CN115925891A - 抗乙型流感病毒抗体、检测乙型流感病毒的试剂和试剂盒 - Google Patents

抗乙型流感病毒抗体、检测乙型流感病毒的试剂和试剂盒 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种抗乙型流感病毒抗体、检测乙型流感病毒的试剂和试剂盒，涉及抗体技术领域。本发明公开的抗乙型流感病毒抗体包括重链互补决定区和轻链互补决定区。该抗体为乙型流感病毒的检测提供了重要的原料来源，且具有提高的活性。

Description

抗乙型流感病毒抗体、检测乙型流感病毒的试剂和试剂盒
技术领域
本发明涉及抗体技术领域，具体而言，涉及一种抗乙型流感病毒抗体、检测乙型流感病毒的试剂和试剂盒。
背景技术
流行性感冒病毒(Influenza virus，Flu)，简称流感病毒，是正粘病毒科的代表种，包括人类流感病毒、猪流感病毒、马流感病毒、禽流感病毒等，其中人流感病毒根据其核蛋白的抗原性可分为甲(A)、乙(B)、丙(C)三型，是流行性感冒的病原体。流感病毒可引起人、禽、猪、马、蝙蝠等多种动物感染和发病。其中可感染人主要是甲型流感病毒和乙型流感病毒，主要引起上呼吸道的感染，也可引起儿童与成年人的下呼吸道感染，主要为肺炎，婴幼儿的重症流感常伴有支气管、高热。
乙型流感，是由乙(B)型流感病毒引起的流行性感冒，其特点是起病急骤，畏寒、发热，体温在数小时至24小时内升达高峰，39-40℃甚至更高。伴头痛，全身酸痛，乏力，食欲减退。呼吸道症状较轻，咽干喉痛，干咳，可有腹泻。颜面潮红，眼结膜外眦充血，咽部充血，软腭上有滤泡。可用金刚烷胺为M2离子阻断剂等药物治疗，也可用中药治疗。
乙型流感病毒会产生许多亚型，因为流感病毒的血凝素(hemagglutinin，HA)和神经氨酸酶 (neuraminidase，NA)抗原易发生转变，其组成氨基酸位点均可发生变异。流感病毒每次大流行后，通过上述的氨基酸位点变异，从而产生新型的流感病毒，人体免疫***对于变异的亚型普遍缺乏抵抗力，容易造成局部流行，在特殊的环境下可以引起大范围人群感染。2017年12月至2018年 1月监测数据显示，乙型流感病毒发病率呈上升趋势。因此，流感病毒的早期快速筛查显得尤为重要。
流感病毒感染后临床症状不典型，临床诊断主要依赖于实验室检测，而可同时感染人类的呼吸道病毒大概有200余种，因此检测试剂的灵敏度和特异度对临床诊断至关重要。选取检测时间短、检出率高的流感病毒筛查技术是保障临床快速诊断和对症治疗的技术路径和前提保障。
针对流感病毒的实验室检测方法有多种，参照***《流行性感冒诊断标准》的变化可知，早期检测依赖鸡胚接种，由于操作复杂、技术要求高临床已很少应用，现代检测技术包括抗原检测和核酸PCR检测，新技术具有快速、敏感、特异的特点，为临床诊断提供了很大的帮助。
荧光PCR扩增技术，该方法的优点是灵敏度和特异度均较高，但是PCR法对样品、试验环境、操作人员的要求较高，扩增方法学适用于批量标本的检测，出报告时间较长，无法很好的满足临床快速诊断的要求。而检测病毒抗原的免疫胶体金技术可以作为一种快速诊断乙型流感的优选方法，检测时间短，能有效地辅助临床诊断，很大程度上帮助临床尽早对症用药。要加强乙型流感病毒的监测，为乙型流感病毒感染的快速、准确筛查提供帮助，重点在于优化快检试剂的质量，缩短样本裂解时间，降低样本检出浓度限度，提高试剂的灵敏度和特异性。因此，本领域对于有效且特异性结合乙(B)型流感病毒并对其进行检测的抗体存在着强烈需求。
有鉴于此，特提出本发明。
发明内容
本申请提供一种活性提高的抗乙型流感病毒抗体，以改善乙型流感病毒的检测，为乙型流感病毒的检测提供重要的原料来源。
为了实现上述目的，根据本发明的一个方面，提供了一种抗乙型流感病毒抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括：
a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1至3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和氨基酸序列如SEQID NO:4至SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
b)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的重链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区；或
c)氨基酸序列与b)所示序列具有80％以上同一性的重链可变区和轻链可变区，且包括a)所示序列的HCDR1至HCDR3和LCDR1至LCDR3；或
d)氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的重链，和氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的轻链。
