CN115976178A - 基于纳米孔宏基因组测序的sftsv检测方法 - Google Patents
基于纳米孔宏基因组测序的sftsv检测方法 Download PDFInfo
- Publication number
- CN115976178A CN115976178A CN202211476258.XA CN202211476258A CN115976178A CN 115976178 A CN115976178 A CN 115976178A CN 202211476258 A CN202211476258 A CN 202211476258A CN 115976178 A CN115976178 A CN 115976178A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequencing
- sftsv
- nanopore
- rna
- virus
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 title claims abstract description 86
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims abstract description 42
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 40
- 238000007405 data analysis Methods 0.000 claims abstract description 13
- 230000003321 amplification Effects 0.000 claims abstract description 10
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 claims abstract description 10
- 230000008569 process Effects 0.000 claims abstract description 10
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 33
- 241000700605 Viruses Species 0.000 claims description 20
- 238000013507 mapping Methods 0.000 claims description 19
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 claims description 16
- 241000894007 species Species 0.000 claims description 13
- 108091035707 Consensus sequence Proteins 0.000 claims description 10
- 108010058966 bacteriophage T7 induced DNA polymerase Proteins 0.000 claims description 10
- 239000011541 reaction mixture Substances 0.000 claims description 9
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 8
- 241000713158 Hazara virus Species 0.000 claims description 8
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 claims description 7
- 241000725619 Dengue virus Species 0.000 claims description 6
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 claims description 6
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 6
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 claims description 6
- 230000002123 temporal effect Effects 0.000 claims description 6
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 5
- 238000001914 filtration Methods 0.000 claims description 5
- 230000001717 pathogenic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000003757 reverse transcription PCR Methods 0.000 claims description 5
- 229920006068 Minlon® Polymers 0.000 claims description 4
- 108020000999 Viral RNA Proteins 0.000 claims description 4
- 238000011534 incubation Methods 0.000 claims description 4
