CN115948537B - 一种基因chst3复合杂合突变的应用及检测试剂和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基因CHST3复合杂合突变的应用及检测试剂和应用，属于医学诊断技术领域。本发明首次发现了CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R和CHST3:NM_004273.5:exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup位点复合杂合突变可以导致先天性脊柱骨骺发育不全(MIM 143095)。本发明检测所述基因突变位点的试剂用于先天性脊柱骨骺发育不全的遗传学诊断和优生优育指导，为先天性脊柱骨骺发育不全的发病机制研究提供了新的基础和途径，可以为治疗先天性脊柱骨骺发育不全提供可能的药物靶点。
Description
技术领域
本发明属于医学诊断技术领域，具体涉及一种基因CHST3复合杂合突变的应用及检测试剂和应用。
背景技术
脊柱骨骺发育不全(spondyloepiphyseal dysplasia SED)是一种累及脊柱骨骺和干骺端软骨的遗传性骨疾病。其遗传方式包括常染色体显性遗传、常染色体隐性遗传以及X染色体连锁隐性遗传。该病的共同特征是累及椎体和骨骺，患者主要表现为出生后生长发育迟缓，短躯干性身材矮小，走路跛行。X线显示胸腰椎侧弯、椎体骨不规则、骨质疏松、股骨头碎裂变扁和髋臼密度高等。依照《国际遗传性骨病分类标准(2010年版)》，可根据SED的临床特征、影像特点以及分子遗传学的不同表现分为九种临床类型：1)先天性脊柱骨骷发育不良(spondyloepiphyseal dysplasia congenita，SEDC)；2)迟发性脊柱骨16发育不良(spondyloepiphyseal dysplasia tarda，SEDT)；3)迟发性脊柱骨添发育不良伴进行性骨关节病(spondyloepiphyseal dysplasia tarda with progressivearthropathy，SEDT-PA)；4)Omani型SED(spondyloepiphyseal dysplasia Omani type，SED-OT)；5)Kimberley型SED(spondyloepiphyseal dysplasia Kimberley type，SEDK)；6)Wolcott-Rallison型SED(spondyloepiphyseal dysplasia Wolcott-Rallison type，SED-WR)；7)轻度SED伴早发性关节炎(Mild SED with premature onset arthrosis)；8)SED伴妬骨短缩畸形(SEDwith metatarsal shortening)；(9)常染色体隐性晚发型SED(Late onset SED，autosomalrecessive type)。迄今，人类基因组突变数据库(HGMD Professional 2012.3)收录的SED相关致病基因共8个，分别为COL2A1，TRAPPC2(SEDL)，WISP3，CHST3，ACAN(AGCl)，EIF2AK3，MATN3和PAPSS2。其中，先天性脊柱骨骺发育不全(MIM 143095)是CHST3基因突变所致，该病是一种常染色体隐性遗传病。
CHST3基因(MIM 603799)定位于染色体10q22.1，包括3个外显子和2个内含子，基因长48.2kb，开放读码框1440bp，编码479个氨基酸序列的蛋白碳水化合物磺基转移酶3(CHST3)，CHST3是催化硫酸软骨素硫酸化的关键酶，催化GalNAc残基第6位碳原子的硫酸化，通过硫酸化反应后引入负电荷，硫酸软骨素依赖负电荷的吸水性能赋予蛋白聚糖以保水能力，而椎间盘充足的含水量是维持正常渗透压和组织弹性的必备条件，因此CHST3是椎间盘中重要的保护性基因，CHST3的活性对于椎间盘结构和功能的维持具有重要作用。人体内CHST3基因突变导致酶活性异常可引起骨骼异常隐性遗传病，如脊柱骨骺发育不良等。
基因突变是导致先天性脊柱骨骺发育不全发生发展的重要遗传基础，基因诊断是确诊先天性脊柱骨骺发育不全的金标准。临床上需要针对不同突变建立相应的检测技术并用于明确病因和疾病诊断，现有技术中对基因突变位点基因型的检测，可以采用其他方法限制性酶切片段长度多态性、单链构象多态性、等位基因特异的寡聚核苷酸杂交等等，但这些检测方法均不能同时满足定性、定量及明确突变基因的序列的目的。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一种导致先天性脊柱骨骺发育不全的致病基因CHST3复合杂合突变的应用，开发一种新型的致病基因复合杂合突变可以作为诊断先天性脊柱骨骺发育不全的生物标志物，区分先天性脊柱骨骺发育不全患者、携带者和正常人群。
本发明的目的还在于提供一种检测导致先天性脊柱骨骺发育不全的致病基因CHST3复合杂合突变的试剂和应用，助力先天性脊柱骨骺发育不全基因突变的筛查和诊断。
本发明提供了一种用于检测先天性脊柱骨骺发育不全的致病基因CHST3复合杂合突变位点的试剂，包括检测致病基因CHST3突变位点c.675C>A:p.S225R的引物和检测致病基因CHST3突变位点c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup的引物；
所述检测致病基因CHST3突变位点c.675C>A:p.S225R的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的CHST3-1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的CHST3-1R；
所述检测致病基因CHST3突变位点c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的CHST3-2F和核苷酸序列如SEQ IDNO:4所示的CHST3-2R。
优选的，还包括测序引物；
所述测序引物包括致病基因CHST3突变位点c.675C>A:p.S225R的测序引物和/或致病基因CHST3突变位点c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup的测序引物；
