CN115927360B - 密码子优化的门冬胰岛素前体基因、重组载体、基因工程菌及其应用 - Google Patents

密码子优化的门冬胰岛素前体基因、重组载体、基因工程菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本申请属于基因工程技术领域，公开了密码子优化的门冬胰岛素前体基因、重组载体、基因工程菌及其应用。本发明所述含有进一步优化的门冬胰岛素前体基因序列的载体转化毕赤酵母菌获得高效表达的毕赤酵母基因工程菌株。采用本发明所述基因工程菌株生产门冬胰岛素前体可达到了进一步提高门冬胰岛素前体蛋白表达量的目的。

Description

密码子优化的门冬胰岛素前体基因、重组载体、基因工程菌及 其应用
本申请是申请日为2020年05月26日、申请号为202010455882.6，发明名称为“密码子优化的门冬胰岛素前体基因、重组载体、基因工程菌及其应用”的中国专利申请的分案申请。
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及门冬胰岛素前体基因改造及外源蛋白表达，尤其是涉及密码子优化的门冬胰岛素前体基因、重组载体、基因工程菌及其应用。
背景技术
糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，主要特征为慢性高血糖造成的多饮多食却多尿消瘦。糖尿病时长期存在的高血糖，导致各种组织，特别是眼、肾、心脏、血管、神经的慢性损害、功能障碍。高血糖的主要原因则是由于胰岛素分泌缺陷或其生物作用受损，或两者兼有引起。其中胰岛素的分泌或作用缺陷，即胰腺不能分泌足够的胰岛素或机体不能有效使用其分泌的胰岛素而导致的糖、脂肪和蛋白质代谢紊乱。
胰岛素是由胰脏内的胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸、胰高血糖素等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。胰岛素是由A链和B链两条肽链组成，共有51个氨基酸残基。A、B链之间有A7-B7和A20-B19四个Cys的巯基构成两对二硫键，A链内A6-A11两个Cys有一对链内二硫键。胰岛素是用于I型糖尿病患者和II型糖尿病患者的治疗药物。通过模拟人体生理性胰岛素分泌的情况来满足能量代谢的需要。对于糖尿病患者来说，通过胰岛素的治疗能有效的减少或缓解I型和II型糖尿病症状的发生和发展，因此，胰岛素已成为较为理想的治疗方法。
天然胰岛素虽然具有降低血糖的作用，但是注射后不能模拟正常人的胰岛素基础分泌和追加分泌，造成疗效不佳甚至低血糖的危险状况。因此，在对胰岛素结构研究的基础上，通过对改变胰岛素上某些特定位点氨基酸的序列、改变等电点、改变多聚体强度、脂肪酸链修饰等方法，对胰岛素的理化和生物学特性进行改造，分别构建了起峰、达峰作用时间较短的速效胰岛素和分解、吸收、作用时间较长的长效胰岛素，以分别用于对正常人在餐后和空腹状态下胰岛素的追加分泌和基础分泌进行模拟。
门冬胰岛素(insulin aspart)是一种速效胰岛素，由丹麦诺和诺德公司研制开发，其设计原理为利用基因重组技术将B链28位的脯氨酸被天冬氨酸取代，该阴离子的引入能够增加胰岛素分子间的互相排斥，阻止胰岛素分子间二聚体的形成。门冬胰岛素制剂中含有苯酚，皮下注射后能够被快速吸收，在体内分散于血液的速度、与胰岛素受体特异性结合的亲和力及药物发挥降血糖的效能均与天然人胰岛素类似。门冬胰岛素因以胰岛素单体形式存在，皮下注射后的吸收速度与天然人胰岛素相比，要快很多，起效速度约为注射天然人胰岛素的2倍，而且与天然人胰岛素相比，因其拥有更短的作用时间，低血糖发生率也随之可降低。门冬胰岛素已经作为一种常见的速效胰岛素得到广泛应用。
目前门冬胰岛素主要利用酿酒酵母来表达生产，但表达产量低，其表达产物存在过度糖基化现象，效果并不理想。相比酿酒酵母，毕赤酵母操作简单、易于培养、生长速度快、外源蛋白表达量高、AOX强效启动子将甲醇作为唯一碳源进行高密度发酵，受甲醇严格调控，是目前最强、调控机制最严格的启动子之一，可控制外源蛋白大量表达并以分泌形式释放到胞外，产物后期处理同样简单。与酿酒酵母相比，该***外源蛋白表达量更高、糖基化程度低，表达产物不会出现过度糖基化现象。因此毕赤酵母是目前最为理想的真核表达***之一。
