CN115975985B - 一种中高温Argonaute蛋白在特异性切割靶核酸中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种中高温Argonaute蛋白在特异性切割靶核酸中的应用，所述Argonaute蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该Argonaute蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提供了上述Argonaute蛋白的体外合成方法，并发现该蛋白对两种向导5’OH‑gRNA和5’P‑gRNA具有结合活性，其能够利用这两种向导去切割靶ssDNA和利用5’OH‑gRNA去切割靶RNA，实现靶向DNA或靶向RNA编辑，同时还可切割质粒。因此，本发明为基于原核生物来源的Argonaute蛋白的基因克隆和分子检测提供了一种新的工具。

Description

一种中高温Argonaute蛋白在特异性切割靶核酸中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种中高温Argonaute蛋白在特异性切割靶核酸中的应用。

背景技术

目前，真核生物来源的Argonaute蛋白(简称eAgos)能够在常温条件下催化RNA向导(gRNA)引导的RNA切割反应，并在体内的RNA干扰(RNA interference，RNAi)途径中发挥至关重要的作用。原核生物来源的Argonaute蛋白(简称pAgos)相比eAgos功能和结构更加多样化，但其生理功能长期以来难以捉摸。大部分原核Argonaute蛋白偏爱利用5’末端磷酸化(5’P)的向导DNA(gDNA)切割靶单链DNA(single-stranded DNA，ssDNA)。随着越来越多关于pAgos性质的探究，发现有些pAgos能够利用5’末端羟基化(5’OH)的gDNA切割靶ssDNA，包括CbAgo(Clostridium butyricum),LrAgo(Limnothrix rosea),CpAgo(Clostridiumperfringens),IbAgo(Intestinibacter bartlettii),SeAgo(Synechococcus elongatus)和KmAgo(Kurthia massiliensis)。还有一些pAgos可以利用向导RNA(gRNA)切割核酸底物，包括AaAgo(Aquifex aeolicus),MpAgo(Marinitoga piezophila),TpAgo(Thermotogaprofunda)和KmAgo。除此之外，一些pAgos还能切割靶RNA，包括AaAgo,TtAgo(Thermusthermophilus),MpAgo,CpAgo和KmAgo。这些pAgos中最令人感到惊喜的是MpAgo，不同于其它已表征的pAgos,MpAgo偏爱利用5’OH的gRNA切割靶ssDNA。还有一种来源于Rhodobactersphaeroides的RsAgo，它也展现了不同于其它pAgos的独特的性质，它只能利用5’P的gRNA去识别DNA底物但没有切割活性。

对于单链核酸底物，Argonaute蛋白的切割模式可以分为八种，包括5’OH-gDNA介导的ssDNA切割，5’OH-gDNA介导的RNA切割，5’OH-gRNA介导的ssDNA切割，5’OH-gRNA介导的RNA切割，5’P-gDNA介导的ssDNA切割，5’P-gDNA介导的RNA切割，5’P-gRNA介导的ssDNA切割，5’P-gRNA介导的RNA切割。尽管pAgos展现了丰富多彩的活性特征，但到目前为止大多数已经表征的pAgos都更偏爱利用gDNA切割靶ssDNA或RNA。尽管eAgos被认为自pAgos进化而来，但是目前大部分已经表征的pAgos并不能像eAgos一样在gRNA引导下去切割靶RNA，pAgos在体内的生理功能也尚不如eAgos清楚。

通过上述分析，为了更好地丰富体外基因水平的操作工具，了解pAgos体内生理功能和进一步探索Argonaute蛋白的进化过程，更多的Argonaute蛋白的体外功能需要被表征，特别是具有独特性质的Argonaute蛋白。随着越来越多病毒引起的疾病的发生，早期诊断能够有效地预防疾病的进一步爆发。中高温甚至于多功能pAgos的挖掘能够丰富现有的核酸检测方法，甚至能够实现不依赖PCR和等温扩增的核酸诊断，这可能可以规避已有的核酸检测方法的弊端。不能忍受单碱基错配的编程酶的出现可能可以解决假阳性和假阴性的问题。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了一种来源于原核生物Tepiditoga spiralis的Argonaute蛋白，其对两种向导(5’OH-gRNA,5’P-gRNA)具有结合活性，并且能够利用这两种向导去切割靶ssDNA和利用5’OH-gRNA去切割靶RNA，实现靶向DNA或靶向RNA编辑，为基于原核生物来源的Argonaute蛋白的基因克隆和分子检测提供了一种新的工具。

