CN115927607A - 生物标志物在胃癌诊断中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种生物标志物在胃癌诊断中的应用。具体该标志物为IRF4基因区域甲基化。本发明首次发现IRF4基因区域1～24在胃癌样本中的甲基化水平显著高于正常样本，能够用于胃癌诊断，可用作胃癌标志物。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学领域，具体而言，涉及一种生物标志物在胃癌诊断中的应用。
背景技术
在世界范围内，胃癌是致死率排名居高不下的恶性肿瘤。胃癌患者的预后与其被诊断时的分病理期有关，发现的越早，预后越好，在胃癌早筛项目的推广和实施较为完善的国家，胃癌患者的5年生存率可以超过70％。早期的胃癌被定义为局限于粘膜或粘膜下层的癌症，无论是否存在***转移，但由于胃癌的非特异性症状以及在门诊环境中难以区分早期胃癌与良性消化性溃疡和胃炎，在全球范围内，只有很少的胃癌在早期可以得到诊断。
内窥镜因其准确性高而被广泛用于胃癌的早期诊断，但其准确性取决于内窥镜医师的观察能力，内窥镜漏诊胃癌的现象很常见，假阴性率在5％-19％之间。另外，内镜检查为侵入性的，且有可能需要使用麻醉剂，操作复杂，因此，除了技术改进外，迫切需要用于早期诊断的新型生物标志物。
胃癌的发生涉及多基因、多因素的综合作用，其中，一些基因的甲基化水平异常在其中发挥着重要作用，基因甲基化水平异常是癌症发生的早期事件，因此可用来用作早期胃癌检测靶标，尽管现有技术已经报道了一些胃癌相关的甲基化标记物，但目前仍缺少检测灵敏度和特异性均较高的，可用于无创检测的标记物。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种用于检测IRF4基因部分区域1～24中至少一种的甲基化水平的试剂在制备胃癌诊断试剂盒中的应用；
所述部分区域包括：
a)所述区域1～24，依次为Chr6:391205-391320正链、Chr6:391400-391488正链、Chr6:391469-391563正链、Chr6:391584-391703正链、Chr6:391890-392026正链、Chr6:392075-392186正链、Chr6:392462-392580正链、Chr6:392610-392744正链、Chr6:392786-392913正链、Chr6:393095-393220正链、Chr6:393302-393530正链、Chr6:393600-393788正链、Chr6:393788-393652负链、Chr6:393596-393416负链、Chr6:393380-393240负链、Chr6:393222-393091负链、Chr6:393075-392956负链、Chr6:392906-392801负链、Chr6:392646-392505负链、Chr6:392478-392329负链、Chr6:392219-391988负链、Chr6:391891-391703负链、Chr6:391653-391501负链、Chr6:391478-391283负链所示序列；或
b)包含a)区域1～24中的甲基化位点的其他区域。
本发明的第二目的在于提供一种用于检测上述IRF4基因区域1～24中至少一种的甲基化水平的引物和探针组合产品以及试剂盒。
本发明首次发现IRF4基因区域1～24在胃癌样本中的甲基化水平显著高于正常样本，能够用于胃癌诊断，可用作胃癌标志物。
附图说明
为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明一个实施例中区域1-6区分胃癌血浆样本和正常样本的ROC曲线图；
图2为本发明一个实施例中区域7-12区分胃癌血浆样本和正常样本的ROC曲线图；
图3为本发明一个实施例中区域13-18区分胃癌血浆样本和正常样本的ROC曲线图；
图4为本发明一个实施例中区域19-24区分胃癌血浆样本和正常样本的ROC曲线图。
具体实施方式
现将详细地提供本发明实施方式的参考，其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上，对本领域技术人员而言，显而易见的是，可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。
除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。
本发明中用端点表示的数值范围包括该范围内所包含的所有数值及分数，以及所引述的端点。
本发明涉及用于检测IRF4基因部分区域1～24中至少一种的甲基化水平的试剂在制备胃癌诊断试剂盒中的应用；
所述部分区域包括：
a)所述区域1～24，依次为Chr6:391205-391320正链、Chr6:391400-391488正链、Chr6:391469-391563正链、Chr6:391584-391703正链、Chr6:391890-392026正链、Chr6:392075-392186正链、Chr6:392462-392580正链、Chr6:392610-392744正链、Chr6:392786-392913正链、Chr6:393095-393220正链、Chr6:393302-393530正链、Chr6:393600-393788正链、Chr6:393788-393652负链、Chr6:393596-393416负链、Chr6:393380-393240负链、Chr6:393222-393091负链、Chr6:393075-392956负链、Chr6:392906-392801负链、Chr6:392646-392505负链、Chr6:392478-392329负链、Chr6:392219-391988负链、Chr6:391891-391703负链、Chr6:391653-391501负链、Chr6:391478-391283负链所示序列；或
b)包含a)区域1～24中的甲基化位点的其他区域。