所述致病基因CHST3突变位点c.675C>A:p.S225R的测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5所示的CHST3-Seq1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的CHST3-Seq1R；
所述致病基因CHST3突变位点c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup的测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的CHST3-Seq2F和核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的CHST3-Seq2R。
本发明提供了一种先天性脊柱骨骺发育不全诊断试剂盒，包括所述试剂和PCR扩增试剂。
优选的，所述PCR扩增试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶；
所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液：500mmol/L KCl、pH 8.3的100mmol/LTris-Cl和15mmol/L MgCl2。
本发明还提供了一种用于检测先天性脊柱骨骺发育不全的致病基因CHST3突变位点的试剂盒，包括所述试剂和PCR扩增试剂。通过优化检测致病基因CHST3突变位点的引物和反应体系，大大提高检测结果的准确性和可靠性，极大助力先天性脊柱骨骺发育不全基因突变的筛查和诊断，并为其药物筛选、药效评价及靶向治疗提供新的技术支持。
附图说明
图1显示先天性脊柱骨骺发育不全1号家系遗传图谱；其中，表示男性携带者，/>表示女性携带者，◆表示患病胎儿，↗表示先证者。
图2显示利用Sanger测序检测CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R位点基因型的结果图，其中1号家系先证者、先证者父亲为“c.675C>A杂合突变”，先证者母亲为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
图3显示利用Sanger测序检测CHST3:NM_004273.5:exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup位点基因型的结果图，其中1号家系先证者、先证者母亲为“c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG杂合突变”，先证者父亲野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
图4显示先天性脊柱骨骺发育不全2号家系遗传图谱；其中，表示男性携带者，/>表示女性携带者，●表示女性患者，↗表示先证者。
图5显示利用试剂盒检测2号家系CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R位点基因型的结果图，其中2号家系先证者、先证者父亲为“c.675C>A杂合突变”，先证者母亲为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
图6显示利用试剂盒检测2号家系CHST3:NM_004273.5:exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup位点基因型的结果图，其中2号家系先证者、先证者母亲为“c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG杂合突变”，先证者父亲为野生型(测序图中箭头所指为突变发生位置)。
具体实施方式
本发明提供了一种基因CHST3复合杂合突变位点在制备先天性脊柱骨骺发育不全诊断试剂或制备防治先天性脊柱骨骺发育不全的药物中的应用，所述致病基因CHST3复合杂合突变位点为CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R和CHST3:NM_004273.5:exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup。
在本发明中，首先利用外显子测序筛选与先天性脊柱骨骺发育不全高度相关的致病基因突变，为了避免假阳性结果出现，之后通过Sanger测序进行验证，最终获得先天性脊柱骨骺发育不全的致病基因复合杂合突变，具体为CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R和exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup。所述致病基因复合杂合突变可以作为诊断先天性脊柱骨骺发育不全的生物标志物，将先天性脊柱骨骺发育不全患者和正常人群区分开。其中CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R突变指野生型CHST3基因的第3号外显子的第675位碱基由C突变为A，形成CHST3基因突变体，所述CHST3基因突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：9(CTCCAGACGCTCC)所示。本发明所述CHST3突变体蛋白与野生型CHST3基因编码的蛋白相比，第225位氨基酸由丝氨酸(S)突变为精氨酸(R)，及发生错义突变，即所述CHST3突变体蛋白含有p.S225R的突变，所述突变是由于c.675C>A的错义突变引起的；所述CHST3突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：10(RGSRRSL)所示。
