CN115947795B - 一种检测asfv抗体的重组蛋白、双抗原夹心elisa试剂盒及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测非洲猪瘟病毒(ASFV)抗体的重组蛋白、双抗原夹心ELISA试剂盒及其应用，包括包被抗原的酶标板、酶标抗体、非洲猪瘟阳性对照血清、ASF阴性对照血清、稀释液、反应液、10×洗涤液、TMB底物溶液、终止液。该试剂盒中包被酶标板的抗原为携带His标签的重组ASFV p54、p30融合蛋白(p54‑30‑His)。该试剂盒可用于ASFV感染血清学诊断以及抗体的水平的监测、流行病学调查等，并能有效避免重组亚单位疫苗或病毒样颗粒疫苗免疫猪抗体检测时标签蛋白的干扰，为ASFV抗体检测、检测提供一种准确、有效的方法。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测ASFV抗体的重组蛋白、双抗原夹心ELISA试剂盒及其应用。
背景技术
非洲猪瘟(African swine fever,ASF)是由非洲猪瘟病毒(African swine fevervirus,ASFV)引起家猪或野猪的一种高度接触性、热性传染病，高致病性毒株可造成感染猪100％死亡。
ASF目前现有的诊断技术主要包括三大类：核酸检测、抗原检测和抗体检测。强毒株常引起猪急性死亡，抗体检测难度；中、低毒力毒株感染后，因病程较长，能刺激机体产生较好的体液免疫应答，抗体检测是有效的诊断方法之一，OIE也明确指出，康复猪或感染持续一段时间的猪体内有ASFV抗体，可通过抗体检测来确诊是否感染过ASFV。
ASFV抗体检测方法主要以ELISA为主，有间接ELISA、阻断ELISA/竞争ELISA等。间接ELISA包被的往往是重组抗原，检测灵敏度较高，试剂盒制备相对简单，但在重组抗原纯化时使用了融合性标签蛋白(如His标签)，而临床上猪使用的病毒样颗粒(VLPs)亚单位疫苗在制备时，也常使用His标签纯化抗原，多次免疫后导致正常猪体内有一定水平的标签蛋白抗体，尽管在检测时血清做了大量稀释，但还是较容易出现检测结果的假阳性；阻断ELISA/竞争ELISA需要使用酶标记的特异性的抗体，猪血清中的ASFV抗体与酶标板上的抗原结合，阻断酶标抗体吸附，通过底物溶液显色确定结果的阴阳性，该方法虽然能降低检测结果的假阳性率，但需要合适、有效的单克隆抗体来提高反应的特异性与稳定性。
发明内容
为了实现上述发明目的，本发明以重组蛋白p54-30-His包被酶标板，通过抗原抗体反应吸附待检样品种的抗ASFV p54、p30抗体，加入反应液，间接吸附的抗体与重组蛋白GST-p54-30，利用HRP标记的抗GST酶标抗体结合吸附在酶标板上的GST抗原，底物溶液显色后，与临界值进行比较，判定待检样品中是否存在ASFV抗体，基于此原理建立、组装成检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒。该试剂盒可用于ASFV感染血清学诊断以及抗体的水平的监测、流行病学调查等，并能有效避免重组亚单位疫苗或病毒样颗粒(VLPs)疫苗免疫猪抗体检测时标签蛋白的干扰，为ASFV抗体检测、检测提供一种准确、有效的方法。
本发明采用的技术方案为：
一种检测ASFV抗体的重组蛋白，所述重组蛋白以ASFV p54和p30为抗原，所述重组蛋白序列如SEQ ID No.1所示，ASFV抗原氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
本发明还提供上述检测ASFV抗体的重组蛋白的制备方法，在p54和p30基因两端分别引入限制性酶切位点NdeI和XhoI，合成后***载体pUC57中。
一种检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒，其特征在于，包括上述检测ASFV抗体的重组蛋白、酶标板、HRP标记的抗GST酶抗体、ASF阳性对照血清、ASF阴性对照血清、稀释液、反应液、10×洗涤液、TMB底物溶液、终止液。
进一步的，所述的试剂盒中包被96孔酶标板的抗原为携带His标签的重组ASFVp54、p30重组蛋白p54-30-His；所述反应液为工作浓度的携带GST标签的重组ASFV p54、p30重组蛋白GST-p54-30。