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 3
- 241000150452 Orthohantavirus Species 0.000 claims description 3
- 241000276569 Oryzias latipes Species 0.000 claims description 3
- 239000011324 bead Substances 0.000 claims description 3
- 239000013024 dilution buffer Substances 0.000 claims description 3
- 238000007672 fourth generation sequencing Methods 0.000 claims description 3
- 230000035772 mutation Effects 0.000 claims description 3
- 239000007788 liquid Substances 0.000 claims description 2
- 238000011068 loading method Methods 0.000 claims description 2
- 238000012544 monitoring process Methods 0.000 claims description 2
- 241001535172 Severe fever with thrombocytopenia virus Species 0.000 claims 17
- 238000003556 assay Methods 0.000 claims 1
- 238000007622 bioinformatic analysis Methods 0.000 claims 1
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 claims 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 abstract description 8
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 abstract 1
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 27
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 8
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 8
- 244000052769 pathogen Species 0.000 description 7
- 244000175448 Citrus madurensis Species 0.000 description 5
- 235000004332 Citrus madurensis Nutrition 0.000 description 5
- 235000007438 Citrus mitis Nutrition 0.000 description 5
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 4
- 241000150562 Hantaan orthohantavirus Species 0.000 description 3
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- 238000011160 research Methods 0.000 description 3
- 208000011580 syndromic disease Diseases 0.000 description 3
- 206010043554 thrombocytopenia Diseases 0.000 description 3
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 3
- 238000013500 data storage Methods 0.000 description 2
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 230000005180 public health Effects 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 2
- 102000040650 (ribonucleotides)n+m Human genes 0.000 description 1
- 208000008371 Bunyaviridae Infections Diseases 0.000 description 1
- 208000035473 Communicable disease Diseases 0.000 description 1
- 208000001490 Dengue Diseases 0.000 description 1
- 206010012310 Dengue fever Diseases 0.000 description 1
- 206010061192 Haemorrhagic fever Diseases 0.000 description 1