门冬胰岛素前体基因序列很少报道，申请人在以往的研究中参照了徐岩等人优化胰岛素序列，并将其用于门冬胰岛素前体基因序列的优化，但是在毕赤酵母的表达效果仍然欠佳。因此，进一步优化门冬胰岛素前体基因序列以提高目前门冬胰岛素前体的表达量，在产业化需求上具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在针对现有技术中存在的问题，进一步优化门冬胰岛素前体基因序列，构建表达效率高、表达产物便于加工的生产门冬胰岛素前体的毕赤酵母工程菌株，以降低门冬胰岛素生产成本。
为实现本发明的目的，本发明采用如下技术方案：
一种密码子优化的门冬胰岛素前体基因，其具有如SEQ ID NO:7-10所示序列。
本发明还提供了一种重组载体，含有所述密码子优化的门冬胰岛素前体基因序列的载体。
在一些实施方案中，所述的重组载体为pPICZαA载体。
本发明还提供了一种基因工程菌，含有所述重组载体的宿主菌。
在一些实施方案中，所述宿主菌为毕赤酵母菌。
在一些具体实施例中，所述毕赤酵母菌为毕赤酵母X33、KM71、GS115、SDM1168或SMD1165。
本发明还提供了所述基因工程菌的制备方法，将所述密码子优化的门冬胰岛素前体基因连接至载体中的构建重组载体，鉴定后转化宿主菌。
本发明还提供了所述密码子优化的门冬胰岛素前体基因、所述重组载体、所述基因工程菌在制备用于治疗糖尿病相关疾病的药物中的用途。
本发明还提供了一种门冬胰岛素前体的生产方法，具体为将所述基因工程菌接种培养基中进行发酵培养。
由上述技术方案可知，本发明提供了密码子优化的门冬胰岛素前体基因、重组载体、基因工程菌及其应用。本发明所述含有进一步优化的门冬胰岛素前体基因序列的载体转化毕赤酵母菌获得高效表达的毕赤酵母基因工程菌株。采用本发明所述基因工程菌株生产门冬胰岛素前体可达到了进一步提高门冬胰岛素前体蛋白表达量的目的。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。
图1示重组质粒XhoI，NotI酶切图；M：5000bpMaker；A：含有门冬胰岛素前体Sequence NO.1的质粒酶切结果；B：含有门冬胰岛素前体Sequence NO.2的质粒酶切结果；C：含有门冬胰岛素前体Sequence NO.3的质粒酶切结果；D：含有门冬胰岛素前体SequenceNO.4的质粒酶切结果；E：含有门冬胰岛素前体Sequence NO.5的质粒酶切结果；F：含有门冬胰岛素前体Sequence NO.6的质粒酶切结果；G：含有门冬胰岛素前体Sequence NO.7的质粒酶切结果；H：含有门冬胰岛素前体Sequence NO.8的质粒酶切结果；I：含有门冬胰岛素前体Sequence NO.9的质粒酶切结果；J：含有门冬胰岛素前体Sequence NO.10的质粒酶切结果；
图2示门冬胰岛素前体质粒电转化毕赤酵母后，采用Sequence NO.14和SequenceNO.15引物进行菌落PCR鉴定；M：5000bpMaker；A：含有Sequence NO.1的阳性转化子PCR结果；B：含有Sequence NO.2的阳性转化子PCR结果；C：含有Sequence NO.3的阳性转化子PCR结果；D：含有Sequence NO.4的阳性转化子PCR结果；E：含有Sequence NO.5的阳性转化子PCR结果；F：含有Sequence NO.6的阳性转化子PCR结果；G：含有Sequence NO.7的阳性转化子PCR结果；H：含有Sequence NO.8的阳性转化子PCR结果；I：含有Sequence NO.9的阳性转化子PCR结果；J：含有Sequence NO.10的阳性转化子PCR结果；
图3示诱导前液相图谱；进样量10μl，10分钟左右无目的峰出现；
图4示门冬胰岛素前体原始菌株Sequence NO.1摇瓶实验诱导72h液相图谱；进样量10μl，出峰时间为10.309分钟，峰面积为544.566，表达量为0.021g/L；
图5示门冬胰岛素前体Sequence NO.2菌株摇瓶实验诱导72h液相图谱；进样量10μl，出峰时间为10.337分钟，峰面积为720.942，表达量为0.036g/L；
图6示门冬胰岛素前体Sequence NO.3菌株摇瓶实验诱导72h液相图谱；进样量10μl，出峰时间为10.355分钟，峰面积为1029.600，表达量为0.064g/L；
图7示门冬胰岛素前体Sequence NO.4菌株摇瓶实验诱导72h液相图谱；进样量10μl，出峰时间为10.380分钟，峰面积为1228.023，表达量为0.072g/L；
图8：门冬胰岛素前体Sequence NO.5菌株摇瓶实验诱导72h液相图谱；进样量10μl，出峰时间为10.358分钟，峰面积为1128.812，表达量为0.083g/L；
图9示门冬胰岛素前体Sequence NO.6菌株摇瓶实验诱导72h液相图谱；进样量10μl，出峰时间为10.398分钟，峰面积为1668.964，表达量为0.102g/L；
图10示门冬胰岛素前体Sequence NO.7菌株摇瓶实验诱导72h液相图谱；进样量10μl，出峰时间为10.329分钟，峰面积为2021.716，表达量为0.114g/L；
图11示门冬胰岛素前体Sequence NO.8菌株摇瓶实验诱导72h液相图谱；进样量10μl，出峰时间为10.390分钟，峰面积为2231.163，表达量为0.133g/L；
图12示门冬胰岛素前体Sequence NO.9菌株摇瓶实验诱导72h液相图谱；进样量10μl，出峰时间为10.371分钟，峰面积为2363.445，表达量为0.145g/L；
图13示门冬胰岛素前体Sequence NO.10菌株摇瓶实验诱导72h液相图谱；进样量10μl，出峰时间为10.409分钟，峰面积为2771.315，表达量为0.170g/L；
图14示门冬胰岛素前体Sequence NO.16菌株摇瓶实验诱导72h液相图谱；进样量10μl，出峰时间为10.293分钟，峰面积为1547.705，表达量为0.091g/L；
图15示门冬胰岛素前体Sequence NO.1菌株1000L发酵培养92h放罐样品液相图谱；进样量10μl，出峰时间为10.368分钟，峰面积为4513.029，表达量为0.390g/L；
图16示门冬胰岛素前体Sequence NO.10菌株1000L发酵培养92h放罐样品液相图谱。进样量10μl，出峰时间为10.368分钟，峰面积为6067.344，表达量为5.310g/L；
图17示门冬胰岛素前体Sequence NO.16菌株摇瓶实验诱导92h液相图谱；进样量10μl，出峰时间为10.298分钟，峰面积为5253.177，表达量为3.200g/L；
图18示pPICZαA载体质粒图谱；
图19示门冬胰岛素前体基因序列优化前后蛋白表达情况；
图20示门冬胰岛素前体基因序列优化前后门冬胰岛素前体Sequence NO.1菌株、Sequence NO.10菌株、Sequence NO.16菌株1000L发酵的表达情况。
具体实施方式
本发明公开了密码子优化的门冬胰岛素前体基因、重组载体、基因工程菌及其应用。本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及产品已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本发明技术。
为了进一步理解本发明，下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
在发明中，关于本发明基因的设计及制备本发明基因的方法并没有具体限制，本领域技术人员可以参照现有技术中的任何已知方法对所述基因进行制备。下面详细描述经过优化的门冬胰岛素前体基因设计及合成。其仅仅是说明相关方法，并非是限制性的；也可以采用其他已知的方法，或者采用修改的方法。具体步骤为：
1)根据毕赤酵母偏好密码子对原基因序列进行优化，获得经过优化的门冬胰岛素前体基因；
根据门冬胰岛素前体氨基酸序列，设计将其中个别氨基酸的密码子替换为毕赤酵母偏爱的密码子，通过生物信息相关内容与技术，对密码子进行合理优化，增加基因的稳定性，获得相应的经过优化的门冬胰岛素前体基因，提高门冬胰岛素前体在毕赤酵母中的表达水平。
2)含有经过优化的门冬胰岛素前体基因的表达载体的构建及鉴定；
a)含有经过优化的门冬胰岛素前体基因的表达载体的构建：
