CN115991880B

CN115991880B - 一种树状大分子pamam-g5-tco及其制备方法与应用

Info

Publication number: CN115991880B
Application number: CN202211569194.8A
Authority: CN
Inventors: 尤启冬; 姜正羽; 毕欣宇; 金雨辉; 范静; 王茹嫣; 朱志伟; 王轩宇; 徐晓莉; 郭小可; 王磊
Original assignee: China Pharmaceutical University
Current assignee: China Pharmaceutical University
Priority date: 2022-12-08
Filing date: 2022-12-08
Publication date: 2024-03-19
Anticipated expiration: 2042-12-08
Also published as: CN115991880A

Abstract

本发明公开了一种树状大分子PAMAM‑G5‑TCO及其制备方法与应用，属于生物化学技术领域。本发明树状大分子PAMAM‑G5‑TCO为反式环辛烯修饰的聚酰胺PAMAM树状大分子。本发明还公开了一种即时终止靶蛋白降解的连接‑吸附***，所述***由可控蛋白水解靶向嵌合体和PAMAM‑G5‑TCO组成，所述可控蛋白水解靶向嵌合体是以四嗪基团为母核的化合物，所述PAMAM‑G5‑TCO通过逆电子Diels‑Alder反应形成PAMAM‑PROTACs，完全吸收可控蛋白水解靶向嵌合体，因此该***可以在活细胞中终止BET家族蛋白的降解。

Description

一种树状大分子PAMAM-G5-TCO及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物化学技术领域，具体涉及一种树状大分子PAMAM-G5-TCO及其制备方法与应用。

背景技术

近年来，靶向诱导蛋白降解技术(proteolysis targeting chimeras，PROTACs)作为一种新型的药物开发策略，以其独特的作用模式而蓬勃兴起并备受全球学术界和制药工业界的关注。PROTACs技术的最大特点是利用双功能缀合物调控体内蛋白质泛素化降解***，靶向诱导体内特定蛋白的降解，从而直接下调细胞内蛋白的含量。该技术充分利用体内泛素-蛋白酶体***实现特异性诱导靶标蛋白降解，解决了诱导蛋白质降解的选择性问题，也有望解决很多传统小分子难以靶向“难成药靶标”的问题。

PROTACs技术开发的初衷是降解传统意义上的“不可成药性”靶标，这类靶标包含了绝大部分骨架蛋白及部分转录因子。而PROTACs属于事件驱动型分子，在靶标蛋白的降解过程中，该技术所具备的催化性降解的特征也给功能性靶标带来了过度降解的风险。目前，降解过程的不可终止而导致的靶蛋白过度降解是PROTACs技术在应用过程中一直未能解决的重要问题之一。

近年来，有大量研究致力于通过引入刺激响应元件来开发可调控的PROTACs。许多细胞内外的刺激信号已被应用于构建可激活的PROTACs，包括：(1)外部光学信号；(2)肿瘤微环境的变化：hypoxia、氧化还原因子(如GSH)和肿瘤中过表达的特异性酶(如组织蛋白酶b，水解酶，脱氢酶等)，该策略能够有效缓解PROTAC药物潜在的组织外副作用。

到目前为止，针对可调控PROTACs研究主要集中于刺激响应元件，以激活型PROTACs为主，而针对终止过程的研究尚是空白。

发明内容

发明目的：本发明目的在于针对现有技术的不足，提供一种树状大分子PAMAM-G5-TCO及其制备方法与应用。本发明的PAMAM-G5-TCO是反式环辛烯修饰的聚酰胺PAMAM树状大分子，其通过逆电子Diels-Alder反应形成PAMAM-PROTACs，完全吸收可控蛋白水解靶向嵌合体，从而完全终止活细胞中的事件驱动型蛋白降解。

本发明可控蛋白水解靶向嵌合体(以下简称：“Tz-PROTACs”)为以四嗪基团为母核的化合物，该化合物可通过生物正交反应来实现靶向蛋白降解的终止调控，进而为终止PROTACs的降解过程提供一种切实可行的方案。

本发明针对事件驱动型蛋白降解过程开发了一种有效的即时终止策略。理想的终止策略需要有较高的反应速率及敏感度，能迅速彻底地清除细胞内亚化学计量的PROTACs分子。为实现这一目的，本发明设计了一个基于PAMAM树状大分子和逆电子Diels-Alder反应(IEDDA)的“连接-吸附”***：其中PAMAM树状大分子构成了一个完美的支架，其表面可被不同的功能性基团修饰。修饰过的PAMAM树状大分子可以通过生物正交反应吸收PROTACs，理论上IEDDA的高反应速率以及PAMAM分子表面的大量基团可以迅速彻底地清除胞内游离的PROTACs，从而完全终止活细胞中的事件驱动型蛋白降解。

技术方案：本发明的目的通过下述技术方案实现：

本发明提供了一种树状大分子PAMAM-G5-TCO，所述树状大分子PAMAM-G5-TCO为反式环辛烯修饰的聚酰胺PAMAM树状大分子，具有如下结构式：

本发明还提供了上述树状大分子PAMAM-G5-TCO的制备方法，包括以下步骤：

将PAMAM-G5-NH₂溶于有机溶剂，加入TCO-NHS-Ester溶液，搅拌反应，反应结束后将反应液进行纯水透析，收集透析液冷冻干燥即得PAMAM-G5-TCO产物。

优选地，所述有机溶剂选自甲醇。

优选地，所述搅拌反应的温度为室温，搅拌反应的时间为0.5～1h。

本发明还提供了上述树状大分子PAMAM-G5-TCO在终止靶向蛋白降解中的应用。

本发明提供了一种即时终止靶蛋白降解的连接-吸附***，所述***由PAMAM-G5-TCO与可控蛋白水解靶向嵌合体组成，所述可控蛋白水解靶向嵌合体是以四嗪基团为母核的化合物，所述PAMAM-G5-TCO通过逆电子Diels-Alder反应形成PAMAM-PROTACs，完全吸收可控蛋白水解靶向嵌合体。

优选地，所述可控蛋白水解靶向嵌合体具有通式I所示的结构式：

其中，

R₁选自

R₂选自

n＝1～3。

进一步地，所述可控蛋白水解靶向嵌合体选自：

其中，n＝1～3。

更进一步地，本发明可控蛋白水解靶向嵌合体优选n＝1时的化合物。

本发明基于四嗪与反式环辛烯的生物正交反应，设计了“连接-吸附”***。四嗪基团是一个小体积的连接片段，能够很容易地嵌入PROTACs分子中构建异双功能分子。同时，第五代PAMAM树状大分子是一种商业化的、高度分枝的、单分散的球形纳米材料。该材料具有完美的球型骨架，而巨大的分子表面能够修饰大量功能性片段。理论上，PAMAM-G5-TCO可以通过IEDDA反应形成PAMAM-PROTACs，从而完全吸收Tz-PROTACs。由于IEDDA的快速反应性和PAMAM-G5-TCO大分子表面的众多基团，使得细胞内游离的PROTACs可以迅速完全被清除，从而终止活细胞中的事件驱动降解。

本发明一种具体的优选实施方式是：

称取50mg PAMAM-G5-NH₂溶于3mL甲醇，加入1mL TCO-NHS-Ester(40eq.)甲醇溶液，室温下搅拌反应0.5小时，反应结束后将反应液转移至透析袋(截留分子量2kDa)中，纯水透析24小时，收集透析液冷冻干燥即得PAMAM-G5-TCO产物。

有益效果：

(1)本发明提供了一种反式环辛烯修饰的聚酰胺PAMAM树状大分子PAMAM-G5-TCO，其是一类具有生物正交活性的树枝状分子。该分子为球状结构，具有一定的刚性和稳定的三级结构。同时，该分子毒性低，水溶性高，透膜性良好，具有良好的生物相容性。可用于体内终止事件驱动型过程。

(2)本发明制备方法操作简单，反应条件温和，易于纯化，所用的合成原料均为环境友好型材料。

(3)本发明提供了一种即时终止靶蛋白降解的连接-吸附***。本发明选择BET家族蛋白作为靶蛋白来验证“连接-吸附”策略的概念，实验结果表明“连接-吸附”***可以在活细胞中终止BET家族蛋白的降解。

(4)本发明提供了一种基于生物正交原理的可控蛋白水解靶向嵌合体，该类蛋白水解靶向嵌合体能够可控调节细胞内特定靶蛋白水平。与已报道的蛋白水解靶向嵌合体相比，本发明化合物在高效降解靶蛋白的基础上，可即时终止降解过程，能够实现细胞内靶蛋白水平的自由调节。