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 241000606701 Rickettsia Species 0.000 description 1
- 206010040047 Sepsis Diseases 0.000 description 1
- 206010043561 Thrombocytopenic purpura Diseases 0.000 description 1
- 208000037386 Typhoid Diseases 0.000 description 1
- 230000005856 abnormality Effects 0.000 description 1
- 208000006730 anaplasmosis Diseases 0.000 description 1
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 1
- 208000025729 dengue disease Diseases 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 1
- 230000002496 gastric effect Effects 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 201000009163 human granulocytic anaplasmosis Diseases 0.000 description 1
- 208000022340 human granulocytic ehrlichiosis Diseases 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 201000002364 leukopenia Diseases 0.000 description 1
- 231100001022 leukopenia Toxicity 0.000 description 1
- 238000012473 microbial detection method Methods 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 201000008297 typhoid fever Diseases 0.000 description 1
- 206010048282 zoonosis Diseases 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
- Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
- Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
- Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change
Landscapes
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明涉及基于纳米孔宏基因组测序的SFTSV检测方法。本发明提出了一种融合序列非依赖的单引物扩增和纳米孔宏基因组测序的SFTSV检测方法，研发了一套自动化、实时的生物信息数据分析流程，可应用于宏基因组测序数据的物种鉴定、SFTSV全基因组组装、SFTSV基因型和重排特征解析等方面。
Description
技术领域
本发明属于微生物检测方法技术领域，具体涉及一种基于纳米孔宏基因组测序的SFTSV检测方法。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
发热伴血小板减少综合征(SFTS)是一种由新型布尼亚病毒感染引起的蜱传人畜共患病。SFTS的主要症状是发热、血小板减少、白细胞减少和胃肠道异常等，重症病例常因多器官功能衰竭而死亡。我国SFTS的报告病例数呈现逐年增加的趋势，且其病死率维持在较高水平，流行区的发病率不断上升，非流行区也陆续出现病例报道，严重威胁人民生命健康。基于SFTS对公共卫生的挑战，WHO于2017年将其列为“十大需要优先关注的传染病”之一。SFTS尚无特异性治疗手段，主要采用对症支持治疗，因此及早发现患者是救治的关键。然而，SFTS患者的临床症状特异性不强，需要与肾综合征出血热、人粒细胞无形体病等立克次体病、登革热、败血症、伤寒、血小板减少性紫癜等疾病相鉴别。
目前发热伴血小板减少综合征病毒(SFTSV)检测主要采用核酸和抗体检测方法。基于PCR技术的核酸检测方法虽然具备灵敏和简便等特点，但是严重依赖预先假设，只能检测单一或部分病原体，不能检测靶标之外的病原体。抗体检测方法快速且简易，但病毒进入机体需经过一定的潜伏期才会产生IgM与IgG抗体，不适用于快速检测。此外，常规的核酸和抗体检测方法均不能获得病原体的完整基因组信息，无法进行SFTSV的全基因组特性解析和溯源。因此，构建一种针对SFTSV的快速且信息全面的检测新方法尤为重要。
发明内容
为了解决以上问题，本发明提供一种融合序列非依赖的单引物扩增和纳米孔宏基因组测序的SFTSV检测方法，该检测方法具有快速、信息全面的特点。
为了解决上述技术问题，本发明提供如下技术方案。
本发明的第一方面：提供一种基于纳米孔宏基因组测序的SFTSV实时检测方法，包括如下步骤：
(1)构建血清样本；
(2)使用定量反转录-聚合酶链反应定量Hazara病毒液的病毒载量，向血清样本中加入Hazara病毒作为测序阳性内对照；
(3)对血清样品提取RNA，并去除DNA和纯化RNA；