进一步的，所述的重组蛋白p54-30-His利用装载有上述重组蛋白的质粒pET-30a(+)在BL21(DE3)大肠杆菌中表达、纯化获得；所述重组蛋白GST-p54-30利用装载有上述重组蛋白的质粒pGEX-6P-1在BL21(DE3)大肠杆菌中表达、纯化获得。
进一步的，所述的HRP标记的抗GST酶标抗体为HRP标记的小鼠源抗GST单克隆抗体；所述的ASF阳性对照血清为重组p54、p30融合蛋白免疫猪制备的血清；所述的ASF阴性对照血清为健康猪血清。
进一步的，所述稀释液为含0.01％Proclin300的5％小牛血清；
所述10×洗涤液为：NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4 14.4g，KH2PO4 2.4g，Tween-200.5mL，Proclin300 0.1mL，溶于800mL蒸馏水，调pH7.4，定容至1L，0.22μm滤器过滤除菌，4℃保存；
所述终止液为2M H2SO4。所述的一种检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒，其中包括包被携带His标签的重组ASFV p54、p30融合蛋白的96孔酶标板，携带GST标签的重组ASFV p54、p30融合蛋白的反应液，HRP标记抗GST单克隆抗体的酶标抗体，重组p54、p30融合蛋白免疫猪制备的ASFV阳性对照血清和来自健康猪的ASFV阴性对照血清。
本发明还提供上述检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)重组蛋白p54-30-His、GST-p54-30制备；
(2)ASF阳性对照血清、ASF阴性对照血清的制备；
(3)检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒的制备。
进一步的，检测ASFV抗体的重组蛋白采用的扩增引物序列如SEQ ID NO.3和SEQID NO.4所示。
本发明还提供上述重组蛋白和试剂盒在制备非洲猪瘟病毒抗体检测的试剂中的应用。
检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒制备方法包括如下步骤：
(1)重组蛋白制备
a.ASFV p54、p30基因的人工合成：优化ASFV p54、p30基因密码子，使之适合在大肠杆菌中表达，并在p54、p30基因基因两端分别引入限制性酶切位点NdeI和XhoI，合成该基因，序列如SEQ ID NO.1所示，合成的基因克隆进载体pUC57；
b.重组菌构建：将pET30a(+)质粒和pUC57中的ASFV p54、p30基因分别用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切，回收酶切后的pET30a(+)质粒和约726bp的ASFV p54、p30基因，用T4DNA连接酶连接回收的片段，并将连接产物转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，采用NdeI和XhoI双酶切方法筛选出携带质粒pET-5430的重组菌；以质粒pET-5430为模板，用引物
‘F 5’-CGCggatccCTATTCTCTTCAAGAAAG-3’(SEQ ID NO.3)，
R 5’-GCAActcgagTTTTTTTTTCAGCAGTTTG-3’(SEQ ID NO.4)PCR扩增ASFV p54、p30基因，分别用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切PCR产物和pGEX-6P-1质粒，核酸回收试剂盒回收酶切后的pGEX-6P-1质粒和约726bp的ASFV p54、p30基因，T4 DNA连接酶连接回收的片段，并将连接产物转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，采用BamHI和XhoI双酶方法切筛选出携带质粒pGEX-5430的重组菌。
