CN115927513A - 一种生物酶制备β-烟酰胺单核苷酸的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物技术领域，公开了一种生物酶制备β‑烟酰胺单核苷酸的方法。本发明以D‑核糖、烟酰胺、腺嘌呤核苷三磷酸ATP或腺嘌呤核苷二磷酸ADP或腺嘌呤核苷单磷酸AMP为原料，在核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸激酶以及烟酰胺磷酸核糖焦磷酸激酶催化合成NMN，同时反应体系引入了多聚磷酸激酶和多聚磷酸盐形成了ATP的再生循环，大幅降低了工艺成本，有利于大规模工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及酶法催化生成烟酰胺单核苷酸的方法，具体是一种生物酶制备β-烟酰胺单核苷酸的方法。
背景技术
β-烟酰胺单核苷酸(Nicotinamide mononucleotide，缩写NMN)是生物细胞内存在的一种生化物质，它在β-烟酰胺核苷酸腺苷转移酶腺苷化后即转化成细胞赖以生存的重要物质烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD，又称辅酶Ⅰ)，并且同时直接参与体内的腺苷转移，其在生物细胞内的水平直接影响到NAD的浓度，在生物细胞能量生成扮演着重要角色，并且对人体无危害。
截至目前，人们已经发现烟酰胺单核苷酸具有诸如延缓衰老、治疗帕金森等老年病、调节胰岛素分泌、影响mRNA的表达等诸多医疗保健作用，更多的用途还在不断研发出来，随着人们对烟酰胺单核苷酸药用及保健效果认知的增加，以及作为一种反应底物在化工方面的广泛应用，市场上对烟酰胺单核苷酸的需求与日俱增。
目前NMN的制备方法主要包括以下三种：1.酵母发酵法，2.化学合成法，3.生物酶催化法。其中，化学合成法具有成本较高且产生手性化合物的缺点；而酵母菌发酵法生产的NMN含一定的有机溶剂残留；生物催化法因不含有机溶剂的残留，也不存在手性问题且制备的NMN与机体内的同型而成为目前最绿色环保无公害的NMN制备方法。现有的制备NMN的生物催化法主要有两条途径。一是以烟酰胺核糖(NR)为起始原料，在ATP的存在下，由烟酰胺核糖激酶(NRK)催化生成NMN。目前报道的该路线NMN产量均较低，且底物原料昂贵；二是以烟酰胺和5-磷酸核糖-1-焦磷酸(PRPP)为底物在烟酰胺磷酸核糖转移酶(Nicotinamidephosphoribosyltransferase,缩写NAMPT)催化下制备NMN，其中PRPP市场价格昂贵且来源受限，导致该生物催化法的生产成本较高，严重制约了其应用和发展。
因此有必要开发一种使用低成本底物的高效生物催化技术来制备NMN的新方法。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种多酶催化合成β-烟酰胺单核苷酸的方法，以D-核糖、烟酰胺和腺嘌呤核苷三磷酸ATP、腺嘌呤核苷二磷酸ADP或腺嘌呤核苷单磷酸AMP三者中一种为原料，在核糖激酶RK、磷酸核糖焦磷酸激酶PRS以及烟酰胺磷酸核糖转移酶NAMPT偶联催化下使用一锅法制备NMN，同时引入多聚磷酸激酶PPK2Ⅲ和多聚磷酸盐实现ATP的循环再生，再进一步降低生产成本。
为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案：
一种酶法制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，所述方法以多聚磷酸盐、烟酰胺、D-核糖、ATP为底物，以多聚磷酸激酶、核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸激酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶催化合成β-烟酰胺单核苷酸NMN，同时ATP循环再生。
上述技术方案中，进一步地，所述底物中ATP替换为ADP或AMP；优选地，ADP或AMP等量替换ATP。
上述技术方案中，进一步地，所述核糖激酶RK来源于大肠杆菌，核糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示(E.coli来源)；
所述磷酸核糖焦磷酸激酶PRS来源于大肠杆菌，磷酸核糖焦磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示(E.coli来源)；
所述烟酰胺磷酸核糖转移酶NAMPT源于人，烟酰胺磷酸核糖转移酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示(Homo sapiens来源)；
所述多聚磷酸激酶PPK2Ⅲ源于亚栖热菌，多聚磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示(Meiothermus ruber来源)。
上述技术方案中，进一步地，所述催化合成反应温度为20-50℃，优选为30-40℃；反应pH为6.5-8.5，优选为7.5-8.0。
上述技术方案中，进一步地，所述催化合成反应在PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液中进行；优选PBS缓冲液；所述PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液浓度为50mM。
上述技术方案中，进一步地，所述3种底物D-核糖、ATP、烟酰胺的摩尔比为1：1-5：1-5，按此配比投放原料使D-核糖充分反应，D-核糖转化率达到90％-100％；优选1：1-2：1-3，D-核糖转化率达到100％；添加所述核糖激酶酶量为3mg/L，磷酸核糖焦磷酸激酶酶量为0.35mg/L，烟酰胺磷酸核糖转移酶酶量为1.8g/L，多聚磷酸激酶酶量为1mg/L。
上述技术方案中，进一步地，反应体系中加入辅酶因子Mg2+和K+，辅酶因子Mg2+浓度为5-50mM，K+浓度为50-150mM，Mg2+和K+来自于氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁、硝酸镁、氯化钾、硫酸钾、硝酸钾中的一种或多种。
上述技术方案中，进一步地，所述多聚磷酸盐选自三聚磷酸钠、三聚磷酸钾、六偏磷酸钠、六偏磷酸钾、四偏磷酸钾、四偏磷酸钠中的一种或多种，优选为六偏磷酸钠，在体系中过量存在。
上述技术方案中，进一步地，所述核糖激酶RK、磷酸核糖焦磷酸激酶PRS、烟酰胺磷酸核糖转移酶NAMPT、多聚磷酸激酶PPK2Ⅲ的表达宿主为微生物，所述微生物为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中的至少一种，优选大肠杆菌，进一步优选大肠杆菌BL21(DE3)。微生物中酶的重组表达载体为本领域常规的各种载体，包括：各种质粒、粘粒、噬菌体和病毒载体中的至少一种，如pET28a(+)、柯斯质粒载体、λ噬菌体载体，优选原核表达载体pET28a(+)。
上述技术方案中，进一步地，所述核糖激酶RK、磷酸核糖焦磷酸激酶PRS、烟酰胺磷酸核糖转移酶NAMPT、多聚磷酸激酶PPK2Ⅲ具体存在形式包括酶液、酶冻干粉、含酶细胞以及固定化酶和固定化含酶细胞，未经纯化的粗酶，或是经过部分纯化、完全纯化的形式，优选纯化酶液。
本发明的反应过程如下：D-核糖和ATP在核糖激酶RK作用下先合成5磷酸核糖R-5-P，然后再与ATP经磷酸核糖焦磷酸激酶PRS催化下生成PRPP，最后PRPP与烟酰胺NAM在经过烟酰胺磷酸核糖转移酶NAMPT催化下得到β-烟酰胺单核苷酸NMN。
在多聚磷酸盐存在下，ADP、AMP经PPK2Ⅲ催化，重新生成ATP，实现了ATP的循环再生。或者以催化合成NMN过程中产生的ADP、AMP为底物，经多聚磷酸激酶的催化生成ATP，构成ATP的再生循环具体反应式如图1所示。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
本发明有效降低了生产成本，以多种酶一锅法共同催化，使用成本更低的D-ribose作为原料来取代价格昂贵的PRPP，同时一锅法与传统的分步投料相比操作简便，反应物可连续进行多步反应，缩短了反应时间，提高反应效率，并通过引入了多聚磷酸盐与PPK2Ⅲ酶，将反应过程种产生的ADP、AMP再转化为ATP，实现了ATP的循环再生，同时可以直接使用价格更为低廉的ADP、AMP为底物进行生产，同样实现ATP的循环再生，ATP的循环使用，使整个工艺的成本再次降低，更有利于大规模工业化生产。
附图说明
图1为本发明多酶一锅法制备β-烟酰胺单核苷酸NMN工艺流程图；
图2为本发明核糖激酶BL21(DE3)表达蛋白SDS-PAGE图；
图3为本发明磷酸核糖焦磷酸激酶BL21(DE3)表达蛋白SDS-PAGE图；
图4为本发明烟酰胺磷酸核糖转移酶BL21(DE3)表达蛋白SDS-PAGE图；
图5为本发明多聚磷酸激酶BL21(DE3)表达蛋白SDS-PAGE图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步说明，但不以任何方式限制本发明。
实施例1酶工程菌种的构建
将核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸激酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶以及多磷酸激酶的氨基酸序列(序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示)，送至基因合成公司进行大肠杆菌密码子优化并人工合成编码基因，分别克隆至原核表达载体pET28a(+)的NdeI和XhoI酶切位点之间。包含上述4种酶基因的重组表达载体，通过化学转化法导入大肠杆菌BL21(DE3)中，获得对应的酶基因表达工程菌株。工程菌株的发酵采用常规发酵培养基LB，先在37℃、220rpm条件下培养OD600达0.6-0.8，再采用IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)诱导表达，收集菌体并破碎处理，检测目的蛋白的表达情况(见图2、图3、图4、图5)。对成功表达后的菌液进行离心，收集菌体，对细胞进行裂解处理，将蛋白从其他组分中分离出来，并通过亲和层析、凝胶过滤层析对目的蛋白进行提纯，最终得到酶液。