使用序列非依赖的单引物扩增(SISPA)方法扩增cDNA；
(4)对血清样品进行测序，构建多重测序文库；将测序文库装载到纳米孔R9.4.1测序芯片上，使用纳米孔MinlON测序仪进行测序；
(5)进行生物信息数据分析。
进一步的，步骤(1)中，血清样本第一组包括使用10个SFTSV RNA阳性的患者血清、10个SFTSV RNA阴性患者血清构建的不同血清背景和不同SFTSV浓度的血清样本；第二组包括40个SFTSV RNA阳性的患者血清；第三组包括40个SFTSV RNA阴性的患者血清，分为两部分，第一部分包括10个汉坦病毒或登革热病毒RNA检测阳性的样本，第二部分包括30个SFTSV、汉坦病毒、登革热病毒RNA检测均阴性的样本。
进一步的，步骤(2)中向血清样本中加入浓度为104copies/ml的Hazara病毒。
进一步的，步骤(3)中使用QIAamp viral RNA试剂盒(Qiagen)提取RNA，使用TurboDNase(Thermo Fisher Scientific)和RNA Clean&Concentrator-5kit(Zymo Research)去除DNA和纯化RNA。
进一步的，步骤(3)中反转录过程中，将4μl RNA和1μl浓度为40pmol/μl的引物A混合，并在65℃孵育5min，冷却至室温；第一链合成过程中，添加5μl的SuperScriptIV(ThermoFisher Scientific)反应混合液并在42℃孵育10min；第二链合成过程中，添加5μl的Sequenase(Affymetrix)反应混合液并在37℃孵育8min，然后再添加0.45μl Sequenasedilution buffer和0.15μl Sequenase并在37℃孵育8min；cDNA扩增过程中，将5μl上述反转录产物和50μl AccuTaq LA(Sigma)反应混合液及1μl的引物B混合；PCR的反应条件是：98℃30s、94℃15s、50℃20s、68℃2min重复30个循环，68℃10min；最后使用1:1的AMPure XPBeads(Beckman Coulter)纯化cDNA扩增产物，Qubit定量产物核酸浓度。
所述引物A为5’-GTTTCCCACTGGAGGATA-N9-3’，如SEQNO.1所示。
所述引物B为5’-GTTTCCCACTGGAGGATA-3’，如SEQ NO.2所示。
进一步的，步骤(4)中取6个样本，单个样本200fmol cDNA，使用EXP-NBD104扩展试剂盒和SQK-LSK110连接试剂盒构建多重测序文库。
进一步的，步骤(5)中，生物信息分析包括如下流程：
(a)使用Guppy软件将纳米孔测序原始数据转化为Fastq格式的序列文件；
(b)用Porechop去除测序序列reads两端的编码Barcode，Nanoplot监测数据质量；
(c)使用Centrifuge比对参考数据库(p_compressed+h+v数据库，包含>2万条细菌和病毒等物种的基因组序列)对测序reads进行物种注释，获得初步的分类结果；其次，依据Centrifuge分类结果从其参考数据库中为每一个物种选取一条临时的参考序列；再次，使用Minimap2将测序reads mapping到临时的参考序列,依据多数投票方法(即基因组每个位置选取mapping最多的碱基)，组装一条该物种的临时共有序列；从次，使用Blast将此临时的共有序列和自建的参考数据库比对，以选取最佳参考序列；最后，使用Minimap2将测序reads mapping到最佳参考序列，过滤mapping质量低于50和mapping比例低于50％的测序片段，使用Samtools软件分析统计mapping reads数量、参考序列每个碱基位置的mapping深度等信息。
判断某病毒检测阳性的标准是:≥2条测序reads覆盖病原基因组的不同位置。
(d)采用Medaka分析突变位点并组装病毒的共有序列。
(e)融合上述生物信息分析软件，采用Nextflow流程，构建全自动、并行的生物信息数据分析流程。该数据分析流程依照预设的时间间隔对测序数据存储文件夹进行扫描，实时提取分析测序数据，可同时并行处理多个样本的测序数据，可在个人计算机、高性能服务器和云计算等多种平台运行。
进一步的，所述的自建参考数据库包括NCBI和ViPR病毒数据库中全部SFTSV基因组序列。
本发明的有益效果是：
本发明在SFTSV宏基因组测序中添加了内对照，提升了检测结果的可靠性；本发明对纳米孔宏基因组测序数据的生物信息分析流程中的参数进行了优化选择，可过滤SFTSV假阳性测序片段，提升了检测的灵敏度和特异性；本发明通过纳米孔宏基因组测序及生物信息数据分析不仅能够检测SFTSV病毒，同时能获得SFTSV的基因组序列，序列信息可进一步用于SFTSV的基因组特性解析和溯源。
附图说明
构成本申请的一部分的说明书附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。
图1是SFTSV纳米孔宏基因组测序数据分析的流程图。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
本发明中的血清样本，来源于山东大学公共卫生学院，为SFTSV RNA检测阳性或阴性的样本。
本发明中的试剂来源，如下表：
表1试剂信息
| 试剂 | 生产厂家 |
| QIAamp viral RNA试剂盒 | Qiagen |
| Turbo DNase | Thermo Fisher Scientific |
| RNA Clean&Concentrator-5 kit | Zymo Research |
| SuperScript IV | Thermo Fisher Scientific |
