CN115976179A - 一种高灵敏度探针及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种高灵敏度探针、及其制备方法和应用。该探针为部分双链探针，其包括模板探针链和检测探针链，所述检测探针链从5’到3’端依次为待测目的序列互补配对区、连接碱基、模板探针互补配对区和标记区，所述标记区含有标记碱基；所述模板探针链从3’到5’端依次为检测探针链互补配对区和检测探针链标记区互补配对区，且所述检测探针链标记区互补配对区不含连接碱基；所述模板探针链和检测探针链形成检测探针链5’端为单链的部分双链探针。本发明所提供的探针含有多个标记，其检测灵敏度可达到放射性同位素检测水平。
Description
技术领域
本发明涉及基因检测技术领域，具体涉及一种高灵敏度探针、其制备方法和应用。
背景技术
Northernblot(RNA印迹)是生物化学、分子生物学中常用的实验方法，通过与特定基因互补配对的探针杂交来检测目的片段，是一种常用的RNA定性和定量分析方法。Northern印迹法中RNA样品经过凝胶电泳后会按照分子量大小分离，然后将样品从凝胶转印到膜上，然后用于目标序列互补的标记探针进行杂交，通过对探针信号的显影来检测目的基因的表达情况。
目前，Northern blot所用的探针方法主要有两类：一类是基于同位素的放射性标记，其具有灵敏度高、特异性好、分辨率强的优点，但是放射性同位素对人体有害，探针半衰期短，而且还需要特定的实验室及相应的试验保护设施，以及经过专门培训的人员操作，要求较高，从而导致检测成本也极高；二类是通过酶促、光化学和化学手段等掺入报告基团，这种报告基团可通过高灵敏的冷光、荧光或金属沉淀等检测***来检测。而在small RNA的检测过程中，由于所检测的small RNA长度较短，一般只有20多个核苷酸，所以相应的探针的长度也较短，对于较短的探针一般采用合成的寡核苷酸作为探针，然后对其3’末端或5’末端进行标记，此时一般是只标记一两个基团，可检测基团的数量直接影响了检测灵敏度。
发明内容
针对现有技术所存在的技术问题，本发明的目的之一在于提供了新的探针，该探针含有多个标记，检测灵敏度极高。
所提供的高灵敏度探针为部分双链探针，其包括模板探针链和检测探针链，所述检测探针链从5’到3’端依次为待测目的序列互补配对区、连接碱基、模板探针互补配对区和标记区，所述标记区含有标记碱基；
所述模板探针链从3’到5’端依次为检测探针链互补配对区和检测探针链标记区互补配对区，且所述检测探针链标记区互补配对区不含连接碱基；
所述模板探针链和检测探针链形成检测探针链5’端为单链的部分双链探针。
本发明采用双探针进行融合的方法，在其融合过程中掺入多个标记基团，其检测灵敏度可达到放射性同位素检测水平。
在本发明的一种实施方式中，标记为生物素标记或者地高辛标记。
本发明的目的之二在于提供上述高灵敏度探针的制备方法，包括以下步骤：
分别合成模板探针链和不含有标记区的检测探针链；
将模板探针链和不含有标记区的检测探针链在退火体系中退火形成部分双链探针前体；
将部分双链探针前体在扩增体系中扩增，即得；
其中，扩增体系中含有标记碱基且不含有与连接碱基互补的碱基。
在本发明的一种实施方式中，所述连接碱基为C，所述扩增体系的底物不含dGTP及其标记物；或所述连接碱基为A，所述扩增体系的底物不含dTTP及其标记物；或所述连接碱基为G时，所述扩增体系的底物不含dCTP及其标记物；或所述连接碱基为T时，所述扩增体系的底物不含dATP及其标记物。
在本发明的一种实施方式中，退火条件为：70℃保温5min，之后以0.1℃/s的降温速率降温至22℃保温5min。
本发明的目的之三还在于保护上述高灵敏度探针在核酸检测中的应用。
附图说明
图1为本发明所述的探针的结构和制备方法的示意图；
图2为实施例1-2制备得到的探针的检测效果与现有技术的对比图，其中A为现有技术中生物素探针检测效果，B为本发明所用探针的检测效果；
图3为实施例3-4制备得到的探针的检测效果与放射性同位素标记检测效果的对比图，其中A为放射性同位素标记的检测效果，B为本发明所用探针的检测效果。
图4为实施例5制备得到的探针的检测效果，其中两条泳道均为其检测结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细说明，以使本领域的技术人员更加清楚地理解本发明。
以下各实施例，仅用于说明本发明，但不止用来限制本发明的范围。基于本发明中的具体实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的情况下，所获得的其他所有实施例，都属于本发明的保护范围。
在本发明实施例中，若无特殊说明，所有原料组分均为本领域技术人员熟知的市售产品；在本发明实施例中，若未具体指明，所用的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