术语“甲基化水平”与一般理解相同，指的是一段DNA序列中一个或多个CpG二核苷酸中的胞嘧啶是否发生甲基化、或发生甲基化的频率/比例/百分数，既代表定性的概念，又代表定量的概念。举例来说，如果核酸序列内的胞嘧啶(C)残基为甲基化的，则可将其称为“高甲基化的”或具有“增加的甲基化”在实际应用中，可根据实际情况采用不同的检测指标比较DNA甲基化水平，如在一些情况下，可根据样本检测的Ct值进行比较，在一些情况下，可计算出样本中标记物的甲基化比例，即甲基化分子数/(甲基化分子数+非甲基化分子数)×100，然后再进行比较，在一些情况下，还需要对各个指标进行统计学上的分析整合，得出最终的判定指标。
在本发明中，“CpG岛区域甲基化水平”指的是CpG岛内一个或多个CpG二核苷酸中胞嘧啶的甲基化水平。“甲基化位点”指的是区域中至少一个CpG二核苷酸位点，尤其指区域中至少一个CpG二核苷酸位点中的胞嘧啶。
在本发明中，IRF4基因区域1～24根据参考基因组GRCh38.p13进行定位；但应当理解，上述区域的序列虽然来自于人，但本发明所提供的这些区域所针对的受试者并不局限于人，其可以为任何温血动物，诸如哺乳类，像是灵长类，且较佳地是人类。非人类的灵长类也是个体。用语个体包括驯养动物，诸如猫、狗等，家畜(举例来说，牛、马、猪、绵羊、山羊等)以及实验动物(举例来说，小鼠、兔、大鼠、沙鼠、豚鼠等)。
此外容易理解，区域1～24或其组合相对应的变化的区域(即b中限定的区域)也在本申请的保护范围内，变化的区域可适当延长或缩短(特别是延长)若干个核酸，只要包含上述示例区域中的甲基化位点即可，以区域1为例，其甲基化位点包括Chr6:391206、Chr6:391208、Chr6:391225、Chr6:391240、Chr6:391252、Chr6:391297、Chr6:391304和Chr6:391316位置上胞嘧啶中的至少一个。
在本发明中，“诊断”此术语包括辅助诊断、复发风险评估、癌变风险和癌变程度的评估、预后判断等方面。
本发明中，术语“预后”具有本领域技术人员知悉的含义。在本发明的一个实施方案中，预后是指生存概率(PFS)。其中，如果对象是一个群体(2个或2个以上患者)，预后可以是指中位生存概率或平均生存概率。
在一些实施方式中，所述试剂通过如下方法中的一种或几种实现对目标区域的检测：
甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。
在一些实施方式中，所述试剂包括引物和探针组合产品，所述区域1～24所对应的引物和探针组合依次如SEQ ID NO：1～3、SEQ ID NO：4～6、SEQ ID NO：7～9、SEQ ID NO：10～12、SEQ ID NO：13～15、SEQ ID NO：16～18、SEQ ID NO：19～21、SEQ ID NO：22～24、SEQID NO：25～27、SEQ ID NO：28～30、SEQ ID NO：31～33、SEQ ID NO：34～36、SEQ ID NO：37～39、SEQ ID NO：40～42、SEQ ID NO：43～45、SEQ ID NO：46～48、SEQ ID NO：49～51、SEQID NO：52～54、SEQ ID NO：55～57、SEQ ID NO：58～60、SEQ ID NO：61～63、SEQ ID NO：64～66、SEQ ID NO：67～69、SEQ ID NO：70～72所示。
另外，需要说明的是，在一个方面，有用的引物和探针包括与SEQ ID NO：1～72所示的引物或探针具有大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的核苷酸序列。还考虑了这样的引物和探针修饰并且可根据标准技术制备。
术语“％同一性”在两个或更多个核苷酸序列或氨基酸序列的上下文中，指的是相同或具有特定百分比的相同氨基酸残基或核苷酸的两个或多个序列或子序列，当比较和比对以用于最大对应时，如使用以下序列比较算法之一或通过目视检查来测量的。例如，％同一性是相对于要比较的序列的编码区域的整个长度。
对于序列比较，通常一个序列用作参考序列，测试序列与该序列进行比较。当使用序列比较算法时，测试序列和参考序列被输入到计算机中，如果需要，指定子序列坐标，并且指定序列算法程序参数。然后，序列比较算法根据指定的程序参数计算测试序列相对于参考序列的百分比序列同一性。可使用搜索算法例如BLAST和PSI-BLAST(Altschul etal.,1990、J Mol Biol 215:3,403-410；Altschul et al.,1997,Nucleic Acids Res25:17,3389-402)确定百分比同一性。
引物和探针修饰可以采用公知的方法。这些引物和/或探针序列的修饰版本可包括，通过非限制性例子，将一个或多个核苷酸添加到5’端，将一个或多个核苷酸添加到3’端，将一个或多个核苷酸添加到5’端和3’端，添加尾部，缩短序列，延长序列，将序列上下游移动几个碱基，或其任何组合。
碱基修饰例如3'P、5'P、5-硝基吲哚、2-氨基嘌呤、8-氨基-2'-脱氧腺苷、C-5丙炔基-脱氧胞苷、C-5丙炔基-脱氧尿苷、2-氨基-2'-脱氧腺苷-5'-三磷酸、2,6-二氨基嘌呤(2-氨基-dA)、反向dT、反向二脱氧-T、羟甲基dC、异-dC、5-甲基dC、氨基乙基-吩噁嗪-脱氧胞苷，和锁核酸(LNA’s)，并包括在碱基之一处的至少一个错配碱基，或者替换其中至少一个碱基为RNA碱基，以实现例如增加突变体特异性引物3’端的核酸相互作用，以增加Tm。双链稳定碱基修饰的加入对PCR有积极的影响，从而使其能够在较高的温度下进行，在此范围内已知Taq聚合酶显示出最大的活性。修饰后的探针应当保留区分待检测突变位点和野生型位点的能力。
在一些实施方式中，所述试剂还包括检测内参核酸的引物和探针。
内参基因可以选用本领域技术人员熟知的持家基因，例如Actin、Tubulin、GAPDH；内参基因在正常细胞和癌组织细胞中均存在，且不存在序列差异性，因此能够更好的检测样本，以及反映样本中目标基因的甲基化比例。
在一些实施方式中，所述内参核酸为β-Actin基因或其片段。
在一些实施方式中，所述探针均为自身淬灭探针。