| Sequenase | Affymetrix |
| AccuTaq LA | Sigma |
为了进一步说明本发明的检测方法的应用效果，特给出如下实施例。所述实施例仅是本发明方法的一种示例，并不会对本发明保护主题及保护范围造成约束，在本发明思路范围内的其他等同技术也属于本发明的范畴。
实施例1，建立基于纳米孔宏基因组测序的SFTSV检测技术方法，方法如下：
(1)建立样本并进行分组，包括如下步骤：
第一组包括构建的不同血清背景和不同SFTSV浓度的血清样本。
进一步地，具体方法是：混合10个SFTSV RNA检测阳性的血清样本，构成1个阳性混合样本池。分3次分别混合10个SFTSV RNA检测阴性的患者血清样本，构成3个不同血清背景的阴性混合样本池。将3个阴性混合样本池分别分装到6个EP管(1ml血清/管)，向EP管内加入不等量的阳性混合样本池，使用定量反转录-聚合酶链反应定量病毒载量，使每管SFTSV的浓度分别达到0、102、103、104、105、106copies/ml。
第二组包括40个SFTSV RNA检测阳性的血清样本。
第三组包括40个SFTSV RNA检测阴性的血清样本。分为两部分，第一部分包括10个样本，汉坦病毒或登革热病毒RNA检测呈阳性；第二部分包括30个样本，SFTSV、汉坦病毒、登革热病毒RNA检测均呈阴性。
(2)建立纳米孔宏基因组测序方法，包括如下步骤：
使用定量反转录-聚合酶链反应定量Hazara病毒液的病毒载量，向每个样本中加入浓度为104copies/ml的Hazara病毒作为测序阳性内对照。
所述定量反转录-聚合酶链反应，是将RNA逆转录为DNA并使用聚合酶链式反应扩增特定的DNA靶标。
使用QIAamp viral RNA试剂盒(Qiagen)提取RNA，使用Turbo DNase(ThermoFisher Scientific)和RNA Clean&Concentrator-5kit(Zymo Research)去除DNA和纯化RNA。
使用序列非依赖的单引物扩增(SISPA)方法扩增cDNA。所述的序列非依赖的单引物扩增(SISPA)方法，是一种不依赖病毒分离培养、缩短检测未知病毒的时间的扩增方法。基本技术路线是：用DNase处理样品中游离的核酸后，用含有已知片段的随机引物进行逆转录，分别合成cDNA第一链和cDNA第二链，然后对双链cDNA进行PCR扩增反应，将该已知片段作为引物，使未知病毒核酸片段被准确地扩增。最近几年来，该方法又有了改进，即首先用0.22um的过滤器对样品进行过滤，再用DNase处理去除游离核酸，减少背景核酸的干扰。SISPA的优点在于它既可以不依赖组织培养，也不依赖于核酸序列，大大缩短了检测时间，同时适用于不同类型的临床标本，双链RNA、单链RNA、DNA病毒都可以检测。
具体步骤是:
反转录过程中，将4μl RNA和1μl引物A(5’
-GTTTCCCACTGGAGGATA-N9-3’,40pmol/μl)混合，并在65℃孵育5min，冷却至室温。第一链合成过程中，添加5μl的SuperScriptIV(Thermo Fisher Scientific)反应混合液并在42℃孵育10min。第二链合成过程中，添加5μl的Sequenase(Affymetrix)反应混合液并在37℃孵育8min，然后再添加0.45μl Sequenase dilution buffer和0.15μl Sequenase并在37℃孵育8min。cDNA扩增过程中，将5μl上述反转录产物和50μl AccuTaq LA(Sigma)反应混合液及1μl的引物B(5’-GTTTCCCACTGGAGGATA-3’)混合。PCR的反应条件是:98℃30s、94℃15s、50℃20s、68℃2min重复30个循环，68℃10min。最后使用1:1的AMPure XP Beads(Beckman Coulter)纯化cDNA扩增产物，Qubit定量产物核酸浓度。
每次测序选取6个样本，取单个样本200fmol cDNA，使用EXP-NBD104扩展试剂盒和SQK-LSK110连接试剂盒构建多重测序文库。
将测序文库装载到纳米孔R9.4.1测序芯片上，使用纳米孔MinlON测序仪进行测序。
所述纳米孔MinlON测序仪,是现在最便携的测序仪，其核心是一个有2,048个纳米孔、分成512组、由专用集成电路控制的flow cell。
实施例2，建立纳米孔宏基因组测序数据的生物信息分析流程，流程如下：
(1)使用Guppy软件将纳米孔测序原始数据转化为Fastq格式的序列文件。
(2)用Porechop去除测序序列reads两端的编码Barcode，Nanoplot监测数据质量。
(3)为了能够准确检测病原体，本发明采用一种综合测序reads的物种注释、mapping、过滤的分析方法。方法如下：
首先，使用Centrifuge比对参考数据库(p_compressed+h+v数据库，包含>2万条细菌和病毒等物种的基因组序列)对测序reads进行物种注释，获得初步的分类结果。其次，依据Centrifuge分类结果从其参考数据库中为每一个物种选取一条临时的参考序列。再次，使用Minimap2将测序reads mapping到临时的参考序列,依据多数投票方法(即基因组每个位置选取mapping最多的碱基)，组装一条该物种的临时共有序列。从次，使用Blast将此临时的共有序列和自建的参考数据库(包含公共数据库中全部SFTSV基因组序列)比对，以选取最佳参考序列。最后，使用Minimap2将测序reads mapping到最佳参考序列,过滤mapping质量低于50和mapping比例低于50％的测序片段，使用Samtools软件分析统计mappingreads数量、参考序列每个碱基位置的mapping深度等信息。