在small RNA检测过程中，由于所检测的small RNA长度极短，一般只有20多个核苷酸，所以相应的探针的长度也就较短，对于较短的探针一般采用合成的寡核苷酸作为探针，然后对其3’端或5’端进行标记，而这种标记一般是标记一个基团，因此，可检测基团的数量直接影响了其检测灵敏度。基于此，本发明采用双探针融合的方法，在其融合过程中掺入多个标记的基团，从而大大提高了检测的灵敏度，所提供的探针的结构如下：
该探针为部分双链探针，其包括模板探针链和检测探针链，检测探针链从5’到3’端依次为待测目的序列互补配对区、连接碱基、模板探针互补配对区和标记区，标记区含有标记碱基；模板探针链从3’到5’端依次为检测探针互补配对区和检测探针链标记区互补配对区，且所述检测探针链标记区互补配对区不含连接碱基；模板探针链和检测探针链互补形成检测探针链5’端为单链的部分双链探针。
其制备方法如下：
首先，分别合成模板探针链和不含有标记区的检测探针链；
其次，将模板探针链和不含有标记区的检测探针链在退火体系中退火形成部分双链探针前体；
最后，再将部分双链探针前体在含有标记碱基的扩增体系中扩增，即得；
其中，扩增体系中含有标记碱基且不含有与连接碱基互补的碱基。
在本发明中，连接碱基的目的在于阻断标记时向检测探针的待测目的序列互补配对区合成。连接碱基可以是一个，也可以是两个或者多个，但不可以同时包含A、T、C、G四种碱基。当使用不同的模板引物进行聚合扩增时，根据引物中需标记的区域的碱基，使用不同的底物即可，如当需标记区域含有A、C、G时(即连接碱基为T)，扩增体系中只能含有与其对应互补的碱基底物T、G、C及其标记物。当然需标记的区域的碱基也不一定必须使三种碱基，不过种类少了可能易形成二级结构，影响其扩增效率。
模板探针链上的检测探针链标记区互补配对区为一端随机序列，其不能够含有连接碱基，但需要含有多个连接碱基外的其他碱基，比如，当连接碱基为C时，该区域需要包含多个碱基G、A、T。
本发明中，生物素标记和地高辛标记为最常用的两种标记。
本发明所述的探针的制备和检测原理如图1所示。
实施例1
本发明实施例提供一种高灵敏度探针的制备方法，包括以下步骤：
S1，合成一条检测探针miRGUS，该条探针的5’端包含与所要检测序列互补配对的21个碱基，3’端包含与模板探针互补配对的19个碱基，3’端与5’端以碱基C相连，具体为:5’(AGAGCTGATAGCGCGTGACAA)C(AG GAACGGTGCACAGGCAC)3’，如SEQ ID NO:1所示。
S2，合成一条模板探针，该条探针的3’端是与检测探针3’末端互补配对的序列，5’端为一端随机序列，包含多个G、A、T，但不包含碱基C，具体为：5’(GAGGGAGAGGGTAGGAGGGTGGTGGTGTGGGATGTGTAT)(TGTGCCTGTGCACCGTTCCT)3’，如SEQ ID NO:2所示。
S3，将步骤S1中合成的检测探针和步骤S2中合成的模板探针等量混合后进行退火处理，两条探针根据其3’末端碱基的互补配对形成一条部分双链的探针前体。
其中，退火时的反应体系为：5μL 10mM的检测探针、5μL 10mM的模板探针，共计10μL，检测探针和模板探针的终浓度为5mM。
退火程序为：70℃保温5min，以0.1℃/s的降温速率降温到25℃，保温5min。
S4，将步骤S3中得到的部分双链的探针前体在T4 DNA聚合酶的作用下，以模板探针的5’碱基序列为模板，以dATP、dTTP和有生物素标记的biotin-dCTP为底物，向模板探针的5’端方向合成含有多个生物素基团的标记探针，由于底物中没有加入dGTP，检测探针的5’中连接碱基C就阻断了合成过程中向检测探针5’方向的合成，保证其5’末端的单链状态。
其中，扩增体系为：T4 DNA聚合酶1μL、退火的探针引物2μL、10×Buffer 2.1 1μL、1mM的dATP 1μL、1mM的dTTP 1μL、1mM的biotin-dCTP 1μL、ddH2O 3μL，反应条件为：25℃孵育10min，37℃孵育1h。
其中，10X Buffer2.1和T4DNA聚合酶可以是NEB公司的T4DNA聚合酶(NEB#M0203L)中的试剂；
dATP和dTTP可以是NEB公司的dNTP套装(#N0446S)中的试剂；
biotin-16-dCTP可以是jena bioscience公司的试剂，货号NU-809-BIO16-S。
实施例2
本发明实施例提供一种高灵敏度探针的制备方法，其与实施例1的不同之处在于，步骤S1中合成的检测探针为miR166，具体为：5’(GGGGAATGAAGCCTGGTCCGA)C(AGGAACGGTGCACAGGCAC)3’，如SEQ ID NO:3所示。
实施例3
本发明实施例提供一种高灵敏度探针的制备方法，其与实施例1的不同之处在于，步骤S1中合成的检测探针为yeastU6，具体为：5’(TATGCAGGGGAACTGCTGAT)C(AGGAACGGTGCACAGGCAC)3’，如SEQ ID NO:4所示。
实施例4
本发明实施例提供一种高灵敏度探针的制备方法，其与实施例1的不同之处在于，步骤S1中合成的检测探针为plantU6，具体为：5’(AGGGGCCATGCTAATCTTCTC)C(AGGAACGGTGCACAGGCAC)3’，如SEQ ID NO:5所示。