c.ASFV p54、p30重组融合蛋白表达、纯化：按1∶100体积比，分别将携带质粒pET-5430和pGEX-5430的重组菌接种含50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的2×YT培养基，37℃培养至OD600＝0.8，加入1mmol/L IPTG，37℃诱导4h；8000rpm离心2min，离心得到的菌体用0.01M PBS溶液洗涤2次，再次离心；再次离心得到的菌体用超声波仪裂解，超声波仪功率50W，10s/次，共10min；4℃、12000rpm离心20min，收集沉淀；分别采用Ni-NTA Agarose和GST Binding Resin纯化重组蛋白p54-30-His和GST-p54-30；取纯化后的重组融合蛋白，2μg/甬道，12％聚丙烯酰胺凝胶电泳后，蛋白转印仪转印至硝酸纤维素膜，用抗ASFV p30和抗ASFV p54的单克隆抗体进行Western-blotting验证。
(2)对照血清制备：
a.ASF阳性对照血清：用pH7.4、0.01M PBS将重组蛋白p54-30-His浓度调整为1mg/mL，与等体积弗氏完全佐剂混合，用细胞裂解仪充分乳化，乳化的重组蛋白肌肉注射45日龄健康猪，2mL/只；第一次免疫后第10天，用弗氏不完全佐剂混合、乳化的同样剂量抗原加强免疫1次；10天后再用同样剂量的重组蛋白加强免疫1次；在第三次免疫后第7天，无菌采集猪血分离血清；按照常规间接ELISA方法，分别以2.5μg/mL重组蛋白p54-30-His包被酶标板，封闭酶标板后与连续10倍稀释的猪分离血清反应，二抗为稀释至工作浓度的HRP标记的羊抗猪IgG(H+L)抗体，底物为TMB底物溶液，终止液为2M H2SO4，450nm波长下检测每孔的吸光值，确定重组融合蛋白免疫猪血清的ELISA抗体效价为1∶106，血清分装后-20℃保存，作为检测用ASF阳性对照血清。
b.ASF阴性对照血清：采集75日龄健康猪血液，分离血清，分装后-20℃保存，作为检测用ASF阴性对照血清。
(3)ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒制备：
a.酶标板2块：用pH9.6、0.05M碳酸盐缓冲液稀释重组蛋白p54-30-His至终浓度1μg/mL，96孔板每孔加入100μL，37℃静置2h，用pH7.4的洗涤液PBST洗涤2遍后，每孔加入封闭液200μL，37℃静置1h，再用洗涤液PBST洗涤2遍，吸水纸上拍去残留水分，超净工作台内风干，装入铝箔袋，抽真空密封，4℃保存。其中洗涤液PBST组分为0.01M PBS，0.5‰Tween-20，0.01％Proclin300；封闭液为pH7.6、含有5％小牛血清的洗涤液PBST。
b.稀释液：含0.01％Proclin300的5％小牛血清30mL，具体制备方法为：将5mL小牛血清、10μL Proclin300完全溶解于PBST中，最终体积定容至100mL，0.22μm滤器过滤除菌，取30mL分装进灭菌瓶，4℃保存。
c.反应液：用稀释液将重组蛋白GST-p54-30稀释至1μg/mL，0.22μm滤器过滤除菌，装入25mL灭菌瓶，4℃保存。
d.酶标抗体：HRP标记的小鼠源抗GST单克隆抗体10μL，-20℃保存；
e.ASF阳性对照血清、ASF阴性对照血清：各1mL，-20℃保存。
f.10×洗涤液：10倍浓缩的PBST 30mL，具体将制备方法为：NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4 14.4g，KH2PO4 2.4g，Tween-20 0.5mL，Proclin300 0.1mL，溶于800mL蒸馏水，调pH7.4，定容至1L，0.22μm滤器过滤除菌，取30mL装入灭菌瓶，4℃保存。
g.TMB底物溶液：TMB底物溶液25mL，4℃保存。
h.终止液：2M H2SO4 15mL，室温保存。
有益效果
前期实验过程中我们发现，携带His标签的重组抗原在检测母猪血清时存在His标签干扰现象(多次病毒样颗粒疫苗免疫的猪体内存在His抗体)。近期我们在实验过程中发现p30能形成二聚体，因此本发明中的p30氨基端序列只使用了抗原指数高的羧基端部分，删除了二聚体形成区域，有效避免了在双抗原夹心ELISA检测抗体过程中假阳性的出现，所用的p54抗原去除了疏水性的信号肽区域，能有效提高重组蛋白表达量；通过基因工程方法表达、纯化出抗原性极佳的、分别携带His标签和GST标签的ASFV p54、p30融合重组蛋白，以His标签的重组蛋白包被酶标板，加入待检血清，血清中的ASFV抗体结合到酶标板上，再加入携带GST标签的ASFV重组蛋白，该蛋白被酶标板上结合的抗体捕获，HRP标记的抗GST单克隆抗体与间接结合的GST标签结合，经底物溶液显色后，确定ASFV抗体的存在。该方法不仅可以检测IgG抗体，也可检测机体早期产生的IgM抗体，最重要的是消除了常用融合标签蛋白的干扰，待检血清也不需要大量稀释，且背景低，这对ASFV抗体准确检测有重要意义。