为了实现上述目的，根据本发明的第二个方面，提供了一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包括上述的抗体或其功能性片段。
为了实现上述目的，根据本发明的第三个方面，提供了一种检测乙型流感病毒的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述的抗体或其功能性片段或上述的抗体偶联物。
为了实现上述目的，根据本发明的第四个方面，提供了一种检测乙型流感病毒的方法，包括：使上述抗体或其功能性片段、偶联物或试剂或试剂盒与待检测样品中的乙型流感病毒接触形成免疫复合物。
为了实现上述目的，本发明还提供了一种载体、一种细胞及一种制备上述抗体或其功能性片段的方法。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为Anti-FluB 9B8mut1的还原性SDS-PAGE的结果。
具体实施方式
本发明提供了一种抗乙型流感病毒抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括:
a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1至3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和氨基酸序列如SEQID NO:4至SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3。上述抗体具有提高的活性。
在本发明中，术语“抗体”在最广义上使用，其可以包括全长单克隆抗体，双特异性或多特异性抗体，以及嵌合抗体，只要它们展示所需的生物学活性。
在本发明中，术语“互补性决定区”、“CDR”或“CDRs”是指免疫球蛋白的重链和轻链的高度可变区，指包含一种或多种或者甚至全部的对抗体或抗原结合片段与其识别的抗原或表位的结合起作用的主要氨基酸残基的区域。在本发明具体实施方式中，CDRs是指所述抗体的重链和轻链的高度可变区。
在本发明中，重链互补决定区用HCDR表示，其包括HCDR1、HCDR2和HCDR3；轻链互补决定区用LCDR表示，其包括LCDR1、LCDR2和LCDR3。本领域常用的CDR标示方法包括： Kabat编号方案、IMGT编号方案、Chothia和Lesk编号方案以及1997年Lefranc等人为免疫球蛋白超家族的所有蛋白质序列引入的新的标准化编号***。Kabat等人是第一个为免疫球蛋白可变区提出标准化编号方案的人。在过去的几十年中，序列的积累导致了KABATMAN数据库的创建， Kabat编号方案通常被认为是编号抗体残基广泛采用的标准。本发明采用Kabat注释标准标示CDR 区，但其他方法标示的CDR区也属于本发明的保护范围。
另一方面，本发明提供了一种抗乙型流感病毒的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括：
b)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的重链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区。上述抗体具有提高的活性。
在本发明中，“框架区”或“FR”区包括重链框架区和轻链框架区，是指抗体重链可变区和轻链可变区中除CDR之外的区域；其中，重链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含HFR1、HFR2、HFR3和HFR4框架区；轻链框架区可以被进一步细分成被CDR分隔开的毗邻区域，包含LFR1、LFR2、LFR3和LFR4框架区。
在本发明中，重链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：HFR1-HCDR1- HFR2-HCDR2-HFR3-HCDR3-HFR4；轻链可变区由以下编号的CDR与FR按如下组合排列连接获得：LFR1-LCDR1-LFR2-LCDR2-LFR3-LCDR3-LFR4。
另一方面，本发明提供了一种抗乙型流感病毒的抗体或其功能性片段，所述抗体或其功能性片段包括：
c)氨基酸序列与b)所示序列具有80％以上同一性的重链可变区和轻链可变区，且包括a)所示序列的HCDR1至HCDR3和LCDR1至LCDR3。上述抗体具有提高的活性。
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段包括SEQ ID NO:9所示的重链可变区中的重链框架区，和SEQ ID NO:10所示的轻链可变区中的轻链框架区。
在可选的实施方式中，所述抗体或其功能性片段的框架区氨基酸序列可以与上述框架区具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、 94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在可选的实施方式中，上述任一抗体或其功能性片段还包含恒定区。