在一些实施方式中，各探针的荧光发射基团独立地选自AMCA、Pacific Blue、Atto425、BODIPY FL、FAM、Alexa Fluor 488、TET、JOE、Yakima Yellow、VIC、HEX、Quasar 570、Cy3、NED、TAMRA、ROX、Aqua Phluor593、Texas Red、Atto 590、Cy5、Quasar 670、Cy5.5以及Cy5.5中的任一种。
在一些实施方式中，各探针的淬灭基团独立地选自BHQ1、BHQ2、BHQ3、Dabcyl、Eclipse以及MGB中的任一种。
在一些实施方式中，所述试剂还包括DNA提取试剂、扩增缓冲液、dNTP、Mg2+、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照、水以及亚硫酸盐定序试剂中的至少一种。
在一些实施方式中，所述试剂用于检测IRF4基因区域10、11、12、21和22中至少一种的甲基化水平。
在一些实施方式中，所述胃癌是III期或IV期胃癌样本。
根据本发明的再一方面，还涉及如上所定义的引物和探针组合产品。
根据本发明的再一方面，还涉及试剂盒，其包含如上所定义的试剂。
术语“试剂盒”是指包括至少一个设备的任何制品(例如，包装或容器)，试剂盒可进一步包括在本文中描述的方法或其步骤中使用的使用说明书、补充试剂和/或组分或组件。
本发明还涉及一种胃癌检测方法，包括检测受试者样本中所述区域1～24中至少一种的甲基化水平。
在一些实施方式，所述受试者样本可以来自血液(全血，优选外周血)、血浆、细胞培养上清、粪便、唾液、***、肺泡灌洗液、羊水、绒毛、组织或组织裂解液、骨骼或毛发。
本文使用的“组织或组织裂解液”也可与“裂解物”、“裂解的样品”、“组织或细胞提取物”等用语通用，表示包含裂解的组织或细胞的样品和/或生物样品材料，即其中组织或细胞的结构完整性已经被破坏。为了释放细胞或组织样品的内容物，通常用酶和/或化学试剂处理所述材料，以溶解、降解或破坏这样的组织或细胞的细胞壁和细胞膜。熟练的技术员非常熟悉用于得到裂解物的适当方法。该过程被术语“裂解”包括。优选的组织是肺部组织，更优选是来自肺部的癌组织或癌旁组织。
本领域技术人员均知晓诊断的理想场景是这样的情形，其中单一事件或过程会造成各种疾病，尤其当疾病的病因学不能完全理解时，如在许多癌症类型的情况下，或者本申请所述的胃癌。如熟练的技术人员将明白的，对于给定的多因子病，没有生化标志物的诊断是100％特异性且100％灵敏度，但本领域技术人员有能力综合使用多种疾病标志物、或检测方法联合使用以增加检测的准确性。
确定受试者和健康群体/良性肿瘤对照组/受试者的初始状态(baseline)相比，是否具有显著性的差异可用本领域公知的统计学方法进行，并使用置信区间和/或p值进行确认。在一些实施方案中，置信区间可以为90％、95％、97.5％、98％、99％、99.5％、99.9％或99.99％并且p值可以为0.1、0.05、0.025、0.02、0.01、0.005、0.001或0.0001。
下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
实施例1
本实施例提供一种胃癌诊断的方法。
本实施例提供用于胃癌诊断或辅助诊断的核苷酸组合，其检测的区域及所对应的引物和探针如表1所示。
表1
IRF4基因上各区域的信息如下：
区域1(Chr6:391205-391320)正链碱基序列如下(5’-3’)：
CCGCGGAGAGGCAGGGTTCCCGGTGATGGCCTTGCCGAGGGTGCTCCCGCAACCTCCACCTCCAGTTCTCTTTGGACCATTCCTCCGTCTTCCGTTACACGCTCTGCAAAGCGAAG。
SEQ ID NO：1-3所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr6:391206、Chr6:391208、Chr6:391225、Chr6:391240、Chr6:391252、Chr6:391297、Chr6:391304和Chr6:391316位置上胞嘧啶的甲基化。
区域2(Chr6:391400-391488)正链碱基序列如下(5’-3’)：
TGGCCTCCTGAGGTCCTGGCGCAAAGGCGAGATTCGCATTTCGCACCTCGCCCTTCGCGGGAAACGGCCCCAGTGACAGTCCCCGAAGC。
SEQ ID NO：4-6所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr6:391419、Chr6:391427、Chr6:391434、Chr6:391441、Chr6:391448、Chr6:391464、Chr6:391483和Chr6:391488位置上胞嘧啶的甲基化。
区域3(Chr6:391469-391563)正链碱基序列如下(5’-3’)：
CCAGTGACAGTCCCCGAAGCGGCGCGCGCCCGGCTGGAGGTGCGCTCTCCGGGCGCGGCGCGCGGAGGGTCGCCAAGGGCGCGGGAACCCCACCC。
SEQ ID NO：7-9所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr6:391483、Chr6:391488、Chr6:391491、Chr6:391493、Chr6:391499、Chr6:391511、Chr6:391518、Chr6:391539、Chr6:391548和Chr6:391550位置上胞嘧啶的甲基化。
区域4(Chr6:391584-391703)正链碱基序列如下(5’-3’)：
CTTCACGCCGGCCCTGAGGCTCGCCCGCCCGGCCGGCCCCGGCTCTCGGCTTGCAAAGTCCCTCTCCCCAGTCCAACCCCCGGCCCCCACAGGCCTCGGCGCCCCGCCCCGCCCCAGGCC。
SEQ ID NO：10-12所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr6:391589、Chr6:391592、Chr6:391605、Chr6:391613、Chr6:391617、Chr6:391623、Chr6:391630、Chr6:391683、Chr6:391688和Chr6:391693位置上胞嘧啶的甲基化。
