CN115975206B - 一种杂化mof材料及其制备和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于纳米材料和生物医学领域，具体涉及一种杂化MOF材料及其制备和应用。杂化MOF材料为以带负电的Ag3AuS2@Fe3O4作为核，以双链DNA固定的ATP敏感的ZIF‑90作为壳，壳包裹核形成壳核结构的杂化MOF材料。本发明制备的杂化MOF材料具有特异性识别ADP和ATP的性能，可实现同一体系内ADP和ATP的同时检测。本发明制备的杂化MOF具有良好的稳定性、生物相容性，在临床和环境分析方面具有广阔的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于纳米材料和生物医学领域，具体涉及一种杂化MOF材料及其制备和应用。
背景技术
二磷酸腺苷(ADP)与激酶酶活性相关，涉及许多细胞过程，包括细胞生长、***和程序性细胞死亡。三磷酸腺苷(ATP)是生命***中的主要能量货币，是早期诊断肾病、糖尿病、癌症、视网膜退行性疾病和阿尔茨海默病的生物标志物。ATP通过水解生成ADP为所有活细胞的正常运作提供大量的能量，ATP和ADP的交换反应是根据细胞的需要动态变化的。因此，ADP和ATP之间的比例是细胞能量状态变化的敏感指示器。此外，ADP/ATP比值在调节细胞信号活动中也很重要，例如，AMP活化的蛋白激酶通过感知ADP/ATP比值的变化，激活分解代谢通路或下调合成代谢通路，从而调节能量状态。
在一些研究中已经探索了测量不同细胞状态下ADP和ATP比值的方法。然而，这些荧光传感器只能提供ADP/ATP比值的信息，而不能提供核苷酸的绝对浓度，这限制了其在临床和生理分析中的应用。显然，在一个***中同时鉴别检测ADP和ATP可以为研究细胞能量状态和调节信号活动提供广泛的应用，并且通过简单的计算可以立即得到ADP/ATP比值。到目前为止，同时检测ADP和ATP的工作非常有限。因此，开发同时鉴别ADP和ATP的高灵敏度***是临床和检测领域的迫切需要。
发明内容
本发明的目的在于针对目前现有的不能在同一体系内同时检测ADP和ATP的问题，提供一种杂化MOF材料及其制备和应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种杂化MOF材料，杂化MOF材料为以带负电的Ag3AuS2@Fe3O4作为核，以双链DNA固定的ATP敏感的ZIF-90作为壳，壳包裹核形成壳核结构的杂化MOF材料。
所述壳为ATP敏感的ZIF-90，再通过酰胺反应将ADP适配体和DNA激活链组成的双链DNA固定的ATP敏感的ZIF-90纳米载体表面，进而形成杂化MOF材料的壳。
一种杂化MOF材料的制备方法，以带负电的Ag3AuS2@Fe3O4作为核，其外部包裹ATP敏感的ZIF-90，再通过酰胺反应将ADP适配体和DNA激活链组成的双链DNA固定在ZIF-90纳米载体表面，形成壳核结构的杂化MOF材料
所述杂化MOF材料的Ag3AuS2@Fe3O4内核为四氯金酸，硝酸银，四氧化三铁，硫粉按重量比为1:2:1:1加热反应生成。
所述Ag3AuS2@Fe3O4为四氯金酸，硝酸银，四氧化三铁混合在油酸体系中，加热(50-55℃)反应20-21小时，而后加入硫粉继续反应2-3小时。
所述ATP敏感的ZIF-90外壳为以Ag3AuS2@Fe3O4，2-甲醛咪唑，醋酸锌按重量比为5:1:1混合在DMF体系中，常温反应生成。
所述ATP敏感的ZIF-90外壳将Ag3AuS2@Fe3O4和2-甲醛咪唑混合在DMF中，常温(25-28℃)反应10-15分钟，而后加入醋酸锌常温(25-28℃)反应10-15分钟。
所述ADP适配体，DNA激活链和ATP敏感的ZIF-90按摩尔比4:4:3-4:4:2的比例混合。
所述ADP适配体为GGGACGGAGACGAGGGGACGAAAGUCCCCGGACAAUCAGACACGGUCUCCGUCCC；进一步的说，所述适配体可进一步被修饰；
DNA激活链为TCGTCCCAAACACACAAG GGAC。
一种杂化MOF材料的应用，所述材料可实现同一体系内ADP和ATP的同时检测。
所述材料在临床和环境分析中的应用。
本发明以杂化MOF材料为以带负电的Ag3AuS2@Fe3O4作为核，其外部包裹ATP敏感的ZIF-90，再通过酰胺反应将ADP适配体和DNA激活链组成的双链DNA固定在ZIF-90纳米载体表面，形成壳核结构的杂化MOF材料。本发明制备的杂化MOF材料具有特异性识别ADP和ATP的性能，可实现同一体系内ADP和ATP的同时检测。本发明制备的杂化MOF具有良好的稳定性、生物相容性，在临床和环境分析方面具有广阔的应用前景。
本发明的有益效果在于：
本发明以四氯金酸，硝酸银，四氧化三铁，硫粉反应生成的Ag3AuS2@Fe3O4为内核，包裹在ATP敏感的ZIF-90外壳中，再通过酰胺反应将ADP适配体和DNA激活链组成的双链DNA固定在ZIF-90纳米载体表面，形成壳核结构的杂化MOF材料，发现制备的杂化MOF材料具有特异性识别ADP和ATP的性能，可实现同一体系内ADP和ATP的同时检测，且具有良好的稳定性，选择性，不易被复杂环境干扰。在在临床和环境分析方面具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为本发明实施例1提供的杂化MOF的TEM图，其中，A为Ag3AuS2@Fe3O4、B为ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4、C为双链DNA-ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4；
图2为本发明实施例2提供的杂化MOF检测ADP和ATP的荧光响应图，其中，A为杂化MOF在ADP溶液中反应30分钟、B为杂化MOF在ATP溶液中反应30分钟；
图3为本发明实施例3提供的杂化MOF在ADP和ATP溶液中反应30分钟的荧光变化图；
图4为本发明实施例4提供的杂化MOF在血清样品中检测ADP和ATP的结果。
具体实施方式
以下结合实例对本发明的具体实施方式做进一步说明，应当指出的是，此处所描述的具体实施方式只是为了说明和解释本发明，并不局限于本发明。
本发明通过形成特定的壳核结构的纳米杂化MOF，该纳米载体具有有特异性识别ADP和ATP的性能，可实现同一体系内ADP和ATP的同时检测。
实施例1：
杂化MOF的制备：
1)将20mg HAuCl4·4H2O、40mg AgNO3和20mg Fe3O4加入30mL油酸溶液中。将体系加热至55℃反应20h，然后在搅拌下加入10mL含25mg硫粉的油酸。搅拌2h后，用无水乙醇洗涤三次，再分散于5mL PBS(10mM,pH 7.4)中备用，得到Ag3AuS2@Fe3O4。(参见图1A)。
2)将48.05mg 2-咪唑甲醛(0.05M)和100μL Ag3AuS2@Fe3O4(10mg mL-1)溶于10.0mLDMF中，搅拌15min，然后缓慢加入5.0mL含0.05MZn(CH3COO)2的DMF。最终溶液连续搅拌15min，然后用DMF、超纯水和乙醇洗涤分散体，离心(10000rpm,5min)。最后，将产物分散在超纯水中，得到ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4原液(10mg mL-1)。(参见图1B)。
3)将250μL ADP适配体-1(100μM，NH2-GGGACGGAGACGAGGGGACGAAAGUCCCCGGACAAUCAGACACGGUCUCCGUCCCUUGUGU)与125μL EDC(5mg mL-1)和125μL NHS(5mg mL-1)混合反应20min，加入5mg ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4搅拌15h，然后将得到的DNA适配体-ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4，用PBS(10mM,pH＝7.4)洗涤3次，分散到500μL PBS溶液中。将20μL DNA激活链(10μM，TCGTCCCAAACACACAAGGGAC)溶液加入100μL DNA适配体-ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4溶液中反应3h,PBS洗涤3次后分散到100μLPBS溶液中，再加入20μL ADP适配体-1(10μM，GUUUGGGACGGAGACGAGGGGACGAAAGUCCCCGGACAAUCAGACACGGUCUCCGUCCC)溶液，形成双链DNA-ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4。(参见图1C)。
通过透射电子显微镜(TEM)表征制备的双链Ag3AuS2@Fe3O4、ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4和双链DNA-ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4的形貌。如图1A、图1B和图1C所示，Ag3AuS2@Fe3O4、ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4和双链DNA-ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4的都是均匀的纳米颗粒，平均直径分别为70.4、213.4和229.3nm。
实施例2：
杂化MOF的制备：
1)将20mg HAuCl4·4H2O、40mg AgNO3和20mg Fe3O4加入30mL油酸溶液中。将体系加热至50℃反应21h，然后在搅拌下加入10mL含25mg硫粉的油酸。搅拌3h后，用无水乙醇洗涤三次，再分散于5mL PBS(10mM,pH 7.4)中备用，得到Ag3AuS2@Fe3O4。(参见图1D)。
2)将48.05mg 2-咪唑甲醛(0.05M)和100μL Ag3AuS2@Fe3O4(10mg mL-1)溶于10.0mLDMF中，搅拌30min，然后缓慢加入5.0mL含0.05MZn(CH3COO)2的DMF。最终溶液连续搅拌30min，然后用DMF、超纯水和乙醇洗涤分散体，离心(10000rpm,5min)。最后，将产物分散在超纯水中，得到ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4原液(10mg mL-1)。(参见图1E)。
3)将250μL ADP适配体-1(100μM，NH2-GGGACGGAGACGAGGGGACGAAAGUCCCCGGACAAUCAGACACGGUCUCCGUCCCUUGUGU)与125μL EDC(5mg mL-1)和125μL NHS(5mg mL-1)混合反应20min，加入10mg ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4搅拌15h，然后将得到的DNA适配体-ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4，用PBS(10mM,pH＝7.4)洗涤3次，分散到500μL PBS溶液中。将20μL DNA激活链(10μM，TCGTCCCAAACACACAAGGGAC)溶液加入100μL DNA适配体-ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4溶液中反应3h,PBS洗涤3次后分散到100μLPBS溶液中，再加入20μL ADP适配体-1(10μM，GUUUGGGACGGAGACGAGGGGACGAA AGUCCCCGGACAAUCAGACACGGUCUCCGUCCC)溶液，形成双链DNA-ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4。(参见图1F)。
应用例1：
杂化MOF的刺激响应性：
1)将20μL Cas12a(10nM)和20μL crRNA(UAAUUUCUACUAAGUGUAGAUGUCCCUUGUGUGUUUGGGAC)在37℃下混合30min，再加入50nM的ssDNA(FAM-AACCGCTTCCCCGACTTCC-BHQ)20μL，制备含非活性Cas12a和荧光DNA的报告液。报告液现配现用。在20μL含5nM浓度ADP的PBS缓冲液(10mM,pH＝7.4)中加入20μL实施例1制备所得DNA-ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4(1mg mL-1)溶液检测ADP，孵育5min后，加入60μL报告液,37℃孵育25min,60℃加热5min停止酶促反应，并测定溶液的荧光。(参见图2A)。
2)在20μL含5nM浓度ATP的PBS缓冲液(10mM,pH＝7.4)中加入20μL实施例1制备的双链DNA-ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4(1mg mL-1)溶液检测ATP。孵育5min后，加入60μL PEI-CDs溶液(1mg mL-1)，孵育15min，测定溶液的荧光。(参见图2B)。
如图2A所示，双链DNA-ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4的加入并没有导致荧光响应的显著增加，然而，在ADP的作用下，双链DNA-ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4可以释放出激活链，产生显著的荧光信号。如图2B所示，从图3D中可以看出，PEI-CDs具有较高的荧光，当引入双链DNA-ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4和ATP后荧光显著下降，而在没有ATP的情况下引入双链DNA-ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4几乎不会导致荧光猝灭。
应用例2：
杂化MOF对ADP和ATP同时检测：
为同时检测ADP和ATP，在含ADP和ATP的20μL PBS缓冲液(10mM,pH＝7.4，缓冲溶液中ADP和ATP的浓度分别5nM)中加入40μL双链DNA-ZIF-90@Ag3AuS2@Fe3O4和ATP(1mg mL-1)溶液。孵育5min后，加入120μL报告溶液和20μL PEI-CDs溶液(6mg mL-1)，37℃孵育25min,60℃加热5min，测定荧光响应。
图3A-D为探测***对无靶标、单靶标和双靶标的荧光光谱。与没有ADP和ATP的情况下产生的荧光强度相比(图3A)，ADP的存在使520nm处的荧光发射从1174.2a.u增加到8562.4a.u，而450nm处的荧光信号变化不大(图3B)。同样，ATP的加入导致450nm处的荧光信号从10343.6a.u显著下降到1903.7a.u.，而520nm处的荧光发射没有明显的信号变化(图3C)。同时加入ADP和ATP，导致ssDNA报告基因520nm处的荧光发射显著增加，PEI-CDs 450nm处的荧光发射显著降低(图3D)。
应用例3：
杂化MOF对生物样品中ADP和ATP同时检测：
为了同时检测实际样品中的ADP和ATP，采用人血清样品进行回收实验。在PBS(10mM,pH＝7.4)稀释的10％人血清中加入一系列浓度的ADP和ATP标准品，通过荧光反应测定溶液中ADP和ATP的浓度。如图4所示，ADP的加标回收率分别为95.8、102.8、104.7、106.9％，RSD在2.8％～4.6％之间。ATP检测的加标回收率分别为107.2、97.7、105.8、106.3％，RSD在2.4～4.8％之间。这些结果表明，所提出的生物传感器具有良好的实用性，可用于实际样品中ADP和ATP的超灵敏定量。
Claims (10)
1.一种杂化MOF材料，其特征在于：杂化MOF材料为以带负电的Ag3AuS2@Fe3O4作为核，以双链DNA固定的ATP敏感的ZIF-90作为壳，壳包裹核形成壳核结构的杂化MOF材料。
2.按权利要求1所述的杂化MOF材料，其特征在于：所述壳为ATP敏感的ZIF-90，再通过酰胺反应将ADP适配体和DNA激活链组成的双链DNA固定的ATP敏感的ZIF-90纳米载体表面，进而形成杂化MOF材料的壳。
3.一种权利要求1所述的杂化MOF材料的制备方法，其特征在于：以带负电的Ag3AuS2@Fe3O4作为核，其外部包裹ATP敏感的ZIF-90，再通过酰胺反应将ADP适配体和DNA激活链组成的双链DNA固定在ZIF-90纳米载体表面，形成壳核结构的杂化MOF材料。
4.按权利要求3所述的杂化MOF材料的制备方法，其特征在于：所述杂化MOF材料的Ag3AuS2@Fe3O4内核为四氯金酸，硝酸银，四氧化三铁，硫粉按重量比为1:2:1:1加热反应生成。
5.按权利要求4所述的杂化MOF材料的制备方法，其特征在于：所述Ag3AuS2@Fe3O4为四氯金酸，硝酸银，四氧化三铁混合在油酸体系中，加热至50-55℃反应20-21小时，而后加入硫粉继续反应2-3小时。
6.按权利要求3或4所述的杂化MOF材料的制备方法，其特征在于：所述ATP敏感的ZIF-90外壳为以Ag3AuS2@Fe3O4，2-甲醛咪唑，醋酸锌按重量比为5:1:1混合在DMF体系中，常温反应生成。
7.按权利要求6所述的杂化MOF材料的制备方法，其特征在于：所述ATP敏感的ZIF-90外壳为将Ag3AuS2@Fe3O4和2-甲醛咪唑混合在DMF中，常温25-28℃反应10-15分钟，而后加入醋酸锌，常温25-28℃反应10-15分钟，生成。
8.按权利要求7所述的杂化MOF材料的制备方法，其特征在于：所述ADP适配体，DNA激活链和ATP敏感的ZIF-90按摩尔比4:4:3-4:4:2的比例混合。
9. 按权利要求8所述的杂化MOF材料的制备方法，其特征在于：所述ADP适配体为GGGACGGAGACGAGGGGACGAAAGUCCCCGGACAAUCAGA CACGGUCUCCGUCCC；DNA激活链为TCGTCCCAAACACACAAG GGAC。
10.一种权利要求1所述杂化MOF材料的非疾病诊断与治疗的应用，其特征在于：所述材料可实现同一体系内ADP和ATP的同时检测。
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