本发明所述c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG突变指野生型CHST3基因的第3号外显子的第1072至1089位共18个碱基(CAGCCCGCCTGGCTGCGG，SEQ ID NO：11)重复，形成CHST3基因突变体，所述CHST3基因突变体的核苷酸序列优选如SEQ ID NO：12(CAGCCCGCCTGGCTGCGGCAGCCCGCCTGGCTGCGG)所示。本发明所述CHST3突变体蛋白与野生型CHST3基因编码的蛋白相比，第358至363位共6个氨基酸(QPAWLR，SEQ ID NO：13)重复，即所述CHST3突变体蛋白含有p.Q358_R363dup的突变，所述突变是由于c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG的重复突变引起的；所述CHST3突变体蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.14(QPAWLRQPAWLR)所示。
在本发明中，根据CHST3两个突变位点的上下游序列设计特异性扩增引物或者特异性检测探针来制备诊断试剂。
本发明提供了一种用于检测先天性脊柱骨骺发育不全的致病基因CHST3复合杂合突变位点的试剂，包括检测致病基因CHST3突变位点c.675C>A:p.S225R的引物和检测致病基因CHST3突变位点c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup的引物；所述检测致病基因CHST3突变位点c.675C>A:p.S225R的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:1(GATTCAGCCTTCTCCCA)所示的CHST3-1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2(CCAGCCACTTCTTCCAG)所示的CHST3-1R；所述检测致病基因CHST3突变位点c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3(GGCAACATCTTCTACCTCT)所示的CHST3-2F和核苷酸序列如SEQ ID NO:4(CCAGTTTGTAGCCGAAG)所示的CHST3-2R。
在本发明中，所述试剂优选还包括测序引物。所述测序引物包括致病基因CHST3突变位点c.675C>A:p.S225R的测序引物和/或致病基因CHST3突变位点c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup的测序引物。所述致病基因CHST3突变位点c.675C>A:p.S225R的测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:5(GCAGGGCAACATCTTCTA)所示的CHST3-Seq1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:6(CCACTTCTTCCAGGTCTTAT)所示的CHST3-Seq1R；所述致病基因CHST3突变位点c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup的测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7(TGAGGGAAGAGGAGGTG)所示的CHST3-Seq2F和核苷酸序列如SEQ ID NO:8(CTGCGTGTTCTTTTGGA)所示的CHST3-Seq2R。本发明对所述引物的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的引物合成方法即可。
本发明提供了一种先天性脊柱骨骺发育不全诊断试剂盒，包括所述试剂和PCR扩增试剂。
在本发明中，所述PCR扩增试剂优选包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Tap聚合酶。所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液：500mmol/L KCl、pH 8.3的100mmol/LTris-Cl和15mmol/L MgCl2。
本发明提供了所述试剂在制备检测先天性脊柱骨骺发育不全的致病基因CHST3突变位点的试剂盒中的应用。
在本发明中，所述检测先天性脊柱骨骺发育不全的致病基因CHST3突变位点的方法，优选包括以下步骤：
提取待检样本基因组DNA；
以基因组DNA为模板，用上述方案中所述试剂扩增CHST3基因序列；
将CHST3基因的扩增产物进行DNA测序；
将待检测样本DNA测序结果与正常人基因组DNA序列比对，结果完全一致时说明待检样本中CHST3基因未发生突变为野生型，当比对结果出现染色体中一个等位基因存在CHST3基因(NM_004273.5)第3号外显子675位碱基由C突变为A，则该突变位点的基因型为“c.675C>A:p.S225R杂合突变”，同时染色体上一个等位基因存在第3号外显子第1072至1089位共18个碱基(CAGCCCGCCTGGCTGCGG)重复时，另外一个等位基因不发生突变，则该突变位点的基因型为“c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup杂合突变”。
在本发明中，所述扩增CHST3基因序列的反应体系优选为10×PCR缓冲液2.0μL、10mmol/L dNTPs 0.4μL、100ng/μL CHST3-1F(或CHST3-2F)0.5μL、100ng/μL CHST3-1R(或CHST3-2R)0.5μL、100ng/μL抽提DNA 1.0μL、5U/μL Taq酶0.2μL、ddH2O 15.4μL。对于CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R突变位点的PCR扩增反应程序优选如下：第一步：95℃，5分钟；第二步：30个循环(95℃，30秒→50℃，30秒→72℃，60秒)；第三步：72℃，7分钟；第四步：4℃保温。对于CHST3:NM_004273.5:exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup突变位点反应程序如下：第一步：95℃，5分钟；第二步：30个循环(95℃，30秒→48℃，30秒→72℃，60秒)；第三步：72℃，7分钟；第四步：4℃保温。