附图说明
图1为携带不同标签的重组ASFV p54、p30融合蛋白免疫印迹图；其中，M为Prestained Protein Marker；1、2分别为纯化的重组蛋白GST-p54-30、p54-30-His与抗ASFV p30单克隆抗体免疫印迹结果；3、4分别为纯化的重组蛋白GST-p54-30、p54-30-His与健康小鼠血清免疫印迹结果；5、6分别为纯化的重组蛋白GST-p54-30、p54-30-His与抗ASFVp54单克隆抗体免疫印迹结果。
具体实施方式
为了阐述本发明的技术方案及技术目的，下面结合附图说明及具体实施方式对本发明做进一步的介绍。
生物材料来源：
pET30a(+)：大肠杆菌表达载体，购于美国Novogen公司(Cat No.69909.3)；
BL21(DE3)大肠杆菌(E.coli)感受态细胞：购于海基生物(HaiGene)科技有限公司(Cat No.K10127)；
ASFV抗体阳性血清：12份ASFV抗体阳性血清由中国动物卫生与流行病学中心国家非洲猪瘟参考实验室提供；
ASFV抗体阴性血清：2017年的444份ASFV抗体阴性血清，以及猪细小病毒(PPV)阳性血清、猪***病毒(FMDV)阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清、猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清、猪伪狂犬病病毒(PRV)阳性血清由本实验室鉴定、保存。
酶标抗体：HRP标记的小鼠源抗GST单克隆抗体购于ATAGENIXLABORATORIES公司(Cat No.ATMA10044Mo)，HRP标记的羊抗猪IgG(H+L)抗体购于Abcam公司(Cat No.ab6915)，HRP标记的羊抗小鼠IgG(H+L)抗体购于proteintech公司(Cat No.S00001)。
实施例1重组蛋白制备
1.ASFV p54、p30基因的人工合成：优化ASFV p54、p30基因密码子，使之适合在大肠杆菌中表达，并在p54、p30基因两端分别引入限制性酶切位点NdeI和XhoI，合成该基因，***载体pUC57中，基因序列如下：
catatgCTATTCTCTTCAAGAAAGAAAAAAGCTGCTGCCGCTATTGAGGAGGAAGATATACAGTTTATAAATCCTTATCAAGATCAGCAATGGGCAGAAGTCACTCCACAACCAGGTACCTCTAAACCGGCTGGAGCGACTACAGCAAGTGCAGGCAAACCAGTCACGGGCAGACCGGCAACAAACAGACCAGCAACAAACAAACCAGTCACGGACAACCCAGTTACGGACAGACTAGTCATGGCAACTGGCGGGCCAGCGGCCGCACCTGCGGCCGCGAGTGCTCATCCGACTGAGCCTTACACGACAGTCACTACTCAGAACACTGCTTCACAAACAATGTCGGCTATTGAAAATTTACGACAAAGAAACACCTATACGCATAAAGACCTAGAAAACTCCTTGGATATCGAAGAAGAAACCGAATCTTCTGCTTCTTCTGAATCTATCCACGAAAAAAACGACAACGAAACCAACGAATGCACCTCTTCTTTCGAAACCCTGTTCGAACAGGAACCGTCTTCTGAAGAACCGAAAGACTCTAAACTGTACATGCTGGCTCAGAAAACCGTTCAGCACATCGAACAGTACGGTAAAGCTCCGGACTTCAACAAAGTTATCCGTGCTCACAACTTCATCCAGACCATCCACGGTACCCCGCTGAAAGAAGAAGAAAAAGAAGTTGTTCGTCTGATGGTTATCAAACTGCTGAAAAAAAAActcgag(SEQ ID NO.1)，编码的ASFV抗原氨基酸序列为LFSSRKKKAAAAIEEEDIQFINPYQDQQWAEVTPQPGTSKPAGATTASAGKPVTGRPATNRPATNKPVTDNPVTDRLVMATGGPAAAPAAASAHPTEPYTTVTTQNTASQTMSAIENLRQRNTYTHKDLENSLDIEEETESSASSESIHEKNDNETNECTSSFETLFEQEPSSEEPKDSKLYMLAQKTVQHIEQYGKAPDFNKVIRAHNFIQTIHGTPLKEEEKEVVRLMVIKLLKKK(SEQ ID NO.2)，其中aa1-aa133为去除信号肽的p54蛋白，aa134-aa 238为去除二聚体形成区域的p30羧基端蛋白。
2.重组菌构建：将pET30a(+)质粒和pUC57中的ASFV p54、p30基因分别用限制性内切酶NdeI和XhoI酶切，回收酶切后的pET30a(+)质粒和约726bp的ASFV p54、p30基因，用T4DNA连接酶连接回收的片段，并将连接产物转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，用NdeI和XhoI双酶切筛选重组质粒，并命名为pET-5430；以质粒pET-5430为模板，用引物
F 5’-CGCggatccCTATTCTCTTCAAGAAAG-3(SEQ ID NO.3)，
R 5’-GCAActcgagTTTTTTTTTCAGCAGTTTG-3’(SEQ ID NO.4)PCR扩增ASFV p54、p30基因，分别用限制性内切酶BamHI和XhoI酶切，回收酶切后的pGEX-6P-1质粒和约726bp的ASFV p54、p30基因，T4 DNA连接酶连接回收的片段，并将连接产物转化BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，BamHI和XhoI双酶切筛选出重组质粒，并命名pGEX-5430。
3.ASFV p54、p30重组融合蛋白表达、纯化：按1∶100体积比，分别将携带质粒pET-5430和pGEX-5430的重组菌接种含50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄青霉素的2×YT培养基，37℃培养至OD600＝0.8，加入1mmol/L IPTG，37℃诱导4h；8000rpm离心2min，离心得到的菌体用0.01M PBS溶液洗涤2次，再次离心；再次离心得到的菌体用超声波仪裂解，超声波仪功率50W，10s/次，共10min；4℃、12000rpm离心20min，收集沉淀；分别采用Ni-NTA Agarose和GST Binding Resin纯化携带His标签的重组蛋白(p54-30-His)及携带GST标签的重组蛋白(GST-p54-30)；取纯化后的重组融合蛋白2μg/甬道，12％聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，用蛋白转印仪转印硝酸纤维素膜，用抗ASFV p30和抗ASFV p54的单克隆抗体进行Western-blotting验证(图1)。
实施例2阳性对照血清、阴性对照的制备
1.ASF阳性对照血清：用pH7.4、0.01M PBS将纯化的p54-30-His重组蛋白浓度调整为1mg/mL，与等体积弗氏完全佐剂混合，组织匀浆机中充分乳化；将油包水的重组融合蛋白肌肉注射45日龄健康猪，2mL/只；第一次免疫后10天，用弗氏不完全佐剂混合的同样剂量抗原加强免疫1次；10天后再用同样剂量的重组融合蛋白加强免疫1次；在第三次免疫后第7天，无菌采集猪血分离血清；按照常规间接ELISA方法，分别以2.5μg/mL重组蛋白p54-30-His包被酶标板，封闭酶标板后与连续10倍稀释的猪分离血清反应，二抗为稀释至工作浓度的HRP标记的羊抗猪IgG抗体，底物为TMB底物溶液，终止液为2M H2SO4，450nm波长下检测每孔的吸光值，确定重组融合蛋白免疫猪血清的ELISA抗体效价为1∶106，血清分装后-20℃保存，作为检测用ASF阳性对照血清。
2.ASF阴性对照血清：采集75日龄健康猪血液，分离血清，分装后-20℃保存，作为检测用ASF阴性对照血清。
实施例3ASFV抗体的双抗原夹心ELISA方法的建立
1.ELISA反应条件的优化：将重组蛋白p54-30-His以不同的浓度包被酶标板，以不同种类的封闭液进行封闭(包括5％脱脂乳、2％BSA、5％小牛血清、5％明胶等)，不同稀释倍数的p54-30抗血清及阴性对照血清，不同浓度的GST-p54-30反应液进行组合反应，同时对反应时间进行优化，最终确定：0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释重组蛋白p54-30-His为8μg/mL 37℃包被酶标板2h、5％小牛血清37℃封闭45min、血清稀释5倍37℃反应45min、1μg/mL的GST-p54-30反应45min、TMB底物溶液反应15min效果最佳。
2.ELISA临界值及实验成立条件的确定：根据上述优化的反应条件，对200份ASFV阴性血清进行检测，450nm波长下读取每个孔样品的吸光值(OD450)，并计算出读值的平均值和标准差SD，以/>为临界值，最终确定该ELISA方法的临界值为0.091。ASFV阳性对照血清、ASFV阴性对照血清分别用上述方法重复10次，计算出每次读值的平均值/>和标准差，以/>值和/>值作为阳性和阴性对照血清成立的条件临界值，结果显示阳性对照血清OD450需≥1.510，阴性对照血清OD450需≤0.087。
实施例4ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒的制备
1.抗体检测酶标板：试剂盒内包含2块处理过的96孔酶标板(铝箔袋包装)，酶标板处理过程如下：用0.05M碳酸盐缓冲液(pH9.6)稀释重组蛋白p54-30-His至终浓度1μg/mL，96孔板每孔加入100μL，37℃孵育2h，用洗涤液PBST(0.01MPBS，0.5‰Tween-20，0.01％Proclin300，pH7.4)洗涤2遍后，每孔加入封闭液(0.01M PBS，5％小牛血清，0.01％Proclin300，pH7.6)37℃封闭1h，再用洗涤液PBST洗涤3遍，吸水纸上拍去残留水分，超净工作台内风干，将酶标板和干燥剂装入铝箔袋(1块酶标板/袋)，抽真空密封，4℃保存。
2.稀释液：含0.01％Proclin300的5％小牛血清30mL，具体制备方法为：将5mL小牛血清、10μLProclin300完全溶解于PBST中，最终体积定容至100mL，0.22μm滤器过滤除菌，取30mL装入灭菌瓶，4℃保存；
3.反应液：用稀释液将重组蛋白GST-p54-30稀释至1μg/mL，0.22μm滤器过滤除菌，装入25mL灭菌瓶，4℃保存；
4.酶标抗体：HRP标记的小鼠源抗GST单克隆抗体10μL，-20℃保存；
5.ASFV阳性对照血清、ASF阴性对照血清：各1mL，-20℃保存；
6.10×洗涤液：10倍浓缩的PBST 30mL，具体将制备方法为：NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4 14.4g，KH2PO4 2.4g，Tween-20 0.5mL，Proclin300 0.1mL，溶于800mL蒸馏水，调pH7.4，定容至1L，0.22μm滤器过滤除菌，取30mL装入灭菌瓶，4℃保存；
7.TMB底物溶液：TMB底物溶液25mL，4℃保存；
8.终止液：2M H2SO4 15mL，室温保存。
将上述组无菌分装瓶并组装，得到双抗原夹心ELISA试剂盒。
实施例5ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒的使用
1.从试剂盒中取出酶标板，平衡至室温(16-26℃)，避免阳光直射。
2.用稀释液稀释待检血清、ASFV抗体阳性和阴性对照血清，稀释倍数为5倍，分别加样至酶标板对应孔内，100μL/孔，37℃作用45min；
3.1×洗涤液洗涤酶标板，200μL/孔×3次，3min/次，吸水纸上拍干孔中液体；
4.加入反应液100μL/每孔，37℃作用45min；
5.加入1∶10000稀释的酶标抗体，100μL/孔，37℃作用45min；
6.1×洗涤液洗涤酶标板，200μL/孔×3次，3min/次，吸水纸上拍干孔中液体；
7.加入TMB底物溶液，100μL/孔，室温下避光静置15min；
8.加入终止液终止反应，50μL/孔；
9.酶标仪读取每孔450nm波长吸光值(OD450)；
10.在符合ASFV阳性血清对照孔OD450≥1.510，ASFV阳性血清对照孔OD450≤0.087前提条件下，待检血清样品OD450＞0.091，判定为ASFV抗体阳性；OD450≤0.091，判定为ASFV抗体抗体阴性。
实施例6ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒特异性试验
用制备的检测ASFV抗体双抗原夹心ELISA试剂盒对常见猪病毒性疾病的阳性血清进行检测，包括猪细小病毒(PPV)阳性血清、猪***病毒(FMDV)阳性血清、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)阳性血清、猪圆环病毒2型(PCV2)阳性血清、猪伪狂犬病病毒(PRV)阳性血清，确定该试剂盒是否与上述血清有交叉反应，结果显示，上述样品检测均为阴性(表1)。