附图说明

图1为PAMAM-G5-TCO树枝状化合物TEM图像；

图2为PAMAM-G5-TCO的Zeta电位示意图；

图3为利用免疫印迹法筛选TCB和TCP系列的优势化合物；

图4为TCB-2对BET家族蛋白浓度依赖性降解的免疫印迹检测图；

图5为TCP-1对PARP蛋白浓度依赖性降解的免疫印迹检测图；

图6为TCB-2对BET家族蛋白时间依赖性降解的免疫印迹检测图；

图7为TCP-1对PARP蛋白时间依赖性降解的免疫印迹检测图；

图8为TCB-2诱导BET家族蛋白降解机制的免疫印迹检测图；

图9为流式细胞仪检测不同浓度的TCB-2对MV-4-11细胞系细胞凋亡的影响效果；

图10为TCB-2和(+)-JQ-1对MV-4-11细胞系的抗细胞增殖活性；

图11为HPLC定量分析PAMAM-G5-TCO和TCB-2之间的click反应；

图12为不同当量PAMAM-G5-TCO对TCB-2靶标抑制活性的影响；

图13为(+)-JQ-1、TCB-2和TCB-2+PAMAM-G5-TCO的FP测定；

图14为用TCB-2和不同比例的TCB-2+PAMAM-G5-TCO处理24小时的MV-4-11细胞中BET家族蛋白的免疫检测印迹图；

图15为TCB-2和TCB-2：PAMAM-G5-TCO(1：3)对BET家族蛋白浓度依赖性降解的免疫印迹检测图；

图16为TCB-2和TCB-2：PAMAM-G5-TCO(1：3)对BET家族蛋白时间依赖性降解的免疫印迹检测图；

图17为TCB-2和TCB-2：PAMAM-G5-TCO(1：3)对PARP蛋白浓度依赖性降解的免疫印迹检测图；

图18为TCB-2和TCB-2：PAMAM-G5-TCO(1：3)对PARP蛋白时间依赖性降解的免疫印迹检测图；

图19为PAMAM-G5-TCO终止SW620细胞中PARP蛋白降解的免疫印迹检测图。

图20为流式细胞仪检测(+)-JQ-1，TCB-2和TCB-2+PAMAM-G5-TCO对MV-4-11细胞系细胞凋亡的影响；

图21为(+)-JQ-1，TCB-2和TCB-2+PAMAM-G5-TCO对MV-4-11细胞系的抗细胞增殖活性。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明技术方案进行详细说明，但是本发明的保护范围不局限于所述实施例。

除另有说明外，从商业供应商处购买的所有化学品均按原样使用。化学试剂均为市售的化学纯或者分析纯。所有溶剂均为试剂级，必要时通过标准方法纯化和干燥。所有反应均在可视化的硅胶板(GF-254)上进行薄层色谱(TLC)监测。

¹H-NMR、¹³C-NMR图谱由Bruker AV 300型(300MHz)核磁共振仪测定，TMS为内标物，使用CDCl3、CD3OD或DMSO-d6为溶剂，记录的化学位移(δ)为四甲基硅烷(TMS)的百万分率(ppm)。质谱由Advion Expression LCMS型质谱仪(ESI-MS)、Water Q-Tof型质谱仪(HRMS)测定。

纯度由岛津Reservoir Tray型HPLC测定。色谱柱为Agilent C18(4.6×250mm,5μm)型反相柱；流动相采用色谱甲醇:水＝8:2，流速为1.0mL/min。洗脱剂为石油醚(沸程60～90℃)和乙酸乙酯、二氯甲烷和甲醇。

以下实施例1-9为PROTAC分子的合成和结构确证。

实施例1：2-((S)-4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂-6-基)-N-((6-(4-(2-(2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙基)氨基)-2-氧乙基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基-甲基)氨基甲酰胺(TCB-1，化合物11a)的合成

1、2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-5-氟异吲哚啉-1,3-二酮(化合物2)

将化合物1(1.0g，6mmol)，3-氨基哌啶-2,6-二酮盐酸盐(1.0g，6mmol)和醋酸钠(0.6g，7.2mmol)溶于冰醋酸(15mL)中。60℃反应10小时后，将反应液倒入饱和食盐水(500mL)中，用碳酸氢钠调节pH至中性，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，有机相经柱色谱分离(DCM)纯化得到化合物2，为灰色固体(1.04g，39.2％)。

¹HNMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.18(s,1H),7.97(ddd,J＝8.4,7.3,4.6Hz,1H),7.84–7.71(m,2H),5.18(dd,J＝12.9,5.4Hz,1H),2.91(ddd,J＝17.3,14.0,5.3Hz,1H),2.67–2.57(m,1H),2.55(d,J＝4.4Hz,1H),2.07(ddt,J＝13.2,5.6,2.7Hz,1H)。

2、(2-((2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物3)

将化合物2(500mg，1.81mmol)和(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(289mg，1.81mmol)溶于DMF(7mL)中，加入碳酸钾(750mg，5.4mmol)。90℃反应10小时后，将反应液倒入饱和盐水(500mL)中，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝200:1)纯化得到化合物3，为绿色固体(399.04mg，53.05％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.12(s,1H),7.60(t,J＝7.8Hz,1H),7.16(d,J＝8.6Hz,1H),7.08–6.97(m,2H),6.74(t,J＝6.1Hz,1H),5.07(dd,J＝12.8,5.4Hz,1H),3.38(d,J＝6.0Hz,2H),3.13(q,J＝6.1Hz,2H),2.91(ddd,J＝18.6,14.1,5.2Hz,1H),2.61(d,J＝12.4Hz,1H),2.57(d,J＝3.7Hz,1H),2.03(d,J＝12.1Hz,1H),1.38(s,9H)。

3、2-(4-(6-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)乙酸(化合物5)

将(氰基甲基)氨基甲酸叔丁酯(14.0g，89.74mmol)和化合物4(1.9g，11.8mmol)溶于DMSO(4.5mL)中。冰浴下逐滴加入3-巯基丙酸(1.25g，11.8mmol)和水合肼(9.4g，188.82mmol)，氮气保护下搅拌12小时。将反应液滴入到亚硝酸钠(18.9g，177.02mmol)溶液中，用1M稀盐酸调节pH＝4，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取，然后用碳酸氢钠溶液洗涤，用1M稀盐酸将pH调节＝3，并用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝200:1)纯化得到化合物5，为粉色固体(1.23g，30.16％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.51(s,1H),8.46(d,J＝8.0Hz,2H),7.72(t,J＝6.0Hz,1H),7.59(d,J＝8.1Hz,2H),4.78(d,J＝5.9Hz,2H),3.77(s,2H),1.42(s,9H)。

4、(6-(4-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(化合物6)

将化合物3(3,81mg，0.19mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。室温下搅拌8小时后，反应液经减压蒸馏得到绿色固体。将绿色固体和化合物5(5.67mg，0.19mmol)溶于DMF(5mL)中，冰浴下逐滴加入DIEA(49mg，0.38mmol)和pyBop(128mg，0.24mmol)的DMF(5mL)溶液。室温搅拌12小时后，将反应液倒入饱和食盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝50:1)纯化得到化合物6，为粉色固体(76.72mg，62.29％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.12(s,1H),8.42(d,J＝7.9Hz,3H),7.73(t,J＝5.9Hz,1H),7.61–7.52(m,3H),7.18(d,J＝8.6Hz,1H),7.03(d,J＝7.0Hz,1H),6.78(t,J＝6.1Hz,1H),5.08(dd,J＝12.8,5.3Hz,1H),4.78(d,J＝5.9Hz,2H),3.58(s,2H),3.46–3.41(m,2H),3.31(d,J＝6.0Hz,2H),3.00–2.83(m,1H),2.65(s,1H),2.58(s,1H),2.13–1.99(m,1H),1.42(s,9H)。

5、(S)-2-(2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂-6-基)乙酰氨基)乙酸(化合物10b)

将化合物7(200mg，0.44mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。室温搅拌8小时后，反应液经减压蒸馏后得到无色油状液体(化合物8)。将无色油状液体(化合物8)、DIEA(227.04mg，1.76mmol)和甘氨酸甲酯盐酸盐(55mg，0.44mmol)溶于DMF(5mL)中。冰浴下滴加pyBop(457.6mg，0.88mmol)的DMF(5mL)溶液，室温反应12小时。将反应液倒入饱和食盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝50:1)纯化得到化合物9，为无色油状液体。将化合物9(0.17mmol)溶于甲醇中，加入LiOH(31mg，0.76mmol)溶液。室温反应6小时后，用稀盐酸调节pH至2～4，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝50:1)纯化得到化合物10b，为白色固体(64mg，32.81％)。

¹H NMR(300MHz,Methanol-d₄)δ7.54–7.47(m,2H),7.40(d,J＝8.3Hz,2H),4.64(dd,J＝9.4,4.6Hz,1H),4.00(q,J＝17.9Hz,2H),3.16(td,J＝6.7,3.5Hz,2H),2.70(s,3H),2.45(s,3H),1.70(s,3H)。

6、(S)-3-(2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂-6-基)乙酰氨基)丙酸(化合物10c)

将化合物7(200mg，0.44mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。室温搅拌8小时后，反应液经减压蒸馏后得到无色油状液体(化合物8)。将无色油状液体(化合物8)、DIEA(227.04mg，1.76mmol)和3-氨基丙酸甲酯盐酸盐(61mg，0.44mmol)溶于DMF(5mL)中。冰浴下滴加pyBop(457.6mg，0.88mmol)的DMF(5mL)溶液，室温反应12小时。将反应液倒入饱和食盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝50:1)纯化得到化合物9，为无色油状液体。将化合物9(0.17mmol)溶于甲醇中，加入LiOH(31mg，0.76mmol)溶液。室温反应6小时后，用稀盐酸调节pH至2～4，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝50:1)纯化得到化合物10c，为白色固体(68mg，32.95％)。

¹H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ7.82(t,J＝6.1Hz,1H),7.41(d,J＝8.3Hz,2H),7.33(d,J＝8.4Hz,2H),4.77–4.72(m,1H),3.72(ddd,J＝30.3,14.1,7.5Hz,2H),3.43(ddd,J＝30.7,14.4,6.3Hz,2H),2.69(s,3H),2.55(t,J＝5.7Hz,2H),2.42(s,3H)。

