CN115990187B - 一种用于改善阿尔茨海默病的中药提取物及其应用 - Google Patents
一种用于改善阿尔茨海默病的中药提取物及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药技术领域，具体提供了一种用于改善阿尔茨海默病(AD)的中药提取物，包括金银花多糖，还可包括连翘酯苷A。本发明提供的这种中药提取物由植物天然产物组成，通过神经炎症通路/肠道微生态双途径介导细胞功能，以减轻神经炎症为目标对AD进行干预，能够缓解Aβ25‑35诱导的HT‑22细胞损伤，促进小鼠空间记忆的形成和巩固，显著缓解AD病理表征，并通过调控IL‑17信号通路相关基因的表达来缓解AD病理中的神经炎症，还可通过调节特定物种的丰度、促进有益菌增加，纠正肠道菌群紊乱来改善AD模型小鼠认知功能障碍，对改善AD有显著效果，是一种安全、有效的多靶点药物。
Description
技术领域
本发明属于医药领域，具体涉及一种用于改善阿尔茨海默病的中药提取物及其应用。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是常见的神经退行性疾病，是引起老年痴呆的主要原因之一，病理特征包括脑内细胞外β淀粉样蛋白(Aβ)的沉积形成老年斑以及细胞内Tau蛋白过度磷酸化形成神经纤维缠结受遗传、环境等因素的影响，AD表现出潜伏期长、病程久等特点，一旦发生便不可逆转，且各种治疗手段只能延缓其病程发展，不能进行根治。目前主要使用胆碱酯酶抑制剂和谷氨酸受体拮抗剂(如多奈哌齐、美金刚)、靶向Aβ单抗药物、非甾体抗炎药等治疗AD，其治疗有一定效果，但副作用明显，并且仅限于某些针对症状，不能达到最佳的预防和治愈效果。为克服化学药在治疗上的不足，具有多靶点和副作用少等特点的植物天然产物获得了广泛关注，抗AD植物药的开发已成为当前热门发展方向。
金银花是忍冬科植物忍冬(Lonicera japonica Thunb.)的干燥花蕾，在我国具有很长的用药历史，具有清热解毒、抗病毒、抗菌、抗炎、免疫增强、清除自由基、抗内毒素等功效。连翘(Forsythia suspensa)是木犀科连翘属植物，具有抗病毒、抗菌、抗氧化和抗炎等药理作用。金银花和连翘是常用药对，联用能够增强清热解毒、疏散风热的功效。除代表性方剂银翘散之外，在现有上市的中成药中，涉及金银花-连翘药对的中成药制剂有400余种。网络药理学研究表明金银花连翘1:1配伍使用具有比单独使用更强的抗炎作用；药对中金银花、连翘的单煎、合并及混煎样品的物质基础被证实发生了变化；此外，金银花连翘药对配伍对多糖的溶出具有促进作用。
目前苯乙醇苷类化合物和植物多糖在AD治疗中的作用逐渐被证实，而多糖和酚类物质之间的分子相互作用可以影响生物利用度和有益作用。连翘酯苷A是连翘的主要成分，属于苯乙醇苷类化合物，具有保护神经、改善记忆损伤、修复神经元的功能；金银花多糖能够通过调节肠道菌群以及短链脂肪酸生成改善免疫抑制小鼠肠道免疫功能。因此，结合二者在AD治疗中可能发挥的作用及机制，通过神经炎症通路/肠道微生态双途径介导细胞功能，以减轻神经炎症为目标对AD进行干预不失为一个极具潜力的研究方向。本发明提供了一种中药提取物，通过神经炎症通路/肠道微生态双途径介导细胞功能，以减轻神经炎症为目标对AD进行干预。
发明内容
本发明的目的是提供一种可用于改善AD的安全、有效的多靶点药物，以克服现有技术中AD临床治疗药物多为单一靶点的化学药物，疗效欠佳，且副作用较大的问题。
为此，本发明提供了一种用于改善阿尔茨海默病的中药提取物，包括金银花多糖，所述金银花多糖通过以下方法制备：将金银花粉碎后，采用超声水提法进行提取，离心取上清液，浓缩后加入乙醇静置，然后离心取沉淀，沉淀加水溶解后萃取脱蛋白，得金银花粗多糖；将金银花粗多糖柱层析纯化，得所述金银花多糖。