本发明提供了一种检测致病基因CHST3复合杂合突变位点的引物在制备辅助诊断先天性脊柱骨骺发育不全的试剂盒中的应用，所述致病基因CHST3复合杂合突变位点为CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R和CHST3:NM_004273.5:exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup。
在本发明中，基于所述致病基因CHST3突变位点上下游序列设计特异性引物，采用所述引物扩增含所述突变位点的DNA片段，通过DNA片段的基因型判断是否有患先天性脊柱骨骺发育不全的风险。在本发明实施例中，所述引物优选为上述方案所述试剂。
在本发明中，所述辅助诊断先天性脊柱骨骺发育不全的方法，优选包括以下步骤：用所述试剂盒检测样本中基因突变位点的基因型来诊断个体是否患有先天性脊柱骨骺发育不全的风险：当检测基因型是“c.675C>A:p.S225R杂合子+c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup杂合子”，则判断CHST3基因存在复合杂合突变，个体为患者；若检测基因型为单个杂合突变“c.675C>A:p.S225R杂合突变”或“c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup杂合突变”，则个体为携带者；若检测突变位点没有发生突变，则判断CHST3基因为野生型，个体是正常人。
在本发明中，所述样本优选为血液、羊水和活检组织中的至少一种。
在本发明中，除非另有说明，否则本文中使用的科学和技术名词具有本领域技术人员所通常理解的含义。并且，本文中所用的分子遗传学、核酸化学和分子生物学相关术语和实验室操作步骤均为相应领域内的广泛使用的术语和常规步骤。同时，为了更好地理解本发明，下面提供相关术语的定义和解释。
文中术语“诊断”包括疾病风险的预测、疾病发病与否的诊断、还包括对疾病预后的评估。
文中术语“突变”是指野生型的多核苷酸序列发生改变，成为变异体，变异体可以是天然发生的或非天然发生的。
在本发明中，术语“杂合突变”是指突变仅存在于一对等位基因中的一个基因中。
在本发明中，术语“复合杂合突变”是指是指等位基因均出现1处或以上的杂合突变，也就是双等位突变，每条染色体均突变。
文中术语“产前诊断”是指是在遗传咨询的基础上，主要通过遗传学检测和影像学检查，对高风险胎儿进行明确诊断，通过对患病胎儿的选择性流产达到胎儿选择的目的，从而降低出生缺陷率，提高优生质量和人口素质。
在本发明中，“引物”指用于在PCR反应中扩增靶标核酸的多核苷酸片段，其通常为寡核苷酸，例如含有至少5个碱基，例如5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25个或者更多个碱基的多核苷酸片段。引物不必与待扩增的目的基因或其互补链完全互补，只要其能够特异性扩增目的基因。如本文中所使用的，
术语“特异性扩增”是指引物能够通过PCR反应扩增目的基因，而不扩增其他基因。例如，特异性扩增CHST3基因是指，在PCR反应中引物只扩增CHST3基因，而不扩增其他基因。
下面结合实施例对本发明提供的一种导致先天性脊柱骨骺发育不全的致病基因CHST3复合杂合突变的应用及检测试剂和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆实验室手册(Molecular Cloning A LABORATORY MANUAL 1 SECOND EDITION；NewYork：Cold Spring Harbor LaboratoryPress，2014)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1
样本获取
发明人发现了1个先天性脊柱骨骺发育不全家系(简称1号家系)，该家系部分成员的临床信息见表1。图1家系图谱，其中，表示男性携带者，表示女性携带者，◆表示患病胎儿，↗表示先证者。
1.诊断标准：
可参照《人类单基因遗传疾病》2010版。
CHST3基因突变可导致常染色体隐性遗传的脊椎骨骺发育不良伴先天性关节脱位。临床上主要表现为短躯千型身材矮小、胸部畸形和关节退行性变。影像特点包括椎体扁平、骨骺发育不良及关节软骨破坏。
具体包括：骨骼发育不良、肢体短缩、主动脉瓣狭窄、胫骨弯曲、听力障碍、牙齿萌出延迟、身材矮小、屈曲挛缩、手指弯曲、关节脱位、尺骨弯曲、短掌骨、扁平骨骺、三尖瓣狭窄、盾状胸、椎弓根间隙变窄、肘关节曲位固定、腰椎前凸过度、眼距过宽、膝外翻、肺动脉狭窄、扁平足、智力残疾、脊椎骨骺发育不良、高拱形眉毛、脊柱侧弯、骨成熟延迟、小牙畸形、肘关节脱位、关节病、粗大运动发育迟缓、三尖瓣反流、关节疼痛、小指偏离、周身骨质脱钙、多腕骨骨化中心、双侧单掌横折痕、主动脉瓣反流、椎间隙变窄、二尖瓣返流、肩关节脱位、牙间隙增宽、长人中、桶状胸、短指畸形综合征、髋关节伸展受限、小骨骺、股骨近端骨骺发育低下、股骨颈短、室间隔缺损、小耳畸形、手指短末节指骨、宽前额、眉毛稀疏、蹒跚步态、高腭、***间距宽、膝关节脱位、手指的短指骨、椎体终板不规则、脊柱侧弯、马蹄内翻足、尺骨发育低下、短颈、髋关节外展减小、肺动脉高压、脊柱后凸畸形(驼背)、二尖瓣狭窄、冠状位脊柱裂、心室肥厚、肘外翻。
表1先天性脊柱骨骺发育不全1号和2号家系成员的临床信息
如图1所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。
1号家系人员Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者目前)和Ⅱ1(先证者)外周血DNA用于测序。
实施例2
外显子测序
1.仪器设备如表2所示。
表2仪器设备一览表
2.试剂耗材
人类全外显子测序试剂盒(Agilent)、DNA 1000试剂盒(Agilent)、96孔板(Axygen)、不同型号枪头(Axygen)、200μL离心管(Eppendorf)、1.5mL离心管(Eppendorf)、毛细管电泳缓冲液(Thermo)、测序标准物(Thermo)、无水乙醇(Thermo)、BigDyeTerminator V3.1(Thermo)、外周血gDNA提取试剂盒(TIANGEN)、琼脂糖(TIANGEN)、EB染液(Amresco)。
3.试剂配方
5×TBE电泳液贮存液按照表3配制。
表3 5×TBE电泳液配方
| 试剂 | Tris | 硼酸 | EDTA(pH 8.0，0.5mol/L) | ddH2O |