7、(S)-4-(2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂-6-基)乙酰氨基)丁酸(化合物10d)

将化合物7(200mg，0.44mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。室温搅拌8小时后，反应液经减压蒸馏后得到无色油状液体(化合物8)。将无色油状液体(化合物8)、DIEA(227.04mg，1.76mmol)和4-氨基丁酸甲酯盐酸盐(67mg，0.44mmol)溶于DMF(5mL)中。冰浴下滴加pyBop(457.6mg，0.88mmol)的DMF(5mL)溶液，室温反应12小时。将反应液倒入饱和食盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝50:1)纯化得到化合物9，为无色油状液体。将化合物9(0.17mmol)溶于甲醇中，加入LiOH(31mg，0.76mmol)溶液。室温反应6小时后，用稀盐酸调节pH至2～4，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝50:1)纯化得到化合物10d，为白色固体(66mg，30.68％)。

¹H NMR(300MHz,Chloroform-d)δ7.41(d,J＝8.2Hz,2H),7.32(d,J＝2.7Hz,2H),7.27(d,J＝1.5Hz,1H),4.86–4.62(m,1H),3.86–3.58(m,2H),3.54–3.15(m,4H),2.69(s,3H),2.41(d,J＝4.9Hz,3H),1.88(td,J＝13.9,13.4,6.9Hz,2H)。

8、TCB-1(化合物11a)的合成

将(S)-2-(4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂-6-基)乙酸叔丁酯(56mg，0.12mmol，1当量)溶解在DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。室温下搅拌8小时后，反应液经减压蒸馏获得无色油状液体。将化合物6(80mg，0.12mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。室温下搅拌8小时，反应液经减压蒸馏获得橙色固体。将无色油状液体和橙色固体溶解在DMF(5mL)中，冰浴下逐滴加入DIEA(32mg，0.24mmol)，pyBop(129mg，0.24mmol)的DMF(5mL)溶液。室温下搅拌12小时后，将反应液倒入饱和盐水(100mL)中，并用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝500:17)纯化得到化合物11a，橙色固体(24mg，20.70％)。

¹HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.10(s,1H),9.20(t,J＝5.6Hz,1H),8.40(dd,J＝11.5,6.8Hz,3H),7.54(d,J＝8.0Hz,3H),7.46(s,4H),7.17(d,J＝8.7Hz,1H),7.01(d,J＝7.0Hz,1H),6.76(t,J＝6.1Hz,1H),5.11–4.98(m,2H),4.92(dd,J＝16.4,5.4Hz,1H),4.51(dd,J＝8.9,5.2Hz,1H),3.57(s,2H),3.44(t,J＝4.7Hz,2H),3.26(s,2H),2.97–2.82(m,1H),2.62–2.60(m,1H),2.59(s,3H),2.56(d,J＝3.0Hz,1H),2.39(s,3H),2.02(dd,J＝11.6,6.0Hz,1H),1.59(s,3H)。

HR-MS(ESI,C₄₆H₄₁ClN₁₄O₇S):Calcd.for[M+H]⁺:926.26998；Found:926.27065.实施例2：2-((S)-4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂-6-基)-N-(2-(((6-(4-(2-(2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙基)氨基)-2-氧乙基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基甲基)氨基)-2-氧乙基)乙酰胺(TCB-2，化合物11b)的合成

将化合物6(80mg，0.12mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。室温下搅拌8小时，反应液经减压蒸馏获得橙色固体。将化合物10b(55mg，0.12mmol)和橙色固体溶解在DMF(5mL)中，冰浴下逐滴加入DIEA(32mg，0.24mmol)，pyBop(129mg，0.24mmol)的DMF(5mL)溶液。室温下搅拌12小时后，将反应液倒入饱和盐水(100mL)中，并用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝500:17)纯化得到化合物11b，橙色固体(19mg，15.75％)。

¹HNMR(300MHz,DMSO-d6)δ11.12(s,1H),8.77(dt,J＝12.3,5.9Hz,2H),8.40(d,J＝8.3Hz,3H),7.55(t,J＝8.2Hz,3H),7.44(s,4H),7.17(d,J＝8.6Hz,1H),7.01(d,J＝7.0Hz,1H),6.77(t,J＝5.9Hz,1H),5.07(dd,J＝12.9,5.3Hz,1H),4.95(d,J＝5.5Hz,2H),4.52(t,J＝7.3Hz,1H),4.08–3.71(m,2H),3.57(s,2H),3.44–3.41(m,2H),3.30(s,2H),2.90(ddd,J＝18.0,13.6,5.3Hz,1H),2.75(d,J＝15.4Hz,1H),2.64(d,J＝15.3Hz,2H),2.50(s,3H),2.39(s,3H),2.03(d,J＝12.0Hz,1H),1.60(s,3H)。

¹³CNMR(75MHz,DMSO-d6)δ174.63,172.75,171.19,170.00,169.66,168.61,167.18,166.80,163.79,163.10,155.08,149.80,146.19,141.22,136.59,136.11,135.09,132.08,132.04,130.57,130.14,130.10,129.80,129.66,129.46,128.30,127.38,117.02,110.47,109.12,72.22,64.82,53.75,48.41,42.70,42.12,41.97,41.82,41.19,38.16,37.54,30.88,22.07,13.93,12.55,11.15。

HR-MS(ESI,C₄₇H₄₃ClN₁₄O₇S):Calcd.for[M+Na]⁺:1005.27283；Found:1005.27406。实施例3：3-(2-((S)-4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂-6-基)乙酰胺)-N-((6-(4-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)丙酰胺(化合物11c，TCB-3)

将化合物6(80mg，0.12mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。室温下搅拌8小时，反应液经减压蒸馏获得橙色固体。将化合物10c(61mg，0.12mmol)和橙色固体溶解在DMF(5mL)中，冰浴下逐滴加入DIEA(32mg，0.24mmol)，pyBop(129mg，0.24mmol)的DMF(5mL)溶液。室温下搅拌12小时后，将反应液倒入饱和盐水(100mL)中，并用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝500:17)纯化得到化合物11c，橙色固体(22mg，17.99％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.08(s,1H),8.88(t,J＝5.6Hz,1H),8.47–8.32(m,3H),8.23(t,J＝5.7Hz,1H),7.53(dd,J＝15.1,7.9Hz,3H),7.48–7.37(m,4H),7.15(d,J＝8.6Hz,1H),7.00(d,J＝7.0Hz,1H),6.73(d,J＝6.3Hz,1H),5.04(dd,J＝12.8,5.4Hz,1H),4.89(d,J＝5.5Hz,2H),4.49(t,J＝7.0Hz,1H),3.55(s,2H),3.39(s,2H),3.20(s,1H),2.97–2.79(m,1H),2.61–2.55(m,5H；-CH₃,-CH₂),2.44(d,J＝7.2Hz,2H),2.39(s,3H),2.01(d,J＝13.3Hz,1H),1.60(s,3H),1.22(s,2H)。

HR-MS(ESI,C₄₈H₄₅ClN₁₄O₇S):Calcd.for[M+Na]⁺:1019.28839；Found:1019.28971.实施例4：4-(2-((S)-4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂-6-基)乙酰胺)-N-N-((6-(4-(2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)丁酰胺(化合物11d，TCB-4)

将化合物6(80mg，0.12mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。室温下搅拌8小时，反应液经减压蒸馏获得橙色固体。将化合物10d(67mg，0.12mmol)和橙色固体溶解在DMF(5mL)中，冰浴下逐滴加入DIEA(32mg，0.24mmol)，pyBop(129mg，0.24mmol)的DMF(5mL)溶液。室温下搅拌12小时后，将反应液倒入饱和盐水(100mL)中，并用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝500:17)纯化得到化合物11d，橙色固体(14mg，11.29％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.14(s,1H),8.83(t,J＝5.7Hz,1H),8.42(dd,J＝10.6,7.0Hz,3H),8.29(d,J＝6.0Hz,1H),7.62–7.49(m,3H),7.44(q,J＝8.6Hz,4H),7.19(d,J＝8.7Hz,1H),7.03(d,J＝7.0Hz,1H),6.79(t,J＝6.0Hz,1H),5.08(dd,J＝12.8,5.4Hz,1H),4.91(d,J＝5.5Hz,2H),4.52(dd,J＝8.1,6.1Hz,1H),4.02(dt,J＝18.6,6.6Hz,1H),3.58(s,2H),3.33–3.27(m,2H),3.26–3.19(m,2H),3.19–3.13(m,1H),3.02–2.83(m,1H),2.61(s,3H),2.42(s,3H),2.30(t,J＝7.6Hz,2H),2.11–1.96(m,1H),1.74(t,J＝7.6Hz,2H),1.63(s,3H),1.38–1.21(m,2H)。

HR-MS(ESI,C₄₉H₄₇ClN₁₄O₇S):Calcd.for[M+Na]⁺:1033.30536；Found:1033.30406。实施例5：2-((S)-4-(4-氯苯基)-2,3,9-三甲基-6H-噻吩并[3,2-f][1,2,4]***并[4,3-a][1,4]二氮杂-6-基)-N-(2-(((6-(4-(2-(2-(1-甲基-2,6-二氧哌啶-3-基)-1,3-二氧异吲哚-4-基)氨基)乙基)氨基)-2-氧乙基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基甲基)氨基)-2-氧乙基)乙酰胺(TCB-Neg，TCB-2阴性对照，化合物15)的合成