判断某病毒检测阳性的标准是:≥2条测序reads覆盖病原基因组的不同位置。
(4)采用Medaka分析突变位点并组装病毒的共有序列。
(5)融合上述生物信息分析软件，采用Nextflow流程，构建全自动、并行的生物信息数据分析流程。该数据分析流程依照预设的时间间隔对测序数据存储文件夹进行扫描，实时提取分析测序数据，可同时并行处理多个样本的测序数据，可在个人计算机、高性能服务器和云计算等多种平台运行。
实施例3，评估纳米孔宏基因组测序对不同病毒载量和血清背景SFTSV样本的检测效果。步骤如下：
(1)依照本发明实施例1和例2，对第一组样本进行纳米孔宏基因组测序和生物信息数据分析。
(2)分析从不同背景血清和不同SFTSV载量样本中检测到的内对照Hazara reads数目及其在测序数据中的比例，分析不同背景血清样本中检测到的Hazara reads比例的一致性，评估不同背景的血清对测序方法检测病原的影响。
(3)分析从不同SFTSV载量样本中检测到的SFTSV reads数目及其在测序数据中的比例，分析SFTSV reads比例和SFTSV载量的关系，分析测序方法检测SFTSV的检测限。
(4)重建样本中SFTSV的全基因组序列，分析基因组覆盖率和病毒载量之间的关系，分析测序方法重建SFTSV全基因组的检测限。
实施例4，研究纳米孔宏基因组测序检测SFTSV的灵敏度和特异性，步骤如下：
(1)依照本发明实施例2和例3，对第二和第三组样本进行纳米孔宏基因组测序和生物信息数据分析。
(2)分析从各样本中检测到的内对照Hazara reads数目及其在测序数据中的比例，评估测序方法从不同CT值的SFTSV阳性样本以及阴性样本中检测内对照的稳定性。
(3)分析从各样本中检测到的SFTSV reads数目及其在测序数据中的比例。比较测序结果与SFTSV核酸检测试剂盒结果，分析SFTSV reads比例和CT值之间的关系，分析测序方法检测SFTSV的灵敏度和特异性。
(4)依据核酸检测CT值选取10个阳性样本的cDNA产物进行Illumina测序,分析、比较两种测序平台所获的SFTSV reads比例、基因组覆盖率、基因组的准确性。
所述Illumina测序和数据分析方法是：使用1.5ng SISPA扩增的cDNA产物制备文库，Illumina MiSeq测序仪测序。使用Bwa将测序数据reads比对到参考SFTSV序列上，生成共有序列。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种基于纳米孔宏基因组测序的SFTSV检测方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)构建血清样本；
(2)使用定量反转录-聚合酶链反应定量Hazara病毒液的病毒载量，向血清样本中加入Hazara病毒作为测序阳性内对照；
(3)对血清样品提取RNA，并去除DNA和纯化RNA；
使用序列非依赖的单引物扩增(SISPA)方法扩增cDNA；
(4)对血清样品进行测序，构建多重测序文库；将测序文库装载到纳米孔R9.4.1测序芯片上，使用纳米孔MinlON测序仪进行测序；
(5)进行生物信息数据分析。
2.根据权利要求1所述基于纳米孔宏基因组测序的SFTSV检测方法，其特征在于，步骤(1)中，血清样本第一组包括使用10个SFTSV RNA阳性的患者血清、10个SFTSV RNA阴性患者血清构建的不同血清背景和不同SFTSV浓度的血清样本；第二组包括40个SFTSV RNA阳性的患者血清；第三组包括40个SFTSV RNA阴性的患者血清，分为两部分，第一部分包括10个汉坦病毒或登革热病毒RNA检测阳性的样本，第二部分包括30个SFTSV、汉坦病毒、登革热病毒RNA检测均阴性的样本。
3.根据权利要求1所述基于纳米孔宏基因组测序的SFTSV检测方法，其特征在于，步骤(2)中向血清样本中加入浓度为104copies/ml的Hazara病毒。
4.根据权利要求1所述基于纳米孔宏基因组测序的SFTSV检测方法，其特征在于，步骤(3)中使用QIAamp viral RNA试剂盒提取RNA，使用Turbo DNase和RNA Clean&Concentrator-5kit去除DNA和纯化RNA。
5.根据权利要求1所述基于纳米孔宏基因组测序的SFTSV检测方法，其特征在于，步骤(3)中，反转录过程中，将4μl RNA和1μl浓度为40pmol/μl的引物A混合，并在65℃孵育5min，冷却至室温；第一链合成过程中，添加5μl的SuperScriptIV反应混合液并在42℃孵育10min；第二链合成过程中，添加5μl的Sequenase反应混合液并在37℃孵育8min，然后再添加0.45μl Sequenase dilution buffer和0.15μl Sequenase并在37℃孵育8min；cDNA扩增过程中，将5μl上述反转录产物和50μl AccuTaq LA(Sigma)反应混合液及1μl的引物B混合；PCR的反应条件是:98℃30s、94℃15s、50℃20s、68℃2min重复30个循环，68℃10min；最后使用1:1的AMPure XP Beads(Beckman Coulter)纯化cDNA扩增产物，Qubit定量产物核酸浓度。
6.根据权利要求5所述基于纳米孔宏基因组测序的SFTSV检测方法，其特征在于，所述引物A为5’-GTTTCCCACTGGAGGATA-N9-3’；
所述引物B为5’-GTTTCCCACTGGAGGATA-3’。
7.根据权利要求1所述基于纳米孔宏基因组测序的SFTSV检测方法，其特征在于，步骤(4)中使用EXP-NBD104扩展试剂盒和SQK-LSK110连接试剂盒构建多重测序文库。