实施例5
本发明实施例提供一种高灵敏度探针的制备方法，其与实施例4的不同之处在于，步骤S1中合成的检测探针为plantU6，具体为：5’(AGGGGCCATGCTAATCTTCTC)TT(AGGCGCTCACTGTCCCAGT)3’，如SEQ ID NO:6所示，模板探针为：5’(GCGAGCGGAGCGCGGAGCGGAGAGCGAGGAGGCGAGGAGA)(ACTG GGACAGTGAGCGCCT)3’，如SEQ ID NO:7所示，以dGTP、dTTP和有生物素标记的biotin-dCTP为底物。
实施例6
本发明实施例提供一种高灵敏度探针的制备方法，其与实施例5的不同之处在于，步骤S1中合成的检测探针为miR156，具体为：5’(GTGCTCACTCTCTTCTGTCA)TT(AGGCGCTCACTGTCCCAGT)3’，如SEQ ID NO:8所示。
将实施例1-2制备得到的探针与现有技术采用单链含有一个标记碱基的探针同时用于标记检测，检测结果如图2所示；
将实施例3-4制备得到的探针与采用放射性同位素标记的探针同时用于标记检测，检测结果如图3所示。
实施例5制备得到的探针的检测结果如图4所示。
从图2、3可以看出，本发明所采用的探针其检测灵敏度远远高于现有技术中的生物素标记探针，基本能达到放射性同位素标记探针的灵敏度。
在此有必要指出的是，以上实施例仅限于对本发明的技术方案做进一步的阐述和说明，并不是对本发明的技术方案的进一步的限制，本发明的方法仅为较佳的实施方案，并非用于限定本发明的保护范围。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (6)
1.一种高灵敏度探针，其特征在于，所述高灵敏度探针为部分双链探针，其包括模板探针链和检测探针链，
所述检测探针链从5’到3’端依次为待测目的序列互补配对区、连接碱基、模板探针互补配对区和标记区，所述标记区含有标记碱基；
所述模板探针链从3’到5’端依次为检测探针互补配对区和检测探针链标记区互补配对区，且所述检测探针链标记区互补配对区不含连接碱基；
所述模板探针链和检测探针链互补形成检测探针链5’端为单链的部分双链探针。
2.根据权利要求1所述的高灵敏度探针，其特征在于，标记为生物素标记或者地高辛标记。
3.权利要求1～2任一项所述的高灵敏度探针的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
分别合成模板探针链和不含有标记区的检测探针链；
将模板探针链和不含有标记区的检测探针链在退火体系中退火形成部分双链探针前体；
将部分双链探针前体在扩增体系中扩增，即得；
其中，扩增体系中含有标记碱基且不含有与连接碱基互补的碱基。
4.根据权利要求3所述的高灵敏度探针的制备方法，其特征在于，所述连接碱基为C，所述扩增体系的底物不含dGTP及其标记物；
或
所述连接碱基为A，所述扩增体系的底物不含dTTP及其标记物；
或
所述连接碱基为G时，所述扩增体系的底物不含dCTP及其标记物；
或
所述连接碱基为T时，所述扩增体系的底物不含dATP及其标记物。
5.根据权利要求3所述的高灵敏度探针的制备方法，其特征在于，退火条件为：70℃保温5min，之后以0.1℃/s的降温速率降温至22℃保温5min。
6.权利要求1所述的高灵敏度探针在核酸检测中的应用。
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| CN202210816308.8A Pending CN115976179A (zh) | 2022-07-12 | 2022-07-12 | 一种高灵敏度探针及其制备方法和应用 |
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|---|---|
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Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1274847A (zh) * | 2000-06-02 | 2000-11-29 | 上海长征医院 | 标记信号放大探针的制备方法 |
| CN1435492A (zh) * | 2003-03-05 | 2003-08-13 | 东南大学 | 一种非标记检测dna结合蛋白的芯片及其制备、应用方法 |
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-
2022
- 2022-07-12 CN CN202210816308.8A patent/CN115976179A/zh active Pending
Patent Citations (6)
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