具体的，上述超声水提法的提取条件为超声时间25-35min，超声温度55-65℃，料液比以体积质量比计为1:25-1:35。
具体的，上述金银花多糖制备过程中加入Savag试剂萃取脱蛋白；所述Savag试剂包括氯仿和正丁醇；所述氯仿与所述正丁醇的体积比为4：1。
具体的，上述金银花多糖制备过程中将金银花粗多糖经DEAE-52纤维素层析柱、Sephadex G-100凝胶层析柱纯化，得所述金银花多糖。
具体的，上述中药提取物还包括连翘酯苷A；所述连翘酯苷A和所述金银花多糖的质量浓度比为1:2到1:6。
具体的，上述连翘酯苷A的制备方法为：将连翘叶粉碎后置于容器中，使用乙醇溶液浸提，然后使用树脂进行吸附、洗脱，采用反相层析法处理洗脱液，得到所述连翘酯苷A。
具体的，上述浸提过程中乙醇浓度为40-50％，液料比以体积质量比计为25:1-30:1，提取温度40-60℃，提取时间20-30min。
具体的，上述吸附、洗脱过程中以AB-8大孔吸附树脂为吸附剂，先用5-10BV的水洗脱，再用5-10BV的30％乙醇溶液和5-10BV的50％乙醇溶液分别洗脱，洗脱流速2-5BV/h。
本发明提供的这种中药提取物可用于制备改善AD的药物。
具体的，上述改善AD的药物以金银花多糖与连翘酯苷A混合物或金银花多糖为活性成分，还包括药学上可接受的辅料。
与现有技术相比，本发明具有以下优点和有益效果：
本发明提供的这种中药提取物通过神经炎症通路/肠道微生态双途径介导细胞功能，以减轻神经炎症为目标对AD进行干预，能够缓解Aβ25-35诱导的HT-22细胞损伤，促进小鼠空间记忆的形成和巩固，显著缓解AD病理表征，并通过调控IL-17信号通路相关基因的表达来缓解AD病理中的神经炎症，还可通过调节特定物种的丰度、促进有益菌增加，纠正肠道菌群紊乱来改善AD模型小鼠认知功能障碍，对改善AD有显著效果。此外，该中药提取物由植物天然产物组成，是一种安全、有效的多靶点药物，克服了单一靶点的化学药物疗效欠佳，且副作用较大的问题。
以下将结合附图对本发明做进一步详细说明。
附图说明
图1是本发明实施例2中FA和/或LP的细胞毒性以及其对Aβ25-35诱导的HT-22细胞损伤的影响；a、b和c：FA和/或LP在HT-22细胞上的细胞活力的统计分析；d、e和f：FA和/或LP对Aβ25-35诱导的HT-22细胞死亡的细胞活力的统计分析。
图2是本发明实施例2中连翘酯苷A、金银花多糖及其混合物对Aβ25-35诱导的HT-22细胞线粒体膜电位的影响结果图。
图3是本发明实施例3中小鼠的空间探索实验结果；a,实验设计；b,红外轨迹记录；c,定位航行实验中小鼠找到平台所需的时间；d：空间探索实验中小鼠穿越平台所在象限的次数；e,空间探索实验中小鼠搜寻平台的游泳路径；f：空间探索实验中小鼠在目标象限内滞留的时间。
图4是本发明实施例3中连翘酯苷A、金银花多糖及其混合物对Aβ诱导的HT-22细胞及小鼠血清中炎症因子含量的影响。
图5是本发明实施例3中连翘酯苷A、金银花多糖及其混合物对小鼠脑部海马区以及皮层中Aβ25-35蛋白含量免疫荧光反应的影响。
图6是本发明实施例4中MIX组与APP/PS1组小鼠脑组织差异基因的KEGG生物过程类别。
图7是本发明实施例4中小鼠脑组织中差异基因表达水平验证；a为Il-17a、Act1、Ifkba、Nfkbp65和cox2表达水平的PCR验证；b为NFκBp65和IL-17A的Western blot验证；c为Western blot量化图。
图8是本发明实施例5中金银花多糖联合连翘酯苷A对AD小鼠肠道菌群alpha多样性和结构的影响。
图9是本发明实施例5中AD小鼠肠道菌群各分类群优势物种分布。
具体实施方式