本发明的技术方案具体如下：

本发明合成了一种能够特异性切割靶核酸的中高温Argonaute蛋白，其来源于中高温原核生物Tepiditoga spiralis的Argonaute蛋白基因，将其命名为TsAgo且该蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码该蛋白的基因序列如SEQ ID NO.2所示。

对TsAgo蛋白的进一步分析表明，其催化活性位点为SEQ ID NO.1所示序列的第444-452位、第480-488位、第514-522位和第622-630位。

基于此，对上述催化活性位点以外的位点(即非催化活性位点)进行氨基酸的突变、***或缺失后所得的蛋白质仍可能具有与TsAgo蛋白相同的功能；故可以理解的是，与SEQ ID NO.1所示序列的非催化活性位点具有至少50％或至少80％同源性序列的蛋白质仍可能具有与TsAgo蛋白相同的靶核酸切割活性；优选地，其与SEQ ID NO.1所示序列的非催化活性位点具有至少90％同源性；最佳地，其与SEQ ID NO.1所示序列的非催化活性位点具有至少95％同源性。

实验表明，对上述催化活性位点进行至少一个氨基酸突变后，TsAgo蛋白的催化活性会改变；当突变体全部丧失核酸酶活性后，其与RNA向导复合后可用于靶DNA或靶RNA的位点特异性靶向阻断，也可融合其他效应蛋白以拓展其应用。

本发明进一步提供了利用TsAgo蛋白特异性切割靶核酸的方法，具体为：构建核酸切割体系，该体系包括TsAgo蛋白、单链向导RNA、靶RNA或靶DNA，TsAgo蛋白与单链向导RNA结合形成pAgo复合物，TsAgo蛋白在单链向导RNA识别引导下切割靶RNA和/或靶DNA。

在上述方法中，单链向导RNA的长度为13至30个核苷酸；优选地，单链向导RNA的长度为17至25个核苷酸；更为优选地，其长度为19至21个核苷酸。

在上述方法中，单链向导RNA为5’末端羟基化的ssRNA或5’末端磷酸化的ssRNA。

在上述方法中，靶DNA或靶RNA具有与单链向导RNA序列互补配对的核苷酸序列，其中互补配对具体包括：

(a)、靶DNA或靶RNA具有与单链向导RNA序列完全互补的核苷酸序列；

或(b)、靶DNA或靶RNA具有与单链向导RNA序列存在单个碱基错配的核苷酸序列，如当单链向导RNA的长度为18个核苷酸时，单个碱基错配的错配位点可能在5’末端(位点1)，种子区(位点2～8)，中心区(位点9～12)，3’补充区(位点13～15)，3’尾巴区(位点16～18)。

优选地，单个碱基错配的错配位点发生在中心区时，切割特异性更好；如对于长度为18个核苷酸的单链向导RNA，错配发生在位点11或12，切割特异性最好。

在上述方法中，靶RNA没有高级结构，或有高级结构，或为双链RNA，或为体外转录的RNA，或为病毒基因组RNA，或为mRNA，或细胞内的其他RNA；靶DNA是单链DNA或双链DNA。

在上述方法中，核酸切割体系在37～70℃时，TsAgo蛋白具有切割活性；优选地，温度为50～65℃，其中60℃为最佳。

在上述方法中，切割体系中含有二价金属阳离子，优选为Mn²⁺或/和Mg²⁺；当二价金属阳离子为Mn²⁺时，其浓度优选为0.5～10mM；当二价金属阳离子为Mg²⁺时，其浓度优选为2.5～10mM。

基于上述TsAgo蛋白的催化活性及其在特异性切割靶核酸的应用方法，本发明还提供了一种富集低丰度目标核酸的方法，具体为：在反应体系中加入核酸样本、用于核酸等温扩增反应所需的试剂、TsAgo蛋白和单链向导RNA，使核酸样本同时进行依赖解旋酶等温扩增技术和核酸切割反应，其中核酸样本含有目标核酸和非目标核酸。在上述反应体系中，TsAgo蛋白和单链向导RNA形成的pAgo复合物特异性切割非目标核酸但不切割目标核酸，进而在反应产物中富集目标核酸。

本发明还提供了一种试剂盒，该试剂盒中含有TsAgo蛋白。进一步地，该试剂盒还可包含单链向导RNA，通过对单链向导RNA的设计，可实现对不同靶标分子的检测、富集等。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

(1)本发明提供的原核生物来源的TsAgo具体特异性切割靶RNA和靶DNA的活性，并提供了包含编码TsAgo蛋白的核酸表达载体，以及用于以序列特异性方式切割和编辑靶核酸的组合物、试剂盒和方法等；为TsAgo在生物技术的许多领域如核酸检测、基因克隆中的应用奠定了基础。

(2)本发明所述的TsAgo对单链向导RNA具有结合活性，并对与单链向导RNA互补配对的靶ssDNA或靶RNA具有核酸酶活性，特别是偏好利用5’OH-gRNA切割靶ssDNA和靶RNA且切割活性高，而且可以使用5’OH-gRNA特异性切割质粒，扩大了其应用。

(3)TsAgo对单链向导RNA形成的pAgo复合物不用依赖靶位点附近的特殊基序来识别和结合靶，核酸向导设计方便，不用考虑位点限制。而且pAgo复合物严格依赖于向导和靶的互补配对发挥切割活性，当靶DNA或靶RNA与单链向导RNA序列在中心区存在单个碱基错配时，特异性最优。

附图说明

图1为实施例1中SDS-PAGE凝胶分析TsAgo纯度示意图；

图2为实施例1中TsAgo与部分已表征的Argonaute蛋白的进化树；

图3为实施例1中用于测试的靶DNA、靶RNA、向导RNA的序列示意图；

图4为实施例1中TsAgo切割靶ssDNA和靶RNA的检测结果图；

图5为实施例2中不同核酸向导长度切割靶ssDNA和靶RNA所得产物的尿素/聚丙烯酰胺凝胶检测结果图；

图6为实施例3中TsAgo在不同金属阳离子条件下所得裂解产物的尿素/聚丙烯酰胺凝胶检测结果图；

图7为实施例3中TsAgo在不同Mn²⁺或Mg²⁺离子浓度条件下所得裂解产物的尿素/聚丙烯酰胺凝胶检测结果图；

图8为实施例4中TsAgo在不同温度条件下所得裂解产物的尿素/聚丙烯酰胺凝胶检测结果图；

图9为实施例5中TsAgo在不同单碱基错配条件下所得裂解产物的尿素/聚丙烯酰胺凝胶检测结果图；

图10为本发明提供的TsAgo的催化DEDX四联体与已表征Ago蛋白的序列比对示意图；

图11为实施例6中TsAgo的双突变体DM对靶ssDNA和靶RNA切割产物的尿素/聚丙烯酰胺凝胶检测结果图；

图12为实施例7中TsAgo切割质粒DNA的检测结果图。

具体实施方式

下面将结合本发明中的实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。

下述实施例中，若无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例1

本例构建了体外表达TsAgo蛋白的方法，其过程具体为：

从中高温原核生物Tepiditoga spiralis(一种来源于深海热液喷口烟囱的螺旋菌)中扩增得到如SEQ ID NO.2所示的核苷酸序列，并采用常规方法连接至pET28a上得到pET28a-TsAgo质粒，然后转化至大肠杆菌Rosetta Blue(DE3)，单菌落接种到含有50mg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，于37℃、220rpm的摇床上摇瓶培养，当菌体OD₆₀₀达到0.8时，移至18℃摇床，IPTG诱导过夜。

待诱导表达结束后，6000rpm离心10min收集菌体，用Buffer A(20mM HEPES缓冲液，pH 7.5，250mM NaCl，1mM DTT)洗菌后，将菌体重悬于Buffer A，添加终浓度1mM的PMSF，高压破碎。18000rpm离心30min，收集上清。

上清过滤后，进行Ni-NTA纯化。20mM和50mM咪唑各洗10个柱体积(分3次加入)，100mM、200mM、300mM、400mM、500mM、600mM、700mM、800mM各洗3个柱体积，取样进行SDS-PAGE检测。收集含有高纯度目的蛋白的洗脱组分，超滤换液至Buffer A。用20mM HEPES(pH 7.5)将NaCl浓度稀释至125mM后，进行肝素柱(HiTrap Heparin HP,GE Healthcare)纯化。肝素柱预先用Buffer B(20mM HEPES，pH 7.5，125mM NaCl)平衡，通过升高NaCl的浓度洗脱TsAgo。收集纯化的蛋白，用SDS-聚丙烯酰胺凝胶鉴定纯度并分析，将蛋白分成小份，经液氮速冻后，储存在-80℃。

SDS-聚丙烯酰胺凝胶鉴定分析结果如图1所示，通过http://www.expasy.org/计算，TsAgo的预期大小为77.15kDa，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，检测结果表明与预期一致。

TsAgo与部分已表征的Argonaute蛋白(Ago蛋白)的进化树如图2所示。

本例进一步测定了上述TsAgo蛋白的切割活性，具体试验过程如下：

为了评估TsAgo能够裂解向导RNA/DNA和靶RNA/DNA的哪些组合，对所有可能的组合进行了活性测定。其中靶DNA(SEQ ID NO.3)、靶RNA(SEQ ID NO.4)、向导ssDNA(SEQ IDNO.5)和向导ssRNA(SEQ ID NO.6)的序列示意图如图3所示，其中箭头表示预测的切割位点，M1和M2为裂解产物。

裂解试验均在60℃下以4∶2∶1(TsAgo∶向导∶靶)摩尔比进行。将800nM TsAgo与400nM向导放在含有10mM HEPES-NaOH(pH 7.5)，100mM NaCl，5mM MnCl₂和5％甘油的反应缓冲液中混合，先在55℃孵育10分钟以用于向导加载；再将核酸靶添加至200nM，于60℃反应30min；最后通过将样品与2×RNA上样染料(95％甲酰胺，18mM EDTA，0.025％SDS和0.025％溴酚蓝)混合并在95℃加热5min来终止反应。裂解产物通过20％变性PAGE解析，用SYBR Gold(Invitrogen)染色，用Gel Doc^TM XR+(Bio-Rad)可视化。

TsAgo对靶ssDNA和靶RNA的切割结果如图4所示，从结果可知：①在没有核酸向导的情况下(no guide泳道)，进行孵育的靶DNA/RNA对照测定中未观察到产物带(34nt)，表明产物带的形成是TsAgo核酸酶活性的结果；②TsAgo可以利用5’磷酸化的向导RNA和5’羟基化的向导RNA切割靶ssDNA，还可以利用5’羟基化的向导RNA切割靶RNA。

实施例2

本例检测了核酸向导长度对靶ssDNA和靶RNA切割活性影响。

分别选择长度为12-30nt的5’羟基化的RNA(序列见表1)作为向导RNA，将其分别与TsAgo孵育结合形成pAgo复合物，并测定不同长度向导RNA对TsAgo识别并切割靶ssDNA/RNA(SEQ ID NO.3/4)的活性。

表1

长度	序列	序列号
			12nt C-gRNA	CGAGGUAGUAGG	SEQ ID NO.7
13nt C-gRNA	CGAGGUAGUAGGU	SEQ ID NO.8
			14nt C-gRNA	CGAGGUAGUAGGUU	SEQ ID NO.9
15nt C-gRNA	CGAGGUAGUAGGUUG	SEQ ID NO.10
			16nt C-gRNA	CGAGGUAGUAGGUUGU	SEQ ID NO.11
17nt C-gRNA	CGAGGUAGUAGGUGUA	SEQ ID NO.12
			19nt C-gRNA	CGAGGUAGUAGGUUGUAUA	SEQ ID NO.13
20nt C-gRNA	CGAGGUAGUAGGUUGUAUAG	SEQ ID NO.14
			21nt C-gRNA	CGAGGUAGUAGGUUGUAUAGU	SEQ ID NO.15
25nt C-gRNA	CGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUAAGC	SEQ ID NO.16
			30nt C-gRNA	CGAGGUAGUAGGUUGUAUAGUAAGCUUGGC	SEQ ID NO.17

反应体系及操作过程同实施例1，测定结果如图5所示，表明：向导RNA的长度对于TsAgo识别切割靶ssDNA和RNA活性有一定影响，其中当向导RNA长度的范围为13-30nt，且优选长度为17至25时，可以有效切割靶ssDNA/靶RNA。

实施例3

本例检测了反应体系中的二价金属离子及其浓度对靶ssDNA和RNA切割活性影响。

将TsAgo与5’OH向导RNA放在含有10mM HEPES-NaOH(pH 7.5)，100mM NaCl，5mM二价金属阳离子和5％甘油的反应缓冲液中混合，反应操作过程同实施例1，且二价金属阳离子分别为Mn²⁺，Mg²⁺，Ca²⁺，Cu²⁺，Fe²⁺，Co²⁺，Zn²⁺和Ni²⁺。

测定结果如图6所示，结果显示：二价金属阳离子的选择对于TsAgo的切割活性有一定的影响，其中在Mn²⁺条件下切割活性最好，其次是Mg²⁺。

进一步对二价金属离子的最低浓度进行摸索，分别选取0.1mM～10mM的Mn²⁺或Mg²⁺加入缓冲液中，反应操作过程同上。测定结果如图7所示，表明：二价金属阳离子的浓度对TsAgo的切割活性有一定影响，其中Mn²⁺浓度最低为0.5mM，Mg²⁺靶向切割DNA浓度最低为2.5mM，靶向切割RNA浓度最低为5mM；Mg²⁺和Mn²⁺的浓度越高，TsAgo的切割活性越好。

实施例4

本例检测了温度对TsAgo切割靶ssDNA和靶RNA活性的影响。

将TsAgo与5’OH向导RNA孵育结合形成复合物后，添加靶ssDNA或者RNA，分别于25～80℃反应，其余反应操作添加同实施例1。

产物检测结果如图8所示，结果显示：TsAgo可以在温度为37～70℃时切割靶ssDNA，其中55～70℃切割活性相对较高；在温度为37～70℃时切割靶RNA，其中55～60℃切割活性相对较高。

实施例5

本例检测了单碱基错配对TsAgo切割靶ssDNA和靶RNA活性的影响。

将TsAgo与5’OH向导RNA孵育结合形成复合物后，添加靶ssDNA和靶RNA，并使靶ssDNA和靶RNA与向导RNA发生单碱基错配，分别于60℃反应30min后，其余反应操作添加同实施例1。

产物检测结果如图9所示，其中m1表示位点1发生错配，m2表示位点2发生错配，依次类推至位点18。表明：错配发生在中心区(位点9～12)对TsAgo的活性影响最大，特别是发生在位点11和12，即单碱基错配发生在中心区时，TsAgo的切割特异性相对较好。

实施例6

TsAgo的催化四联体DEDN分别为SEQ ID NO:1所示序列的第444-452位、第480-488位、第514-522位和第622-630位，且TsAgo的催化DEDX四联体以及与十七个已表征Ago蛋白的序列比对示意图如图10所示。