将Sequence NO.1、Sequence NO.2、Sequence NO.3、Sequence NO.4、SequenceNO.5、Sequence NO.6、Sequence NO.7、Sequence NO.8、Sequence NO.9、Sequence NO.10基因序列连接至pPICZαA载体中NotI和XhoI酶切位点之间，转化大肠杆菌感受态TOP10，涂布含有50μg/ml的卡那霉素抗性平板，37℃过夜培养后获得转化子。
tttgttaaccaacatttgtgtggttctcatttggttgaagctttgtacttggtttgtggtgaaagaggtttcttctacactgacaaggctgctaagggtattgttgaacaatgttgtacttctatttgttctttgtaccaattggaaaactactgtaactgataa(Sequence NO.1)。
tttgttaatcaacatttgtgtggttctcatttggttgaagctttgtacttggtttgtggtgaaagaggtttcttctacactgacaaggctgctaagggtattgttgaacaatgttgtacttctatttgttctttgtaccaattggaaaactactgtaactgataa(Sequence NO.2)。
tttgttaaccaacatttgtgtggatctcatttggttgaagctttgtacttggtttgtggtgaaagaggtttcttctacactgacaaggctgctaagggtattgttgaacaatgttgtacttctatttgttctttgtaccaattggaaaactactgtaactgataa(Sequence NO.3)。
tttgttaaccaacatttgtgtggttctcatttggttgaagctttgtacttggtttgcggtgaaagaggtttcttctacactgacaaggctgctaagggtattgttgaacaatgttgtacttctatttgttctttgtaccaattggaaaactactgtaactgataa(Sequence NO.4)。
tttgttaaccaacatttgtgtggttctcatttggttgaagctttgtacttggtttgtggtgaaagaggtttcttctatactgacaaggctgctaagggtattgttgaacaatgttgtacttctatttgttctttgtaccaattggaaaactactgtaactgataa(Sequence NO.5)。
tttgttaatcaacatttgtgtggttctcatttggttgaagctttgtacttggtttgcggtgaaagaggtttcttctacactgacaaggctgctaagggtattgttgaacaatgttgtacttctatttgttctttgtaccaattggaaaactactgtaactgataa(Sequence NO.6)。
tttgttaaccaacatttgtgtggatctcatttggttgaagctttgtacttggtttgcggtgaaagaggtttcttctacactgacaaggctgctaagggtattgttgaacaatgttgtacttctatttgttctttgtaccaattggaaaactactgtaactgataa(SEQ ID NO:7)。
tttgttaatcaacatttgtgtggatctcatttggttgaagctttgtacttggtttgcggtgaaagaggtttcttctacactgacaaggctgctaagggtattgttgaacaatgttgtacttctatttgttctttgtaccaattggaaaactactgtaactgataa(SEQ ID NO:8)。
tttgttaatcaacatttgtgtggttctcatttggttgaagctttgtacttggtttgcggtgaaagaggtttcttctatactgacaaggctgctaagggtattgttgaacaatgttgtacttctatttgttctttgtaccaattggaaaactactgtaactgataa(SEQ ID NO:9)。
tttgttaatcaacatttgtgtggatctcatttggttgaagctttgtacttggtttgcggtgaaagaggtttcttctatactgacaaggctgctaagggtattgttgaacaatgttgtacttctatttgttctttgtaccaattggaaaactactgtaactgataa(SEQ ID NO:10)。
b)含有经过优化的门冬岛素前体DNA转化子的鉴定：以3’AOX(Sequence NO.14)作为上游引物，α-factor(Sequence NO.15)作为下游引物，挑取转化子进行菌落PCR鉴定，PCR获得DNA片段大小为424bp的转化子定义为阳性转化子，将PCR样品送检测序，进行DNA鉴定。
gcaaatggcattctgacatcc(Sequence NO.14)；tactattgccagcattgctgc(SequenceNO.15)。
3)经过优化的门冬胰岛素前体基因向毕赤酵母的转化及表达。
a)经过优化的门冬胰岛素前体基因向毕赤酵母的转化：将阳性重组质粒用限制性核酸内切酶SacI线性化后，采用电击法电转化毕赤酵母，在含有Zeocin抗性的YPD平板上筛选重组子，并对重组子进行菌落PCR鉴定，PCR获得DNA片段大小为424bp的转化子定义为阳性转化子，将PCR样品送检测序，进行DNA鉴定。
b)含有优化的门冬胰岛素前体基因的毕赤酵母在摇瓶培养基中的诱导表达：将阳性转化子接种于100ml BMGY培养基，过夜培养后更换为BMMY培养基，加入甲醇至终浓度为0.5％，每24h加入0.5％甲醇进行诱导，诱导72h后结束培养。收集发酵液离心，取上清对目的蛋白进行液相检测。
如无特殊说明，本发明实施例中所涉及的试剂均为市售产品，均可以通过商业渠道购买获得。
实施例1、门冬胰岛素前体基因的优化设计
一、实验材料
实验中所使用引物和基因序列由生工生物工程(上海)股份有限公司合成；DNA聚合酶、DNA连接酶、限制性内切酶、毕赤酵母菌株、pPICZαA载体购自Thermo Fisher公司；质粒抽提试剂盒与胶回收试剂盒均为生工生物工程(上海)股份有限公司产品；基因测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成；其他相关试剂均为市购。
二、方法结果
以Gurramkonda等人(Application of simple fed-batch technique tohighlevel secretory production of insulin precursor using Pichia pastoriswith subsequent purification and conversion to human insulin.Microbial CellFactories 2010,9:3)报道的人胰岛素前体基因序列(tttgttaaccaacatttgtgtggttctcatttggttgaagctttgtacttggtttgtggtgaaagaggtttcttctacactccaaaggctgctaagggtattgttgaacaatgttgtacttctatttgttctttgtaccaattggaaaactactgtaactaa(Sequence NO.12))为基础(其对应的人胰岛素前体氨基酸序列为Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser HisLeu Val Glu Ala Leu Tyr Leu Val Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Pro LysAla Ala Lys Gly Ile Val Glu Gln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln LeuGlu Asn Tyr Cys Asn(Sequence NO.13))，获得门冬胰岛素前体原始基因序列(SequenceNO.1)，将其中个别氨基酸的密码子替换为毕赤酵母偏爱密码子，通过生物信息学技术合理优化，增加外源基因的稳定性及其在毕赤酵母中的表达水平，获得9种经过优化的门冬胰岛素前体基因序列(Sequence NO.2、Sequence NO.3、Sequence NO.4、Sequence NO.5、Sequence NO.6、Sequence NO.7、Sequence NO.8、Sequence NO.9和Sequence NO.10)。
