CN115991736B

CN115991736B - 一种靶向cd137的多肽及其应用

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Publication number: CN115991736B
Application number: CN202210858614.8A
Authority: CN
Inventors: 王怡宁; 曲婵娟; 王子华; 陈跃鑫
Original assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Current assignee: Peking Union Medical College Hospital Chinese Academy of Medical Sciences
Priority date: 2022-07-21
Filing date: 2022-07-21
Publication date: 2023-08-22
Anticipated expiration: 2042-07-21
Also published as: CN115991736A

Abstract

本发明涉及分子生物学和医药技术领域，具体涉及一种靶向CD137的多肽及其应用。本发明提供了一种靶向CD137的多肽，为GGACIEEGQYCF。本发明的多肽对CD137具有较高的亲和力和特异性，能够特异高效地靶向CD137阳性细胞，可作为多肽分子探针用于检测动脉粥样硬化易损斑块的情况，以实时监控病情发展；还可作为靶向多肽，用于高表达CD137组织的成像，具有广阔的应用前景。

Description

一种靶向CD137的多肽及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学和医药技术领域，具体涉及一种靶向CD137的多肽及其应用。

背景技术

急性冠脉综合征是冠心病患者死亡的主要原因，病理基础为冠状动脉粥样硬化易损斑块的破裂或糜烂继发血栓形成致冠脉完全或不完全闭塞。易损斑块（Vulnerableplaque,不稳定斑块、高危斑块、软斑块）尚无公认的定义，主要特点包括斑块脂核比例较大（超过40%），成分主要为液态胆固醇酯，纤维帽薄（＜150μm），内部炎症反应和新生血管形成。“冠心病事件”风险主要取决于冠脉斑块的稳定性，而不是冠脉斑块所导致的狭窄程度，因此易损斑块的影像学评价以及如何逆转易损斑块是当今冠心病研究的热点之一。目前临床上对冠状动脉粥样硬化高风险斑块的影像学评价手段存在不足，目前临床上对易损斑块的诊断手段包括血管内超声、光学相干断层成像、冠脉增强CT、冠脉增强核磁等，但各有不足。具体如下：血管内超声（IVUS）：目前临床上评价斑块的金标准，为有创检查，病人接受率低；存在局限性和安全性：导管本身直径1mm，且推送能力差，在病变狭窄程度严重或血管扭曲明显的情况下，导管无法通过病变；可产生环晕伪像、不均匀伪像、导丝伪像、图像的几何扭曲、血液回声；不能可靠的识别血栓，不能分辨较小的斑块的破裂等。光学相干断层成像（OCT）：分辨率是IVUS的10倍，达到10微米，可检出细微的斑块破裂，但做检查时需要暂时阻断血流，可加重或诱发心肌缺血，且难以应用于开口病变。冠脉增强CT：敏感性和特异性相对较低，具体说来表现在：（1）不能发现冠脉远段或细小分支的病变；（2）很难区分富含脂质的斑块与富含纤维组织的斑块，因其CT密度值有重叠；（3）迄今为止空间分辨率不足以满足对冠脉斑块细微组织结构的评估，对斑块纤维帽的形态结构和厚度的评价有限，对于较小的斑块来说，其CT密度测量的准确性受部分容积效应的影响。冠脉增强MRA：仍处于临床前研究阶段，扫描时间长，运动伪影多，未广泛应用于临床。最重要的是这几项检查并不是早期诊断，亦不能反映高风险斑块的病理生理情况。磁共振软突出的优点为软组织和对比度分辨率高，可以清楚的区分软组织结构；可多参数，多平面成像，因此可以清楚地显示病变的位置和程度以及周围组织与器官之间的关系，可以准确判断病变，四氧化三铁已被批准应用于临床。荧光成像敏感性高，ICG已经应用于临床眼底荧光血管造影等。因此，在许多病变的定性，定位和量化在诊断方面上是有优越性的。