1、4-氟-2-(1-甲基-2,6-二氧哌啶-3-基)异吲哚-1,3-二酮(化合物12)

将2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-4-氟异吲哚啉-1,3-二酮(630mg，2.32mmol)和碳酸铯(1.13g，3.49mmol)溶于DMF(5mL)。冰浴下逐滴加入碘甲烷(396mg，2.79mmol)。冰浴下搅拌8小时后，将反应液倒入饱和盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经减压蒸馏得到粗品，乙醇中重结晶得到化合物12(282mg，42.70％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ7.96(td,J＝7.9,4.5Hz,1H),7.82–7.71(m,2H),5.23(dd,J＝13.0,5.3Hz,1H),3.00–2.85(m,1H),2.78(ddd,J＝18.1,5.1,2.8Hz,1H),2.54–2.49(m,1H),2.09(dtd,J＝13.3,5.5,2.6Hz,1H)。

2、(2-((2-(1-甲基-2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物13)

将(2-氨基乙基)氨基甲酸叔丁酯(825.6mg，5.16mmol)和化合物12(500mg，1.72mmol)溶于1,4-二氧六环(10mL)中。100℃下反应8小时后，将反应液倒入饱和食盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝500:17)纯化得到化合物13，为绿色固体(340mg，45.10％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ7.60(dd,J＝8.6,7.1Hz,1H),7.17(d,J＝8.6Hz,1H),7.07(dd,J＝9.1,6.2Hz,2H),6.76(t,J＝6.2Hz,1H),5.15(dd,J＝13.0,5.3Hz,1H),3.38(d,J＝4.4Hz,2H),3.13(q,J＝6.0Hz,2H),3.00–2.90(m,1H),2.77(dt,J＝16.7,3.7Hz,1H),2.58(dd,J＝13.0,4.4Hz,1H),2.12–1.97(m,1H),1.38(s,9H)。

3、(6-(4-(2-((2-((2-(1-甲基-2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)乙基)氨基)-2-氧代乙基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(化合物14)

将化合物13(266mg，0.62mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。室温下搅拌8小时后，反应液经减压蒸馏得到绿色固体。绿色固体和2-(4-(6-(((叔丁氧基羰基)氨基)甲基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)苯基)乙酸(5，213mg，0.62mmol)溶于DMF(5mL)中。冰浴下逐滴加入DIEA(160mg，1.24mmol)和pyBop(645mg，1.24mmol)的DMF(5mL)溶液。室温下搅拌12小时后，将反应液倒入饱和食盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝50:1)纯化得到化合物14，为粉红色固体(198mg，48.60％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.40(dd,J＝6.4,3.0Hz,3H),7.71(t,J＝6.3Hz,1H),7.61–7.49(m,3H),7.17(d,J＝8.6Hz,1H),7.02(d,J＝7.0Hz,1H),6.76(t,J＝6.1Hz,1H),5.13(dd,J＝12.9,5.3Hz,1H),4.76(d,J＝5.9Hz,2H),3.56(s,2H),3.41(t,J＝6.2Hz,2H),3.30(d,J＝5.8Hz,2H),3.02(s,3H),2.99–2.87(m,1H),2.83–2.69(m,1H),2.64–2.52(m,1H),2.19–1.99(m,1H),1.40(s,9H)。

4、TCB-Neg(化合物15)的合成

将化合物14(40mg，0.064mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。室温下搅拌8小时后，反应液经减压蒸馏得到橙色固体。将橙色固体和化合物10b(30mg，0.064mmol)溶于DMF(5mL)中。冰浴下逐滴加入DIEA(17mg，0.13mmol)和pyBop(68mg，0.13mmol)的DMF(5mL)溶液。室温下搅拌12小时后，将反应液倒入饱和食盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝500:17)纯化得到化合物15，为橙色固体(11mg，17.50％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ8.76(dd,J＝13.0,6.6Hz,2H),8.40(d,J＝7.7Hz,3H),7.54(dd,J＝7.9,3.2Hz,3H),7.44(s,4H),7.17(d,J＝8.6Hz,1H),7.02(d,J＝7.0Hz,1H),6.76(t,J＝6.1Hz,1H),5.13(dd,J＝12.9,5.3Hz,1H),4.95(d,J＝5.5Hz,2H),4.53(t,J＝7.3Hz,1H),4.00–3.76(m,2H),3.57(s,2H),3.42(d,J＝6.1Hz,2H),3.30(d,J＝7.8Hz,2H),2.99–2.89(m,1H),2.82–2.71(m,1H),2.62–2.54(m,1H),2.39(s,3H),2.04(d,J＝13.1Hz,1H),1.60(s,3H)。

HR-MS(ESI,C₄₈H₄₅ClN₁₄O₇S):Calcd.for[M+Na]⁺:1019.28971；Found:1019.28760。实施例6：2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-N-((6-(4-(2-(4-(2-(2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)乙酰胺(TCP-1，化合物20)的合成

1、4-(2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-羧酸叔丁酯(化合物17)

将2-氟-5-(4-氧基-3,4-二氢苯酞嗪-1-基)苯甲酸(1.19g,4mmol)和叔丁基哌嗪-1-羧酸酯(890mg,4mmol)溶于5mL DMF中，加入DIEA(1032mg,8mmol)。冰浴下滴加pyBop(2.7mg,5.2mmol)的DMF溶液(5mL)。室温反应8小时后，将反应液倒入饱和盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取，有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝50:1)纯化得到化合物17，为白色固体(845mg,45.33％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.61(s,1H),8.26(dd,J＝7.5,1.7Hz,1H),7.96(d,J＝7.2Hz,1H),7.89(td,J＝7.5,1.7Hz,1H),7.83(td,J＝7.4,1.5Hz,1H),7.44(ddd,J＝8.3,5.1,2.2Hz,1H),7.35(dd,J＝6.5,2.3Hz,1H),7.24(t,J＝9.0Hz,1H),4.33(s,2H),3.59(s,2H),3.38(t,J＝3.9Hz,2H),3.22(d,J＝6.1Hz,2H),3.14(s,2H),1.40(s,9H).

2、((6-(4-(2-(4-(2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(化合物18)

将化合物17(100mg,0.21mmol)溶解在DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。室温搅拌8小时后，反应液经减压蒸馏得到无色油状液体。将无色油状液体与化合物5(74mg,0.21mmol)溶于5mL的DMF中，加入DIEA(227.04mg,0.64mmol)，冰浴下滴加pyBop(145.06mg,0.27mmol)的DMF(5mL)溶液，室温反应12小时。将反应液倒入饱和盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取3次，有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝50:1)纯化得到化合物18，为粉色油状物(60mg,41.37％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.62(s,1H),8.43(d,J＝6.0Hz,2H),8.30–8.21(m,1H),7.97(d,J＝7.7Hz,1H),7.84(q,J＝8.1,7.1Hz,2H),7.74(t,J＝5.9Hz,1H),7.53(t,J＝7.1Hz,2H),7.43(d,J＝7.0Hz,1H),7.39(d,J＝6.9Hz,1H),7.24(t,J＝9.0Hz,1H),4.76(d,J＝5.9Hz,2H),4.33(s,2H),3.90(d,J＝19.8Hz,2H),3.62(s,4H),3.46(d,J＝14.2Hz,2H),3.18(s,2H),1.40(s,9H)。

3、(2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)甘氨酸叔丁酯(化合物19)

向2-(2,6-二氧哌啶-3-基)-4-氟异吲哚-1,3-二酮(2,500mg,1.81mmol)的DMSO溶液(7mL)中加入叔丁基(2-氨基乙基)氨基甲酸酯(474mg,3.62mmol)和DIEA(750mg,5.43mmol)。90℃反应10小时后，将反应混合物倒入500mL饱和食盐水中，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取3次，有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝200:1)纯化得到化合物19，为绿色固体(387mg,51.39％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ11.13(s,1H),7.59(dd,J＝8.5,7.1Hz,1H),7.08(d,J＝7.1Hz,1H),6.98(d,J＝8.5Hz,1H),6.86(t,J＝5.9Hz,1H),5.08(dd,J＝12.8,5.3Hz,1H),4.10(d,J＝6.0Hz,2H),2.97–2.83(m,1H),2.62(s,1H),2.56(s,1H),2.11–1.99(m,1H),1.43(s,9H)。

4、TCP-1(化合物20)的合成

将化合物18(50mg，0.072mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。室温下搅拌8小时，反应液经减压蒸馏获得粉色油状液体。将化合物19(27.86mg，0.072mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。室温下搅拌8小时，反应液经减压蒸馏获得绿色油状液体。将粉红色液体和绿色液体以及DIEA(27.86mg，0.216mmol)溶于DMF(5mL)，冰浴下滴加pyBop(48.67mg，0.094mmol)的DMF(5mL)溶液。室温反应12小时后，将反应液倒入饱和食盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝50:1)纯化得到化合物20，为橙色固体(28mg，41.89％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.61(s,1H),11.11(s,1H),9.06(t,J＝5.7Hz,1H),8.43(dd,J＝8.3,3.2Hz,2H),8.30–8.23(m,1H),7.96(d,J＝7.8Hz,1H),7.89(s,1H),7.86–7.80(m,1H),7.61(t,J＝7.8Hz,1H),7.53(t,J＝7.1Hz,2H),7.49–7.41(m,1H),7.38(s,1H),7.24(t,J＝9.0Hz,1H),7.09(d,J＝7.1Hz,1H),7.02(t,J＝5.8Hz,1H),6.94(d,J＝8.5Hz,1H),5.07(dd,J＝12.7,5.3Hz,1H),4.95(d,J＝5.5Hz,2H),4.33(s,2H),4.11(d,J＝5.7Hz,2H),3.90(d,J＝19.8Hz,2H),3.62(s,4H),3.46(d,J＝13.1Hz,2H),3.38(d,J＝7.0Hz,2H),3.19(s,2H),2.98–2.79(m,1H),2.61(s,1H),2.55(s,1H),2.02(d,J＝12.0Hz,1H)。