具体优化方案为：
将Sequence NO.1中的B链3位氨基酸密码子进行替换得到SequenceNO.2；
替换Sequence NO.1序列中B链8位氨基酸密码子得到Sequence NO.3；
替换Sequence NO.1序列中B链19位氨基酸密码子得到Sequence NO.4；
将Sequence NO.1中的B链27位氨基酸密码子进行替换得到Sequence NO.5；
替换Sequence NO.2序列中B链19位氨基酸密码子得到Sequence NO.6；
替换Sequence NO.3序列中B链19位氨基酸密码子得到Sequence NO.7；
将Sequence NO.6中的B链8位氨基酸密码子进行替换得到Sequence NO.8；
替换Sequence NO.6序列中B链27位氨基酸密码子得到Sequence NO.9；
替换Sequence NO.8序列中B链27位氨基酸密码子得到Sequence NO.10。
Sequence NO.1～NO.10所对应的氨基酸序列为Sequence NO.11。
Phe Val Asn Gln His Leu Cys Gly Ser His Leu Val Glu Ala Leu Tyr LeuVal Cys Gly Glu Arg Gly Phe Phe Tyr Thr Asp Lys Ala Ala Lys Gly Ile Val GluGln Cys Cys Thr Ser Ile Cys Ser Leu Tyr Gln Leu Glu Asn Tyr Cys Asn(SequenceNO.11)。
1、引物设计
利用通用引物进行PCR反应及测序，包括Primer NO.1、Primer NO.2。
表1第一组实验引物序列表
引物名称 序列编号 引物序列
Primer NO.1(3’AOX1) Sequence NO.14 GCAAATGGCATTCTGACATCC
Primer NO.2(α-factor) Sequence NO.15 TACTATTGCCAGCATTGCTGC
2、基因合成及载体构建
Sequence NO.1、Sequence NO.2、Sequence NO.3、Sequence NO.4、SequenceNO.5、Sequence NO.6、Sequence NO.7、Sequence NO.8、Sequence NO.9、Sequence NO.10均由生工生物工程(上海)股份有限公司完成合成。将上述基因序列连接pPICZαA可得毕赤酵母表达载体，分别命名为pPICZαAA/B/C/D/E/F/G/H/I/J。
实施例2、经过优化的门冬胰岛素前体基因在毕赤酵母中的表达及鉴定
一、实验材料
毕赤酵母菌株、限制性内切酶(SacI)购自Thermo Fisher公司；质粒抽提试剂盒与胶回收试剂盒均为生工生物工程(上海)股份有限公司产品；基因测序由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。
二、方法结果
1、经过优化的门冬胰岛素前体基因向毕赤酵母的转化
将含有经过优化的门冬胰岛素前体基因表达载体pPICZαAA/B/C/D/E/F/G/H/I/J用限制性内切酶SacI进行线性化，反应体系为500μl，包括：10×FD buffer 50μl、Sac I 25μl、pPICZαAA/B/C/D/E/F/G/H/I/J 50μl、ddH2O 375μl。反应条件为37℃酶切15分钟。
根据毕赤酵母表达操作手册上的电击转化方法将线性化表达载体pPICZαAA/B/C/D/E/F/G/H/I/J转入毕赤酵母基因组中。在含有zeocin抗性的平板上30℃培养2-3天，筛选阳性重组子。将转化子划线后用Sequence NO.14和Sequence NO.15作为上下游引物进行菌落PCR鉴定。将扩增出424bp目的片段的转化子定为阳性转化子。反应体系为50μl，包括：5×buffer 10μl、dNTPs 1μl、上下游引物各2.5μl、模板为重组子单菌落、MgCl2 1.5μl、DMSO1.5μl、DNA polymerase 0.5μl。反应条件为：98℃ 2min，98℃ 20s，64℃ 20s，72℃ 30s，30个循环后72℃ 5min。
2、含有经过优化的门冬胰岛素前体基因的毕赤酵母在摇瓶培养基中的表达
将鉴定为阳性的转化子保种后，接种至100ml BMGY培养基中30℃培养24h，当OD600达到6左右的时候，弃去BMGY，补加含有终浓度0.5％无水甲醇的BMMY 100ml，诱导72小时后结束。取样离心后，使用Kromasil 100-5C4液相色谱柱进行目的蛋白检测，在10分钟左右目的蛋白出峰。
从液相检测结果计算得出，原基因序列(Sequence NO.1)的表达量只有0.030g/L，而经过优化的序列Sequence NO.2、Sequence NO.3、Sequence NO.4、Sequence NO.5、Sequence NO.6、Sequence NO.7、Sequence NO.8、Sequence NO.9和Sequence NO.10的表达量分别为0.036、0.064、0.072、0.083、0.102、0.114、0.133、0.145、0.170g/L，表达量分别提高了1.7、3.0、3.4、4.0、4.9、5.4、6.3、6.9和8.1倍。同时采用徐岩等人优化基因序列(Sequence NO.16)表达量为0.091，表达量提高4.3倍。
3、含有经过优化的门冬胰岛素前体基因的毕赤酵母在1000L发酵罐中诱导表达
将在摇瓶培养基中表达最高的Sequence NO.10在1000L发酵罐中进行发酵培养，同时以原基因序列Sequence NO.1的菌株和徐岩等人优化基因序列(Sequence NO.16)的菌株作为对照。将菌种按1％的比例接种于YPG培养基中30℃过夜活化，当OD600达到6左右，转接入50L种子罐培养14～18h后接种至1000L发酵罐。待生长至合适OD后诱导92h，取样离心后，使用Kromasil 100-5C4液相色谱柱进行目的蛋白检测，在10分钟左右目的蛋白出峰。
从液相检测结果计算得出，原基因序列(Sequence NO.1)的菌株的1000L发酵罐表达量只有0.390g/L，序列Sequnence NO.16的菌株的表达量达到3.200g/L，表达量提高了8.2倍，而经过优化的序列Sequnence NO.10的表达量可达到5.310g/L，表达量提高了13.6倍。由此可见，本发明经过一系列的密码子优化后，达到了进一步提高门冬胰岛素前体蛋白表达量的目的。
tttgttaaccagcacttgtgtggttctcatttggttgaggctttgtacttggtttgtggtgaaagaggtttcttctacactgacaaggctgctaagggtattgttgaacaatgttgtacttctatttgttctttgtaccaattggaaaactactgtaactaa(Sequence NO.16)。

Claims (9)

1.一种密码子优化的门冬胰岛素前体基因，其序列如SEQ ID NO：8-10任一所示。
2.一种重组载体，其为含有权利要求1所述的门冬胰岛素前体基因序列的载体。
3.根据权利要求2所述的重组载体，所述载体为pPICZαA载体。
4.一种基因工程菌，其为含有权利要求2或3所述重组载体的宿主菌。
5.根据权利要求4所述的基因工程菌，所述宿主菌为毕赤酵母菌。
6.根据权利要求5所述的基因工程菌，所述毕赤酵母菌为毕赤酵母X33、KM71、GS115、SDM1168或SMD1165。
7.权利要求4所述基因工程菌的制备方法，将权利要求1所述的门冬胰岛素前体基因连接至载体中构建重组载体，鉴定后转化宿主菌。
8.权利要求1所述密码子优化的门冬胰岛素前体基因、权利要求2或3所述重组载体、权利要求4-6中的任一项所述基因工程菌在制备用于治疗糖尿病相关疾病的药物中的用途。
9.一种门冬胰岛素前体的生产方法，将权利要求4-6中的任一项所述基因工程菌接种培养基中进行发酵培养。
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