通过突变对TsAgo蛋白的催化活性必不可少的一个或多个氨基酸残基以形成新的核酸酶活性，特别是核酸内切酶活性缺失。

如本例将TsAgo催化四联体中的第1个和第3个D突变为A，得到双突变体DM(序列如图10中TsAgo_DM所示)，并测定其对于靶ssDNA和RNA的切割活性。

测定结果见图11，结果显示：对TsAgo的催化四连体进行突变后，会使其失去全部5’OH或者5’P的RNA向导切割靶ssDNA和RNA的活性。也就是说，至少突变一个位于进化保守的氨基酸四联体中的氨基酸，可改变TsAgo蛋白的催化活性。即该四联体为TsAgo催化活性关键位点。

失活后的蛋白可用于体外靶向阻断靶DNA或靶RNA，具体为：使用上述无核酸酶活性的pAgo和RNA向导，向导和该pAgo形成pAgo-向导复合物；使所得的pAgo-向导复合物与靶RNA或靶DNA接触，且靶具有与所述向导序列大部分互补的核苷酸序列，pAgo-向导复合物结合在靶上与向导大部分互补的区域。

实施例7

相对于其他pAgos，本发明提供的TsAgo能够使用5’末端羟基化的RNA向导特异性切割质粒，其检测过程如下：

先进行两个半反应，在含有5mM HEPES pH 7.5、50mM NaCl、0.5mM MnCl₂、2.5％甘油的反应缓冲液中，8pmol的TsAgo与10pmol的正向或反向RNA向导一起加载，半反应在55℃下孵育30min。然后将两个半反应混合，加入200ng目标质粒，并于60℃下反应1h。再在Cutsmart缓冲液(NEB)中使用ScaI(NEB)在37℃下消化产物1小时。通过向混合物中添加6×DNA加载染料(NEB)来停止反应。裂解产物通过0.8％琼脂糖凝胶分离，用溴化乙锭染色，用Gel DocTM XR+(Bio-Rad)显像。

TsAgo对质粒DNA的切割结果见图12，结果显示：TsAgo可以在没有gRNA的情况下切割pUC19以产生开放的环状质粒DNA，但pUC19只有在提供与两条质粒链互补的两个gRNA时才能使质粒线性化；加入限制性内切酶后，可以产生预计大小的产物。即表明TsAgo可以在5’末端羟基化的RNA向导作用下特异性切割质粒。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种中高温Argonaute蛋白在特异性切割靶核酸中的应用，其特征在于，所述Argonaute蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，编码所述Argonaute蛋白的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，所述应用不以疾病的诊断和治疗为目的。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述Argonaute蛋白在核酸切割体系中特异性切割靶RNA或靶DNA，所述核酸切割体系包括单链向导RNA，Argonaute蛋白以及与所述单链向导RNA序列互补配对的靶RNA或靶DNA。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述互补配对具体为：

（a）所述靶DNA或靶RNA具有与所述单链向导RNA序列完全互补的核苷酸序列；

或（b）所述靶DNA或靶RNA具有与所述单链向导RNA序列存在单个碱基错配的核苷酸序列。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述靶RNA没有高级结构，或有高级结构，或为双链RNA，或为体外转录的RNA，或为病毒基因组RNA，或为mRNA，或细胞内的其他RNA；所述靶DNA是单链DNA或双链DNA。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述单链向导RNA的长度为13至30个核苷酸。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述单链向导RNA为5’末端羟基化的RNA或5’末端磷酸化的RNA。

7.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述核酸切割体系的温度为37～70℃。

8.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述核酸切割体系中包含Mn²⁺或Mg²⁺。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，在所述核酸切割体系中， Mn^{2 +}的浓度0.5～10 mM， Mg²⁺的浓度为2.5～10 mM。

10.权利要求1所述的Argonaute蛋白在制备核酸检测试剂盒中的应用。