8.根据权利要求1所述基于纳米孔宏基因组测序的SFTSV检测方法，其特征在于，步骤(5)中，生物信息分析包括如下流程：
(a)使用Guppy软件将纳米孔测序原始数据转化为Fastq格式的序列文件；
(b)用Porechop去除测序序列reads两端的编码Barcode，Nanoplot监测数据质量；
(c)使用Centrifuge比对参考数据库(p_compressed+h+v数据库，包含>2万条细菌和病毒等物种的基因组序列)对测序reads进行物种注释，获得初步的分类结果；其次，依据Centrifuge分类结果从其参考数据库中为每一个物种选取一条临时的参考序列；再次，使用Minimap2将测序reads mapping到临时的参考序列,依据多数投票方法，组装一条该物种的临时共有序列；从次，使用Blast将此临时的共有序列和自建的参考数据库比对，以选取最佳参考序列；最后，使用Minimap2将测序reads mapping到最佳参考序列,过滤mapping质量低于50和mapping比例低于50％的测序片段，使用Samtools软件分析统计mapping reads数量、参考序列每个碱基位置的mapping深度等信息；
(d)采用Medaka分析突变位点并组装病毒的共有序列；
(e)融合上述生物信息分析软件，采用Nextflow流程，构建全自动、并行的生物信息数据分析流程；
所述自建的参考数据库为根据NCBI或者ViPR数据库中所有SFTSV序列建的数据库，其包含公共数据库中全部SFTSV基因组序列。
9.根据权利要求8所述基于纳米孔宏基因组测序的SFTSV检测方法，其特征在于，判断某病毒检测阳性的标准是:≥2条测序reads覆盖病原基因组的不同位置。
10.根据权利要求8所述基于纳米孔宏基因组测序的SFTSV检测方法，其特征在于，所述多数投票方法即基因组每个位置选取mapping最多的碱基。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211476258.XA CN115976178A (zh) | 2022-11-23 | 2022-11-23 | 基于纳米孔宏基因组测序的sftsv检测方法 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202211476258.XA CN115976178A (zh) | 2022-11-23 | 2022-11-23 | 基于纳米孔宏基因组测序的sftsv检测方法 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN115976178A true CN115976178A (zh) | 2023-04-18 |
Family
ID=85971188
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202211476258.XA Pending CN115976178A (zh) | 2022-11-23 | 2022-11-23 | 基于纳米孔宏基因组测序的sftsv检测方法 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN115976178A (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117746980A (zh) * | 2023-12-18 | 2024-03-22 | 广州凯普医学检验所有限公司 | 一种流感病毒自动化快速分型方法、装置、设备及介质 |
Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102787177A (zh) * | 2012-09-04 | 2012-11-21 | 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 | 检测新布尼亚病毒的试剂盒和寡核苷酸 |
| WO2014197607A1 (en) * | 2013-06-05 | 2014-12-11 | The Regents Of The University Of California | Detection of tick-borne diseases |
| KR20200045667A (ko) * | 2018-10-23 | 2020-05-06 | 울산대학교 산학협력단 | Sfts 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 그를 이용한 중증열성혈소판감소증후군 진단 키트 |
-
2022
- 2022-11-23 CN CN202211476258.XA patent/CN115976178A/zh active Pending
Patent Citations (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102787177A (zh) * | 2012-09-04 | 2012-11-21 | 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 | 检测新布尼亚病毒的试剂盒和寡核苷酸 |
| WO2014197607A1 (en) * | 2013-06-05 | 2014-12-11 | The Regents Of The University Of California | Detection of tick-borne diseases |