下面将结合实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。尽管已经详细描述了本发明的代表性实施例，但是本发明所属技术领域的普通技术人员将理解，在不脱离本发明范围的情况下可以对本发明进行各种修改和改变。因此，本发明的范围不应局限于实施方案，而应由所附权利要求及其等同物来限定。
下面通过具体实施例对本发明的药物组合物及其应用的效果进行研究。
实施例1：
本实施例提供了一种用于改善阿尔茨海默病的中药提取物，包括金银花多糖和连翘酯苷A，其中各组分通过以下步骤获取。
本实施例所用连翘叶采自山西省安泽县，金银花样品采自河北省巨鹿县，经分别鉴定为木犀科连翘属植物连翘的叶和忍冬科植物忍冬，均烘干后低温保存。
(1)金银花多糖的提取纯化
干燥后的金银花粉碎后过4号筛，采用超声水提法进行提取，超声时间30min，超声温度60℃，料液比以体积质量比计为1:30。滤液离心取上清液，浓缩至适当体积，加入95％乙醇使含醇量为80％，静置48h，离心取沉淀。沉淀加适量水溶解，加入Savag试剂(氯仿：正丁醇＝4：1)萃取脱蛋白，重复操作至无变性蛋白产生为止。将脱蛋白后的多糖溶液浓缩至适当体积，冻干后即得金银花粗多糖。金银花粗多糖样品溶于水中，充分溶解后上样于DEAE-52纤维素层析柱、Sephadex G-100凝胶层析柱对粗多糖进行纯化，得到纯化后的金银花。纯化后金银花多糖的得率为1.15％，金银花多糖中多糖含量为96.31％，气相色谱结合质谱鉴定得到金银花多糖的单糖组成为***糖、鼠李糖、核糖、木糖、甘露糖、果糖、半乳糖、葡萄糖。
(2)连翘酯苷A的提取纯化
将连翘叶粉碎后置于容器中，使用浓度为46％的乙醇溶液浸提，液料比为29：1(mL:g)，提取温度51℃，提取时间28min。然后以AB-8大孔吸附树脂为吸附剂进行吸附，先用8BV的水洗脱，再用6BV的30％乙醇溶液和6BV的50％乙醇溶液分别洗脱，洗脱流速3BV/h。最后采用C18-硅胶柱反相层析法处理洗脱液，得到纯化的连翘酯苷A。连翘酯苷A的提取率为5.95％，纯度达96％。
实施例2：
Aβ25-35是Aβ引起神经毒性的主要种类之一，体内试验表明，其能导致记忆力下降和脑内炎症的发生，研究表明由Aβ25－35诱导产生的促炎细胞因子，如IL-1β、TNF-α能够引起神经元凋亡，与AD的发病具有密切的关系。本实施例研究了实施例1提供的金银花多糖和连翘酯苷A对Aβ25-35诱导的HT-22神经细胞损伤的改善作用。
1、细胞培养
HT22小鼠海马神经元细胞(337709；BeNa Culture Collection,China)在添加了10％胎牛血清(FBS)、1％100U/mL青霉素和100μg/mL链霉素的培养基(DMEM)中培养，培养温度为37℃，浓度为5％/95％ CO2/空气。
2、细胞毒性
HT22细胞以4.0×104细胞/孔的密度接种到96孔板中，使用不同浓度比的连翘酯苷A(FA)和/或金银花多糖(LP)预处理3h，然后用Aβ25-35(Sigma-Aldrich,USA)孵育24h。随后，在每孔中加入10μL的3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基溴化四唑(MTT)(Sigma-Aldrich,USA)(5mg/ml)，在黑暗中孵育4h。最后，在每孔中加入100μL DMSO溶解福玛赞晶体。为了分析细胞活力，使用SynergyTM4Microplate Reader(BioTek Instruments,USA)在490nm处分析每个孔的光密度。
结果如图1所示，连翘酯苷A的安全浓度是20-100μg/mL，金银花多糖的安全浓度为100 -500μg/mL。如图1所示，在安全浓度范围内，连翘酯苷A和金银花多糖单独处理均改善了Aβ25-35诱导的HT-22细胞损伤，联合使用连翘酯苷A和金银花多糖处理细胞也对细胞无显著毒性，且改善了Aβ25-35诱导的HT-22细胞损伤。