绝大多数医学工作者和科研人员对肿瘤免疫和靶向治疗较为熟知，然而心血管免疫和靶向示踪、治疗也是近年来心血管领域新兴的观念和发展方向。近年来一些欧美发达国家冠心病发病率和死亡率有所下降，但发现存在一部分特殊群体，虽给予了各种最优干预措施（包括他汀类药物），仍反复发生心血管意外，Nilsson J指出这是由动脉粥样硬化高风险斑块的其他机制决定的，如斑块阻塞管腔引起血流动力学改变从而使抗炎因子分泌减少、胆固醇等脂类导致的血管炎症及血管对斑块成分的自身免疫性应答，并指出需要新方法去检测、验证上述病理生理学机制。Antoniades C等人指出血管壁炎症也是心血管病的高危因素，它使血管壁异常表达的分子促进动脉粥样硬化进展，是非常有潜力的新治疗靶点，但是目前检测冠状动脉炎症的方法缺乏特异性（如血浆生物标志物）或者昂贵而不实用（PET）。Saba L等人则明确指出炎症标志物是检测易损斑块的影像学示踪靶标。炎症在斑块失稳中发挥了关键作用，固有免疫和适应性免疫均参与，血管内皮细胞、T细胞活化，单核/巨噬细胞释放大量促炎因子，如单核细胞趋化蛋白 (MCP-1)、INF-γ, TNF-α等，释放的基质降解蛋白酶使纤维帽的胶原纤维降解；促进斑块内新生血管形成。Olofsson PS等人证实CD137是表达于高风险斑块活化的血管内皮细胞、斑块内活化的T细胞和单核细胞膜表面的共刺激分子，具有高特异性，当配体与其结合时，促进斑块内白细胞进一步活化和增多、致炎因子分泌，有潜力作为高风险斑块示踪和治疗的靶点。

发明内容

基于此，有必要提供了一种靶向CD137的多肽及其应用。

为实现上述目的，本发明具体技术方案如下：

首先，本发明提供一种靶向CD137的多肽，其氨基酸序列为GGACIEEGQYCF。

进一步地，提供一种核酸，其编码所述多肽。

进一步地，提供所述多肽的偶联物，所述偶联物由所述多肽与载体以共价或非共价的方式连接或作用得到。

优选的，所述载体包括荧光素、抗体、多聚物、高分子材料、纳米材料、脂质体、油性化合物、无机材料中的任意一种或多种。

进一步地，提供所述多肽或所述核酸或所述生物材料或所述偶联物在制备用于CD137介导疾病的预防或治疗的药物、诊断试剂、诊断试剂盒或显影制剂中的应用。

优选的，所述CD137介导疾病包括动脉粥样硬化易损斑块。

进一步地，提供所述多肽或所述核酸或所述生物材料或所述偶联物在制备用于检测细胞CD137表达水平的试剂中的应用。

进一步地，提供一种用于CD137介导疾病的诊断试剂或试剂盒，其包含所述多肽或所述偶联物。

进一步地，提供一种显像制剂，包含所述的多肽或所述偶联物。

进一步地，提供一种荧光/磁共振双模态分子探针的制备方法，包括如下步骤：

（1）将疏水Fe₃O₄纳米颗粒用四氢呋喃稀释后加入DP-PEG-Mal并溶解，将反应液加热并振荡反应；

（2）用环己烷沉淀纳米颗粒，并洗涤，然后除去环己烷；

（3）干燥后的纳米颗粒溶于去离子水，进行离心超滤，并用去离子水洗涤；

（4）将DP-PEG-Mal修饰的Fe₃O₄纳米颗粒溶于Tris-HCl缓冲液后加入多肽搅拌混匀，再加入ICG-SH并搅拌反应。

（5）进行离心超滤，并用PBS缓冲液洗涤。

基于上述技术方案，本发明具有以下有益效果：

目前缺乏敏感性和特异性强、无创且可动态监测动脉粥样硬化易损斑块的方法，本发明在验证CD137表达于患者易损斑块标本及小鼠易损斑块模型标本的基础上，以基于靶向CD137蛋白的多肽偶联四氧化三铁及ICG，在动脉粥样硬化易损斑块模型鼠中进行鉴定，提供一种安全性高、敏感性和特异性强、无创且可动态监测易损斑块的分子探针。且该探针为双模态探针，既可以做荧光检测CD137的存在，又可以应用于磁共振检测。

附图说明

图1 鉴定动脉粥样硬化易损斑块模型及CD137免疫组化结果；

图2 CD137 @Fe₃O₄/ICG探针制备流程示意图；

图3 CD137 @Fe₃O₄/ICG探针体外表征测试结果；A：探针电镜图；B：探针磁共振T2信号与浓度线性关系；C：不同浓度的探针磁共振T2图；D：ICG、Fe₃O₄@ICG荧光波谱；E：不同浓度探针的荧光信号；F：探针细胞毒性实验；