| 体积/重量 | 5.4g | 750mg | 2mL | 90mL |
用ddH2O将最终体积调整为100mL。
0.5×TBE电泳液工作液，用ddH2O稀释10倍即可。
10×红细胞裂解液按照表4配制。
表4 10×红细胞裂解液配方
| 试剂 | NH4Cl | KHCO3 | EDTA | 加ddH2O |
| 体积/重量 | 82.9g | 10g | 0.37g | 至1000mL |
高压灭菌，4℃保存。
1×细胞核裂解液按照表5配制。
表5 1×细胞核裂解液配方
| 试剂 | 2M Tris-HCl，pH 8.2 | 4M NaCl | 2mM EDTA |
| 体积/重量 | 0.5mL | 10mL | 0.4mL |
4.实验步骤
签署知情同意书后，采集1号家系中Ⅰ1(先证者父亲)、Ⅰ2(先证者母亲)的外周血3-5mL和Ⅱ1(先证者)羊水5～10mL。
4.1样本DNA提取
1)将样本3～5mL装入15mL离心管中，加2～3倍体积的1×红细胞裂解液，混匀，冰上静置30分钟，直至溶液变透明。
2)4℃，3000转/分钟离心10分钟，小心去上清液。沉淀中加1mL 1×细胞核裂解液，混匀，再加2mL 1×细胞核裂解液和150μL 20％SDS，摇匀，至出现粘稠透明状。加10μL20mg/mL蛋白酶K，摇匀。37℃消化6小时以上或过夜。
3)加等体积饱和酚，轻摇混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。
4)小心移上清至另一离心管，加等体积酚/氯仿(1:1v/v)混匀，室温3000转/分钟离心10分钟。
5)小心移上清，若上清不清亮透明，则用等体积氯仿再抽提一次。
6)将上清移入另一离心管中，加二倍体积无水乙醇，摇匀，见白色絮状DNA。用火焰灭菌的玻璃钩针将DNA钩出，70％乙醇洗二次，室温干燥5分钟，再将DNA溶于200μL 1×TE中，转鼓溶解过夜。紫外测OD值。
7)TE溶解的DNA，在4℃下可保存一年，如要求长期保存，则需加2倍体积无水乙醇置-70℃保存。
4.2外显子测序
参考人类全外显子测序试剂盒(Agilent)说明书和分子克隆实验室手册(第三版；Molecular Cloning A LABORATORY MANUAL 1SECOND EDITION；New York：Cold SpringHarbor LaboratoryPress，2014)操作指南。
1)取2μg DNA，机械打断，使片段大小在200bp左右，切胶回收150-250bp片段；
2)DNA片段做末端修复和3’末端加A；
3)连接测序接头，对连接产物进行纯化，再行PCR扩增，扩增产物纯化；
4)Agilent试剂盒探针加入纯化后的扩增产物进行杂交捕获，杂交产物经洗脱回收后做PCR扩增，再行最终产物回收，取小样行琼脂糖凝胶电泳进行质控分析；
5)NextSeq500测序仪测序和数据分析。
4.3结果
最终得到1个具有致病意义的基因复合杂合突变CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R和exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup；其中c.675C>A突变为第675位碱基C突变为A，造成了错义突变，导致第225位氨基酸由丝氨酸(S)突变为精氨酸(R)；c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG突变是第1072至1089位碱基CAGCCCGCCTGGCTGCGG重复，导致发生重复突变，第358至363位6个氨基酸(QPAWLR)发生重复突变。在1号家系患者(先证者)CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R和exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup位点的基因型是“c.675C>A+c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG”复合杂合突变；在1号家系携带者该位点的基因型为“c.675C>A”杂合突变或“c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG”杂合突变。
实施例3
Sanger测序验证
对于外显子组测序结果进一步利用Sanger测序法，对CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R和exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup位点进行验证。分别对实施例1中的1号家系3名人员(先证者、先证者父亲、先证者母亲)、2号家系4名人员(先证者、先证者母亲、先证者父亲、胎儿)和100名家系外正常人进行CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R和exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup位点基因型检测。
具体方法步骤如下：
1、DNA提取
按照实施例1的方法提基因组DNA。
2、候选引物设计、验证及优选
2.1候选引物设计参考人类基因组序列数据库hg19/build36.3(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome，或http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgGateway？redirect＝manual&source＝genome.ucsc.edu)。
2.2针对突变位点c.675C>A和c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG分别设计16对和15对候选引物(见表6)，并利用PCR实验来验证和评价各对候选引物的优劣情况。
表6各对候选引物基本情况和验证实验结果一览表
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注：正常PCR扩增结果电泳后只有一条特异性条带，若出现引物二聚体条带、非特异产物条带均是引物异常反应的结果；目标引物尽可能避免这类情况。另外参考如下原则来综合评价和选择最优引物对：