| KR20200045667A (ko) * | 2018-10-23 | 2020-05-06 | 울산대학교 산학협력단 | Sfts 바이러스 검출용 프라이머 세트 및 그를 이용한 중증열성혈소판감소증후군 진단 키트 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| KUIAMA LEWANDOWSKI等: "Metagenomic Nanopore Sequencing of Influenza Virus Direct from Clinical Respiratory Samples", JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY, vol. 58, no. 1, 31 January 2020 (2020-01-31), pages 1 - 15 * |
| YIFEI XU等: "NanoSPC: a scalable, portable, cloud compatible viral nanopore metagenomic data processing pipeline", NUCLEIC ACIDS RESEARCH, vol. 48, 22 May 2020 (2020-05-22), pages 366 - 371 * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117746980A (zh) * | 2023-12-18 | 2024-03-22 | 广州凯普医学检验所有限公司 | 一种流感病毒自动化快速分型方法、装置、设备及介质 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11629378B2 (en) | Non-invasive prenatal diagnosis of fetal genetic condition using cellular DNA and cell free DNA | |
| JP6161607B2 (ja) | サンプルにおける異なる異数性の有無を決定する方法 | |
| Delorey et al. | A single-cell and spatial atlas of autopsy tissues reveals pathology and cellular targets of SARS-CoV-2 | |
| US20120183969A1 (en) | Immunodiversity Assessment Method and Its Use | |
| CN115786459B (zh) | 一种应用于高通量测序检测实体瘤微小残留病的方法 | |
| CN106191311A (zh) | 一种快速检测豚鼠LCMV、SV、PVM、Reo‑3病毒的多重液相基因芯片方法及试剂 | |
| CN115976178A (zh) | 基于纳米孔宏基因组测序的sftsv检测方法 | |
| CN116875721B (zh) | 隐球菌的cfDNA在诊断隐球菌感染中的应用 | |
| CN108570496A (zh) | 一种遗传性骨病的分子诊断方法及试剂盒 | |
| CN114566224B (zh) | 一种用于鉴别或区分不同海拔人群的模型及其应用 | |
| CN113195738A (zh) | 识别患有川崎病的受试者的方法 | |
| CN115044665A (zh) | Arg1在制备脓毒症诊断、严重程度判断或预后评估试剂或试剂盒中的应用 | |
| US20220148690A1 (en) | Immunorepertoire wellness assessment systems and methods | |
| KR20210071983A (ko) | 임산부로부터 분리된 순환 페탈 세포가 현재 또는 과거의 임신의 것인지 확인하는 방법 | |
| CN112011606B (zh) | 肠道菌群在重症肌无力中的应用 | |
| CN116516068A (zh) | 基于加标引物富集纳米孔宏基因组测序的呼吸道rna病毒实时检测方法 | |
| CN112226501B (zh) | 一种重症肌无力的肠道菌群标志物及其应用 | |
| Ellershaw | Monitoring of OrgAn Transplants (MOAT) Study | |
| CN108070644B (zh) | 一种妊娠高血压的诊断*** | |
| Wang et al. | Interferon-responsive neutrophils and macrophages extricate SARS-CoV-2 Omicron critical patients from the nasty fate of sepsis | |
| Hanron | Using Host Response For Respiratory Virus Discovery And Surveillance | |
| CN116904575A (zh) | 与矽肺患者体能衰退相关的生物标志物及其用途 | |
| CN115806998A (zh) | 肺动脉高压变异基因notch3及其应用 | |
| CN118256613A (zh) | 靶向检测与Blau综合征相关的NOD2基因变异片段的检测试剂及其应用 | |
| CN116445606A (zh) | 血清分子标志物comp在辅助诊断抑郁症中的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination |