CN115948574B

CN115948574B - 一种基于三代测序的个体识别体系、试剂盒及其应用

Info

Publication number: CN115948574B
Application number: CN202211700477.1A
Authority: CN
Inventors: 王广云; 罗渊; 梅竹松; 严江伟; 刘晋玎; 张家榕; 杨婷婷; 叶巧; 房龙梅
Original assignee: Air Force Specialty Medical Center of PLA
Current assignee: Air Force Specialty Medical Center of PLA
Priority date: 2022-12-28
Filing date: 2022-12-28
Publication date: 2023-11-10
Anticipated expiration: 2042-12-28
Also published as: CN115948574A

Abstract

本发明提供了一种基于三代测序的个体识别体系、试剂盒及其应用，涉及生物技术领域，该个体识别体系包括扩增6个STR位点的引物序列，对应的引物序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.12所示；所述的6个STR位点包括D3S1358、CSF1PO、D6S1043、D7S820、D12S391、D13S317位点；本发明还提供了一种用于个体识别的试剂盒，该试剂盒包括上述引物序列和DNA模板、长片段扩增缓冲液、长片段扩增聚合酶、去离子水，能够进行混合复杂样本分型、个体身份识别以及亲缘关系的鉴定，且该方法适用于纳米测序仪，极具便携性，对测序环境需求低，测序结果准确。

Description

一种基于三代测序的个体识别体系、试剂盒及其应用

技术领域

本发明属于生物技术领域,具体涉及一种基于三代测序的个体识别体系、试剂盒及其应用。

背景技术

短串联重复序列(short tandem repeat,STR)，又叫微卫星DNA，是指基因组DNA中存在一类重复单位长度为2bp-6bp的重复序列，是人类的DNA指纹，广泛分布于基因组中，其中富含A-T碱基对。STR广泛存在于人类及哺乳动物的基因组中，具有高度多态性，它们一般由2-6个碱基构成一个核心序列，核心序列串联重复排列，由核心序列重复数目的变化产生长度多态性。对于一个特定的个体，染色体上某个特定位置的重复序列的重复次数是固定的，而对于不同的个体在同一位置处的重复次数可能不同，这就构成了群体中这些重复序列的多态性。由于人类及哺乳动物基因组中这种重复序列非常多，通过对这种多态性的检测，就可以明确区分个体与个体的不同，确定父母子的亲缘关系，区分不同个体的方法叫做“个体识别”，也被称为“同一认定”。

人类遗传学是法医物证学的重要的基础。人类的遗传和变异使每一个体的遗传信息与他的亲代和子代具有相似性，但每一个体又具备自身的遗传特征。法医物证学就是研究将这些遗传规律应用于个体识别和亲权鉴定实践，为案件的侦破与审判提供准确、有效的科学证据。目前的个体识别技术主要包括：一代STR检测技术和基于下一代测序(Next-generation sequencing technology,NGS)的检测技术。其中，一代STR检测技术中，STR是人类基因组中多态性基因座，它由2-6碱基对构成核心序列，呈串联重复排列，STR位点长度一般在100-300bp之间，个体之间STR长度差异构成多态性，在基因传递中遵循孟德尔遗传定律，已广泛应用于法医学个体识别和亲子鉴定，目前市面一般为18个STR位点左右的检测试剂盒；而下一代测序技术又称高通量测序技术(High throughput sequencing)，该技术可以对数百万个DNA分子进行同时测序，这使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，堪称测序技术发展历程的一个里程碑。但是，一代STR检测技术和基于下一代测序所依赖的基础仪器设施，光学元器件敏感，存放及使用环境条件严格，极难实现随意搬运使用。中国专利CN108517363B公开了一种基于二代测序的个体识别体系、试剂盒及其用途，该体系只需要一次扩增就能同时获得常染色体、X染色体、Y染色体上的二代或三代遗传标记信息，减少操作步骤，缩短实验时间，适用于全球不同国家不同地区人群的DNA分型检测，但是该测序需要使用高通量测序仪，不具有便携性，不能解决对现场采集样本立即进行个体识别的问题。当前在法医物证学领域尚未实现现场化个体识别的应用，还没有适用于纳米孔现场测序的STR复合扩增体系。

所以当前亟需一种适用于现场测序，能够适用于纳米孔现场测序且结果准确、操作便捷的方法和体系。

发明内容

本发明针对现有技术存在的问题，提供了一种基于三代测序的个体识别体系、试剂盒及其应用，该个体识别体系包括扩增6个STR位点D3S1358、CSF1PO、D6S1043、D7S820、D12S391、D13S317的引物序列，能够适用于纳米孔现场测序，进行混合复杂样本分型、个体身份识别、亲缘关系鉴定。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

本发明提供了一种基于三代测序的个体识别体系，包括扩增6个STR位点的引物序列，对应的引物序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.12所示；所述的6个STR位点包括D3S1358、CSF1PO、D6S1043、D7S820、D12S391、D13S317位点。

6个STR位点的大小在1.5-2kb之间，具体信息如表1所示：

表1STR信息汇总表

位点	染色体	基序重复范围	基序结构
				D3S1358	3	8–22	TCTA[TCTG]_n[TCTA]_n
CSF1PO	5	5–17	[AGAT]_n
				D6S1043	6	8–26	[AGAT]_n
D7S820	7	5–21.1	[GATA]_n
				D12S391	12	13–28	[AGAT]_n[GAT]_n[AGAT]_n[AGAC]_n[AGAT]_n
D13S317	13	5–17	[TATC]_n[AATC]_n

本发明还提供了一种个体识别的方法，采用上述的个体识别体系进行个体识别。

优选地，个体识别的方法包括以下步骤：

S1、样本核酸提取与扩增6个STR位点；

S2、三代文库构建；

S3、纳米测序上机；

S4、测序数据分析，进行个体识别。

优选地，步骤S1所述提取的方法包括Chelex100法、磁珠提取法或有机抽提法。

优选地，步骤S1所述扩增的体系包括：长片段扩增缓冲液11μL、长片段扩增聚合酶0.5μL、引物混合物5μL、DNA模板13.5μL；所述扩增的程序包括：①95℃，3min；②28-30个循环，每个循环98℃10s，60℃8min；③72℃，10min；④4℃，保存。

具体的扩增程序如表4所示，具体的扩增试剂如表5所示。

优选地，步骤S2所述三代文库构建的步骤包括：DNA靶向扩增目的片段末端修复：连接barcode；混合样本；连接adaptor。

其中，所述的混合样本得到混合文库后，若体积若超过65μL，用2.5倍混合文库体积的AMPure XP磁珠对混合文库进行纯化浓缩，最终使用67μL无核酸酶水洗脱混合文库，吸出65μL用于下一步adaptor连接。

优选地，所述DNA靶向扩增目的片段末端修复的投入量的计算方式为：根据Qubit定量仪测得的待检样本浓度(ng/μL)，需用于末端修复的样本体积(μL)＝200fmol×660×靶向复合扩增目的片段平均长度(bp)÷待检样本浓度(ng/μL)÷10⁶。

其中，浓度换算公式：fmol/μL＝待检样本浓度(ng/μL)÷660÷靶向复合扩增目的片段平均长度×10⁶。

优选地，所述混合样本的步骤包括每个连接barcode的样本混合在一起；所述每个连接barcode的样本混合的体积计算公式为：混合的体积(μL)＝200×660×靶向复合扩增目的片段平均长度(bp)÷待检样本Qubit定量仪定量浓度(ng/μL)÷10⁶÷待检样本个数。

优选地，步骤S4所述个体识别的认定标准为：群体中随机两个基因型一致的鉴定效率不低于1：10000；具体地，要求所有6个STR位点，如果第i个位点的任意两个基因型一致的概率为P_i，则乘积∏P_i<0.0001。

具体地，个体识别的认定标准使用法医学参数：个人识别率；个人识别率为在多大的群体中随机可能发现两个基因型一致个体的组合概率。

本发明还提供了一种个体识别试剂盒，包括上述的引物序列；所述的个体识别试剂盒还包括DNA模板、Long PCR buffer、Long PCR polymerase和去离子水。

本发明还提供了一种上述的个体识别试剂盒在混合复杂样本分型、个体身份识别、亲缘关系鉴定中的应用。

相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明为STR长扩增片段复合体系，该长片段扩增子适用于纳米孔连接建库试剂盒，可实现高效特异性扩增；

(2)该扩增体系可以用于现场个体识别，具有极高的便携性，对测序环境需求低，适用于现场测序；

(3)可以得到至少6个1.5-2kb的靶向扩增STR目的片段，测序结果准确。

附图说明

图1为6个STR位点均一性效果图。

具体实施方式

下面通过具体实施例对本发明进行说明，以使本发明技术方案更易于理解、掌握，但本发明并不局限于此，描述的实施例仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。

在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其它实施例，都应当属于本申请保护的范围。下述实施例中所述实验方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述试剂和材料，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

试剂耗材：1.DNA样本(每个样本需要50ng模板DNA)；2.PCR(酶、引物、缓冲液)；3.NEBNext Ultra II End repair/dA-tailing Module；4.Ligation Sequencing Kit(SQK-LSK109)；5.Flow Cell Priming Kit(EXP-FLP002)；6.MinION Flow Cell(R9.4.1)；7.Agencourt AMPure XP beads(AMPure XP磁珠提前拿出冰箱恢复至室温后使用)；8.Qubit^TM1X dsDNA HS Assay Kit；9.Qubit定量管、无水乙醇、1.5mL离心管、0.2mL PCR离心管；10.NEB Blunt/TA Ligase Master Mix；11.NEBNext Quick Ligation Module；12.Native Barcoding Expansion 1-12(EXP-NBD104)，Native Barcoding Expansion 13-24(EXP-NBD114)，Native Barcoding Expansion 96(EXP-NBD196)，注意：当检测样本数量≤12，单独使用EXP-NBD104或者EXP-NBD114或者EXP-NBD196；当13≤样本个数≤24，联合使用EXP-NBD104和EXP-NBD114或者单独使用EXP-NBD196；当25≤样本个数≤96，单独使用EXP-NBD196

仪器：Qubit定量仪、MinION MK1B测序仪

实施例1筛选可被纳米孔测序置信鉴定的有效位点

筛选条件：常见于个体识别的STR位点；可以设计1.5-2kb特异性扩增产物的引物；核心重复基序为不包含单一碱基串联重复；位点累积个体识别力能够满足司法鉴定技术规范。筛选到表1所示的STR位点，分别为D3S1358、CSF1PO、D6S1043、D7S820、D12S391、D13S317。

最终所构建的STR检测体系共包含6个STR基因座，每个基因座的个人识别力(DP)见下表，体系的累计个人识别力(CDP)为1-1.328×10^-7。

表2STR基因座个人识别力(CDP)统计表

扩增6个STR位点的正反引物序列信息如表3所示

表3引物信息

实施例2基于三代测序的多重PCR扩增技术

按照表4的扩增程序和表5的扩增试剂进行扩增。

表4多重PCR扩增程序

表5多重PCR扩增试剂

试剂名称	体积(μL)	终浓度
			Long PCR buffer	11	1X
Long PCR polymerase	0.5
			Primer mixture(μM)	5	16μM/μL
DNA template	13.5	50ng
			Total	30	-

测试例识别无关个体

一、DNA靶向扩增捕获目的片段

A.试剂准备：

a)室温下解冻表5试剂，保证试剂充分溶解，试剂溶解后将所有试剂放在冰盒上：

b)震荡混匀试剂并离心，确保试剂充分混匀。

c)第一次打开管前一定要离心，将管盖及管壁上的试剂离心到试管底部。计算待检样本投入量：

B.计算待检样本投入量：

每个样本需要50ng模板DNA，根据Qubit 4定量仪测得的待检样本浓度C1(ng/μL),取足量(XμL)原始DNA样本稀释至3.8ng/μL。(X(μL)＝50/C1+2)

定量体系如下：

表6标准品体系

表7样本体系

试剂	体积(μL)
		Qubit^TM1X dsDNA HS Working Solution	199
DNA	1

C.PCR反应预混液配制：

表8PCR反应预混液体系

备注：同时处理多个样本时，需多配2个反应混合液体系，确保补足加样操作对反应混合液的损耗。使用移液枪吹吸混匀并离心。

D.PCR反应体系

表9PCR反应体系

试剂	体积(μL)
		50ng DNA(3.8ng/μL)	13.5
PCR反应预混液	16.5
		反应体系总量	30

使用移液枪吹吸混匀，确保充分混匀反应体系后轻微离心，使管壁和管盖上的液体混入管内。

E.使用PCR仪，按照以下程序设置，对反应体系进行扩增：

表10PCR扩增程序

F.PCR产物纯化(30μL样本+30μL AMPure XP磁珠，磁珠用量：30μL*样本个数+5μL)

1)充分震荡混匀AMPure XP磁珠后，取新的1.5mL离心管并标记样本名称，每个离心管中加入30μL AMPure XP磁珠。

2)将完成反应后的每个样本的所有产物分别转移至对应编号的1.5mL离心管中，轻弹管以混合均匀。

3)室温孵育5分钟。期间多次轻弹管，确保DNA扩增产物充分结合磁珠。期间配置70％新鲜乙醇溶液。70％新配置乙醇溶液所需体积＝400μL*样本个数+500μL。

4)将样本静置于磁力架上，当磁珠被吸附于一侧，液体澄清后，保持试管在磁力架上，利用移液枪吸出澄清液体并丢弃。

5)保持试管在磁力架上，用200μL新鲜制备的70％乙醇清洗磁珠，不要将磁珠吹散。每隔30秒顺时针旋转离心管180度，旋转4次后静置离心管，当磁珠被吸附于一侧，液体澄清后，用移液枪吸出乙醇并丢弃。

6)重复一次5)步骤。

7)离心试管，将离心管放回磁力架上，选择10μL移液枪吸出剩余酒精。打开离心管盖晾干酒精，约1分钟，切忌磁珠干裂。注：具体酒精晾干时间根据操作环境的温度及湿度确定。8)将离心管拿下磁力架，加入30μL无核酸酶水充分混匀，室温下孵育2分钟，洗脱末端修复产物。

9)将离心管放回磁力架上等待磁珠被吸附至一侧，直到洗脱液清澈无色，此过程至少等待1分钟。吸出并保留28μl洗脱液到干净的1.5mL离心管中用于三代文库构建，取1μl进行Qubit定量，丢弃含有磁珠的离心管。

二、三代文库构建

1.DNA靶向扩增目的片段末端修复

A.准备试剂

a)室温下解冻试剂，试剂溶解后将所有试剂放在冰上：

b)轻弹或者上下颠倒试剂管，确保试剂充分混匀。

c)第一次打开管前一定要离心，将管盖及管壁上的试剂离心到试管底部。

d)Ultra II End-prep buffer可能会有一些白色沉淀。当试剂恢复至室温时，使用移液枪吹吸几次，沉淀会自然溶解。震荡Ultra II End-prep buffer试剂管，确保试剂充分混匀。

e)Ultra II End-Prep Enzyme Mix禁止用力震荡。

B.计算待检样本用于DNA末端修复的投入量。

根据Qubit定量仪测得的待检样本浓度(ng/μL)，计算需用于末端修复的样本体积，每个样本需要200fmol DNA：需用于末端修复的样本体积(μL)＝200fmol×660×靶向复合扩增目的片段平均长度(bp)÷待检样本浓度(ng/μL)÷10⁶。

(浓度换算公式：fmol/μL＝待检样本浓度(ng/μL)÷660÷靶向复合扩增目的片段平均长度×10⁶)

C.样本准备

将200fmol扩增产物转移到0.2mL的PCR离心管中，用无核酸酶水将体积调至48μL，通过轻弹管彻底混匀，在微型离心机中短暂离心。

D.末端修复反应预混液配制：

表11末端修复反应预混液体系

试剂	体积(μL)	多个样本时(μL)
			Ultra II End-prep reaction buffer	3.5μL	3.5*(样本个数+2)μL
Ultra II End-prep enzyme mix	3μL	3*(样本个数+2)μL

备注：同时处理多个样本时，需多配2个反应混合液体系，确保补足加样操作对反应混合液的损耗。使用移液枪吹吸充分混匀每个反应体系。

E.末端修复体系配制

表12末端修复体系

试剂	添加体积(μL)
		200fmol待检样本扩增产物	48μL
末端修复反应预混液	6.5μL
		反应体系总量	54.5μL

使用移液枪吹吸充分混匀，确保充分混匀反应体系后轻微离心，使管壁和管盖上的液体混入管内。

F.使用PCR仪，按照以下程序设置，对反应体系进行孵育，热盖温度设置：80℃，反应体系设置：55μL。

表13PCR程序

温度(℃)	时间(min)
		20℃	5min
65℃	5min
		4℃	∞

G.纯化末端修复后样本(磁珠用量：60μL*样本个数+5μL)

a)充分震荡混匀AMPure XP磁珠后，取新的1.5mL离心管并标记样本名称，每个离心管中加入60μL AMPure XP磁珠。

b)将完成反应后的每个样本的所有产物分别转移至对应编号的1.5mL离心管中，轻弹管以混合均匀。

c)室温孵育5分钟。期间多次轻弹管，确保DNA扩增产物充分结合磁珠。期间配置70％新鲜乙醇溶液。70％新配置乙醇溶液所需体积＝400μL*样本个数+500μL。

d)将样本静置于磁力架上，当磁珠被吸附于一侧，液体澄清后，保持试管在磁力架上，利用移液枪吸出澄清液体并丢弃。

e)保持试管在磁力架上，用200μL新鲜制备的70％乙醇清洗磁珠，不要将磁珠吹散。每隔30秒顺时针旋转离心管180度，旋转4次后静置离心管，当磁珠被吸附于一侧，液体澄清后，用移液枪吸出乙醇并丢弃。

f)重复一次e)步骤。

g)离心试管，将离心管放回磁力架上，选择10μL移液枪吸出剩余酒精。打开离心管盖晾干酒精，约1分钟，切忌磁珠干裂。注意具体酒精晾干时间根据操作环境的温度及湿度确定。

h)将离心管拿下磁力架，加入25μL无核酸酶水充分混匀，室温下孵育2分钟，洗脱末端修复产物。

i)将离心管放回磁力架上等待磁珠被吸附至一侧，直到洗脱液清澈无色，此过程至少等待1分钟。吸出并保留22.5μl洗脱液到干净的1.5mL离心管中用于下一步barcode连接。丢弃含有磁珠的离心管。

2.连接barcode

A.准备试剂

a)每个样本单独一一对应一个barcode，从24个barcode中为每个样本选择一个唯一编号的条形码，用于本次芯片测序。

b)室温下解冻试剂，试剂溶解后将所有试剂放在冰上。

c)第一次打开试剂管盖前一定要离心，将管盖及管壁上的试剂离心到试管底部。

d)通过移液枪吹吸方式，将所有试剂一一单独充分混匀。

B.样本及barcode对应编表：

样本Sample01-24对应Barcode编号Barcode01-24。

C.Barcode连接体系

按以下顺序将试剂加入第1步中得到的22.5μL纯化洗脱产物的1.5mL离心管中:

表14Barcode连接体系

试剂	添加体积(μL)
		已完成末端修复样本	22.5μL
Barcode	2.5μL
		Blunt/TA Ligase Master Mix	25μL
反应体系总量	50μL

使用移液枪吹吸充分混匀Barcode连接体系，轻微离心，将管盖及管壁上的溶液离心到试管底部。

D.孵育Barcode连接体系：在室温下，将离心管静置10分钟。

E.纯化已连接barcode样本(磁珠用量：50μL*样本个数+5μL)

a)充分震荡吹吸混匀AMPure XP磁珠后，向每个含有完成连接barcode反应体系的1.5mL离心管中加入50μL AMPure XP磁珠，轻弹离心管以混合均匀。

b)室温孵育5分钟。期间多次轻弹管，确保DNA扩增产物充分结合磁珠。期间配置70％新鲜乙醇溶液。70％新配置乙醇溶液所需体积＝400μL*样本个数+500μL。

c)将样本静置于磁力架上，当磁珠被吸附于一侧，液体澄清后，保持试管在磁力架上，利用移液枪吸出澄清液体并丢弃。

d)保持试管在磁力架上，用200μL新鲜制备的70％乙醇清洗磁珠，不要将磁珠吹散。每隔30秒顺时针旋转离心管180度，旋转4次后静置离心管，当磁珠被吸附于一侧，液体澄清后，用移液枪吸出乙醇并丢弃。

e)重复一次d)步骤。

f)离心试管，将离心管放回磁力架上，选择10μL移液枪吸出剩余酒精。打开离心管盖晾干酒精，约1分钟，切忌磁珠干裂。注意具体酒精晾干时间根据操作环境的温度及湿度确定。

g)将离心管拿下磁力架，加入26μL无核酸酶水充分混匀，室温下孵育2分钟，洗脱末端修复产物。

h)将离心管放回磁力架上等待磁珠被吸附至一侧，直到洗脱液清澈无色，此过程至少等待1分钟。吸出并保留24μl洗脱液到干净的1.5mL离心管中用于下一步样本混合。丢弃含有磁珠的离心管。

3.混合样本

A.已连接barcode样本定量。取第2步中已连接barcode并纯化洗脱后的每个样本1μL，使用Qubit定量仪，进行定量。

B.计算混合样本时每个已连接barcode样本需混入体积。根据Qubit定量仪定量结果，混合样本时每个样本需要混入体积(μL)＝200×660×靶向复合扩增目的片段平均长度(bp)÷待检样本Qubit定量仪定量浓度(ng/μL)÷10⁶÷待检样本个数。

C.取一个干净的1.5mL离心管，根据B.中的计算结果，将所有第(2)步中已连接barcode并纯化洗脱后的每个样本按照计算所得体积，依次混入离心管中，最终得到一个终浓度为200fmol的混合文库；同时记录样本混合后的总体积(μL)。

D.若C中得到的混合文库体积若不足65μL，用无核酸酶水补足至65μL。

4.连接adaptor

A.准备试剂

a)室温下解冻试剂，试剂溶解后将所有试剂放在冰上。

b)第一次打开试剂管盖前一定要离心，将管盖及管壁上的试剂离心到试管底部。

c)通过移液枪吹吸方式，将所有试剂一一单独充分混匀。

d)NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer可能有少量沉淀，待恢复至室温后，利用移液枪吹吸混匀多次，沉淀将溶解，一定确保试剂完全混匀。

e)避免剧烈震荡Quick T4 DNA Ligase。

B.Adaptor连接体系

按以下顺序将试剂加入第3.步中含有最终纯化洗脱后体积为65μL混合文库的1.5mL离心管中：

表15Adaptor连接体系

试剂	添加体积(μL)
		200fmol混合文库	65μL
Adapter Mix II(AMII)	5μL
		NEBNext Quick Ligation Reaction Buffer	20μL
Quick T4 DNA Ligase	10μL
		反应体系总量	100μL

使用移液枪吹吸充分混匀Adaptor连接体系，轻微离心，将管盖及管壁上的溶液离心到试管底部。

C.孵育Adaptor连接体系：在室温下，将离心管静置10分钟。

D.纯化已连接Adaptor混合文库(磁珠用量：50μL)

a)充分震荡吹吸混匀AMPure XP磁珠后，向连接adaptor反应体系的1.5mL离心管中加入50μL AMPure XP磁珠，轻弹离心管以混合均匀。

b)室温孵育5分钟。期间多次轻弹管，确保DNA扩增产物充分结合磁珠。

d)保持试管在磁力架上，用200μL Short Fragment Buffer(SFB)清洗磁珠，不要将磁珠吹散。每隔30秒顺时针旋转离心管180度，旋转4次后静置离心管，当磁珠被吸附于一侧，液体澄清后，用移液枪吸出澄清液体并丢弃。

e)重复一次d)步骤。

f)离心试管，将离心管放回磁力架上，选择10μL移液枪吸出剩余澄清液体。打开离心管盖晾干磁珠，约1分钟，切忌磁珠干裂。注意具体磁珠晾干时间根据操作环境的温度及湿度确定。

g)将离心管拿下磁力架，加入17μL Elution Buffer(EB)充分混匀，室温下孵育10分钟，洗脱末端修复产物。

h)将离心管放回磁力架上等待磁珠被吸附至一侧，直到洗脱液清澈无色，此过程至少等待1分钟。吸出并保留15μL洗脱混合文库到干净的1.5mL离心管中。丢弃含有磁珠的离心管。E.已连接adaptor混合文库定量及稀释。取第(4)步中已连接adaptor并纯化洗脱后的最终混合文库1μL，使用Qubit定量仪定量。

F.根据定量结果计算出100fmol混合文库的体积。100fmol混合文库的体积(μL)＝100fmol×660×靶向复合扩增目的片段平均长度(bp)÷待检样本浓度(ng/μL)÷10⁶。

G.根据B.中计算结果，吸取100fmol混合文库至干净的1.5mL离心管中，用ElutionBuffer(EB)补足至12μL，用于上机测序终文库的准备。

三、纳米测序上机

芯片上机前准备、终文库制备及上机测序

A.准备试剂

a)室温下解冻Sequencing Buffer(SQB)，Loading Beads(LB)，Flush Tether(FLT)以及一管Flush Buffer(FB)，溶解后将所有试剂放在冰上。

c)通过移液枪吹吸方式，将所有试剂一一单独充分混匀。

B.芯片启动预混液制备：吸取30μL Flush Tether(FLT)，直接加入Flush Buffer(FB)的管中，室温下吹吸充分混匀。

C.打开MinION设备的盖子，将芯片***仪器右侧的卡槽后，用力向下压芯片，以确保温度和电流接触处连接稳定。

a)将芯片***仪器右侧的卡槽；b)用力向下压芯片

D.顺时针滑动priming port盖子，打开priming port。

E.检查priming port盖子下面是否有小气泡。使用移液枪倒吸少量体积，以去除所有气泡(20～30μL):

a)将1000μL量程移液枪调至200μl。

b)将枪头完全***priming port中，使枪头与priming port紧密嵌合。

c)逆时针转动移液枪量程调节旋钮，直到刻度盘显示220～230uL，或直至看到少量液体进入移液管尖端。

F.通过priming port将800μL的启动预混液加入芯片中，避免气泡的引入。等待5分钟。在此期间，按照以下步骤准备装测序文库。

G.通过移液枪将Loading Beads(LB)充分混匀。Loading Beads(LB)管内包含悬浮的珠子。这些珠子沉降很快，一定要即用即混。

H.文库准备

表16文库体系

试剂	加入体积(μL)
		混合文库	12μL
Sequencing Buffer(SQB)	37.5μL
		Loading Beads(LB)	25.5μL
反应体系总量	75μL

注:在添加Sequencing Buffer(SQB)和Loading Beads(LB)后立即将文库加入芯片中，因为缓冲液中的燃料将开始被adaptor消耗。

I.完成芯片启动

a)轻轻地提起SpotON样本加样孔盖子，使SpotON样本加样孔打开。

b)将200μL的启动预混液通过priming port(不是SpotON样本加样孔)加入芯片中，避免气泡的引入。注意在此步骤之后尽快往芯片中加入文库。

J.在文库加样前，通过移液枪轻轻吹吸混匀制备好的文库。

K.通过SpotON样本加样孔，将75μL文库以滴加方式加入到芯片中，确保每一滴文库都进入孔内后，再添加下一滴文库。

L.轻轻地盖上SpotON样本加样孔盖，确保盖塞***SpotON孔内，关闭primingport盖子，以及MinION设备盖子。开始测序。

测序结果如表17所示：以MiSeq FGx二代测序结果为标准结果，用以评价三代测序结果。

基于二代测序结果，通过对三代测序结果比较，结果证明6个位点的分型结果在两个测序平台上均表现一致，能够在三代测序中能够得到正确的分型结果。说明这6个位点，适用于基于三代测序平台的个体识别，能够准确的实现无关个体的分辨。

表17二代测序与三代测序结果

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种个体识别的方法，其特征在于：采用基于三代测序的个体识别体系进行个体识别；包括扩增6个STR位点的引物，对应的引物序列如SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.12所示；所述的6个STR位点包括D3S1358、CSF1PO、D6S1043、D7S820、D12S391、D13S317位点；

包括以下步骤：

S1、样本核酸提取与扩增6个STR位点；

S2、三代文库构建；

S3、纳米测序上机；

S4、测序数据分析，进行个体识别；

步骤S1所述提取的方法包括Chelex100法、磁珠提取法或有机抽提法；

步骤S1所述扩增的体系包括：长片段扩增缓冲液 11µL、长片段扩增聚合酶 0.5µL、引物混合物 5µL、DNA 模板 13.5µL；所述扩增的程序包括：①95℃，3min；②28-30个循环，每个循环98℃ 10s，60℃ 8min；③72℃，10min；④4℃，保存；

步骤S2所述三代文库构建的步骤包括：DNA靶向扩增目的片段末端修复：连接barcode；混合样本；连接adaptor；

所述混合样本的步骤包括每个连接barcode的样本混合在一起；所述每个连接barcode的样本混合的体积计算公式为：混合的体积=200× 660 × 靶向复合扩增目的片段平均长度÷待检样本Qubit定量仪定量浓度÷ 10⁶÷ 待检样本个数；所述混合的体积的单位为µL；所述片段平均长度的单位为bp；所述定量浓度的单位为ng/µL；

步骤S4所述个体识别的认定标准为：群体中随机两个基因型一致的鉴定效率不低于1：10000；要求所有6个STR位点，如果第i个位点的任意两个基因型一致的概率为Pi，则乘积∏Pi<0.0001。

2.一种个体识别试剂盒，其特征在于：包括权利要求1中所述的引物；所述的个体识别试剂盒还包括DNA模板、长片段扩增缓冲液、长片段扩增聚合酶和去离子水。

3.权利要求2所述的个体识别试剂盒在混合复杂样本分型、个体身份识别、亲缘关系鉴定中的应用。