区域5(Chr6:391890-392026)正链碱基序列如下(5’-3’)：
TCCAGGGCAGCGCAGGGTACCCCGGCTTCGGAGCGGGAAGGGAGCGCGCCCCGTCCTGGAGCTCCGACTCCCACCCCATCTGCGCTGAGCCGGAGGCGCTGGTTTGGGCTCCAAGGCCCGCCTCCTTGGCTCTGCCC。
SEQ ID NO：13-15所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr6:391900、Chr6:391912、Chr6:391934、Chr6:391936、Chr6:391941、Chr6:391954、Chr6:392008和Chr6:392026位置上胞嘧啶的甲基化。
区域6(Chr6:392075-392186)正链碱基序列如下(5’-3’)：
CTGGACGGGATGAGCTAACCGGACTGTCGGGGCCCCAGGAGTGGCTGAGGCGGGGCCGTCCAAGGCACCCACACAAGACGGCACAACTGCCTGCGAGAAACAGGCCCGGCCC。
SEQ ID NO：16-18所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr6:392080、Chr6:392094、Chr6:392125、Chr6:392131、Chr6:392168和Chr6:392181位置上胞嘧啶的甲基化。
区域7(Chr6:392462-392580)正链碱基序列如下(5’-3’)：
CCGTACTGGGGCTGCAGCCCCCGCGTCTGCGCCACTTGTCGTTTGCAGAGCCCACTTAGTGCGCGCTAGCTGGGCAGGGATAGGGGTCCTATTCGGGGCGAAGGGTCTGGATGCGAGCA。
SEQ ID NO：19-21所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr6:392463、Chr6:392483、Chr6:392523、Chr6:392525和Chr6:392575位置上胞嘧啶的甲基化。
区域8(Chr6:392610-392744)正链碱基序列如下(5’-3’)：
CTGCGCCCCTGGAACGCCCGGCCGCAGGCGAGGTCCTCCGCGCGTGGAGGCCGCCAGGGGAGTGGAAACTGACAGAGTCGCGGGGAAGGGGCGAGAAGCGGGTTGGGAGTGAGCGAAGGCAAGCGAGAGCTGCGA。
SEQ ID NO：22-24所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr6:392613、Chr6:392624、Chr6:392628、Chr6:392648、Chr6:392650、Chr6:392652、Chr6:392661、Chr6:392733和Chr6:392742位置上胞嘧啶的甲基化。
区域9(Chr6:392786-392913)正链碱基序列如下(5’-3’)：
GGGAGAGAGGGTGCAAGACGAGCGGCGCGTGTCGGGAGCCTTTGGGCTGCGGGTGCGTTACAGGAGAGCAGGCGGGTAGGAGCCTTCGCGGGGGCCGAGCTCGGAAGGCGGACGGCTGTGCCCGCCCA。
SEQ ID NO：25-27所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr6:392804、Chr6:392835、Chr6:392841、Chr6:392894、Chr6:392898和Chr6:392908位置上胞嘧啶的甲基化。
区域10(Chr6:393095-393220)正链碱基序列如下(5’-3’)：
CAGTGCAGAGCAGAGCGGGCGGAGGACCCCGGGCGCGGGCGCGGACGGCACGCGGGGCATGAACCTGGAGGGCGGCGGCCGAGGCGGAGAGTTCGGCATGAGCGCGGTGAGCTGCGGCAACGGGAA。
SEQ ID NO：28-30所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr6:393110、Chr6:393114、Chr6:393140、Chr6:393145、Chr6:393147、Chr6:393209和Chr6:393215位置上胞嘧啶的甲基化。
区域11(Chr6:393302-393530)正链碱基序列如下(5’-3’)：
CCGCATCCCCTGGAAGCACGCGGGCAAGCAGGACTACAACCGCGAGGAGGACGCCGCGCTCTTCAAGGTCTCCGGCCTCGGGAGCCGGCGGGGGCGCGCCGGGGAGGGCCCAGAGACAGAGCCCGGGGTCCCCGGCGCCGCCTCCGAGGCGAGCCCAGGGGACCGCGCGGGGCGGACGGGCGGGCGGCGGAGGCATCAGGTGGCGTCGCCGGAGCCGCAGGAGGAGGAA。
SEQ ID NO：31-33所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr6:393303、Chr6:393320、Chr6:393322、Chr6:393342、Chr6:393344、Chr6:393353、Chr6:393511和Chr6:393517位置上胞嘧啶的甲基化。
区域12(Chr6:393600-393788)正链碱基序列如下(5’-3’)：
