对照品溶液进样精密度试验结果

由上表结果可知，发明所述检测方法针对杂质F对照品溶液测定进样精密度，峰面积RSD小于2％，精密度良好。

实施例6：对照品和供试品溶液稳定性检测

取杂质F对照品溶液、原料药和片剂供试品溶液分别于0h、2h、4h、6h、8h、10h和12h进样20μl，记录色谱图，并计算杂质F峰面积相对标准偏差，试验结果见表6。

表6：对照品、供试品溶液稳定试验结果

时间	1.0％对照品	原料药供试品	片剂供试品
				0h	216819	<LOQ	<LOQ
2h	221798	<LOQ	<LOQ
				4h	220599	<LOQ	<LOQ
6h	219004	<LOQ	<LOQ
				8h	220105	<LOQ	<LOQ
10h	217378	<LOQ	<LOQ
				12h	215520	<LOQ	<LOQ
平均	218746	/	/
				RSD	1.03％	/	/

由上表可知，室温放置12小时，对照品溶液峰面积RSD<2.0％，供试品溶液检出杂质F小于定量限，溶液稳定性良好。

实施例7：重复性检测

取秋水仙碱原料药和片剂样品，按照本发明实施例1检测方法重复6次检测，来验证方法良好的精密度，结果见表7。

表7：重复性测试结果

编号	原料药供试品	片剂供试品
			A1	＜LOQ	＜LOQ
A2	＜LOQ	＜LOQ
			A3	＜LOQ	＜LOQ
A4	＜LOQ	＜LOQ
			A5	＜LOQ	＜LOQ
A6	＜LOQ	＜LOQ
			均值	/	/
RSD(％)	/	/

由上表可知，6次检测杂质F均低于检测限，证明该方法具有良好的精密度。

实施例8：中间精密度检测

取原料药和片剂样品，由不同人员在不同时间及不同仪器上，与实施例7重复性相同方法测定，比较两人测定结果的差异，结果见表8。

表8：中间精密度测试结果

由上表可知，不同人员在不同时间和不同仪器上测定的十二份供试品溶液中杂质F均低于定量限，该检测方法中间精密度良好。

实施例9：准确度检测

采用加样回收法测定，测定加标样品中杂质F的实际测定量与理论量之间的比值(回收率)，以百分率％表达，要求回收率在90％～110％之间，以证实方法具有良好的准确度，结果见表9。

表9：准确度试验结果

由上表可知，杂质F在原料药和片剂中各回收率在介于90.0％～110.0％，符合验证要求，证实了该方法具有良好的准确度；回收率RSD值小于10％，重复性良好。

综上所述，在专属性的试验中，供试品主成分峰及其杂质不影响杂质F检测。

在定量限的试验中，杂质F定量限浓度远低于质控限度(0.15％)；杂质F检测限浓度低于质控限度的1/10(0.01％)。

在线性范围的试验中，杂质F在相对于供试品浓度0.05％～1.5％范围内线性关系良好，相关系数r为0.9995，y轴截距相对限度浓度对照品峰面积的百分比远小于25％。

在准确度的试验中，杂质F的回收率在在90％～110％之间，RSD值小于10％。

在重复性的试验中，6份样品杂质F均小于LOQ。

在中间精密度的试验中，由不同试验人员，于不同日期，在不同仪器上分别测定的6份样品中杂质F含量均小于LOQ。

由此可知，本发明采用酸性含依地酸二钠流动相体系，优化了杂质F峰形，并抑制了溶液中杂质F与溶剂及色谱***中金属离子的络合，并且杂质F和秋水仙碱及其杂质能有效分离，峰型对称性较好，不受色谱***中微量金属离子污染物干扰导致的不对称峰形和数值异常的峰面积，利于杂质F的检出。同时在专属性、定量限、检测限、线性范围以及重复性上表现出无可拟比的优势，具有较高的精密度。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为发明的保护范围。

Claims

1.一种秋水仙碱杂质F的HPLC检测方法，其特征在于，通过色谱法检测秋水仙碱或秋水仙碱片剂中杂质F的含量；

所述杂质F为去甲秋水仙碱，结构式如下：

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述方法采用辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂的色谱柱，采用溶液A-甲醇的混合溶液作为样品溶液的稀释剂和流动相进行等度洗脱，所述溶液A为依地酸二钠-磷酸-水的混合液。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：

a)配制秋水仙碱原料药供试品溶液

精密称取秋水仙碱原料药置量瓶中，用稀释剂制成秋水仙碱原料药供试品溶液；

b)配制秋水仙碱片剂供试品溶液

取秋水仙碱片，研细，精密称定适量，置量瓶中，加稀释剂制成秋水仙碱片剂供试品溶液；

c)配制对照品溶液

取杂质F适量，加稀释剂溶解制成对照品溶液；

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述液相色谱的检测条件为：

色谱柱：Welch Xtimate C8色谱柱，规格为150mm×4.6mm，5μm；

流动相：体积比为55∶45的溶液A和甲醇的混合溶液；

洗脱方式：等度洗脱；

流速：1.0ml/min；

柱温：25℃；

检测波长：245nm；

进样量：20μL。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述溶液A的配制方法为，取依地酸二钠100mg和磷酸2.0ml，加水溶解并稀释至1000ml，摇匀。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，该检测方法最低可定量检测供试品中0.01％的杂质F。

7.根据权利要求1-6任一项所述的秋水仙碱杂质F的HPLC检测方法，该方法适用于需要进行秋水仙碱杂质F检测的秋水仙碱原料药及含秋水仙碱的相关制剂，优选为秋水仙碱片剂。