3、连翘酯苷A和金银花多糖混合比例
将连翘酯苷A和金银花多糖以多种比例(1:1到1:10)混合于细胞实验体系筛选其最佳浓度配比，结果如表1所示，当连翘酯苷A和金银花多糖的质量浓度比为1：5时，其EC50值最小，表明其作用效果最强。
表1 FA/LP混合物对Aβ25-35诱导的HT-22细胞损伤的抑制作用(以EC50表示)
数据为平均值±标准差，a、b、c、d:各组比较的显著差异用不同的字母表示，P＜0.05。
4、线粒体膜电位(MMP)检测
为了验证连翘酯苷A和金银花多糖的协同作用效果，使用二者1：5比例的混合物进行了其对Aβ25-35诱导的HT-22细胞线粒体膜电位影响的作用。
HT22细胞以4.0×104细胞/孔的密度接种到6孔板中，以不同浓度的连翘酯苷A和/或金银花多糖预处理3h，用Aβ25-35孵育12h。然后用2μM的5,5’，6,6’-四氯-1,1’，3,3’-四乙基-咪达碳菁碘化染色液(jc-1,420,200；EMD Millipore,USA)在黑暗中照射20分钟。使用荧光显微镜和CCD相机(200倍放大；TE2000；尼康，日本)，并使用ImageJ软件1.46版本进行量化。红绿荧光强度之比被用作MMP变化的指标。结果如图2所示，连翘酯苷A和金银花多糖混合物能够显著改善Aβ25-35导致的细胞膜电位下降，表明连翘酯苷A和金银花多糖在Aβ25-35诱导的HT-22细胞损伤中可发挥协同缓解作用。
综上所述，金银花多糖单独或与连翘酯苷A联合处理细胞，均改善了Aβ25-35诱导的HT-22细胞损伤。金银花多糖和连翘酯苷A混合物之间具有协同作用，其中浓度比为1：5时，协同作用最强。通过金银花多糖和连翘脂苷A预处理后，细胞的形态得到了明显的改善，细胞增值率明显升高，说明金银花多糖和连翘脂苷A能够抑制由Aβ25－35引起的细胞毒性。
实施例3：
本实施例研究了实施例1提供的金银花多糖联合连翘酯苷A对AD小鼠治疗作用药效。
1、动物饲养和分组
雄性6月龄APP/PS1小鼠和C57B6/J小鼠购自北京斯贝福生物科技有限公司，在室温22℃下，12h明暗循环标准条件下饲养。APP/PS1双转基因小鼠随机分为4组:模型组APP/PS1(生理盐水5mL/kg/d)，金银花多糖组LP(200mg/kg/d)，连翘酯苷A组FA(40mg/kg/d)，金银花多糖联合连翘酯苷A组MIX(连翘苷A 40mg/kg/d+金银花多糖200mg/kg/d)，以6月龄CLB57野生型小鼠为空白对照组W(生理盐水5mL/kg/d)，每组12只。灌胃给药6周，每日测量体重。
2、统计分析
使用GraphPad Prism统计软件(9.0版本；GraphPad软件公司，圣地亚哥，加利福尼亚州，美国)。所有数据均以均数±标准差表示，采用单因素方差分析确定统计学显著性，统计显著性的置信水平设为P<0.05。
3、Morris水迷宫
实验小鼠的学***台。平台直径8厘米，位于彩色水面以下1厘米处。实验是在一个安静、温度可控(25℃)的房间里进行的。实验小鼠于第5周进行训练，训练5d后进行正式试验。记录90秒内的逃逸延迟(即找到平台的时间)。
结果如图3所示，模型组小鼠穿越平台所在象限的次数显著低于正常组小鼠，同时其在目标象限内滞留时间也较正常组明显减少。野生组、金银花多糖组、连翘酯苷A组小鼠穿越平台所在象限的次数与模型组相比明显增多，金银花多糖联合连翘酯苷A组小鼠与模型组相比，穿越平台所在象限的次数和在目标象限内滞留时间均有显著改善。结果表明，金银花多糖和连翘酯苷A单独或联合处理均能促进小鼠空间记忆的形成和巩固。
4、小鼠血清炎症因子表达的ELISA分析
为了测定炎症细胞因子的表达，小鼠血清TNF-α、IL-6和IL-1βELISA试剂盒按照制造商说明(上海酶联生物技术有限公司，上海，中国)进行检测。