表1 试剂盒特异性检测结果
实施例7ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒的临床应用
用本发明的ASFV抗体ELISA试剂盒检测456份临床血清样品，其中12份ASFV抗体阳性血清，444份ASFV抗体阴性血清。结果显示12份ASFV抗体阳性血清检测结果均阳性，抗体阳性检测准确率为100％；444份ASFV抗体阴性血清中，425份检测结果为阴性，抗体阴性检测准确率为95.7％；总体检测符合率为95.8％。
实施例8ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒的批內、批间重复性试验
1.批內重复性试验：随机抽取同批次3块酶标板在室温平衡30min，按照建立的双抗原夹心ELISA方法对20份ASFV抗体阴性猪血清、9份ASFV抗体阳性血清进行检测，根据OD450值计算批内变异系数(CV)，结果显示CV≤7.18％(表2)。
表2 ASFV抗体ELISA检测试剂盒批内重复试验结果
2.批间重复性试验：随机抽取不同批次酶标板各1块，室温平衡30min，按照建立的双抗原夹心ELISA方法对20份ASFV抗体阴性猪血清、9份ASFV抗体阳性血清进行检测，根据OD450值计算批间变异系数，结果显示CV≤6.56％(表3)。
表3 ASFV抗体ELISA检测试剂盒批间重复试验结果
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。
Claims (6)
1. 一种检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒，其特征在于，包括酶标板、HRP标记的抗GST酶标抗体、ASF阳性对照血清、ASF阴性对照血清、稀释液、反应液、10×洗涤液、TMB底物溶液和终止液；所述的试剂盒中包被酶标板的抗原为携带His标签的ASFV p54、p30融合蛋白，命名为重组蛋白p54-30-His；所述反应液包括携带GST标签的ASFV p54、p30融合蛋白，命名为重组蛋白GST-p54-30；编码ASFV p54、p30融合蛋白的基因序列如SEQ ID No.1所示。
2.如权利要求1所述的一种检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述的重组蛋白p54-30-His为利用装载有所述的重组蛋白的质粒pET-30a（+）在BL21(DE3)大肠杆菌中表达、纯化获得；所述重组蛋白GST-p54-30为利用装载有所述的重组蛋白的质粒pGEX-6P-1在BL21(DE3)大肠杆菌中表达、纯化获得。
3.如权利要求1所述的一种检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒，其特征在于，所述的HRP标记的抗GST酶标抗体为HRP标记的小鼠源抗GST单克隆抗体；所述的ASF阳性对照血清为重组p54、p30融合蛋白免疫猪制备的血清；所述的ASF阴性对照血清为健康猪血清。
4.如权利要求1所述的一种检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒，其特征在于，
所述稀释液为含0.01%Proclin300的5%小牛血清；
所述10×洗涤液为：NaCl 80g，KCl 2g，Na2HPO4 14.4g，KH2PO4 2.4g，Tween-20 0.5mL，Proclin300 0.1 mL，溶于800mL蒸馏水，调pH7.4，定容至1L，0.22µm滤器过滤除菌，4℃保存；
所述终止液为2M H2SO4。
5.权利要求1~4中任意一项所述的检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：
重组蛋白p54-30-His、GST-p54-30制备；
ASF阳性对照血清、ASF阴性对照血清的制备；
检测ASFV抗体的双抗原夹心ELISA试剂盒的制备。
6.权利要求1所述的试剂盒在制备非洲猪瘟病毒抗体检测的试剂中的应用。
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