在可选的实施方式中，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区。
在可选的实施方式中，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD 的重链恒定区，所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区。
在可选的实施方式中，所述重链恒定区选自IgM的重链恒定区。
在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为牛、马、乳牛、猪、羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅、火鸡、斗鸡或人。
在可选的实施方式中，所述恒定区的种属来源为小鼠。
在可选的实施方式中，所述重链恒定区序列(CH)如SEQ ID NO:7所示，所述轻链恒定区 (CL)序列如SEQ ID NO:8所示。
需要说明的是，在其他的实施例中，所述恒定区序列可以与上述恒定区(SEQ IDNO:7或8) 具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、 93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。
在可选的实施方式中，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
上述抗体的功能性片段通常具有与其来源抗体相同的结合特异性。本领域技术人员根据本发明记载的内容容易理解到，上述抗体的功能性片段可以通过比如酶消化的方法(包括胃蛋白酶或木瓜蛋白酶)和/或通过化学还原***二硫键的方法获得。在本发明公开了完整抗体的结构基础上，本领域技术人员容易获得上述的功能性片段。
上述抗体的功能性片段还可以通过也是本领域技术人员所知的重组遗传学技术或通过例如自动肽合成仪，比如Applied BioSystems等销售的自动肽合成仪合成获得。
另一方面，本发明提供了一种抗乙型流感病毒的抗体，包括
d)氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的重链，和氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的轻链。上述抗体具有提高的活性。
另一方面，本发明提供一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包括上述的抗体。其中，所述抗体直接或间接共价偶联至待偶联物。或者，所述抗体以非共价吸附的方式偶联至待偶联物。
在可选的实施方式中，上述抗体偶联物中所述抗体偶联至生物素或生物素衍生物。
在可选的实施方式中，上述抗体偶联物中所述抗体偶联至标记物。
在可选的实施方式中，上述标记物是指具有能够被肉眼直接观察或被仪器检测或探测到的特性例如发光、显色、放射性等特性的一类物质，通过该特性可以实现对相应目标物的定性或定量检测。
在可选的实施方式中，所述标记物包括但不限于荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物。
在实际的使用过程中，本领域技术人员可以根据检测条件或实际需要选择合适的标记物，无论使用何种标记物，其均属于本发明的保护范围。
在可选的实施方式中，所述荧光染料包括但不限于荧光素类染料及其衍生物(例如包括但不限于异硫氰酸荧光素(FITC)羟基光素(FAM)、四氯光素(TET)等或其类似物)、罗丹明类染料及其衍生物(例如包括但不限于红色罗丹明(RBITC)、四甲基罗丹明(TAMRA)、罗丹明B (TRITC)等或其类似物)、Cy系列染料及其衍生物(例如包括但不限于Cy2、Cy3、Cy3B、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、Cy3等或其类似物)、Alexa系列染料及其衍生物(例如包括但不限于AlexaFluor350、405、430、488、532、546、555、568、594、610、33、647、680、700、750等或其类似物)和蛋白类染料及其衍生物(例如包括但不限于藻红蛋白(PE)、藻蓝蛋白(PC)、别藻蓝蛋白(APC)、多甲藻黄素-叶绿素蛋白(preCP)等)。
在可选的实施方式中，所述酶包括但不限于辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、β-半乳糖苷酶、葡萄糖氧化酶、碳酸酐酶、乙酰胆碱酯酶以及6-磷酸葡萄糖脱氧酶。