结果如图4所示，金银花多糖联合连翘酯苷A能降低包括TNF-α、IL-6在内的炎症因子的蛋白表达。
5、海马和皮层中Aβ蛋白表达的免疫荧光分析
AD的一个重要病理表征是皮层和海马区淀粉样蛋白Aβ的沉积。本实验采用免疫荧光进一步观察连翘酯苷A和金银花多糖对APP/PS1小鼠脑皮层和海马区淀粉样蛋白沉积的影响。
处死APP/PS1小鼠，大脑于4％多聚甲醛灌浸泡固定至少1天，收集海马和皮层切片，然后用含0.3％ Triton X-100的0.1M PBS处理。将上述切片用4％多聚甲醛固定，然后用Triton-X 100在室温下渗透30分钟。阻塞非免疫血清30分钟后，切片进一步与兔抗neun(1:50 00，亲和性)，GFAP(1:5000，亲和性)，Iba1(1:50 00，亲和性)，8-OHdG(1:50 00，亲和性)和GPX4(1:50 00，亲和性)在4℃孵育过夜。然后这些切片与二级抗体包括Alexa546共轭山羊抗兔IgG(1:50 00，赛默飞世尔科学)，Alexa 488共轭山羊抗小鼠IgG(1:50 00，赛默飞世尔科学)和DAPI(1:1000，亲和力)在室温下孵育2小时在37℃。染色图像由荧光显微镜(Nikon，日本)获得，并由共聚焦激光显微镜(Lecia，德国)捕获。用Image J软件对图像的数量、面积和荧光强度进行量化。
结果如图5所示，白色的点为淀粉样蛋白，对照组小鼠皮质和海马区无淀粉样蛋白沉积。实验结果显示，模型组小鼠脑皮层和海马区与正常组小鼠相比均有明显变化，沉积物密度和面积均增大。与模型组比较，金银花多糖组、连翘酯苷A组、金银花多糖联合连翘酯苷A组小鼠脑内淀粉样蛋白的数量和面积均有不同程度的减少。其中，金银花多糖联合连翘酯苷A组与模型组具有显著差异，表明其对淀粉样斑块沉积有改善作用，二者对小鼠脑损伤、认知和行为有恢复作用。以上结果提示，金银花多糖、连翘酯苷A及两者的混合物可减少淀粉样蛋白在APP/PS1小鼠皮质和海马中的沉积，减轻淀粉样蛋白起的病理损伤。
实施例4：
本实施例研究了实施例1提供的金银花多糖与连翘酯苷A混合物基于IL-17信号通路干预AD的机制。
1、脑组织RNA的提取、文库构建和测序
将小鼠的完整脑组织提取总RNA。RNA降解和污染在1％琼脂糖凝胶中进行评估，并使用量子比特2.0荧光计中的量子比特RNA检测试剂盒(Life Technologies,Carlsbad,CA,USA)测定其浓度。根据制造商的建议，使用Illumina TruSeq RNA样本制备试剂盒(Illumina,San Diego,CA,USA)对文库进行测序，并添加4个索引代码来为每个样本指定序列。第一链cDNA合成使用随机寡核苷酸和SuperScript II。第二链cDNA合成使用DNA聚合酶I和RNase h进行，其余悬垂部分通过添加外切酶和聚合酶转化为钝端。将DNA片段的3'端进行腺苷化修饰后，连接Illumina PE适配器寡核苷酸进行杂交。在10循环PCR中，使用Illumina PCR引物鸡尾酒选择性富集两端连接适配器分子的DNA片段。使用ABIStepOnePlus实时PCR***和Agilent 2100生物分析仪***对产品进行定量分析后集群生成***上对索引编码样本进行聚类。聚类生成后，在Illumina HiSeq 4000平台上对文库制剂进行测序。
2、基因注释和表达谱分析
测序后，使用SeqPrep和镰刀软件去除适配器和低质量序列，对原始reads进行清理。随后，使用TopHat2软件进行序列比对，将获得的干净reads映射到已知的小鼠基因组(ftp://ftp.ensembl.org/pub/release89/fasta/mus_musculus/dna/Mus_musculus.GRCm38.dna.toplevel.fa.gz)，然后使用CuSinks软件组装成基因。使用GO、KEGG、COG、NR、SWISS-PROT和PFAM数据库生成补充材料中提供的数据。通过计算每千碱基转录本每百万映射读取(FPKM)值的片段分析注释基因的表达，以及利用edgeR软件(3.8.2版本)比较其FPKM值，从而识别出恒表达基因(DEGs)。