实施例2纯化酶一锅法制备NMN(无ATP循环)
在反应体系中加入50mM PBS缓冲溶液、0.5mM的D-核糖、1mM的ATP、3mM的烟酰胺NAM、10mM的MgCl2以及125mM的KCl，将pH调至7.5-8.0，然后加入3mg/L核糖激酶RK、0.35mg/L磷酸核糖焦磷酸激酶PRS、1.8g/L烟酰胺磷酸核糖转移酶NAMPT，控制反应温度在37℃，维持pH为7.5-8.0，反应1h后得到β-烟酰胺单核苷酸的粗产品溶液，得到0.03mM NMN，产量10.1mg/L。
实施例3纯化酶一锅法制备NMN(以ATP为初始底物进行ATP循环)
在反应体系中加入50mM PBS缓冲溶液、0.5mM的D-核糖、1mM的ATP、3mM的烟酰胺NAM、10mM的MgCl2以及125mM的KCl，10mM的六偏磷酸钠，将pH调至7.5-8.0，然后加入3mg/L核糖激酶RK、0.35mg/L磷酸核糖焦磷酸激酶PRS、1.8g/L烟酰胺磷酸核糖转移酶NAMPT、1mg/L多聚磷酸盐激酶PPK2Ⅲ，控制反应温度在37℃，维持pH为7.5-8.0，反应1h后得到β-烟酰胺单核苷酸的粗产品溶液，得到0.09mM NMN，产量29.9mg/L。
实施例4纯化酶一锅法制备NMN(以ADP为初始底物进行ATP循环)
在反应体系中加入50mM PBS缓冲溶液、0.5mM的D-核糖、1mM的ADP、3mM的烟酰胺NAM、10mM的MgCl2以及125mM的KCl，10mM的六偏磷酸钠，将pH调至7.5-8.0，然后加入3mg/L核糖激酶RK、0.35mg/L磷酸核糖焦磷酸激酶PRS、1.8g/L烟酰胺磷酸核糖转移酶NAMPT、1mg/L多聚磷酸盐激酶PPK2Ⅲ，控制反应温度在37℃，维持pH为7.5-8.0，反应1h后得到β-烟酰胺单核苷酸的粗产品溶液，得到0.049mM NMN，产量16.4mg/L。
实施例5纯化酶一锅法制备NMN(以AMP为初始底物进行ATP循环)
在反应体系中加入50mM Tris-HCl缓冲溶液、0.5mM的D-核糖、1mM的AMP、3mM的烟酰胺NAM、10mM的MgCl2以及125mM的KCl，10mM的六偏磷酸钠，将pH调至7.5-8.0，然后加入3mg/L核糖激酶RK、0.35mg/L磷酸核糖焦磷酸激酶PRS、1.8g/L烟酰胺磷酸核糖转移酶NAMPT、1mg/L多聚磷酸盐激酶PPK2Ⅲ，控制反应温度在37℃，维持pH为7.5-8.0，反应1h后得到β-烟酰胺单核苷酸的粗产品溶液，得到0.052mM NMN，产量17.4mg/L。
本发明提供了一种新的酶法制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，显著降低了生产成本。现有方法中使用的PRPP的价格约在8.3万/g，而本方法中使用的D-ribose价格约在0.5元/g，ATP价格约在3.2万/g，当以ADP和AMP替代ATP后，更进一步降低生产成本，ADP的价格约是107元/g，AMP价格约19元/g。
对于任何熟悉本领域的技术人员而言，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的技术内容对本发明技术方案作出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均应仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (10)
1.一种酶法制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述方法以多聚磷酸盐、烟酰胺、D-核糖、ATP为底物，以多聚磷酸激酶、核糖激酶、磷酸核糖焦磷酸激酶、烟酰胺磷酸核糖转移酶催化合成β-烟酰胺单核苷酸，同时ATP循环再生。
2.根据权利要求1所述的一种酶法制备β-烟酰胺单核苷酸的方法，其特征在于：所述底物中ATP替换为ADP或AMP；优选地，ADP或AMP等量替换ATP。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，
所述核糖激酶来源于大肠杆菌，核糖激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示；
所述磷酸核糖焦磷酸激酶来源于大肠杆菌，磷酸核糖焦磷酸激酶的氨基酸序列如SEQID NO.2所示；
所述烟酰胺磷酸核糖转移酶来源于人，烟酰胺磷酸核糖转移酶的氨基酸序列如SEQ IDNO.3所示；