¹³C NMR(75MHz,DMSO)δ172.71,169.94,169.46,168.56,168.50,167.20,166.70,163.98,163.89,159.28,145.72,144.75,140.89,136.05,134.73,133.39,131.89,131.73,131.62,131.47,130.34,129.70,128.97,128.85,127.78,127.46,125.97,125.35,117.55,115.98,115.68,111.00,109.85,48.44,46.41,46.11,45.32,45.12,41.93,41.36,41.06,36.32,30.87,22.04。

HR-MS(ESI,C₄₆H₃₉FN₁₂O₈):Calcd.for[M+Na]⁺:929.28901；Found:929.28947。

实施例7：2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-N-((6-(4-(2-((2-(4-(2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)乙酰胺(TCP-2，化合物23a)

1、(2-(4-(2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物21a)

将化合物17(200mg，0.42mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。在室温下搅拌8小时，反应液经减压蒸馏获得无色油状液体。将无色油状液体和N-Boc-甘氨酸(74mg，0.42mmol)以及DIEA(162.54mg，1.26mmol溶于DMF(5mL)，冰浴下滴加pyBop(283.92mg，0.55mmol)的DMF(5mL)溶液。室温下搅拌12小时后，将反应液倒入饱和盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝50:1)纯化得到化合物21a，为无色油状液体(146mg，66.67％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.61(s,1H),8.30–8.23(m,1H),7.97(d,J＝7.8Hz,1H),7.92(d,J＝7.5Hz,1H),7.87–7.79(m,1H),7.49–7.42(m,1H),7.38(s,1H),7.24(t,J＝9.0Hz,1H),6.80(s,1H),4.34(s,2H),3.80(dd,J＝17.3,5.8Hz,2H),3.62(s,2H),3.50(s,2H),3.18(s,2H),1.38(s,9H)。

2、(3-(4-(2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)-3-氧代丙基)氨基甲酸叔丁酯(化合物21b)

将化合物17(200mg，0.42mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。在室温下搅拌8小时，反应液经减压蒸馏获得无色油状液体。将无色油状液体和N-Boc-β-丙氨酸(79mg，0.42mmol)以及DIEA(162.54mg，1.26mmol溶于DMF(5mL)，冰浴下滴加pyBop(283.92mg，0.55mmol)的DMF(5mL)溶液。室温下搅拌12小时后，将反应液倒入饱和盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝50:1)纯化得到化合物21b，为无色油状液体(128mg，57.14％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.60(s,1H),8.29–8.23(m,1H),7.97(d,J＝7.9Hz,1H),7.90(t,J＝7.4Hz,1H),7.83(td,J＝7.4,1.5Hz,1H),7.43(d,J＝6.9Hz,1H),7.36(s,1H),7.24(t,J＝9.0Hz,1H),6.72(s,1H),4.33(s,2H),3.61(d,J＝19.0Hz,2H),3.50(s,2H),3.14(s,4H),3.01(h,J＝3.8Hz,4H),1.38(s,9H)。

3、(4-(4-(2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁基)氨基甲酸叔丁酯(化合物21c)

将化合物17(200mg，0.42mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。在室温下搅拌8小时，反应液经减压蒸馏获得无色油状液体。将无色油状液体和N-Boc-γ-氨基丁酸(85mg，0.42mmol)以及DIEA(162.54mg，1.26mmol溶于DMF(5mL)，冰浴下滴加pyBop(283.92mg，0.55mmol)的DMF(5mL)溶液。室温下搅拌12小时后，将反应液倒入饱和盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝50:1)纯化得到化合物21c，为无色油状液体(132mg，57.03％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.61(s,1H),8.28(d,J＝7.6Hz,1H),7.98(d,J＝7.9Hz,1H),7.91(t,J＝7.8Hz,1H),7.85(t,J＝7.7Hz,1H),7.45(d,J＝6.8Hz,1H),7.37(s,1H),7.25(t,J＝9.0Hz,1H),6.82(s,1H),4.35(s,2H),3.62(d,J＝19.3Hz,2H),3.52(s,2H),3.18(s,2H),3.03(td,J＝6.6,3.7Hz,2H),2.94(s,2H),2.38–2.22(m,2H),1.61(s,2H),1.38(s,9H)。

4、((6-(4-(2-((2-(4-(2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)-2-氧代乙基)氨基)-2-氧代乙基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(22a)

将化合物21a(100mg，0.19mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。在室温下搅拌8小时，反应液经减压蒸馏获得无色油状液体。将无色油状液体和化合物5(65.97mg，0.19mmol)溶于DMF(5mL)，加入DIEA(73.99mg，0.57mmol)，冰浴下滴加pyBop(128.44mg，0.25mmol)的DMF(5mL)溶液。室温下搅拌12小时后，将反应液倒入饱和食盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝125:3)纯化得到化合物22a，为粉色固体(90mg，63.15％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.62(s,1H),8.42(d,J＝7.3Hz,2H),8.35(d,J＝5.4Hz,1H),8.26(dd,J＝7.7,1.6Hz,1H),7.97(d,J＝7.9Hz,1H),7.93–7.87(m,1H),7.83(td,J＝7.4,1.4Hz,1H),7.73(t,J＝6.0Hz,1H),7.59(d,J＝7.9Hz,2H),7.44(s,1H),7.38(d,J＝6.1Hz,1H),7.24(t,J＝8.9Hz,1H),4.76(d,J＝5.9Hz,2H),4.33(s,2H),4.02(dd,J＝17.8,5.1Hz,2H),3.68(s,2H),3.64(s,2H),3.54(s,2H),3.40(s,2H),3.18(s,2H),1.40(s,9H)。

5、((6-(4-(2-((3-(4-(2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)-3-氧代丙基)氨基)-2-氧代乙基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(22b)

将化合物21b(102mg，0.19mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。在室温下搅拌8小时，反应液经减压蒸馏获得无色油状液体。将无色油状液体和化合物5(65.97mg，0.19mmol)溶于DMF(5mL)，加入DIEA(73.99mg，0.57mmol)，冰浴下滴加pyBop(128.44mg，0.25mmol)的DMF(5mL)溶液。室温下搅拌12小时后，将反应液倒入饱和食盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝125:3)纯化得到化合物22b，为粉色固体(77mg，53.04％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.61(s,1H),8.49–8.38(m,2H),8.32–8.17(m,2H),7.98(d,J＝8.1Hz,1H),7.94–7.81(m,2H),7.76–7.69(m,1H),7.60–7.52(m,2H),7.45(s,1H),7.40–7.32(m,1H),7.24(t,J＝9.0Hz,1H),4.77(d,J＝5.5Hz,2H),4.35(s,2H),3.62(s,2H),3.57(s,4H),3.50(s,2H),3.40(s,2H),3.31(s,2H),3.17(s,2H),1.41(s,9H)。

6、((6-(4-(2-((4-(4-(2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁基)氨基)-2-氧代乙基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)氨基甲酸叔丁酯(22c)

将化合物21c(105mg，0.19mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。在室温下搅拌8小时，反应液经减压蒸馏获得无色油状液体。将无色油状液体和化合物5(65.97mg，0.19mmol)溶于DMF(5mL)，加入DIEA(73.99mg，0.57mmol)，冰浴下滴加pyBop(128.44mg，0.25mmol)的DMF(5mL)溶液。室温下搅拌12小时后，将反应液倒入饱和食盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝125:3)纯化得到化合物22c，为粉色固体(82mg，55.47％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.59(s,1H),8.41(dd,J＝14.0,7.9Hz,2H),8.30–8.21(m,1H),8.17(s,1H),7.96(d,J＝8.0Hz,1H),7.90(d,J＝6.7Hz,1H),7.86–7.79(m,1H),7.70(s,1H),7.55(t,J＝7.7Hz,2H),7.43(s,1H),7.35(d,J＝6.5Hz,1H),7.23(t,J＝9.0Hz,1H),4.76(d,J＝5.9Hz,2H),4.33(s,2H),3.63–3.56(m,2H),3.55(s,2H),3.49(d,J＝13.5Hz,2H),3.41–3.34(m,2H),3.18–3.04(m,4H),2.41–2.22(m,2H),1.65(t,J＝7.2Hz,2H),1.40(s,9H)。