3、用qRT-PCR和western blot对DEGs进行验证
通过转录组测序分析鉴定的DEGs使用Applied Biosystems 7900快速实时PCR***(Foster,CA,USA)进行定量逆转录-聚合酶链反应(qRT-PCR)验证。设计了跨越外显子-外显子边界的引物用于qRT-PCR，使用Platinum Taq聚合酶(Invitrogen)和SYBR Green(Bioneer Inc.，Seoul,Korea)进行。用管家基因β-actin进行数据归一化处理。
全脑组织在PRO-PREP蛋白提取液中均质(iNtRON Biotechnology Inc.，Seongnam,Korea)。用20μg全蛋白测定CAT和SREBP-1C水平。蛋白质在10％ Tris-HCl聚丙烯酰胺凝胶上根据蛋白质的分子量进行凝胶电泳分离，并转移到聚偏二氟乙烯膜上。用5％的BSA在TBST中阻断膜，然后用特定的一抗(TBST中稀释，1:1000)在4”C孵育一夜，然后用相应的酶联抗兔/小鼠二抗(TBST中稀释，1:500)在室温下孵育1小时。蛋白质条带检测过程中使用ECL选择Western Blotting检测Regent试剂盒(GE Healthcare,Chicago,IL,USA)。使用Bio-Rad ChemiDoc XRS成像***扫描膜，并使用Bio-Rad Quantity One软件(Bio-Rad,CA,USA)分析能带强度。
4、结果与分析
本实施例利用Illumina Hiseq4000测序平台构建小鼠脑组织cDNA文库并测序，评估小鼠脑基因表达图谱。本次分析共共获得252.76Gb Clean Data，各样品Clean Data均达到6.9Gb以上，Q30碱基百分比在92.94％以上；分别将各样品的Clean Reads与指定的参考基因组进行序列比对，比对率从95.81％到96.55％不等；表达量分析：本次分析共检测到表达基因共34130个，其中已知基因33639个，新基因491个；表达转录本共122410个，其中已知转录本104511个，新转录本17899个。此外，还获得了在参考基因组上具有唯一和多个位置的clean reads，以及可成功比对到参考基因组正链和负clean reads，这些结果表明此转录组数据有效，适合于进一步分析。
基于表达量定量结果，比较了不同处理组转录组的差异基因表达情况。进行组间差异基因分析，获得两组间发生差异表达的基因，差异分析软件为：DESeq2，筛选阈值为：|log2FC|>＝1&p value<0.05，结果表明，W组有449个基因与APP/PS1组存在差异表达(超过1.5倍，p值<0.05)，其中388个为上调，111个为下调；MIX组有419个基因与APP/PS1组存在差异表达(分别有139基因上调和280个基因下调)。为了评价金银花多糖联合连翘酯苷A对AD病理的影响机制，使用DAVID数据库对MIX组和APP/PS1组的419个差异表达基因进行了分析，如图6所示，139个上调和280个下调的差异表达基因主要富集在“信号分子反应”、“免疫***”和“信号转导”中，表明金银花多糖联合连翘酯苷A可能通过参与这些途径来改善AD小鼠缺陷。