所述多聚磷酸激酶源于亚栖热菌，多聚磷酸激酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述催化合成反应温度为20-50℃，优选为30-40℃；反应pH为6.5-8.5，优选为7.5-8.0。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述催化合成反应在PBS缓冲液或Tris-HCl缓冲液中进行；优选PBS缓冲液；所述缓冲液浓度为50mM。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述3种底物D-核糖、ATP、烟酰胺的摩尔比为1：1-5：1-5，优选1：1-2：1-3；添加所述核糖激酶酶量为3mg/L，磷酸核糖焦磷酸激酶酶量为0.35mg/L，烟酰胺磷酸核糖转移酶酶量为1.8g/L，多聚磷酸激酶酶量为1mg/L。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：反应体系中加入辅酶因子Mg2+和K+，辅酶因子Mg2+浓度为5-50mM，K+浓度为50-150mM，Mg2+和K+来自于氯化镁、硫酸镁、亚硫酸镁、硝酸镁、氯化钾、硫酸钾、硝酸钾中的一种或多种。
8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述多聚磷酸盐选自三聚磷酸钠、三聚磷酸钾、六偏磷酸钠、六偏磷酸钾、四偏磷酸钾、四偏磷酸钠中的一种或多种，优选为六偏磷酸钠，在体系中过量存在。
9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述核糖激酶RK、磷酸核糖焦磷酸激酶PRS、烟酰胺磷酸核糖转移酶NAMPT、多聚磷酸激酶PPK2Ⅲ的表达宿主为微生物，所述微生物为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和酿酒酵母中的至少一种，优选大肠杆菌，进一步优选大肠杆菌BL21(DE3)。
10.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述核糖激酶RK、磷酸核糖焦磷酸激酶PRS、烟酰胺磷酸核糖转移酶NAMPT、多聚磷酸激酶PPK2Ⅲ具体存在形式包括酶液、酶冻干粉、含酶细胞以及固定化酶和固定化含酶细胞，未经纯化的粗酶，或是经过部分纯化、完全纯化的形式，优选纯化酶液。
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Cited By (2)
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|---|---|---|---|---|
| CN116875578A (zh) * | 2023-08-25 | 2023-10-13 | 康盈红莓(中山)生物科技有限公司 | 一种三联体融合酶及其制备方法和以之制备烟酰胺单核苷酸的方法 |
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Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110373397A (zh) * | 2019-08-06 | 2019-10-25 | 江苏诚信药业有限公司 | 一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用 |
| CN110373398A (zh) * | 2019-08-06 | 2019-10-25 | 江苏诚信药业有限公司 | 一种烟酰胺核糖激酶突变体及其应用 |
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Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN110373397A (zh) * | 2019-08-06 | 2019-10-25 | 江苏诚信药业有限公司 | 一种烟酰胺磷酸核糖转移酶突变体及其应用 |
| CN110373398A (zh) * | 2019-08-06 | 2019-10-25 | 江苏诚信药业有限公司 | 一种烟酰胺核糖激酶突变体及其应用 |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN116875578A (zh) * | 2023-08-25 | 2023-10-13 | 康盈红莓(中山)生物科技有限公司 | 一种三联体融合酶及其制备方法和以之制备烟酰胺单核苷酸的方法 |
| CN118006710A (zh) * | 2024-01-16 | 2024-05-10 | 康诺生物制药股份有限公司 | 一种生产烟酰胺单核苷酸的方法 |
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