图4 CD137 @Fe₃O₄/ICG探针在模型鼠体内对易损斑块示踪及成像；A：磁共振T2序列；B：磁共振压脂序列；C：注射造影剂1小时后信号情况；D：模型鼠注射造影剂前及注射后1小时T2信号柱状图；E：模型鼠注射探针前、注射后1小时荧光图；F：对照组和实验组注射探针后荧光信号柱状图；G：模型鼠离体主动脉弓及心脏、肺、肝脏、双肾、脾脏、胰腺、胃肠器官荧光信号；

图5 模型鼠和对照鼠注射探针1小时后获取的正常颈动脉、颈动脉稳定斑块、易损斑块的H&E染色（100μm），普鲁士蓝染色（50μm）以及定量柱状图。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

下述实施例所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所有的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1建立动脉粥样硬化易损斑块模型及鉴定

1．建立动脉粥样硬化易损斑块模型：

实验组：从华阜康购买30只ApoE敲除的c57/b6背景小鼠，喂养高脂饮食6个月；

对照组：10只c57/b6小鼠喂养普通饮食6个月。

2．对动脉粥样硬化易损斑块模型进行鉴定：对1中的实验组小鼠和对照组小鼠行超声检查，如图1A所示，发现实验组在主动脉弓及分支如颈动脉处有斑块形成凸起于管腔之中；如图1B所示，处死后取出主动脉及分支进行HE染色，发现其有多处斑块形成，斑块凸起于管腔之中；如图1C所示，对样本进行油红染色，可见大量脂质堆积于内膜之下，为易损斑块的特征，证实造模成功。

3．分别对临床患者颈动脉内膜剥脱术后的易损斑块、稳定斑块、正常血管，小鼠主动脉易损斑块、稳定斑块、正常血管进行CD137免疫组化，分别如图1D和E所示，可证实CD137表达在人和小鼠易损斑块中明显高于稳定斑块、正常血管，证明CD137是一个示踪易损斑块具有高敏感性、特异性的有潜力的靶点。

实施例2CD137靶向多肽文库的构建和筛选

1．实验仪器与材料

N-甲基吗啉(NMM)，哌啶，三氟乙酸（TFA），二氯甲烷（DCM），茚三酮，维生素C，苯酚，四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)，六氢吡啶，三异丙基硅烷(TIS)，乙二硫醇(EDT)，N,N二甲基甲酰胺(DMF)，无水***，树脂，甲醇，各种Fmoc保护氨基酸，Alexa Fluor 647-anti-CD137抗体，MB-Streptavidin（链霉亲和素磁珠），Streptavidin-HRP（链霉亲和素标记辣根过物氧化酶），三氯化铁六水合物（FeCl₃·6H₂O），油酸钠，无水乙醇，正己烷，油酸，1-十八烯，丙酮，四氢呋喃，DP-PEG-Mal（分子量2000 Da），环己烷，Tris-HCl缓冲液（1 mM，pH 7.4），吲哚菁绿-巯基（ICG-SH），超滤离心管（截留分子量为100 kDa），PBS缓冲液（0.01 M，pH 7.4）,多肽合成管，摇床，真空水泵，旋转蒸发仪，离心机，加热套，激光共聚焦显微镜（ZEISS LSM710），上述试剂和材料均从商业途径获得。

2．CD137 “一珠一物”多肽文库的合成

采用Fmoc固相肽合成方法合成多肽文库，具体方法为将被保护的氨基酸逐个偶联到固相树脂上，然后在强酸下将肽链从树脂上裂解同时去除侧链保护基团。

（1）称取200mg的Tentagel-NH2树脂，按照上述固相多肽合成程序循环，依次加入200mg的Met、Gly依次进行反应；

（2）待反应完成后，把树脂均分3份，向每管分别加入80 mg的Asp、Asn、Arg与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把3管树脂脱保护后混合，再把树脂均分为3份，向每管分别加入90mg的Glu、Arg、Lys与等量的HBTU进行偶联；

（3）待偶联完毕后，把3管树脂脱保护后混合。再把树脂均分为5份，向每管分别加入60mg的Ile、Ser、Thr、His、Gln与等量的HBTU进行偶联；

（4）待偶联完毕后，把5管树脂脱保护后混合。再把树脂均分为4份，向每管分别加入80 mg的Asp、Asn、Arg、Ile与等量的HBTU进行偶联；

（5）待偶联完毕后，把5管树脂脱保护后混合。再把树脂均分为2份，向每管分别加入100 mg的Gly、Ala与等量的HBTU进行偶联；

（6）待偶联完毕后，把2管树脂脱保护后混合。再把树脂均分为4份，向每管分别加入80mg的Glu、Lys、Thr、Asp与等量的HBTU进行偶联；

（7）待偶联完毕后，把4管树脂脱保护后混合。再把树脂均分为4份，向每管分别加入80mg的His、Tyr、Thr、Asn与等量的HBTU进行偶联；

（8）待偶联完毕后，把4管树脂脱保护后混合。再把树脂均分为5份，向每管分别加入80mg的Gln、Lys、Thr、Tyr、Arg与等量的HBTU进行偶联；

（9）待偶联完毕后，把5管树脂脱保护后混合。再把树脂均分为3份，向每管分别加入90mg的Glu、Ser、Arg与等量的HBTU进行偶联；

（10）待偶联完毕后，把3管树脂脱保护后混合。再把树脂均分为5份，向每管分别加入60mg的His、Tyr、Phe、Asp、Val与等量的HBTU进行偶联；

（11）待偶联完毕后，把5管树脂脱保护后混合。再把树脂均分为4份，向每管分别加入80mg的Gln、Asp、His、Asn与等量的HBTU进行偶联，待偶联完毕后，把4管树脂脱保护后混合。经过甲醇置换和收缩步骤，真空抽干，得到加载有肽库的干燥树脂备用。

3．CD137阳性多肽的筛选

（1）取干燥肽库用1×PBS洗3次，加入5%的脱脂牛奶在混旋仪上37℃对肽珠表面封闭2h，再用1×PBS洗3次；

（2）取生物素(biotin)标记的CD137蛋白与多肽库混合，37℃孵育2h后用1×PBS洗3次；

（3）然后分别取100µL MB-Streptavidin和Streptavidin-HRP同时加入肽库在混旋仪上37℃避光混合孵育2h。把孵育后含多肽库EP管置于磁力架上。阳性多肽受磁力影响吸附于EP管侧壁，而阴性多肽由于重力沉降在EP管底。

阳性多肽珠与生物素标记的受体蛋白孵育后，阳性肽珠特异性识别蛋白，标记HRP和磁珠的链霉亲和素通过识别生物素而识别阳性肽珠。阳性肽珠表面将包覆一层磁珠具有磁性，从而被磁场捕获，同时由于辣根过物氧化酶的催化变蓝色。将阳性肽珠转移到微芯片阵列中，滴加溴化氢原位裂解，用MALDI-TOF-MS鉴定，通过Mascot数据库解出相应序列信息K。按序列重新合成阳性多肽部分标记荧光，MALDI-TOF鉴定和HPLC纯化用于后续试验。经化学合成制得本发明的1条靶向CD137的多肽为：GGACIEEGQYCF（SEQ ID NO:1）。

实施例3多肽偶联物的制备

本实施例以多肽荧光/磁共振双模态偶联物制备为例，说明多肽偶联物的制备方法，具体如下：

1．疏水Fe₃O₄纳米颗粒的合成

将10.8 g FeCl₃·6H₂O和36.5 g油酸钠溶于由80 mL乙醇、140 mL正己烷和60 mL去离子水组成的混合溶剂中。将反应液搅拌加热至70℃反应4 h。随后，通过分液漏斗对反应液萃取，留上层有机相，并用去离子水洗涤上层有机相三次。清洗完成后，旋转蒸发除去正己烷，并在真空干燥中过夜，得到黑色蜡状油酸铁复合物。取3.6 g油酸铁复合物和3.39g油酸溶解在25 mL的1-十八烯中，将其以3.3℃/min的升温速率升温至310℃，并在氩气保护下搅拌反应30 min。反应结束后，反应液在室温条件下冷却至室温，随后通过丙酮沉淀，并进行磁分离。同时，将磁分离的粗品疏水Fe₃O₄纳米颗粒用丙酮洗涤3次，获得疏水Fe₃O₄纳米颗粒，并保存至四氢呋喃中。

2．靶向CD137蛋白的双模态分子探针的制备

将疏水Fe₃O₄纳米颗粒用四氢呋喃稀释至1 mg/mL。取10 mL该溶液加入150 mg DP-PEG-Mal并溶解。将反应液通过金属浴加热至60℃并震荡反应12 h。随后，用环己烷沉淀纳米颗粒，并用环己烷洗涤三次，然后在室温下真空干燥除去环己烷。干燥后的纳米颗粒溶于去离子水，用100 kDa截留分子量的超滤管离心超滤，并用去离子水洗涤3次，以除去未修饰上的DP-PEG-Mal。将DP-PEG-Mal修饰的Fe₃O₄纳米颗粒以3 mg/mL溶于Tris-HCl缓冲液（1mM，pH 7.4）,随后，加入360 μg筛选后的CD137阳性多肽，37℃搅拌混匀20分钟，再加入ICG-SH，4℃搅拌反应48 h。最后，用100 kDa截留分子量的超滤管离心超滤，并用PBS缓冲液（0.01 M，pH 7.4）洗涤3次，以除去未偶联的CD137阳性多肽和ICG-SH，制备成探针CD137 @Fe3O4/ICG，如图2。

实施例4靶向CD137蛋白的双模态分子探针功能验证

1．对分子探针CD137 @Fe3O4/ICG进行体外表征测试

图3A为其电镜图片；如图3B所示，磁共振T2信号与探针浓度呈线性关系，R²=0.997；如图3C所示，不同浓度的探针磁共振T2图，随着铁浓度增加，T2信号增高；如图3D所示，ICG发射，Fe3O4/ICG吸收、发射荧光波谱；如图3E所示，荧光信号与探针浓度之间的关系，荧光信号与探针浓度呈线性关系，R²=0.9809；如图3F所示，细胞毒性试验，说明探针铁浓度在50μg以下时是安全的，毒性低。

2．分子探针CD137@Fe3O4/ICG在体内对易损斑块示踪及成像

为了实现对动脉粥样硬化易损斑块的靶向追踪，在小鼠动脉粥样硬化模型中尾静脉注射CD137@Fe3O4/ICG分子探针后进行荧光和MRI成像。体内 MRI 结果：图4A显示注射前磁共振T2序列，箭头所示处血管腔中较高信号影；图4B显示磁共振压脂序列，同层面所示处较高信号影减弱消失；图4C显示注射分子探针1小时后所示处信号减弱消失；图4D 还表明CD137@Fe3O4/ICG分子探针对颈动脉斑块具有明显的 T2 增强作用，注射探针1h后采集图像，T2 值为10.69± 1.91，注射探针前的T2 值为14.03 ± 1.02，P < 0.05。

荧光结果：图4E的荧光图像显示，模型鼠在注射探针前没有荧光信号，注射后1小时出现明显的荧光信号；图4F显示，注射 CD137@Fe3O4/ICG分子探针后，HFD喂养组位于主动脉弓和颈动脉处的斑块的信号强度远高于对照组，尤其是在注射后1小时（1 h：1.14 ±0.42×10⁸ 与 4.90 ± 2.21×10⁶，p/sec/cm² /sr，P < 0.05）。结果说明分子探针对易损斑块有特异性响应；图4G显示，从注射CD137@Fe3O4/ICG的HFD喂养组中分离出的主动脉的体外成像进一步支持了在主动靶向时，体内光信号来源于主动脉弓和颈动脉。

模型鼠和对照组小鼠分别注射探针1小时后分离颈动脉行H&E染色和普鲁士蓝染色。如图5所示，H&E染色显示探针可定位于易损斑块，普鲁士蓝定量分析显示易损斑块与稳定斑块有显著差异，正常动脉普鲁士蓝染色阴性，进一步说明CD137@Fe3O4/ICG分子探针在靶向易损斑块时具有特异性。

虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种靶向CD137的多肽，其特征在于，其氨基酸序列为GGACIEEGQYCF。

2.权利要求1所述多肽在制备用于检测细胞CD137表达水平的试剂中的应用。

3.一种荧光/磁共振双模态分子探针的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将疏水Fe₃O₄纳米颗粒用四氢呋喃稀释后加入DP-PEG-Mal并溶解，将反应液加热并振荡反应；

(2)用环己烷沉淀纳米颗粒，并洗涤，然后除去环己烷；

(3)干燥后的纳米颗粒溶于去离子水，进行离心超滤，并用去离子水洗涤；

(4)将DP-PEG-Mal修饰的Fe₃O₄纳米颗粒溶于Tris-HCl缓冲液后加入权利要求1所述的靶向CD137的多肽搅拌混匀，再加入ICG-SH并搅拌反应；

(5)进行离心超滤，并用PBS缓冲液洗涤。

4.根据权利要求3所述的制备方法制备的荧光/磁共振双模态分子探针，其特征在于，其包含权利要求1所述多肽。