7、TCP-2(化合物23a)的合成

将化合物22a(54mg，0.072mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。室温下搅拌8小时，反应液经减压蒸馏获得粉色油状液体。将化合物19(27.86mg，0.072mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。室温下搅拌8小时，反应液经减压蒸馏获得绿色油状液体。将粉红色液体和绿色液体以及DIEA(27.86mg，0.216mmol)溶于DMF(5mL)，冰浴下滴加pyBop(48.67mg，0.094mmol)的DMF(5mL)溶液。室温反应12小时后，将反应液倒入饱和食盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝50:1)纯化得到化合物23，为橙色固体(37mg，53.36％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.63(s,1H),11.14(s,1H),9.08(t,J＝5.8Hz,1H),8.43(d,J＝7.9Hz,2H),8.37(s,1H),8.30–8.24(m,1H),7.98(d,J＝7.8Hz,1H),7.91(t,J＝7.4Hz,1H),7.88–7.81(m,1H),7.76–7.64(m,1H),7.64–7.57(m,3H),7.44(d,J＝7.3Hz,1H),7.39(d,J＝6.0Hz,1H),7.25(t,J＝9.0Hz,1H),7.10(d,J＝7.1Hz,1H),7.02(d,J＝6.1Hz,1H),6.95(d,J＝8.6Hz,1H),5.14–5.04(m,1H),4.96(d,J＝5.5Hz,2H),4.34(s,2H),4.12(d,J＝5.4Hz,2H),4.03(dd,J＝18.1,5.2Hz,2H),3.69(s,2H),3.64(s,2H),3.53(s,2H),3.36(s,2H),3.20(s,2H),2.98–2.83(m,1H),2.62(d,J＝3.4Hz,1H),2.16(d,J＝16.6Hz,1H),2.04(dd,J＝11.8,6.2Hz,1H)。

HR-MS(ESI,C₄₈H₄₂FN₁₃O₉):Calcd.for[M+Na]⁺:986.31047；Found:986.30863。

实施例8：2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-N-((6-(4-(2-((3-(4-(2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)-3-氧代-丙基)氨基)-2-氧代乙基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)乙酰胺(化合物23b，TCP-3)

将化合物22b(55mg，0.072mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。室温下搅拌8小时，反应液经减压蒸馏获得粉色油状液体。将化合物19(27.86mg，0.072mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。室温下搅拌8小时，反应液经减压蒸馏获得绿色油状液体。将粉红色液体和绿色液体以及DIEA(27.86mg，0.216mmol)溶于DMF(5mL)，冰浴下滴加pyBop(48.67mg，0.094mmol)的DMF(5mL)溶液。室温反应12小时后，将反应液倒入饱和食盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝50:1)纯化得到化合物23，为橙色固体(24mg，33.34％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.62(s,1H),11.13(s,1H),9.08(s,1H),8.42(d,J＝4.8Hz,3H),8.27(d,J＝8.4Hz,3H),7.97(d,J＝7.8Hz,1H),7.89(dd,J＝16.4,7.4Hz,2H),7.63(d,J＝7.6Hz,1H),7.61–7.52(m,3H),7.45(s,1H),7.37(d,J＝6.6Hz,1H),7.24(t,J＝9.0Hz,1H),7.10(d,J＝7.1Hz,1H),7.01(d,J＝6.0Hz,1H),6.95(d,J＝8.5Hz,1H),5.09(dd,J＝12.9,5.2Hz,1H),4.96(d,J＝5.6Hz,2H),4.34(s,2H),4.12(d,J＝5.7Hz,3H),3.57(s,6H),2.88(d,J＝13.1Hz,1H),2.62(s,1H),2.03(s,1H)。

HR-MS(ESI,C₄₉H₄₄FN₁₃O₉):Calcd.for[M+Na]⁺:1000.32612；Found:1000.32351。

实施例9：2-((2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)-1,3-二氧代异吲哚啉-4-基)氨基)-N-((6-(4-(2-((4-(4-(2-氟-5-((4-氧代-3,4-二氢酞嗪-1-基)甲基)苯甲酰基)哌嗪-1-基)-4-氧代丁基)氨基)-2-氧代乙基)苯基)-1,2,4,5-四嗪-3-基)甲基)乙酰胺(化合物23c，TCP-4)

将化合物22b(55mg，0.072mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。室温下搅拌8小时，反应液经减压蒸馏获得粉色油状液体。将化合物19(27.86mg，0.072mmol)溶于DCM(2mL)中，加入三氟乙酸(1mL)。室温下搅拌8小时，反应液经减压蒸馏获得绿色油状液体。将粉红色液体和绿色液体以及DIEA(27.86mg，0.216mmol)溶于DMF(5mL)，冰浴下滴加pyBop(48.67mg，0.094mmol)的DMF(5mL)溶液。室温反应12小时后，将反应液倒入饱和食盐水(100mL)中，用乙酸乙酯(30mL×3)萃取。有机相经柱色谱分离(DCM:MeOH＝50:1)纯化得到化合物23，为橙色固体(32mg，43.83％)。

¹H NMR(300MHz,DMSO-d₆)δ12.65(s,1H),11.16(s,1H),9.10(s,1H),8.47(dd,J＝13.4,8.1Hz,2H),8.31(d,J＝7.6Hz,1H),8.24(s,1H),8.02(d,J＝8.0Hz,1H),7.96(d,J＝7.0Hz,1H),7.90(d,J＝9.1Hz,1H),7.67(d,J＝7.8Hz,1H),7.62(d,J＝7.9Hz,2H),7.49(s,1H),7.40(t,J＝8.5Hz,1H),7.28(t,J＝8.9Hz,1H),7.14(d,J＝7.1Hz,1H),7.06(s,1H),6.99(d,J＝8.5Hz,1H),5.13(dd,J＝12.8,5.4Hz,1H),5.01(d,J＝5.3Hz,2H),4.39(s,2H),4.16(d,J＝5.1Hz,2H),3.66(s,2H),3.61(s,4H),3.51(s,2H),3.49(s,1H),3.19(s,2H),2.92(d,J＝12.0Hz,1H),2.67(s,1H),2.61(s,1H),2.40(s,1H),2.07(d,J＝12.5Hz,1H)。

HR-MS(ESI,C₄₉H₄₄FN₁₃O₉):Calcd.for[M+Na]⁺:1014.34177；Found:1014.34048。

实施例10 PAMAM-G5-TCO的合成与结构确证

称取50mg PAMAM-G5-NH₂(CAS号：163442-68-0)溶于3mL甲醇，加入1mLTCO-NHS-Ester(CAS号：1191901-33-3)(40eq.)甲醇溶液，室温下搅拌反应0.5小时，反应结束后将反应液转移至透析袋(截留分子量2kDa)中，纯水透析24小时，收集透析液冷冻干燥即得PAMAM-G5-TCO产物。

PAMAM-G5-TCO的新型树状大分子，其表面胺基被功能化的TCO基团修饰(1:40)。该化合物的结构经¹HNMR确证：PAMAM的骨架显示5个宽峰，修饰后的TCO的酰胺键特征峰为6.92ppm，对应于连接TCO和PAMAM支架的-NHCO-，双键特征峰为5.39～5.61ppm，对应于反式环辛烯的-CH＝CH-，TCO环上脂肪氢的特征峰为1.39～4.22ppm。PAMAM-G5-TCO的¹HNMR谱证实了反式环辛烯被成功地修饰在了PAMAM-G5-NH2的表面。

透射电子显微镜(TEM)图像显示，纳米颗粒很致密，共轭物的形状大多为球形(见图1)。TEM观察到的颗粒尺寸在20～40nm左右。

使用nanoZsizer(Malvern Zetasizer Nano ZS90)分别通过动态光散射(DLS)和相分析光散射(PALS)测定PAMAM-G5-TCO的Zeta电位(见图2)。结果显示其zeta电位为正电荷，约为36.7mV。该结果表明，经TCO基团修饰后，枝状大分子的尺寸增大，但仍带正电荷性；这表明PAMAM失去了一些正的氨基末端基团，但在溶液中仍可保持稳定。

实施例11利用免疫印迹法筛选优势Tz-PROTAC

本发明采用免疫印迹实验方法对实施例1-9中给出的Tz-PROTAC分子(TCB-1～TCB-4以及TCP-1～TCP-4)进行活性筛选。配制浓度0.5nM、5nM和50nM的TCB-1～TCB-4加入MV-4-11细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)在37℃，5％CO₂的培养箱中孵育24小时后，利用免疫印迹法检测目标蛋白浓度。或配制浓度0.5nM、5nM和50nM的TCP-1～TCP-4加入SW620细胞(购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库)在37℃，100％空气的培养箱中孵育24小时后利用免疫印迹法检测目标蛋白浓度。