GAAACCGCTGAAGGCCCGGCCGGGCCCGGGGAAGGGCGGCCAAAGGCTTGAGGGGTTTTGCGCGTTCGTCCGTGCGTTCTCGTTTCCACGCAAGCCTCCCGCCCTTCCTCCGGGCTCCCGTCTGCCGCCTCCGTCCGTGGGTCCCCCTCGCCCTCTCCGTGCGTCCGCGCCTGTGCCGGCGGCTGTTTT。
SEQ ID NO：34-36所示的核苷酸可检测位于该区域正链上Chr6:393605、Chr6:393616、Chr6:393620、Chr6:393660、Chr6:393662、Chr6:393776和Chr6:393779位置上胞嘧啶的甲基化。
区域13(Chr6:393788-393652)负链碱基序列如下(5’-3’)：
AAAACAGCCGCCGGCACAGGCGCGGACGCACGGAGAGGGCGAGGGGGACCCACGGACGGAGGCGGCAGACGGGAGCCCGGAGGAAGGGCGGGAGGCTTGCGTGGAAACGAGAACGCACGGACGAACGCGCAAAACCC。
SEQ ID NO：37-39所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr6:393661、Chr6:393663、Chr6:393667、Chr6:393671、Chr6:393736、Chr6:393749、Chr6:393768、Chr6:393777和Chr6:393780位置上胞嘧啶的甲基化。
区域14(Chr6:393596-393416)负链碱基序列如下(5’-3’)：
GCAGCCTCCACGCGCCCAGGACCCGGCTCCCGGCCCCCGCGGTCCCGCTGAGAGCCGAGGCCTCCTTTCCTCCTCCTGCGGCTCCGGCGACGCCACCTGATGCCTCCGCCGCCCGCCCGTCCGCCCCGCGCGGTCCCCTGGGCTCGCCTCGGAGGCGGCGCCGGGGACCCCGGGCTCTGTC。
SEQ ID NO：40-42所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr6:393426、Chr6:393435、Chr6:393483、Chr6:393487、Chr6:393490、Chr6:393506、Chr6:393573、Chr6:393584和Chr6:393586位置上胞嘧啶的甲基化。
区域15(Chr6:393380-393240)负链碱基序列如下(5’-3’)：
GAGGCCGGAGACCTTGAAGAGCGCGGCGTCCTCCTCGCGGTTGTAGTCCTGCTTGCCCGCGTGCTTCCAGGGGATGCGGAAGATGCTCTTCTCCTCGTTCTCCCACACCAGCCCGGGGTACTTGCCGCTGTCGATCTGGTC。
SEQ ID NO：43-45所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr6:393240、Chr6:393249、Chr6:393255、Chr6:393323、Chr6:393343、Chr6:393345、Chr6:393359和Chr6:393375位置上胞嘧啶的甲基化。
区域16(Chr6:393222-393091)负链碱基序列如下(5’-3’)：
GCTTCCCGTTGCCGCAGCTCACCGCGCTCATGCCGAACTCTCCGCCTCGGCCGCCGCCCTCCAGGTTCATGCCCCGCGTGCCGTCCGCGCCCGCGCCCGGGGTCCTCCGCCCGCTCTGCTCTGCACTGCGGG。
SEQ ID NO：46-48所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr6:393094、Chr6:393111、Chr6:393141、Chr6:393146、Chr6:393148、Chr6:393198、Chr6:393200、Chr6:393210和Chr6:393216位置上胞嘧啶的甲基化。
区域17(Chr6:393075-392956)负链碱基序列如下(5’-3’)：
TCAGCCACGAGGCACCGCACTCCGGGCACCCCGCCCCGATCCCCTGCGCCAGTGACCACGAGGCCCCGGAGTCTTTGAGGCTGCGAAGCGCGCGCGTGCCGTGTCAGGGTCGTCCGGGCC。
SEQ ID NO：49-51所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr6:392961、Chr6:392965、Chr6:393009、Chr6:393017、Chr6:393029、Chr6:393053、Chr6:393060和Chr6:393068位置上胞嘧啶的甲基化。
区域18(Chr6:392906-392801)负链碱基序列如下(5’-3’)：
GCACAGCCGTCCGCCTTCCGAGCTCGGCCCCCGCGAAGGCTCCTACCCGCCTGCTCTCCTGTAACGCACCCGCAGCCCAAAGGCTCCCGACACGCGCCGCTCGTCT。
SEQ ID NO：52-54所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr6:392805、Chr6:392809、Chr6:392812、Chr6:392814、Chr6:392819、Chr6:392859、Chr6:392873、Chr6:392875、Chr6:392882、Chr6:392888、Chr6:392895和Chr6:392899位置上胞嘧啶的甲基化。
区域19(Chr6:392646-392505)负链碱基序列如下(5’-3’)：
AGGACCTCGCCTGCGGCCGGGCGTTCCAGGGGCGCAGCCCCGGGTTCCTCCACCCTCCGCTTTCTCTGCTCGCATCCAGACCCTTCGCCCCGAATAGGACCCCTATCCCTGCCCAGCTAGCGCGCACTAAGTGGGCTCTGCA。