在可选的实施方式中，所述放射性同位素包括但不限于212Bi、131I、111In、90Y、186Re、 211At、125I、188Re、153Sm、213Bi、32P、94mTc、99mTc、203Pb、67Ga、68Ga、43Sc、47Sc、 110mIn、97Ru、62Cu、64Cu、67Cu、68Cu、86Y、88Y、121Sn、161Tb、166Ho、105Rh、 177Lu、172Lu和18F。
在可选的实施方式中，所述化学发光试剂包括但不限于鲁米诺及其衍生物、光泽精、甲壳动物荧光素及其衍生物、联吡啶钌及其衍生物、吖啶酯及其衍生物、二氧环乙烷及其衍生物、洛粉碱及其衍生物和过氧草酸盐及其衍生物。
在可选的实施方式中，所述纳米颗粒类标记物包括但不限于纳米颗粒、胶体、有机纳米颗粒、磁性纳米颗粒、量子点纳米颗粒和稀土络合物纳米颗粒。
在可选的实施方式中，所述胶体包括但不限于胶体金属、胶体硒、分散型染料、染料标记的微球和乳胶。
在可选的实施方式中，所述胶体金属包括但不限于胶体金或胶体银。
在可选的实施方式中，所述胶体金属为胶体金。
在可选的实施方式中，上述抗体偶联物中所述抗体偶联至固相。
在可选的实施方式中，所述固相选自微球、板和膜。
在可选的实施方式中，所述固相包括但不限于磁性微球、塑料微球、塑胶微粒、微孔板、玻璃、毛细管、尼龙和硝酸纤维素膜。
在可选的实施方式中，所述固相为硝酸纤维素膜。
另一方面，本发明提供一种检测乙型流感病毒的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括上述的抗体或其功能性片段或上述的抗体偶联物。
另一方面，本发明提供上述抗体或其功能性片段、抗体偶联物或上述的试剂或试剂盒在乙型流感病毒检测中的用途。
另一方面，本发明提供一种检测乙型流感病毒的方法，包括：使上述抗体或其功能性片段、抗体偶联物或上述的试剂或试剂盒与待检测样品中的乙型流感病毒接触形成免疫复合物。
在可选的实施方式中，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与所述抗体或其功能性片段结合。
在可选的实施方式中，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与乙型流感病毒结合。
另一方面，本发明提供一种编码上述抗体或其功能性片段的核酸分子。
另一方面，本发明提供含有上述核酸分子的载体。
另一方面，本发明提供含有上述载体的细胞。
另一方面，本发明提供一种制备抗体或其功能性片段的方法，其包括：培养如上所述的细胞。
在本发明公开了抗体或其功能性片段的氨基酸序列的基础上，本领域技术人员容易想到采用基因工程技术或其他技术(化学合成、重组表达)制备得到该抗体或其功能性片段，例如从能够重组表达如上任一项所述的抗体或其功能性片段的重组细胞的培养产物中分离纯化得到该抗体或其功能性片段，这对本领域技术人员来说是容易实现的，基于此，无论采用何种技术制备本发明的抗体或其功能性片段，其均属于本发明的保护范围。
为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常理解的含义相同的含义。尽管与本文描述的那些方法和材料类似或等同的任何方法和材料都可用于本文的制剂或单位剂量的实践或测试，但现在描述一些方法和材料。除非另有说明，否则本文采用或考虑的技术是标准方法。材料、方法和实例仅是说明性而非限制性的。
除非另外指明，否则实践本发明将采用细胞生物学、分子生物学(包含重组技术)、微生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述常规技术在本领域技术人员的能力范围内。文献中充分解释了这种技术，如《分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:ALaboratory Manual)》，第二版 (Sambrook等人，1989)；《寡核苷酸合成(OligonucleotideSynthesis)》(M.J.Gait编，1984)；《动物细胞培养(Animal Cell Culture)》(R.I.Freshney编，1987)；《酶学方法(Methods in Enzymology)》(学术出版社有限公司(Academic Press，Inc.)；《实验免疫学手册(Handbook of Experimental Immunology)》(D.M.Weir和C.C.Blackwell编)；《哺乳动物细胞用基因转移载体(Gene Transfer Vectors forMammalian Cells)》(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)；《当代分子生物学方法 (CurrentProtocols in Molecular Biology)》(F.M.Ausubel等人编，1987)；《PCR:聚合酶链反应(PCR:The Polymerase Chain Reaction)》(Mullis等人编，1994)；以及《当代免疫学方法(Current Protocols in Immunology)》(J.E.Coligan等人编，1991)，所述文献中的每个文献均通过引用明确并入本文中。