①引物长度为15-30nt，常用为20nt左右；
②G+C含量以40-60％为宜，G+C太少扩增效果不佳，G+C过多易出现非特异条带。ATGC最好随机分布；
③避免5个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列参照；
④引物内部不应出现互补序列；
⑤两个引物之间不应存在互补序列，尤其是避免3`端的互补重叠；
⑥引物与非特异扩增区的序列的同源性不要超过70％，引物3`末端连续8个碱基在待扩增区以外不能有完全互补序列，否则易导致非特异性扩增；
2.3候选引物PCR验证反应
按照表7中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上；每对引物设置8个反应测试管(表7中序号1至8)。
表7引物检测PCR反应体系
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反应条件：将上述测试反应管放入PCR仪，执行以下反应程序：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→Tm，30秒→72℃，60秒)；(根据表6中各引物Tm值设置PCR扩增参数，如为双引物则取Tm平均值)。
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
2.4候选引物PCR结果进行琼脂糖凝胶电泳检测，以评估引物反应的有效性、特异性：
1)用胶带将洗净干燥的凝胶成样器两端封好，置于一水平台面上，在成样器的一端约1cm处放置梳子。
2)称量2g琼脂粉末于一锥形瓶中，加入100mL 0.5×TBE电泳缓冲液，摇匀后置微波炉或电炉上(加石棉网)加热，沸腾后取出摇匀，再加热，直至凝胶完全熔解，取出室温冷却。
3)待凝胶冷却至50℃左右，倒入封好的凝胶成样器，使厚度在5mm左右。
4)凝胶凝固拆除胶带，将凝胶与成样器一起放入电泳槽中。
5)加入电泳缓冲液，使液面高于胶面1-2mm，向上拔出梳子；用微量移液器将样品和DNA大小标准品分别与载样液混匀后，加入各加样孔内，由于载样液中蔗糖比重较大，DNA沉入孔底。
6)盖上电泳槽，接通电源，调至适当电压，开始电泳。根据载样液中溴酚蓝的指示，判断样品的大概位置，决定是否终止电泳。
7)切断电源，取出凝胶，放入0.5g/mL的EB水溶液中染色10-15分钟。
8)将凝胶放到透射式紫外照射仪下观察结果，波长254nm，并用加红色滤色片的相机照相或用凝胶扫描***记录电泳结果。
2.5结果评价：
1)如果7号管仅出现一条明亮清晰目的条带，无其它条带，则判断该对引物和发应体系有效性好和特异性强；
2)如果7号管没有出现目的条带，则判断该对引物和反应体系无效；
3)如果7号管出现目的条带外的引物引物二聚体带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体带，则判断该对引物和反应体系有效性差；
4)如果7号管出现目的条带外的非特异性带，并在5、6号部分管中也同样出现非特异性带，则判断该对引物和反应体系特异性差；
5)如果7号管出现目的条带外的引物二聚体和非特异性带，并在2、3、4、5、6号部分管中也同样出现引物二聚体和非特异性带，则判断该对引物和反应体系有效性和特异性差。
2.6根据表6验证测试后统计的结果，选择其中最优一对(表6中两位点1号对候选引物)作为突变家系检测用引物：
针对CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R位点的PCR扩增引物序列如下：
5’-GATTCAGCCTTCTCCCA-3’(SEQ ID NO:1)
5’-CCAGCCACTTCTTCCAG-3’(SEQ ID NO:2)
针对CHST3:NM_004273.5:exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup位点的PCR扩增引物序列如下：
5’-GGCAACATCTTCTACCTCT-3’(SEQ ID NO:3)
5’-CCAGTTTGTAGCCGAAG-3’(SEQ ID NO:4)
按照表8中的反应体系进行PCR并保持反应体系在冰上。
表8突变位点PCR反应体系
反应条件：将反应体系放入PCR仪，执行以下反应程序：
针对CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R位点的PCR扩增程序如下：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→50℃，30秒→72℃，60秒)；
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
针对CHST3:NM_004273.5:exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup位点的PCR扩增程序如下：
第一步：95℃，5分钟；
第二步：30个循环(95℃，30秒→48℃，30秒→72℃，60秒)；
第三步：72℃，7分钟；
第四步：4℃直至取样时。
4、琼脂糖凝胶电泳检测
参照上述2.4步骤。
5、PCR产物酶解法纯化：5μLPCR产物中分别加入0.5μL核酸外切酶I(Exo I)，1μL碱性磷酸酶(AIP)，37℃消化15分钟，85℃使酶失活15分钟。
6、BigDye反应
BigDye反应体系见表9。
表9 BigDye反应体系
| 试剂 | PCR产物纯化后DNA | 3.2pmol/μL测序引物 | BigDye | 5×BigDye测序缓冲液 | ddH2O |
| 体积 | 2.0μL | 1.0μL | 0.5μL | 2.0μL | 4.5μL |
测序PCR循环条件：
第一步：96℃，1分钟；
第二步：33个循环(96℃，30秒→55℃，15秒→60℃，4分钟)；
第三步：4℃直至取样时。
7、BigDye反应产物纯化：
1)每管加入1μL 125mM EDTA(pH8.0)，加到管底，再加入1μL 3mol/L NaAc(pH5.2)；
2)加入70μL 70％酒精，震荡混匀4次，室温放置15分钟；
3)3000g，4℃离心30分钟；马上倒置96孔板，185g离心1分钟；