免疫印迹法实验操作如下：

首先用1*PBS(Gibco,10010023)混合并洗涤细胞，吸出，加入弱效RIPA裂解液(100μL)(碧云天，P0013)裂解细胞，裂解时间为30分钟，13000rpm、4℃离心15分钟，取80μL上清液并加入20μL上样缓冲液(碧云天，P0015)，并在100℃下加热8分钟，放在冰上冷却，上样10μL到10％的SDS-PAGE凝胶上，在Bio-Rad蛋白质电泳仪上用60V恒压跑直到将marker分开后，转为120V跑至最底边。电泳后取下胶，按尺寸剪取合适大小的PVDF膜，白板到黑板的顺序依次为滤纸、PVDF膜、胶、滤纸和黑色纱网。采用湿法转膜，时间为2h，转移蛋白到PVDF膜(PerkinElmer,Northwalk,CT,USA)。结束后，将PVDF膜浸入丽春红染色液中，染色2～5min，蒸馏水冲洗，剪下目标条带，用1*TBST(碧云天，ST671)洗去丽春红。用封闭缓冲液(含5％w/v脱脂奶粉的1*TBST)37℃封闭1h。封闭完成后用15ml 1*TBST洗涤三次，每次5分钟。测试所用一抗为BRD2(Abcam,ab139690)、BRD3(Abcam,ab50818)、BRD4(Abcam,ab128874)、PARP(CST，#9532S)、β-actin(Proteintech,66009-1-Ig),将一抗按照产品说明书中建议的适当稀释度置于10mL一抗稀释缓冲液(含5％脱脂奶粉的1*TBST，要制备20ml，添加1.0g脱脂奶粉至20ml 1*TBST，然后充分混匀)中，在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动，完成后用1*TBST洗涤三次，每次10分钟，然后使用1*TBST稀释Anti-rabbit IgG,HRP-linked Antibody(Cell Signaling Technology#7074，按1:2000的比例)和Anti-mouse IgG,HRP-linkedAntibody(Cell Signaling Technology#7076，按1:1000-1:3000的比例)，将膜与稀释液一起孵育，在室温下轻轻摇晃孵育1小时，然后用1*TBST洗涤三次，每次10分钟，接下来进行蛋白质检测，将显色液(SignalFireTMECLReagent#6883)与膜一起室温孵育1分钟，倒掉多余溶液(膜保持湿润)并曝光。免疫印迹结果显示如图3所示，其中TCB-2和TCP-1分别为两个系列的优势化合物。

实施例12“连接-吸附”***的建立

本发明“连接-吸附”***由可控蛋白水解靶向嵌合体Tz-PROTACs和PAMAM-G5-TCO组成，PAMAM-G5-TCO是反式环辛烯修饰的聚酰胺(PAMAM)树状大分子，其通过逆电子Diels-Alder反应形成PAMAM-PROTACs，完全吸收可控蛋白水解靶向嵌合体。

本发明将(+)-JQ-1通过不同长度的四嗪基团修饰的连接子与CRBN配体结合，构建了一系列靶向BET家族蛋白的Tz-PROTACs(TCB系列)。1,2,4,5-四氮嗪是一个小的连接片段，可以很容易地引入到PROTACs的连接子中。

第五代PAMAM树状大分子是一种商业化的、高度分枝的、单分散的球形纳米材料。该材料具有完美的球型骨架，而巨大的分子表面能够修饰大量功能性片段。本发明制备了一种名为PAMAM-G5-TCO的新型树状大分子(见实施例10)。

理论上，PAMAM-G5-TCO可以通过IEDDA反应形成PAMAM-PROTACs，从而完全吸收Tz-PROTACs。由于IEDDA的快速反应性和PAMAM-G5-TCO大分子表面的众多基团，使得胞内游离的PROTACs可以迅速完全被清除，从而终止活细胞中的事件驱动型蛋白降解。

实施例13Tz-PROTACs降解活性评价

本发明利用免疫印迹实验评价了TCB-2和TCP-1对目的蛋白的降解效果。

用DMSO配制TCB-2的10μM溶液，3倍稀释12个浓度，加入MV-4-11细胞中。在37℃，5％CO₂的培养箱中孵育24小时后，利用免疫印迹法检测MV-4-11细胞中的BET蛋白(BRD2,BRD3和BRD4)，免疫印迹实验参考实施例11。实验结果显示，TCB-2能够浓度依赖性地诱导MV-4-11内BET蛋白降解。(见图4)。

用DMSO配制TCP-1的10μM溶液，3倍稀释12个浓度，加入SW-620细胞中。孵育24小时后，利用免疫印迹法检测SW620细胞中的PARP蛋白，免疫印迹实验参考实施例11。实验结果显示，TCP-1能够浓度依赖性地诱导SW620细胞中PARP蛋白降解。(见图5)

用DMSO配制5nM的TCB-2溶液，加入MV-4-11细胞中。依次孵育0、2、4、8、12和24小时后，利用免疫印迹法检测MV-4-11细胞中的BET蛋白(BRD2,BRD3和BRD4)，免疫印迹实验参考实施例11。实验结果显示，TCB-2能够时间依赖性地诱导MV-4-11内BET蛋白降解。(见图6)。

用DMSO配置10nM的TCP-1溶液，加入SW620细胞中。依次孵育0、2、4、8、12和24小时后，利用免疫印迹法检测SW620细胞中的PARP蛋白，免疫印迹实验参考实施例11。实验结果显示，TCP-1能够时间依赖性地诱导MV-4-11内BET蛋白降解。

(见图7)。

实施例14TCB-2的降解机制探究

本发明利用免疫印迹实验验证了TCB-2诱导BET家族蛋白降解机制。

用DMSO溶液配制(+)-JQ-1(1μM)(MCE：HY-13030)、MLN4924(1μM)(MCE：HY-70062)溶液，加入MV-4-11细胞中在37℃，5％CO₂的培养箱中孵育4h后，加入阴性化合物TCB-Neg(50nM，TCB-2阴性对照)和TCB-2(5nM)，16h后收样，利用免疫印迹法检测MV-4-11细胞中的BET家族蛋白(BRD2,BRD3和BRD4)，免疫印迹实验操作参考实施例11。实验结果显示，NAE抑制剂(MLN-4924)完全阻断了TCB-2对BRD2和BRD3的降解，说明该降解过程依赖于蛋白酶体。同时，加入BET抑制剂(+)-JQ-1和TCB-Neg有效阻断了TCB-2对BRD2和BRD3降解。这一系列结果表明TCB-2是通过诱导三元复合物的形成，并利用UPS***诱导了BET家族蛋白的降解(见图8)。

实施例15TCB-2通过降解BET蛋白诱导MV-4-11细胞凋亡

用DMSO溶液配制TCB-2(5nM)、TCB-2(50nM)以及(+)-JQ-1(50nM)溶液，加入MV-4-11细胞中在37℃，5％CO₂的培养箱中孵育24小时后利用BD FACS Calibur流式细胞仪进行分析，实验结果表明，MV-4-11细胞经TCB-2作用24h后，出现了浓度依赖性的凋亡。与TCB-2组相比，相同浓度的BET抑制剂组未见明显凋亡(见图9)。

实施例16TCB-2通过降解BET蛋白抑制MV-4-11细胞增殖

细胞活力测试用于评价靶向BET家族蛋白的抑制剂和降解剂对AML细胞系的抑制水平。将MV-4-11细胞以5×10³细胞/孔的密度植入96孔板中培养。用DMSO溶液配制TCB-2(2μM)、(+)-JQ-1(2μM)溶液，三倍稀释9个浓度梯度，加入MV-4-11细胞。细胞和不同浓度化合物在37℃，5％CO₂的培养箱中孵育48小时。然后在每孔中加入100μL CellTiter-Lumi Plus(Beyotime C0068M)检测试剂，振荡5min。使用分光光度计(多功能微板读取器)测量荧光值(RLU)。测试中空白(培养基,Gibco 11875093)的荧光值记录为RLU_blank，阴性对照(培养基+细胞)的荧光值记录为RLU_control，样品的荧光值记录为RLU_treated。各浓度下化合物的抑制率计算公式如下:

使用GraphPad Prim 8.0软件计算IC₅₀值。

细胞活力测试显示，TCB-2对MV-4-11细胞的抑制作用(IC₅₀<5nM)远远大于(+)-JQ1(IC₅₀＝211nM)，这表明TCB-2通过降解BET抑制细胞活力(见图10)。综上所述，TCB-2是一个典型的事件驱动型降解剂。

实施例17TCB-2与PAMAM-G5-TCO之间Click反应的定性/定量分析

本发明针对PAMAM-G5-TCO和Tz-PROTACs之间的反应进行了定性和定量分析，本发明中提到的PAMAM-G5-TCO浓度是指PAMAM骨架表面修饰的反式环辛烯的表观浓度。

将500μM浓度的TCB-2(DCM溶液)和PAMAM-G5-TCO(PBS溶液)等体积混合，37℃搅拌5分钟，观察实验现象。定性分析结果表明：溶解在有机相(DCM)中的TCB-2在37℃下通过IEDDA反应在5min内能够被溶解在水相(PBS)中的PAMAM-G5-TCO吸收，水相(PBS)由无色变为黄色，有机相(DCM)的颜色变浅。

将200μM的TCB-2与0、0.5、1、1.5、2和3当量的PAMAM-G5-TCO在37℃下孵育5分钟，用高效液相色谱法(HPLC)评价游离TCB-2的残留量。结果表明，2倍以上当量的PAMAM-G5-TCO在37℃下可在5min内完全吸收并完全消除游离TCB-2(见图11)。上述结果验证了PAMAM-G5-TCO能够通过IEDDA反应快速而完全地吸收游离Tz-PROTACs。

实施例18“连接-吸附”***抑制TCB-2的靶标结合活性

采用荧光偏振法评价TCB-2对BRD4中BD1的抑制活性。化合物母液(10mM DMSO)用缓冲液(150mM NaCl,50mM Na₃PO₄,4mM Chaps,0.3mM DTT,pH 7.4)梯度稀释12个浓度，5-FAM-(+)-JQ-1探针及BRD4-BD1蛋白(5-FAM-(+)-JQ-1探针、BRD4-BD1蛋白均参照文献方法制得：doi.org/10.1016/j.ejmech.2022.114423)经缓冲液稀释至指定浓度。将等体积(20μL)的化合物，BRD4的BD1(终浓度60nM)和5-FAM-(+)-JQ-1溶液(终浓度3.7nM)依次加入黑色384孔板(Corning 3575)中，最终体积为60μL。将平板覆盖并在4℃避光震荡4小时，然后使用激发波长为485nm、发射波长为535nm的SpectraMax多模微孔板监测***(MolecularDevices)检测偏振值。测试中空白对照(仅5-FAM-(+)-JQ-1)的FP值记录为mP_min，阴性对照(5-FAM-(+)-JQ-1和BRD4-BD1蛋白)的FP值记录为mP_max，试验孔(化合物、5-FAM-(+)-JQ-1和BRD4-BD1蛋白)的FP值记录为mP_test。化合物的抑制率计算公式如下:

使用GraphPad Prim 8.0软件计算IC₅₀值。

荧光偏振实验(FP)结果显示：TCB-2对BRD4蛋白有较强的抑制活性(300nM时抑制率超过80％)。相比于游离状态，TCB-2与不同当量的PAMAM-G5-TCO在37℃下孵育5分钟后，对BRD4的抑制活性显著降低，2倍以上当量的PAMAM-G5-TCO可以完全吸收游离的TCB-2(见图12)。浓度梯度测试显示，经PAMAM-G5-TCO处理后的TCB-2对BRD4的抑制活性(1188nM)比游离的TCB-2(76nM)降低约15倍(见图13)。

实施例19细胞内PAMAM-G5-TCO与Tz-PROTAC的定量关系研究

在MV-4-11细胞中加入TCB-2(5nM)和不同当量的PAMAM-G5-TCO(TCB-2:PAMAM-G5-TCO为1:1～1:4)，37℃孵育24小时。利用免疫印迹法检测MV-4-11细胞内BET蛋白的水平。免疫印迹实验方法参照实施例11，收集细胞后冰浴下在裂解缓冲液(20mM HEPES,150mMNaCl,2mM EDTA,1％Triton X-100,pH 7.4)中裂解30分钟，加入无EDTA的磷酸酶抑制剂(碧云天,1045)和蛋白酶抑制剂(碧云天,1005)。在4℃下，12000g离心10分钟，吸出上清，并用BCA法测试蛋白含量。测试所用一抗为BRD2(Abcam,ab139690)、BRD3(Abcam,ab50818)、BRD4(Abcam,ab128874)、PARP(CST，#9532S)、β-actin(Proteintech,66009-1-Ig)。采用Tanon5500 Multi-maging***检测和分析蛋白质含量。

分析结果表明，等摩尔量PAMAM-G5-TCO的加入可以有效抑制TCB-2的降解作用，且2倍当量以上的PAMAM-G5-TCO可以完全终止TCB-2的降解作用(见图14)。

实施例20“连接-吸附”***终止细胞内TCB-2诱导的蛋白降解

用DMSO溶液配制TCB-2(100nM)以及TCB-2(100nM):PAMAM-G5-TCO为1：3的溶液，3倍稀释7个浓度，加入MV-4-11细胞中。在37℃，5％CO₂的培养箱中孵育24小时后，利用免疫印迹法检测MV-4-11细胞中的BET蛋白(BRD2,BRD3和BRD4)，免疫印迹实验参考实施例11。实验结果显示，TCB-2被PAMAM-G5-TCO吸收后，BET家族蛋白没有明显的降解，而TCB-2组的BET家族蛋白的降解是浓度依赖性的(见图15)。

用DMSO溶液配制TCB-2(5nM)以及TCB-2(5nM):PAMAM-G5-TCO为1：3的溶液，加入MV-4-11细胞中。依次在37℃，5％CO₂的培养箱中孵育0、2、4、8、12和24小时后，利用免疫印迹法检测MV-4-11细胞中的BET家族蛋白(BRD2,BRD3和BRD4)，免疫印迹实验参考实施例11。实验结果显示，TCB-2被PAMAM-G5-TCO吸收后，BET家族蛋白没有明显的降解，而TCB-2组的BET家族蛋白的降解是时间依赖性的(见图16)。

实施例21“连接-吸附”***终止细胞内TCP-1诱导的蛋白降解

用DMSO溶液配制TCP-1(150nM)以及TCP-1(150nM):PAMAM-G5-TCO为1：3的溶液，3倍稀释7个浓度，加入SW620细胞中。在37℃，100％空气的培养箱中孵育24小时后，利用免疫印迹法检测SW620细胞中的PARP蛋白，免疫印迹实验参考实施例11。实验结果显示，TCP-1被PAMAM-G5-TCO吸收后，PARP蛋白没有明显的降解，而TCP-1组的PARP蛋白的降解是浓度依赖性的(见图17)。

用DMSO溶液配制TCP-1(10nM)以及TCP-1(10nM):PAMAM-G5-TCO为1：3的溶液，加入SW620细胞中。依次在37℃，100％空气的培养箱中孵育0、2、4、8、12和24小时后，利用免疫印迹法检测SW620细胞中的PARP蛋白，免疫印迹实验参考实施例11。实验结果显示，TCP-1被PAMAM-G5-TCO吸收后，PARP蛋白没有明显的降解，而TCP-1组的PARP蛋白的降解是时间依赖性的(见图18)。

用DMSO溶液配制TCP-1(10nM)的溶液，加入SW620细胞中，依次在37℃，100％空气的培养箱中孵育0、2、4、8、12小时后收集细胞样品，将上述用TCP-1(10nM)孵育12h后的SW620细胞，以TCP-1:PAMAM-G5-TCO为1：3的比例加入PAMAM-G5-TCO后，依次在37℃，100％空气的培养箱中孵育0、2、4、6、8、12、24、36、48小时后收集细胞样品，将上述细胞样品利用免疫印迹法检测PARP蛋白水平，免疫印迹实验参考实施例11。实验结果显示，“连接-吸附”***可以在活细胞中终止PARP蛋白的降解(见图19)。

实施例22“连接-吸附”***吸收TCB-2终止细胞凋亡

用DMSO溶液配制TCB-2(5nM)、(+)-JQ-1(5nM)以及TCB-2(5nM)：PAMAM-G5-TCO(1：3)的溶液，加入MV-4-11细胞中孵育24小时后用流式细胞仪进行分析，实验结果表明，加入PAMAM-G5-TCO后，TCB-2诱导MV-4-11细胞凋亡的效果被有效终止(见图20)。

实施例23“连接-吸附”***终止TCB-2对细胞的增殖抑制效果

将MV-4-11细胞以5×10³细胞/孔的密度植入96孔板中培养。用DMSO溶液配制TCB-2(2μM)、(+)-JQ-1(2μM)、PAMAM-G5-TCO(2μM)以及TCB-2(5nM)：PAMAM-G5-TCO(1：3)的溶液，三倍稀释9个浓度梯度，加入MV-4-11细胞。实验方法与实施例16相同。

细胞活力测试显示，与PAMAM-G5-TCO孵育的TCB-2对MV-4-11细胞活力的抑制能力显著低于(+)-JQ1和游离TCB-2(见图21)。这表明：“连接-吸附”***成功终止了TCB-2对细胞的增殖抑制效果。

本发明的“连接-吸附”***可以快速清除细胞内的PROTACs分子，并终止事件驱动降解。该策略具有以下优势：首先，该体系能够快速而彻底地终止事件驱动降解，这得益于IEDDA反应的快速反应性和PAMAM-G5-TCO大分子表面的众多基团。其次，四嗪是一个小体积的功能片段，具有良好的生物相容性，可以很容易地应用于不同的分子设计中，具有很好的通用性；第三，该***操作简单，只需加入Tz-PROTACs或PAMAM-G5-TCO即可启动/关闭靶蛋白的降解过程，无需任何附加操作。综上所述，本发明为研究蛋白质降解提供了一种前所未有的工具，使根据需要灵活调整活细胞中的靶蛋白水平成为可能。

如上所述，尽管参照特定的优选实施例已经表示和表述了本发明，但其不得解释为对本发明自身的限制。在不脱离所附权利要求定义的本发明的精神和范围前提下，可对其在形式上和细节上作出各种变化。

Claims

1.一种树状大分子PAMAM-G5-TCO，其特征在于，所述树状大分子PAMAM-G5-TCO为反式环辛烯修饰的聚酰胺PAMAM树状大分子，其具有如下结构式：

2.一种权利要求1所述的树状大分子PAMAM-G5-TCO的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述有机溶剂选自甲醇。

4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌反应的温度为室温，搅拌反应的时间为0.5～1h。

5.权利要求1所述的树状大分子PAMAM-G5-TCO在终止靶向蛋白降解中的应用。

6.一种即时终止靶蛋白降解的连接-吸附***，其特征在于，所述***由权利要求1所述PAMAM-G5-TCO与可控蛋白水解靶向嵌合体组成，所述可控蛋白水解靶向嵌合体是以四嗪基团为母核的化合物，所述PAMAM-G5-TCO通过逆电子Diels-Alder反应形成PAMAM-PROTACs，完全吸收可控蛋白水解靶向嵌合体。

7.根据权利要求6所述的即时终止靶蛋白降解的连接-吸附***，其特征在于，所述可控蛋白水解靶向嵌合体具有通式I所示的结构式：

其中，

R₁选自

R₂选自

n＝1～3。

8.根据权利要求7所述的即时终止靶蛋白降解的连接-吸附***，其特征在于，所述可控蛋白水解靶向嵌合体选自：

其中，n＝1～3。

9.根据权利要求8所述的即时终止靶蛋白降解的连接-吸附***，其特征在于：n＝1。