以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
实施例1Anti-FluB 9B8单克隆抗体的制备
本实施例中限制性内切酶、Prime Star DNA聚合酶购自Takara公司。MagExtractor-RNA提取试剂盒购自TOYOBO公司。BD SMARTTM RACE cDNA AmplificationKit试剂盒购自Takara公司。 pMD-18T载体购自Takara公司。质粒提取试剂盒购自天根公司。引物合成和基因测序由Invitrogen 公司完成。
1.重组质粒的构建
(1)抗体基因制备
从分泌抗乙型流感病毒的单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取mRNA，通过RT-PCR方法获得 DNA产物，该产物用rTaq DNA聚合酶进行加A反应后***到pMD-18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取Heavy Chain及Light Chain基因克隆，各4个克隆送基因测序公司进行测序。
(2)Anti-FluB 9B8抗体可变区基因的序列分析
将上述测序得到的基因序列放在Kabat抗体数据库中进行分析，并利用VNTI11.5软件进行分析确定重链和轻链引物对扩增出的基因都是正确的，其中Light Chain扩增出的基因片段中，VL基因序列为321bp，其前方有57bp的前导肽序列；Heavy Chain引物对扩增出的基因片段中，VH基因序列为360bp，属于VH1基因家族，其前方有57bp的前导肽序列。
(3)重组抗体表达质粒的构建
pcDNATM 3.4
Figure BDA0003729637610000071
vector为构建的重组抗体真核表达载体，该表达载体已经引入HindIII、 BamHI、EcoRI等多克隆酶切位点，并命名为pcDNA3.4A表达载体，后续简称3.4A表达载体；根据上述pMD-18T中抗体可变区基因测序结果，设计该抗体的VL和VH基因特异性引物，两端分别带有HindIII、EcoRI酶切位点和保护碱基，通过PCR扩增方法扩出0.73kb的Light Chain基因片段和1.80kb的Heavy Chain基因片段。
Heavy Chain和Light Chain基因片段分别采用HindIII/EcoRI双酶切，3.4A载体采用 HindIII/EcoRI双酶切，将片段和载体纯化回收后Heavy Chain基因和Light Chain基因分别连接3.4A 表达载体中，分别得到Heavy Chain和Light Chain的重组表达质粒。
2.稳定细胞株筛选
(1)重组抗体表达质粒瞬时转染CHO细胞，确定表达质粒活性
质粒用超纯水稀释至40ug/100ul，调节CHO细胞1.43×107cells/ml于离心管中，100μL质粒与 700μL细胞混合，转入电转杯，电转，第3、5、7天取样计数，第7天收样检测。
包被液(主要成分NaHCO3)稀释羊抗鼠IgM 1ug/ml进行微孔板包被，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液(主要成份Na2HPO4+Nacl)清洗2次，拍干；加入封闭液 (20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的细胞上清，100uL/孔， 37℃，60min；甩掉板内液体，拍干，加入20％鼠阴性血封闭，每孔120ul，37℃，1h；甩掉板内液体，拍干，加入稀释的流感B重组抗原(自研)，每孔100uL，37℃，40min；洗涤液清洗5次，拍干；加入抗流感B单克隆抗体HRP标记物，每孔100uL，37℃，30min；加入显色液A液(50uL/ 孔)，加入显色液B液(50uL/孔)，10min；加入终止液，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm) 处读OD值。结果显示细胞上清稀释1000倍后反应OD仍大于1.0，未加细胞上清孔反应OD小于 0.1，表明质粒瞬转后产生的抗体流感B重组抗原(自研)有活性。
(2)重组抗体表达质粒线性化
准备下述试剂：Buffer 50μL、DNA 100μg/管、PuvⅠ酶10μL、无菌水补至500μL，37℃水浴酶切过夜；先用等体积酚/氯仿/异戊醇(下层)25:24:1，再用氯仿(水相)依次进行抽提；0.1倍体积 (水相)3M醋酸钠和2倍体积乙醇冰上沉淀，70％乙醇漂洗沉淀，去除有机溶剂，待乙醇挥发完全用适量的灭菌水进行复融，最后进行浓度的测定。
(3)重组抗体表达质粒稳定转染，加压筛选稳定细胞株
质粒用超纯水稀释至40ug/100ul，调节CHO细胞1.43×107cells/ml于离心管中，100μL质粒与 700μL细胞混合，转入电转杯，电转，次日计数；25umol/L MSX 96孔加压培养约25天。