4)室温放置5分钟，让残余的酒精在室温挥发干，加入10μLHi-Di甲酰胺溶解DNA，96℃变性4分钟，迅速置冰上4分钟，上机测序。
8、测序
将纯化后的BigDye反应产物进行DNA测序。
测序引物则在上述PCR优选引物的基础上设计巢式引物(第二组引物是在第一组引物扩增得到的产物序列范围内设计的)作为测序引物：
针对CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R位点的测序引物序列如下：
5’-GCAGGGCAACATCTTCTA-3’(SEQ ID NO:5)；
5’-CCACTTCTTCCAGGTCTTAT-3’(SEQ ID NO:6)。
针对CHST3:NM_004273.5:exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup位点的测序引物序列如下：
5’-TGAGGGAAGAGGAGGTG-3’(SEQ ID NO:7)；
5’-CTGCGTGTTCTTTTGGA-3’(SEQ ID NO:8)。
9、结果分析
图2的Sanger测序结果显示，1号家系2名人员CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R位点基因型是“c.675C>A杂合子”。图2测序图中箭头所指位置显示B和C层CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R位点基因型是“c.675C>A杂合子”突变；图2测序图中箭头所指位置显示A层个体基因型为野生型。
图3的Sanger测序结果显示，1号家系2名成员CHST3:NM_004273.5:exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup位点基因型是“c.675C>A杂合子”。图3测序图中箭头所指位置显示A和C层个体CHST3:NM_004273.5:exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup位点基因型是“c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG杂合子”突变；图3测序图中箭头所指位置显示B层个体基因型为野生型。
综合上述检测结果，先证者CHST3基因型为c.675C>A、c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG复合杂合突变。
实施例5
先天性脊柱骨骺发育不全诊断试剂盒及应用
1、试剂盒组成：
1)扩增引物：如实施例3所示
2)缓冲液
3)Taq酶
4)dNTPs
5)CHST3:c.675C>A和c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG阳性突变参考品DNA，c.675C>A阳性参考品为一段双链DNA，具体序列如下所示：
c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG阳性参考品为一段双链DNA，具体序列如下所示：
其中，单下划线碱基为PCR扩增上下游引物位置，方框内碱基为点突变位点，双下划线碱基为上下游测序引物位置。
6)测序引物：如实施例3所示。
2、使用方法：
共筛查和检测56个骨骼***发育异常家系中210位个体，并再次发现如下家系，并将本试剂盒应用于2号家系患者检测(见表10)。
表10先天性脊柱骨骺发育不全2号家系成员的临床信息
如图4所示，编号采用Ⅰ(第一代)、Ⅱ(第二代)。
2号家系人员Ⅰ1(父亲)、Ⅰ2(母亲)和Ⅱ1(先证者)外周血DNA用于试剂盒检测。
1)基因组DNA提取：提取样本基因组DNA。
2)先采用上述PCR扩增引物、Taq酶、缓冲液、dNTPs、样本基因组DNA等进行PCR扩增反应，如实施例3；
3)对PCR扩增产物进行纯化；
4)采用上述测序引物对纯化的PCR产物进行BigDye反应；
5)对BiyDye反应产物纯化；
6)对BiyDye反应产物测序，测序序列与正常序列相比较。
图5的试剂盒检测结果显示，2号家系父亲和先证者CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R位点基因型是“c.675C>A杂合子”。图5测序图中箭头所指位置显示A和C层CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R位点基因型是“c.675C>A杂合子”突变；图5测序图中箭头所指位置显示B层个体基因型为野生型。图6的试剂盒检测结果显示，2号家系母亲和先证者CHST3:NM_004273.5:exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup位点基因型是“c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG杂合子”。图6测序图中箭头所指位置显示B和C层CHST3:NM_004273.5:exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup位点基因型是“c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG杂合子”突变；图6测序图中箭头所指位置显示A层个体基因型为野生型。检测结果确认先证者为先天性脊柱骨骺发育不全患者，其母亲和父亲为突变基因携带者；遗传咨询意见为该夫妻再生育先天性脊柱骨骺发育不全患者的几率是1/4，生育携带者后代的几率是1/2，生育完成正常个体的几率是1/4，建议夫妻计划再生育时行胚胎植入前遗传学诊断以及妊娠后来医院行产前诊断。
由以上实施例结果可以看出，本发明发现了新的CHST3基因突变体，且确认了新突变体与先天性脊柱骨骺发育不全的发病密切相关，所述致病突变体可用于先天性脊柱骨骺发育不全的分子诊断及与相关疾病的鉴别诊断。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (7)
1.一种包含基因CHST3突变位点CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>
A:p.S225R的DNA片段和包含基因CHST3突变位点CHST3:NM_004273.
5:exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup的DNA片段在制备先天性脊柱骨骺发育不全诊断试剂中的应用，所述包含基因CHST3突变位点CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：79所示；所述包含基因CHST3突变位点CHST3:NM_004273.5:exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup的DNA片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：80所示。
2.一种用于检测先天性脊柱骨骺发育不全的致病基因CHST3复合杂合突变位点的试剂，其特征在于，为检测致病基因CHST3突变位点c.675C>A:p.S225R的引物、检测致病基因CHST3突变位点c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup的引物和测序引物；
所述检测致病基因CHST3突变位点c.675C>A:p.S225R的引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO:1所示的CHST3-1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示的CHST3-1R；
所述检测致病基因CHST3突变位点c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGG
CTGCGG:p.Q358_R363dup的引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示的CHST3-2F和核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示的CHST3-2R；
所述测序引物包括致病基因CHST3突变位点c.675C>A:p.S225R的测序引物和致病基因CHST3突变位点c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup的测序引物；
所述致病基因CHST3突变位点c.675C>A:p.S225R的测序引物包括核苷酸序列如SEQ IDNO:5所示的CHST3-Seq1F和核苷酸序列如SEQ ID NO:6所示的CHST3-Seq1R；
所述致病基因CHST3突变位点c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTG
CGG:p.Q358_R363dup的测序引物包括核苷酸序列如SEQ ID NO:7所示的CHST3-Seq2F和核苷酸序列如SEQ ID NO:8所示的CHST3-Seq2R。
3.一种先天性脊柱骨骺发育不全诊断试剂盒，其特征在于，包括权利要求2所述试剂和PCR扩增试剂。
4.根据权利要求3所述试剂盒，其特征在于，所述PCR扩增试剂包括dNTP、10×PCR缓冲液、镁离子和Tap DNA聚合酶；
所述10×PCR缓冲液包含以下组分的水溶液：500mmol/L KCl、pH 8.3的100mmol/LTris-HCl和15mmol/L MgCl2。
5.权利要求2所述试剂在制备检测先天性脊柱骨骺发育不全的致病基因CHST3突变位点的试剂盒中的应用，所述致病基因CHST3突变位点为CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R和CHST3:NM_004273.5:exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup。
6.一种检测致病基因CHST3复合杂合突变位点的引物在制备辅助诊断先天性脊柱骨骺发育不全的试剂盒中的应用，所述致病基因CHST3复合杂合突变位点为CHST3:NM_004273.5:exon3:c.675C>A:p.S225R和CHST3:NM_004273.5:exon3:c.1072_1089dupCAGCCCGCCTGGCTGCGG:p.Q358_R363dup。
7.根据权利要求6所述应用，其特征在于，所述引物为权利要求2或3所述试剂。
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Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101541977A (zh) * | 2006-09-19 | 2009-09-23 | 诺瓦提斯公司 | 用于raf抑制剂的靶向调节、效力、诊断和/或预后的生物标志物 |
| WO2018039145A1 (en) * | 2016-08-20 | 2018-03-01 | Avellino Lab Usa, Inc. | Single guide rna, crispr/cas9 systems, and methods of use thereof |
| CN109554461A (zh) * | 2018-12-19 | 2019-04-02 | 天津协和华美医学诊断技术有限公司 | 一组检测原发性hlh的生物标记及其检测试剂盒 |
| CN109897894A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-06-18 | 黄欢 | 一种成骨发育不全疾病的致病突变及其检测试剂 |
| CN115141884A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-10-04 | 湖南家辉生物技术有限公司 | 一种新的atp7b突变基因及其诊断试剂 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2012038382A2 (en) * | 2010-09-20 | 2012-03-29 | Progenika Biopharma, S.A. | Markers for joint displasia, osteoarthritis and conditions secondary thereto |
-
2022
- 2022-12-19 CN CN202211629032.9A patent/CN115948537B/zh active Active
Patent Citations (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101541977A (zh) * | 2006-09-19 | 2009-09-23 | 诺瓦提斯公司 | 用于raf抑制剂的靶向调节、效力、诊断和/或预后的生物标志物 |
| WO2018039145A1 (en) * | 2016-08-20 | 2018-03-01 | Avellino Lab Usa, Inc. | Single guide rna, crispr/cas9 systems, and methods of use thereof |
| CN109554461A (zh) * | 2018-12-19 | 2019-04-02 | 天津协和华美医学诊断技术有限公司 | 一组检测原发性hlh的生物标记及其检测试剂盒 |
| CN109897894A (zh) * | 2018-12-27 | 2019-06-18 | 黄欢 | 一种成骨发育不全疾病的致病突变及其检测试剂 |
| WO2020133233A1 (zh) * | 2018-12-27 | 2020-07-02 | 黄欢 | 一种成骨发育不全疾病的致病突变及其检测试剂 |
| CN115141884A (zh) * | 2022-06-30 | 2022-10-04 | 湖南家辉生物技术有限公司 | 一种新的atp7b突变基因及其诊断试剂 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| Phenotypic Features of Carbohydrate Sulfotransferase 3 (CHST3) Deficiency in 24 Patients: Congenital Dislocations and Vertebral Changes as Principal Diagnostic;Sheila Unger等;AMERICAN JOURNAL OF MEDICAL GENETICS;第2543-2549页 * |
| 脊柱骨骺发育不良的分子遗传学研究进展;夏欣一;周鑫;崔英霞;;医学研究生学报(11);第1217-1224页 * |
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