SEQ ID NO：55-57所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr6:392524、Chr6:392526、Chr6:392606、Chr6:392614、Chr6:392629、Chr6:392633和Chr6:392639位置上胞嘧啶的甲基化。
区域20(Chr6:392478-392329)负链碱基序列如下(5’-3’)：
CTGCAGCCCCAGTACGGGGGATTCCGCGCGCAGAGCGTCCGCCGGACCCCGGAGCAGGCCCGGGAGAGCGGAGGCGGGGAGGGCGCGGGAGAGGGCGACGACAGCTGCGGAGCCTGGGAGGCAGGGACCGCGCCAGGCCGGCTAGGCCAC。
SEQ ID NO：58-60所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr6:392340、Chr6:392348、Chr6:392350、Chr6:392429、Chr6:392436、Chr6:392439、Chr6:392443、Chr6:392454和Chr6:392464位置上胞嘧啶的甲基化。
区域21(Chr6:392219-391988)负链碱基序列如下(5’-3’)：
AGCAGGGGAAGGAGCCTCGGATTGGGGTCCACAGGGCCGGGCCTGTTTCTCGCAGGCAGTTGTGCCGTCTTGTGTGGGTGCCTTGGACGGCCCCGCCTCAGCCACTCCTGGGGCCCCGACAGTCCGGTTAGCTCATCCCGTCCAGCTTGTGGCGACCCCGTCGCAGGAGCGCGGAGGGCAGGCGGGGAGGCTCGGGCAGAGCCAAGGAGGCGGGCCTTGGAGCCCAAACCAG。
SEQ ID NO：61-63所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr6:392009、Chr6:392169、Chr6:392182和Chr6:392202位置上胞嘧啶的甲基化。
区域22(Chr6:391891-391703)负链碱基序列如下(5’-3’)：
GAGGTCGAACCTCTGGTTCGCGCTCCGGGTCCTCTCTGGTATCAGCCTCACACCCCTCCTCCTGCCCGACTCCAGCCCTTACCTCGCCCTGGACTCGGAGCTGAGGGCAGCGGTGGGTCCCAAGATCGAGCGGTGAAACTGAGAGTGCGAGGTGGGAAAGAGGAACTTTATAGAACTCTCTGGGGCGGG。
SEQ ID NO：64-66所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr6391706、chr6391796、chr6391807、chr6391871、chr6391873和chr6391886位置上胞嘧啶的甲基化。
区域23(Chr6:391653-391501)负链碱基序列如下(5’-3’)：
TGGGGAGAGGGACTTTGCAAGCCGAGAGCCGGGGCCGGCCGGGCGGGCGAGCCTCAGGGCCGGCGTGAAGGCTGGGGGCTGCCGCGGCCGGGGTGGGGTTCCCGCGCCCTTGGCGACCCTCCGCGCGCCGCGCCCGGAGAGCGCACCTCCAGC。
SEQ ID NO：67-69所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr6:391512、Chr6:391519、Chr6:391523、Chr6:391590、Chr6:391593和Chr6:391631位置上胞嘧啶的甲基化。
区域24(Chr6:391478-391283)负链碱基序列如下(5’-3’)：
CTGTCACTGGGGCCGTTTCCCGCGAAGGGCGAGGTGCGAAATGCGAATCTCGCCTTTGCGCCAGGACCTCAGGAGGCCAGTCAATCACTAAACTGCAGCGATGTGGCCAGGGCGGGAAATGGGGGGCGTGTAGTAGCGGGAATCTGGTGCGAAGGGGACTTCGCTTTGCAGAGCGTGTAACGGAAGACGGAGGAAT。
SEQ ID NO：70-72所示的核苷酸可检测位于该区域负链上Chr6:391291、Chr6:391298、Chr6:391420、Chr6:391428、Chr6:391435、Chr6:391458和Chr6:391465位置上胞嘧啶的甲基化。
检测方法包括如下步骤：
1、DNA模板的提取：
当所用样本是组织样本时，采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取基因组，具体操作参见试剂盒说明书。
当所用样本是粪便样本时，采用武汉艾米森生命科技有限公司核酸提取试剂盒(鄂汉械备20200225号)提取粪便中的人源IRF4基因，该试剂盒采用捕获探针对粪便中的目的片段进行捕获，捕获探针上标记有生物素，将10μM的不同区域的探针和10mg/mL的链霉亲和素磁珠等比混合，形成捕获剂。正链区域和负链区域分开进行捕获提取，即提取正链基因组时加入正链捕获探针，提取负链区域时加入负链捕获探针，使用时用表2中的捕获探针与链霉亲和素混合形成的捕获剂替代试剂盒中自带的捕获剂即可。正链和负链的捕获探针序列参见表2，具体操作步骤参见试剂盒说明书。
表2
所用样本是血液样本，采用天根生化科技(北京)有限公司的磁珠法血清/血浆游离DNA提取试剂盒(DP709)进行血浆cfDNA提取，具体操作参见试剂盒说明书。
2、亚硫酸盐的转化
将提取好的基因组进行亚硫酸氢盐转化，所用核酸转化试剂盒为武汉艾米森生命科技有限公司核酸纯化试剂(鄂汉械备20500843)，具体实验操作参见试剂盒说明书。
3、甲基化特异性PCR反应
将亚硫酸氢盐转化后的DNA进行甲基化特异性PCR反应以检测IRF4基因区域1-24的甲基化状态，每个区域单独进行检测，即一个PCR管中每次只加入一个区域的检测引物和探针，同时加入内参基因的检测探针。以ACTB(即β-actin)作为内参基因，PCR反应体系如表3所示。其中ACTB上游引物为：AAGGTGGTTGGGTGGTTGTTTTG；ACTB下游引物为：AATAACACCCCCACCCTGC；ACTB探针为：GGAGTGGTTTTTGGGTTTG。
检测目标区域的探针5’端的报告基团为FAM，3’端猝灭基团为MGB，ACTB探针5’端的报告基团为VIC，3’端猝灭基团为BHQ1。
采用Invitrogen Platinum II Taq热启动DNA聚合酶进行PCR扩增，PCR反应液配置体系如下：
表3
| 组分 | 规格 | 体积(μL) |
| Platinum II PCR缓冲液 | 5× | 5 |
| dNTPs | 各2.5mM | 3 |
| 区域上游引物 | 10μM | 0.5 |
| 区域下游引物 | 10μM | 0.5 |
| 区域探针 | 10μM | 0.5 |
| ACTB上游引物 | 10μM | 0.5 |
| ACTB下游引物 | 10μM | 0.5 |
| ACTB探针 | 10μM | 0.5 |
| Taq酶 | / | 0.5 |
| 待测样本DNA | / | 5 |
| 纯化水 | / | 补至25 |
如表3所示，在检测IRF4区域1-区域24任一区域在样本中的甲基化状态时，只需将某一区域对应的引物探针、ACTB引物探针、缓冲液、dNTP、DNA酶和样本DNA等按照表中的体积加入到反应体系中。对于粪便样本，检测区域1-12时，加入的待测样本DNA是前述提取到的正链DNA经转化而成，检测区域13-24时，加入的待检样本DNA是前述提取到的负链DNA经转化而成；对于血液样本，检测区域1-24时，加入的待检样本DNA是提取到的cfDNA经转化而成。
PCR反应条件为：
表4
Ct值读取：PCR完成后，调整基线，将一次PCR中样本最小Ct值提前1-2个循环前的荧光值设置为基线值，将阈值设置在S型扩增曲线的拐点处，得到样本各个基因的Ct值。
质量控制：在每次检测时对阴性对照和阳性对照进行同步检测。
阴性对照为纯化水。
阳性对照的制备方法为：将ACTB的扩增区域对应的经亚硫酸氢盐完全转化后的序列进行人工合成，并克隆至载体上，形成人工合成质粒。将完全甲基化的区域1-24对应的经亚硫酸氢盐转化后的序列进行人工合成，并克隆至载体，形成人工合成质粒。区域1-24的阳性对照为103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的区域1-24的人工合成质粒1：1混合而成，如区域1的阳性对照为103拷贝/微升的ACTB人工合成质粒和103拷贝/微升的区域1的人工合成质粒1：1混合而成。
阴性对照要无扩增，阳性对照要有明显的指数增长期，且阳性对照的Ct值应在26-30之间，待检样本的内参基因的Ct值应≤35，阴性对照、阳性对照及内参基因均满足上述要求后，表明本次实验有效，可进行下一步样本结果的判定。否则，当次实验无效，须重新进行检测。
结果分析和判读方法：对于组织样本和粪便样本，当某一区域的Ct值≤38时，即认为区域在该样本中被检出甲基化；对于血浆样本，用2-ΔΔCt法对胃癌样本和健康人样本进行ROC分析，记录约登指数最大时的灵敏度、特异性和AUC值，其中ΔΔCt＝(Ct待检区域-CtACTB)样本-(Ct待检区域-CtACTB)阳性对照。
实施例2
于武汉某医院收集10例胃癌患者的癌组织样本和对应的10例癌旁组织样本，所有的样本均为***固定、石蜡包埋的组织样本。10例癌组织样本中，有4例是I/II期的样本，6例为III/IV期的样本。按照实施例1所述的方法对样本进行基因组提取、亚硫酸氢盐转化、对区域1-24分别进行PCR扩增，检测每个区域在各个样本中的甲基化状态，当某一区域的PCR Ct值≤38时，视做该区域在该样本中被检出，统计每个区域在各类样本中的检出率，结果如表5所示。
表5
从表5可以看出，区域1-24对I/II期胃癌样本、III/IV期胃癌样本和癌旁样本的检出效果各异，24个区域在III/IV期胃癌样本中的检出率均高于I/II期样本。总地来说，区域10、区域11、区域12、区域21和区域22的检测效果明显优于其他区域，这几个区域在I/II期样本中的检出率均不低于75％，在III/IV期样本中的检出率均大于80％，其中区域10、区域12、区域21和区域22在III/IV期样本中的检出率均为100％。区域10、区域11、区域12、区域21和区域22在癌旁样本中的检出率不高于10％，表明其特异性不低于90％。
实施例3
于武汉某医院收集经组织活检确诊为胃癌患者血浆样本及健康人血浆样本，每人收集5mL，共收集到胃癌患者血浆样本64例(包括I/II期胃癌患者样本19例，III/IV期胃癌患者样本45例)、健康人血浆样本53例。按照实施例1提供的方法进行血浆DNA提取和重亚硫酸盐转化、选用实施例1中的针对IRF4基于24个区域的特异性引物和探针组合进行PCR检测，用PCR检测结果用2-ΔΔCt法进行ROC分析，统计每个区域对胃癌患者的灵敏度、特异性及AUC值。
表6区域1-24在血浆样本中的检测灵敏度和特异性
由表6可以看出，区域1-24均能对胃癌血浆样本和正常样本实现较好区分，但各个区域的检测效果有所不同，整体来看，区域1-24对胃癌的检测灵敏性均大于60％，特异性均大于80％。区域10、区域11、区域12、区域21和区域22检测AUC值均显著优于其他区域，在血浆样本中，检测这几个区域的甲基化水平的增加对胃癌样本的检测灵敏度均超过80％，特异性均大于90％。
实施例4
于武汉某医院收集经组织活检确诊为胃癌患者和健康人的粪便样本，每人收集一份粪便，收集装置为武汉艾米森粪便标本采集保存管(鄂汉械备20191654号)，共收集到胃癌粪便样本20例、健康人的粪便样本50例。按照实施例1提供的方法进行DNA提取提取和重亚硫酸盐转化、选用实施例1中的针对IRF4基于24个区域的特异性引物和探针组合进行PCR检测，检测每个区域在各个样本中的甲基化状态，当某一区域的PCR Ct值≤38时，视做该区域在该样本中被检出，统计每个区域在各类样本中的检出率，结果如表7所示。
表7区域1-24在粪便样本中的检测灵敏度和特异性