如图7所示，转录组数据分析结果表明，模型组(APP/PS1)小鼠脑组织Il-17a基因的mRNA表达水平显著高于野生组(W)小鼠，而金银花多糖联合连翘酯苷A给药组(MIX)小鼠脑组织Il-17a基因的mRNA表达水平明显低于APP/PS1，同样，模型组小鼠脑组织中Act1基因的mRNA表达水平显著高于野生组(W)，而金银花多糖联合连翘酯苷A给药组(MIX)脑组织中Act1基因的mRNA表达水平明显低于模型组；关于Nfkbp65基因，分析结果表明，模型组(APP/PS1)的该基因mRNA水平较野生组(W)显著上调，而金银花多糖联合连翘酯苷A给药组的该基因mRNA表达水平则比模型组显著下调。关于Cox2基因，分析结果表明，模型组(APP/PS1)的该基因mRNA水平较野生组(W)显著上调，而金银花多糖联合连翘酯苷A给药组的该基因mRNA表达水平则比模型组显著下调。
将此部分转录组数据采用qRT-PCR验证，结果与mRNA测序数据一致，即与模型组(APP/PS1)小鼠相比，金银花多糖联合连翘酯苷A给药组(MIX)小鼠Il-17a、Act1、Ifkba、Nfkbp65和Cox2的相对表达减少。Western blot进行验证表明金银花多糖联合连翘酯苷A能够抑制IL-17A和Nfkbp65蛋白表达量的升高。这些结果表明金银花多糖联合连翘酯苷A可以通过调控IL-17信号通路相关基因的表达来缓解AD病理中的神经炎症。
实施例5：
本实施例研究了实施例1提供的金银花多糖与连翘酯苷A混合物基于肠道菌群干预AD的机制。
为避免环境和饮食因素对肠道菌群的影响，所有实验动物均在同一饲养室进行相同食水饲养。
1、材料与方法
肠道内容物组织取自结肠，液氮冷冻后于-80℃保存备用。采用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，每组5个粪便样品。采用16S rRNA测序法进行AD小鼠肠道菌群多样性检测。
用琼脂糖凝胶电泳测定DNA的纯度和浓度。样品用无菌水稀释至1ng·μl-1。以稀释的基因组DNA为模板，16S V3-V4区为测序区。使用了特定的条形码引物。使用Takara ExTaq高保真酶(Bio-Rad，CA，USA)将引物343F(5’-TacgGraggCAGcG-3’)和798R(5’-AgggtatCtaatCCT-3’)用于PCR。PCR产物经电泳检测，磁珠纯化，作为双轮PCR扩增的模板。净化后，量子比特被量化。
最后，根据PCR产物浓度混合等分试样并在Illumina-Miseq(Cal，USA)机器上测序。使用三角软件对原始的两端序列(FASTQ格式)进行整理。当质量小于20时，先前的高质量序列被截获。在生成高质量序列后，利用Vsearch软件根据序列的相似性将其分类为多个OTU。97％以上的序列相似性被归类为一个OTU单元。采用QIIME软件包对各OTU的代表性序列进行筛选。将所有代表性序列进行比较并用Silva(Version132)数据库进行注释，保留置信区间大于0.7的注释结果。
2、结果与分析
采用Kruskal-Wallis检验分析组间Alpha多样性指数差异是否显著。以Observe、Chao1和Shannon指数为例，组间差异分析的箱形图如图8所示。对于基因模型小鼠，Observe、Chao1指数显示，其与对照组有明显的差异，说明基因模型小鼠肠道菌群有明显紊乱。金银花多糖联合连翘酯苷A给药后，对模型小鼠的正常肠道菌群有显著的影响。
如图9所示，连翘酯苷A联合金银花多糖给药对肠道菌群门类别上的丰度有明显的影响。与野生组小鼠相比，AD模型小鼠肠道菌群在门类别上的丰度上有显著的变化。模型小鼠厚壁菌门丰度下降，而拟杆菌门丰度上升。连翘酯苷A联合金银花多糖给药可纠正AD模型肠道菌群在门类别丰度上的异常。对于基因模型小鼠，给药逆转厚壁菌门和拟杆菌门的相对比例效果更加明显。这些结果表明连翘酯苷A联合金银花多糖给药对肠道菌群有显著影响。一般认为厚壁菌门多为有益菌，拟杆菌门多为有害菌。连翘酯苷A联合金银花多糖给药能够显著提高基因型小鼠厚壁菌门和拟杆菌门比例，促进有益菌增加，提示可能连翘酯苷A联合金银花多糖可纠正肠道菌群的紊乱。
