CN115960178A - 人***瘤病毒hpv59 l1蛋白的表达和类病毒样颗粒及其制备方法 - Google Patents
人***瘤病毒hpv59 l1蛋白的表达和类病毒样颗粒及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及医药生物领域,具体涉及人***瘤病毒HPV59型L1蛋白的表达和类病毒样颗粒及其制备方法。对HPV59型L1蛋白的氨基酸序列进行截短,并针对该截短后的蛋白的编码核苷酸序列进行密码子优化得到优化的编码核苷酸序列,最后配合含有特定SD序列无标签表达载体实现无标签表达纯化。本发明通过上述改进使得在原核表达***例如大肠杆菌表达***中可以获得更高的蛋白表达量,且得到质量更均一的VLP。
Description
技术领域
本发明涉及医药生物领域,具体涉及人***瘤病毒HPV59 L1蛋白VLP(类病毒样颗粒)的构建及表达。
背景技术
人***瘤病毒(human papillomavirus,HPV)是一种无包膜的闭环双链DNA病毒,属乳多空病毒科多瘤病毒亚科,主要侵犯人体的上皮黏膜组织,进而诱发各种良性及恶性增生病变。目前已鉴定出来的不同亚型HPV超过200种,HPV感染具有明显的组织特异性,不同型别的HPV对于皮肤和黏膜的嗜向性不同,能诱发不同的***状病变,大约有30多种HPV型别与生殖道感染有关,其中有20多种与肿瘤相关。
根据HPV诱发病变的良恶性不同,HPV可大致分为两类:1)高危型(如HPV16、HPV18、HPV31、HPV33、HPV59、HPV59、HPV45、HPV51、HPV52、HPV56、HPV58、HPV59、HPV59等):高危型HPV与人类多种组织恶性肿瘤密切相关,主要引起重度不典型增生和***;2)低危型(如HPV6、HPV11、HPV40、HPV42、HPV43、HPV44、HPV54、HPV72、HPV81等):低危型HPV可引起表皮细胞良性增殖性性病,如***和***等。HPV主要由病毒外壳和基因组DNA构成。基因组长约7900bp,有8个病毒蛋白编码基因。其中6个ORF编码的蛋白在病毒复制的早期表达,称为早期蛋白;2个ORF编码的蛋白在病毒复制的晚期表达,称为晚期蛋白。晚期蛋白包括主要外壳蛋白L1及次要外壳蛋白L2,并参与病毒外壳的形成。HPV病毒外壳蛋白能够进行自组装,目前在专利文献中,多采用酵母表达***或者昆虫表达***或者在哺乳动物细胞表达***里面单独表达的L1蛋白或将L1 蛋白与L2蛋白共表达时均能自组装成病毒样颗粒(virus-like particle ,VLP),利用外源表达体系生产的VLP免疫后能够在体内诱发产生中和抗体,获得良好的免疫保护效果。但是利用真核表达***在体内直接表达组装VLP,产生VLP的性质并不是很均一,并且真核表达***的成本很高,不利于产业化。
目前针对HPV59型在CN202110442661.X中报道,采用的是汉逊酵母表达***产生HPV59L1蛋白,汉逊酵母表达***是真核表达***,在体内直接组装成VLP,该专利中并没有提出是否在大肠杆菌原核表达***里是否可以正常表达合格标准的蛋白,因为大肠杆菌原核表达***并不具备汉逊酵母表达***翻译后修饰等功能,所以在原核表达***里表达HPV59 L1是有一定难度的。因此,需要研究解决在原核表达***里面表达HPV59L1蛋白困难的问题,以获得更均一的VLP以及在产业应用上有更低的成本。
发明内容
本发明人针对基于疫苗成品成本的考虑,在原核表达***里面表达HPV59 L1 蛋白,并解决了在原核表达***里面表达HPV59L1蛋白困难的问题。具体通过以下改进实现:对HPV59型L1蛋白的氨基酸序列进行截短,并针对该截短后的蛋白的编码核苷酸序列进行密码子优化得到优化的编码核苷酸序列,最后配合含有特定SD序列的无标签表达载体实现高效表达和纯化。
首先,本发明将HPV59L1蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)做N/C端截短处理,为了获得更好的蛋白表达率。N端截短4个氨基酸,且在其C端截短31个氨基酸,具体的截短后的氨基酸见SEQ ID NO:2。N/C端截短处理后,可在无标签表达载体上表达并且获得更高质量的蛋白及VLP。
其中,SEQ ID NO :2所示序列如下:
1 MSSDNKVYLP PPSVAKVVST DEYVTRTSIF YHAGSSRLLT VGHPYFKVPK
51 GGNGRQDVPK VSAYQYRVFR VKLPDPNKFG LPDNTVYDPN SQRLVWACVG
101 VEIGRGQPLG VGLSGHPLYN KLDDTENSHV ASAVDTKDTR DNVSVDYKQT
151 QLCIIGCVPA IGEHWTKGTA CKPTTVVQGD CPPLELINTP IEDGDMVDTG
201 YGAMDFKLLQ DNKSEVPLDI CQSICKYPDY LQMSADAYGD SMFFCLRREQ
251 VFARHFWNRS GTMGDQLPES LYIKGTDIRA NPGSYLYSPS PSGSVVTSDS
301 QLFNKPYWLH KAQGLNNGIC WHNQLFLTVV DTTRSTNLSV CASTTSSIPN
351 VYTPTSFKEY ARHVEEFDLQ FIFQLCKITL TTEVMSYIHN MNTTILEDWN
401 FGVTPPPTAS LVDTYRFVQS AAVTCQKDTA PPVKQDPYDK LKFWPVDLKE
451 RFSADLDQFP LGRKFLLQLG ARP
其次,为了利用大肠杆菌***高效的表达HPV59L1蛋白,发明人根据SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列,针对大肠杆菌***进行核苷酸序列的密码子优化。优化原则包括:a)按照大肠杆菌遗传密码使用频率表选用使用频率最高或较高的密码子;b)消除常用的限制性内切酶识别位点。通过上述原则经过优化的核苷酸序列并进行多次筛选,获得了优化后的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示,进一步提供含有所述编码核酸的表达盒,表达载体和重组宿主细胞。优选地,其是大肠杆菌。
其中,SEQ ID NO :3所示序列如下:
1 ATGTCTTCTG ACAACAAAGT TTACCTGCCG CCGCCGTCTG TTGCTAAAGT
51 TGTTTCTACC GACGAATACG TTACCCGTAC CTCTATCTTC TACCACGCTG
101 GTTCTTCTCG TCTGCTGACC GTTGGTCACC CGTACTTCAA AGTTCCGAAA
151 GGTGGTAACG GTCGTCAGGA CGTTCCGAAA GTTTCTGCTT ACCAGTACCG
201 TGTTTTCCGT GTTAAACTGC CGGACCCGAA CAAATTCGGT CTGCCGGACA
251 ACACCGTTTA CGACCCGAAC TCTCAGCGTC TGGTTTGGGC TTGCGTTGGT
301 GTTGAAATCG GTCGTGGTCA GCCGCTGGGT GTTGGTCTGT CTGGTCACCC
351 GCTGTACAAC AAACTGGACG ACACCGAAAA CTCTCACGTT GCTTCTGCTG
401 TTGACACCAA AGACACCCGT GACAACGTTT CTGTTGACTA CAAACAGACC
451 CAGCTGTGCA TCATCGGTTG CGTTCCGGCT ATCGGTGAAC ACTGGACCAA
501 AGGTACCGCT TGCAAACCGA CCACCGTTGT TCAGGGTGAC TGCCCGCCGC
551 TGGAACTGAT CAACACCCCG ATCGAAGACG GTGACATGGT TGACACCGGT
601 TACGGTGCTA TGGACTTCAA ACTGCTGCAG GACAACAAAT CTGAAGTTCC
651 GCTGGACATC TGCCAGTCTA TCTGCAAATA CCCGGACTAC CTGCAGATGT
701 CTGCTGACGC TTACGGTGAC TCTATGTTCT TCTGCCTGCG TCGTGAACAG
751 GTTTTCGCTC GTCACTTCTG GAACCGTTCT GGTACCATGG GTGACCAGCT
801 GCCGGAATCT CTGTACATCA AAGGTACCGA CATCCGTGCT AACCCGGGTT
851 CTTACCTGTA CTCTCCGTCT CCGTCTGGTT CTGTTGTTAC CTCTGACTCT
901 CAGCTGTTCA ACAAACCGTA CTGGCTGCAC AAAGCTCAGG GTCTGAACAA
951 CGGTATCTGC TGGCACAACC AGCTGTTCCT GACCGTTGTT GACACCACCC
1001 GTTCTACCAA CCTGTCTGTT TGCGCTTCTA CCACCTCTTC TATCCCGAAC
1051 GTTTACACCC CGACCTCTTT CAAAGAATAC GCTCGTCACG TTGAAGAATT
1101 CGACCTGCAG TTCATCTTCC AGCTGTGCAA AATCACCCTG ACCACCGAAG
1151 TTATGTCTTA CATCCACAAC ATGAACACCA CCATCCTGGA AGACTGGAAC
1201 TTCGGTGTTA CCCCGCCGCC GACCGCTTCT CTGGTTGACA CCTACCGTTT
1251 CGTTCAGTCT GCTGCTGTTA CCTGCCAGAA AGACACCGCT CCGCCGGTTA
1301 AACAGGACCC GTACGACAAA CTGAAATTCT GGCCGGTTGA CCTGAAAGAA
1351 CGTTTCTCTG CTGACCTGGA CCAGTTCCCG CTGGGTCGTA AATTCCTGCT
1401 GCAGCTGGGT GCTCGTCCGT AA
最后,本发明提供特定SD序列的无标签表达载体。对于表达载体而言,表达融合蛋白的载体pGEX的特点是在载体上具有一种26kDa的谷胱甘肽S-转移酶基因(GST),与其它的融合载体相比,它具有纯化条件温和、步骤简单、无变性剂加入,以及纯化后蛋白能最大限度保持其空间构象和免疫原性的特点;具有较好的应用价值,但载体pGEX编码的GST融合蛋白标签可能会增加药用蛋白产品的安全性隐患。对此,本发明将该载体的GST标签去除,并且替换能够高效表达HPV59型L1蛋白的SD序列,而形成新的适合HPV59 L1蛋白的表达载体。换后的SD序列为AGGAGGAATTA(5'to3')。
本发明还提供一种制备HPV59型L1 VLP的方法,其特征在于,包括如下步骤:根据所述的方法得到的HPV59型L1蛋白的步骤,调节其所在缓冲液的pH和盐浓度,使其自组装形成VLP。
优选地,所述缓冲液包括但不限于Tris缓冲液,磷酸盐缓冲液,醋酸缓冲液,HEPES缓冲液,MOPS缓冲液,枸橼酸缓冲液、组氨酸缓冲液,硼酸缓冲液,优选磷酸盐缓冲液;
缓冲液的pH在5-5.75,盐浓度在1.5-3.0M之间,优选PH5,PH5.25,PH5.5,PH5.75;其中的盐浓度在1.5M-3.0M之间,优选1.5M,2.0M,2.5M,3.0M。
本发明通过上述改进使得在原核例如大肠杆菌表达***中可以获得更高的蛋白表达量,且得到质量更均一的VLP。
附图说明
图1 XA90 pKL1-HPV59L1a小摇瓶表达电泳检测结果(SD未改造,即SD序列为AGGAGATATACAT)。其中,M:marker;1.XA90pKL1阴性对照;2.XA90 pKL1-HPV59L1-1全菌;3.XA90 pKL1-HPV59L1-1上清;4.XA90 pKL1-HPV59L1-1沉淀;5.HPV18L1;6.XA90 pKL1-HPV59L1-2全菌;7.XA90 pKL1-HPV59L1-2上清;8.XA90 pKL1-HPV59L1-2沉淀。XA90是宿主菌,pKL1是SD序列为AGGAGATATACAT的载体。
图2不同SD序列的蛋白表达检测结果。其中,M:marker;1.未诱导XA90 pBSDm-59L1;2.诱导全菌XA90 pBSDm-59L1;3.诱导上清XA90 pBSDm-59L1;4.诱导沉淀XA90pBSDm-59L1;5.未诱导XA90 pT1SDm-59L1;6.诱导全菌XA90 pT1SDm-59L1;7.诱导上清XA90pT1SDm-59L1;8.诱导沉淀XA90 pT2SDm-59L1;9.未诱导XA90 pT2SDm-59L1;10.诱导全菌XA90 pT2SDm-59L1;11.诱导上清XA90 pT2SDm-59L1;12.诱导沉淀XA90 pT2SDm-59L1;13.对照XA90 pKL1。
图3 HPV59L1五聚体电泳检测结果M:marker;1 HPV59L1五聚体。
具体实施方式
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚,下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
实施例一:含有特定SD序列的无标签表达载体的构建
1.通过突变PCR,在pGEX-6P-2质粒中引入NdeI酶切位点:
PCR引物名称及序列如下:
正向引物:6p1-NdeImut-F (5'to3'):
ATTTCA CACAGG AAACAG TACATA TGTCCC CTATAC TAGGTT ATTGGA AAATTA AG;
反向引物:6p1-NdeImut-R序列 (5'to3'):
ATAACC TAGTAT AGGGGA CATATG TACTGT TTCCTG TGTGAA ATTGTT ATCC。
PCR反应体系如下: 5×phusion HF 缓冲液10μL,ddH2O30.5μL,10mM dNTP 2μL,6PNE-SDm-F 1μL,6PNE-SDm-R 1μL,pGEX-6P-2(稀释20倍) 5μL,Phusion HF酶 0.5μL。
PCR反应程序设置:95℃ 3min; 95℃ 1min,55℃ 1min,72℃ 10 min;循环20次;72℃ 15 min。
PCR产物用DpnI消化后转化到大肠杆菌DH5α中,过夜培养后获得单克隆菌落。将单克隆菌落进行扩大培养,之后由专业的基因测序公司对其中的载体序列进行测序,选出测序结果正确的克隆,然后将克隆扩繁并从中提取质粒,获得成功引入NdeI酶切位点的载体。
2.设计替换SD序列的突变PCR引物,然后通过PCR方法替换原载体的SD序列
引物信息如下:
6PNE-SDm-F(5'to3'):CAATTTCACACAGGAGATATACATATGTCCCCTATACTAGG
6PNE-SDm-R(5'to3'):GTATAGGGGACATATGTATATCTCCTGTGTGAAATTGTTATCC
PCR反应体系如下: 5×phusion HF 缓冲液10μL,ddH2O30.5μL,10mM dNTP 2μL,6PNE-SDm-F 1μL,6PNE-SDm-R 1μL,1.1步骤获得的质粒 5μL,Phusion HF Enzyme 0.5μL。
PCR反应程序设置:95℃3 min;95℃1 min,55℃1 min,72℃10 min;循环20次;72℃15 min。
PCR产物用DpnI消化模板DNA后,转化到
E.coliDH5α中,过夜培养后获得单克隆菌落。将单克隆菌落进行扩大培养,之后由专业的基因测序公司对其中的载体序列进行测序,选出测序结果正确的克隆,然后将克隆扩繁并从中提取质粒,获得成功替换SD序列的载体。替换后的SD序列为AGGAGATATA(5'to3')。
3.载体进行NdeI和BamHI双酶切去除GST基因
酶切体系如下:Cutsmart 缓冲液3μl,ddH2O3μl,1.2获得的载体 20μl,NdeI 2μl,BamHI 2μl。
37℃酶切2h;0.8%琼脂糖凝胶电泳,120V,1h;切胶获得去除GST基因后的载体片段对应电泳条带,4℃保存。
用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收载体片段,所得载体片段取3μl电泳检测回收结果。然后将双酶切产物用DNA聚合酶I补齐粘性末端,反应体系如下:10×T4 DNA 连接酶 缓冲液2.5μl,ddH2O 1.8μl,胶回收的酶切载体片段20μl,10mM dNTP0.2μl,DNA聚合酶I 0.5μl,25℃反应15min,加入EDTA(EDTA终浓度为10mM)并且75℃加热20min终止反应。
将酶切后并末端补齐的载体进行重新连接环化,连接体系如下:T4 DNA 连接酶缓冲液 2μl,线性平末端载体片段 16μl,T4 DNA 连接酶2μl。16℃连接4h。
连接产物转化到
E.coliDH5α中,过夜培养后获得单克隆菌落。将单克隆菌落进行扩大培养,之后由专业的基因测序公司对其中的载体序列进行测序,选出测序结果正确的克隆,然后将克隆扩繁并从中提取质粒,获得成功替换SD序列并去除GST基因的载体。
4.PCR扩增质粒,重新引入NdeI和BamHI的酶切位点
PCR引物如下:
6PNE-SDm-noG-F (5'to3'):CAGGAGATATACATATGGGATCCCCGGAATTCCCG
6PNE-SDm-noG-R (5'to3'):GAATTCCGGGGATCCCATATGTATATCTCCTGTGTG
PCR反应体系如下: 5×phusion HF 缓冲液 10μL,ddH2O 30.5μL,10mM dNTP 2μL,6PNE-SDm-noG-F 1μL,6PNE-SDm-noG-R 1μL,模板质粒 5μL,Phusion HF酶 0.5μL。
PCR反应程序设置:95℃3 min;95℃ 1 min,55℃ 1 min,72℃10 min;循环20次;72℃ 15 min。
PCR产物用DpnI消化模板DNA后,转化到
E.coliDH5α中,过夜培养后获得单克隆菌落。将单克隆菌落进行扩大培养,之后由专业的基因测序公司对其中的载体序列进行测序,选出测序结果正确的克隆,然后将克隆扩繁并从中提取质粒,获得成功替换SD序列、去除GST基因,并重新引入NdeI和BamHI酶切位点的载体。
通过对不同SD序列的改进发现(筛选了三种SD序列:SD序列1:AGGAGGAATTA,SD序列2:AGGAATAA,SD序列3:AGAGGTATATA),本发明所用的SD序列(即AGGAGGAATTA)能够有效将HPV59L1蛋白表达出来,而用载体原有的SD序列,目的蛋白并不能表达,见图1(即载体pKL1-HPV59L1的SD序列是原始未改造的序列AGGAGATATACAT,小摇瓶表达检测结果显示其不能有效表达HPV59L1目的蛋白)。
通过SDS-PAGE的电泳结果显示,没有经过序列改进的SD序列(AGGAGATATACAT)的载体图1的目的蛋白表达明显差于经过序列改进的SD序列(AGGAGGAATTA)载体(如图2所示)。XA90是转化的宿主菌。如图2中,图中XA90 pKL1为阴性对照。与阴性对照相比,XA90pBSDm-59L1(即改造好SD序列的表达载体)试验样品泳道对应目的蛋白理论分子量大小(约52.89 KDa)的位置出现了明显的表达条带(箭头所指),目的蛋白单位菌体表达量约为0.3mg/g湿菌体。而XA90 pT1SDm-59L1(SD序列是AGGAATAA)和XA90 pT2SDm-59L1(SD序列是AGAGGTATATA)试验样品泳道对应目的蛋白理论分子量大小的位置没有出现表达条带。图中3种SD序列的具体基因序列信息如下:SD序列1:AGGAGGAATTA,SD序列2:AGGAATAA,SD序列3:AGAGGTATATA。
实施例二:含密码子优化的HPV59 L1基因的表达载体的构建
人***瘤病毒59型外壳蛋白L1(HPV59L1)的野生型全长氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。对其进行截短处理,即N端截短4个氨基酸,且其C端截短31个氨基酸,其编码的核苷酸序列经过密码子优化,由人工合成,具体见SEQ ID No.3,先PCR扩增HPV59 L1的DNA片段,将含有NdeI和Xho1酶切位点的L1基因PCR片段以及重组载体分别进行NdeI/Xho1双酶切,之后利用T4 DNA连接酶将回收的基因片段与含有对应粘性末端的pKL1(已NdeI/Xho1双酶切并胶回收)进行连接反应,16℃ 10~15 h。
连接体系如下:pKL1载体片段6μl,HPV59L1基因片段2μl,T4 DNA 连接酶 1μl,T4DNA 连接酶 缓冲液 1μl。连接反应后转化连接产物到
E. coli DH5α中进行重组子的筛选。将筛选的单克隆菌落进行扩大培养并进行质粒的提取,之后进行测序验证,得到重组表达载体pKL1-HPV59L1。
实施例三:HPV59 L1蛋白的表达
将实施例二测序结果正确的重组载体-HPV59L1转化大肠杆菌XA90宿主细胞,并作为表达重组蛋白质的工程菌进行HPV L1蛋白的表达。0.05%的接种量接种至LB培养基(Amp+)中,于37℃,220rpm培养16h进行活化。取活化后菌液按0.5%的接种量接种至2YT培养基中,于30℃,220rpm培养7h后添加终浓度为0.2mM的IPTG,于30℃,220rpm诱导培养16h后结束发酵,离心收集菌体用于表达量检测以及纯化实验。通过对SD序列的改造结合密码子优化和三种SD序列的筛选,未经改造优化的蛋白表达载体未见明显可溶表达,纯化回收目的蛋白时没有成功(即无法纯化获取),相当于表达失败;经过SD序列改造优化后蛋白表达量明显提高,并且在上清液中,利于抗原蛋白纯化回收,可以实现人***瘤病毒L1抗原蛋白的可溶表达量从无到有。
从SDS-PAGE的结果来看,未经序列和SD序列改造的载体的目的蛋白表达量极低。经过技术方案改进之后的蛋白却是可溶高效表达的(图2,泳道2及3),HPV59L1蛋白的分子量约为52.89 KDa。
实施例四:HPV59L1蛋白VLP纯化及组装
取适量菌体按质量体积比1:10的比例用破菌缓冲液(20 mM PB,20 mM DTT,pH8.0)充分重悬,然后用高压均质机对菌体进行高压破碎,破碎条件为:800 bar,3次。菌体破碎液接着进行高速离心(4℃,12000 rpm,60 min)收集上清。上清进一步通过饱和度为30%的硫酸铵沉淀,离心(4℃,12000 rpm,60 min)收集沉淀,沉淀按质量体积比1:10的比例用复溶缓冲液(20 mM PB,20 mM DTT,pH8.0)充分复溶后再次离心(4℃,12000 rpm,60min)收集上清获得粗纯液。粗纯液先上样进行Superdex200分子筛层析,分子筛缓冲液(20mM PB,20 mM DTT,pH8.0),根据L1目的蛋白的出峰位置收集其所在组分。接着将分子筛收集样品上样进行Source15Q阴离子交换层析(SQ低盐缓冲液:5 mM PB,10 mM DTT,pH8.0,SQ高盐缓冲液:5 mM PB,1 M NaCl,10 mM DTT,pH8.0),通过0-20% 高盐缓冲液,10个柱体积线性洗脱收集L1目的蛋白所在组分,该组分即为纯化后L1蛋白。通过动态光散射(DLS)法测定L1五聚体的质量。最后调节L1蛋白所在缓冲液的pH和盐浓度至其自组装形成VLP,至此VLP的制备完成。最后通过DLS测定VLP的质量。
表1 . HPV59-N9 L1蛋白组装前后DLS检测结果
从上述表1所示纯化实验结果可知,组装缓冲液的 pH在5-5.75,优选pH5,pH5.25,pH5.5,pH5.75,以及盐浓度在1.5M-3.0M之间,优选1.5M,2.0M,2.5M,3.0M时候,新的HPV59L1的五聚体状态良好(PdI≤0.1),也能有效组装形成状态良好的VLP(45 nm≤粒径大小≤75 nm,PdI≤0.1),纯化所得HPV59L1五聚体的电泳检测结果参见图3。
实施例五,蛋白长期稳定性实验
取实施例4制备的HPV59L1蛋白VLP,在-70℃条件下,进行长期稳定性数据的考察,考察结果如下。
“-”表示无此项规定或者该项未进行试验。
可以看出,经过9个月的长期考察,抗原蛋白的外观性状,pH值,VLP平均粒径及分散系数,纯度以及体外效价等,都没有明显变化,抗原蛋白相当稳定。
Claims (10)
1.一种截短的HPV59型L1蛋白,其是在野生型HPV59型L1蛋白的基础上,在其N端截短4个氨基酸,且在其C端截短31个氨基酸;优选地,截短的HPV59型L1蛋白的氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
2.编码如权利要求1所述的截短的HPV59型L1蛋白的核酸;优选地,其经过密码子优化的核酸;更优选地,其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
3.含有SD序列和编码如权利要求2所述的截短的HPV59型L1蛋白的核苷酸序列的核酸,优选地,所述SD序列的核苷酸序列为5`-AGGAGGAATTA -3`。
4.含有如权利要求2或3所述的编码核酸的表达盒或表达载体。
5.如权利要求4所述的表达盒或表达载体,其特征在于,其是原核表达载体,更优选地是在载体pGEX基础上去除了GST标签序列,并且整合所述SD序列的截短的HPV59型L1蛋白的核酸分子而得到。
6.含有如权利要求2或3所述的编码核酸的表达盒或表达载体的重组宿主细胞。
7.如权利要求6所述的重组宿主细胞,其特征在于,其是原核细胞,优选为大肠杆菌。
8.一种表达如权利要求1截短的HPV59型L1蛋白的方法,其特征在于,培养如权利要求6或7所述的重组宿主细胞以产生HPV59型L1蛋白,任选地,包括纯化步骤,优选地所述纯化步骤为:取所述的重组宿主细胞的菌体用破菌缓冲液充分重悬,然后用高压均质机对菌体进行高压破碎,离心收集上清;上清进一步通过硫酸铵沉淀,硫酸铵的最终饱和度为30%,沉淀复溶后再次离心收集上清获得粗纯液;
粗纯液先上样进行Superdex200分子筛层析,根据L1目的蛋白的出峰位置收集其所在组分;
接着将分子筛收集样品上样进行Source15Q阴离子交换层析,通过NaCl线性洗脱收集L1目的蛋白所在组分,得到HPV59型L1蛋白。
9.一种表达如权利要求1截短的HPV59型L1蛋白的方法,其特征在于,包括如下步骤:根据如权利要求8所述的方法得到的HPV59型L1蛋白的步骤,调节其所在缓冲液的pH和盐浓度,使其自组装形成VLP。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述缓冲液包括但不限于Tris缓冲液,磷酸盐缓冲液,醋酸缓冲液,HEPES缓冲液,MOPS缓冲液,枸橼酸缓冲液、组氨酸缓冲液,硼酸缓冲液,优选磷酸盐缓冲液;
缓冲液的pH在5-5.75,盐浓度在1.5-3.0M之间,优选pH5,pH5.25,pH5.5,pH5.75;其中的盐浓度在1.5M-3.0M之间,优选1.5M,2.0M,2.5M,3.0M;
任选地,还包括纯化所得HPV59L1五聚体的步骤。
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