如表7所示，区域10、区域11、区域12、区域21和区域22在粪便样本中也能区分胃癌样本和健康人样本，当以Ct值＝38为截断值时，这五个区域对胃癌的检测灵敏度分别为55％、65％、55％、60％和60％，特异性分别为98％、96％、100％、98％和96％。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<110> 武汉艾米森生命科技有限公司
<120> 生物标志物在胃癌诊断中的应用
<160> 72
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> DNA
<213> artificial sequence
<400> 1
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ctaatttaaa ctccaaaacc cgcc 24
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<400> 72
atgcgaattt cgtttttgcg ttagg 25
Claims (11)
1.用于检测IRF4基因部分区域1～24中至少一种的甲基化水平的试剂在制备胃癌诊断试剂盒中的应用；
所述部分区域包括：
a)所述区域1～24，依次为Chr6:391205-391320正链、Chr6:391400-391488正链、Chr6:391469-391563正链、Chr6:391584-391703正链、Chr6:391890-392026正链、Chr6:392075-392186正链、Chr6:392462-392580正链、Chr6:392610-392744正链、Chr6:392786-392913正链、Chr6:393095-393220正链、Chr6:393302-393530正链、Chr6:393600-393788正链、Chr6:393788-393652负链、Chr6:393596-393416负链、Chr6:393380-393240负链、Chr6:393222-393091负链、Chr6:393075-392956负链、Chr6:392906-392801负链、Chr6:392646-392505负链、Chr6:392478-392329负链、Chr6:392219-391988负链、Chr6:391891-391703负链、Chr6:391653-391501负链、Chr6:391478-391283负链所示序列；或
b)包含a)区域1～24中的甲基化位点的其他区域。
2.根据权利要求1所述的应用，所述试剂通过如下方法中的一种或几种实现对目标区域的检测：
甲基化特异性PCR、亚硫酸氢盐测序法、甲基化特异性微阵列法、全基因组甲基化测序法、焦磷酸测序法、甲基化特异性高效液相层析法、甲基化特异性高分辨率溶解曲线法、甲基化敏感性限制性内切酶法和荧光定量法。
3.根据权利要求2所述的应用，所述试剂包括引物和探针组合产品，所述区域1～24所对应的引物和探针组合依次如SEQ ID NO：1～3、SEQ ID NO：4～6、SEQ ID NO：7～9、SEQ IDNO：10～12、SEQ ID NO：13～15、SEQ ID NO：16～18、SEQ ID NO：19～21、SEQ ID NO：22～24、SEQ ID NO：25～27、SEQ ID NO：28～30、SEQ ID NO：31～33、SEQ ID NO：34～36、SEQ IDNO：37～39、SEQ ID NO：40～42、SEQ ID NO：43～45、SEQ ID NO：46～48、SEQ ID NO：49～51、SEQ ID NO：52～54、SEQ ID NO：55～57、SEQ ID NO：58～60、SEQ ID NO：61～63、SEQ IDNO：64～66、SEQ ID NO：67～69、SEQ ID NO：70～72所示。
4.根据权利要求3所述的应用，所述试剂还包括检测内参核酸的引物和探针。
5.根据权利要求4所述的应用，所述内参核酸为β-Actin基因或其片段。
6.根据权利要求3～5任一项所述的应用，所述探针均为自身淬灭探针。
7.根据权利要求3～5任一项所述的应用，所述试剂还包括DNA提取试剂、扩增缓冲液、dNTP、Mg2+、DNA聚合酶、阳性对照、阴性对照、水以及亚硫酸盐定序试剂中的至少一种。
8.根据权利要求1～5任一项所述的应用，其特征在于，所述试剂用于检测IRF4基因区域10、11、12、21和22中至少一种的甲基化水平。
9.根据权利要求1～5任一项所述的应用，其特征在于，所述胃癌诊断试剂盒所述检测的样本为组织裂解液、血液样本或粪便样本。
10.权利要求3～6任一项中所定义的引物和探针组合产品。
11.试剂盒，其包含权利要求3～7任一项中所定义的试剂。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202110942431.XA CN115927607B (zh) | 2021-08-17 | 生物标志物在胃癌诊断中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
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|---|---|
| CN115927607A true CN115927607A (zh) | 2023-04-07 |
| CN115927607B CN115927607B (zh) | 2024-06-07 |
Family
ID=
Citations (5)
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| JP2012090555A (ja) * | 2010-10-26 | 2012-05-17 | Sapporo Medical Univ | Ｒａｓｇｒｆ１の定量的メチル化測定を用いた発癌リスク予測 |
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