通过对三组小鼠肠道菌群科水平进行分析，同样发现相比于WT组毛螺菌科相对丰度在AD组中明显降低，而连翘酯苷A联合金银花多糖干预后丰度显著增加(图9)。16S rRNA测序由于读长及扩增区域的局限，最多只能在属水平获取相对准确的菌群信息。因此在进一步对连翘酯苷联合金银花多糖调节肠道菌群作用的比较中，继续选取16S测序最小分辨水平，即属水平，观察了组间菌属差异情况。结果表明，Muribaculu属的丰度在模型组中显著下降，而联合用药组显著增加了Muribaculum的丰度，而此菌被证实与炎症反应密切相关。此外，在给药组中拟杆菌属显著降低，该菌属丰度在模型组中可贡献拟杆菌门丰度，进而导致厚壁菌门与拟杆菌门比例失调，该比例失调与神经性疾病的发生存在着重要联系。因此由以上结果可推断，金银花多糖联合连翘酯苷A给药可能通过调节特定物种的丰度来改善AD模型小鼠认知功能障碍。
本发明提供的金银花多糖联合连翘酯苷A可以改善APP/PS-1双转基因AD模型小鼠认知功能障碍，且能调节肠道菌群组成、结构及特定物种的丰度，另外还能一定程度上缓解由AD引起的肠道微生物功能紊乱。由此说明金银花多糖联合连翘酯苷A可通过调节肠道菌群的结构、组成和功能，缓解AD症状。
以上例举仅仅是对本发明的举例说明，并不构成对本发明的保护范围的限制，凡是与本发明相同或相似的设计均属于本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种用于改善阿尔茨海默病的中药提取物，其特征在于，包括金银花多糖和连翘酯苷A；所述连翘酯苷A和所述金银花多糖的质量浓度比为1:2到1:6；所述金银花多糖通过以下方法制备：将金银花粉碎后，采用超声水提法进行提取，离心取上清液，浓缩后加入乙醇静置，然后离心取沉淀，沉淀加水溶解后萃取脱蛋白，得金银花粗多糖；将金银花粗多糖柱层析纯化，得所述金银花多糖。
2.如权利要求1所述的用于改善阿尔茨海默病的中药提取物，其特征在于：所述超声水提法的提取条件为超声时间25-35min，超声温度55-65℃，料液比以体积质量比计为1:25-1:35。
3.如权利要求1所述的用于改善阿尔茨海默病的中药提取物，其特征在于：加入Savag试剂萃取脱蛋白；所述Savag试剂包括氯仿和正丁醇；所述氯仿与所述正丁醇的体积比为4：1。
4.如权利要求1所述的用于改善阿尔茨海默病的中药提取物，其特征在于：将金银花粗多糖经DEAE-52纤维素层析柱、Sephadex G-100凝胶层析柱纯化，得所述金银花多糖。
5.如权利要求1所述的用于改善阿尔茨海默病的中药提取物，其特征在于，所述连翘酯苷A的制备方法为：将连翘叶粉碎后置于容器中，使用乙醇溶液浸提，然后使用树脂进行吸附、洗脱，采用反相层析法处理洗脱液，得到所述连翘酯苷A。
6.如权利要求5所述的用于改善阿尔茨海默病的中药提取物，其特征在于：所述浸提过程中乙醇浓度为40-50％，液料比以体积质量比计为25:1-30：1，提取温度40-60℃，提取时间20-30min。
7.如权利要求5所述的用于改善阿尔茨海默病的中药提取物，其特征在于：所述吸附、洗脱过程中以AB-8大孔吸附树脂为吸附剂，先用5-10BV的水洗脱，再用5-10BV的30％乙醇溶液和5-10BV的50％乙醇溶液分别洗脱，洗脱流速2-5BV/h。
8.如权利要求1-7任意一项所述的中药提取物在制备改善阿尔茨海默病的药物中的应用。
9.如权利要求8所述的中药提取物在制备改善阿尔茨海默病的药物中的应用，其特征在于：所述药物以连翘酯苷A和金银花多糖为活性成分，还包括药学上可接受的辅料。
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