显微镜下观察标记长有细胞的克隆孔，并记录汇合度；取培养上清，送样检测；挑选抗体浓度、相对浓度高的细胞株转24孔，3天左右转6孔；3天后保种批培，调整细胞密度0.5×106cells/ml，2.2ml进行批培养，细胞密度0.3×106cells/ml，2ml进行保种；7天6孔批培上清送样检测，挑选抗体浓度及细胞直径较小的细胞株转TPP保种传代。
3.重组抗体生产
(1)细胞扩培
细胞复苏之后先在125ml规格的摇瓶中培养，接种体积为30ml，培养基为100％Dynamis培养基，放置于转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％的摇床中。培养72h，以50万cells/ml接种密度接种扩培，扩培体积根据生产需求进行计算，培养基为100％Dynamis培养基。之后每72h 扩培一次。当细胞量满足生产需求时，严格控制接种密度为50万cells/ml左右进行生产。
(2)摇瓶生产及纯化
摇瓶参数：转速120r/min，温度为37℃，二氧化碳为8％。流加补料：在摇瓶中培养至72h时开始每天补料，HyCloneTM Cell BoostTM Feed 7a每天流加初始培养体积的3％，Feed 7b每天流加量为初始培养体积的千分之一，一直补到第12天(第12天补料)。葡萄糖在第六天补加3g/L。第 13天收样。用proteinA亲和层析柱进行亲和纯化。取6μg纯化的抗体进行还原性SDS-PAGE，电泳图如图所示，在还原性SDS-PAGE后显示两条带，1条Mr为70KD(重链)，另一条Mr为23KD (轻链)。
实施例2活性优化
实施例1得到的Anti-FluB 9B8单克隆抗体虽然具备结合乙型流感病毒抗原的能力，但抗体活性均不够理想，因而申请人通过对该抗体的轻链CDR及重链CDR进行定向突变。即利用计算机进行抗体可变区结构模拟、抗原与抗体可变区作用复合物结构模拟、抗体关键氨基酸分析及突变设计，根据突变方案设计合成覆盖突变位点的双向引物，合成目的DNA两端引物，进行高保真PCR 反应，将PCR产物克隆至载体，再按照实施例1所述的方法进行突变抗体的制备。经筛选，得到抗体活性显著提升的单克隆抗体，并命名为：Anti-FluB9B8mut1，其重链和轻链氨基酸序列分别如 SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:12所示。
实施例3抗体的活性和性能检测
1.活性鉴定
包被液(主要成分NaHCO3)稀释羊抗鼠IgM 1ug/ml进行微孔板包被，每孔100uL，4℃过夜；次日，洗涤液(主要成份Na2HPO4+Nacl)清洗2次，拍干；加入封闭液 (20％BSA+80％PBS)，每孔120uL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的纯化抗体，100uL/孔， 37℃，60min；甩掉板内液体，拍干，加入20％鼠阴性血封闭，每孔120ul，37℃，1h；甩掉板内液体，拍干，加入稀释的流感B重组抗原(自研)，每孔100uL，37℃，40min；洗涤液清洗5次，拍干；加入抗流感B单克隆抗体HRP标记物，每孔100uL，37℃，30min；加入显色液A液(50uL/ 孔)，加入显色液B液(50uL/孔)，10min；加入终止液，50uL/孔；酶标仪上450nm(参考630nm) 处读OD值。结果见下表。
表1活性数据
样品浓度(ng/ml) 250.00 125.00 62.50 31.25 15.63 0.00
对照 1.602 1.225 0.672 0.351 0.181 0.063
Anti-FluB 9B8mut1 1.901 1.563 1.129 0.588 0.356 0.064 
2.抗体在胶体金检测上的应用
2.1胶体金检测试纸的制备
2.1.1硝酸纤维素膜的制备
硝酸纤维素膜的制备：用包被缓冲液将另一株流感B抗体稀释到1～5mg/ml，调整机器，划线为T线，即为检测线，T线靠近金标垫端；用包被缓冲液将羊抗鼠IgG抗体稀释到1～5mg/ml，调整机器，划线为C线，即为控制线，C线靠近吸收垫。两线距离5～8mm，均匀。37℃烘干，封装备用。
2.1.2胶体金、金标记单克隆抗体的制备
用双蒸去离子水将1％氯金酸稀释成0.01％，置电炉煮沸，按每100ml 0.01％氯金酸加入2ml 1％柠檬酸三钠，继续煮沸，直到液体呈亮红色即停止加热，冷却至室温后补足失水。制备好的胶体金外观应纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。
用0.1M碳酸钾调胶体金的pH值至8.2，加入纯化抗体，磁力搅拌器混匀30min，搅拌下加入 BSA至终浓度为1％静置1小时。13000rpm、4℃离心30min，弃上清，沉淀用标记洗涤保存液洗涤两次，用十分之一初始胶体金体积的标记洗涤保存液将沉淀重悬，置4℃备用。
2.1.3金标垫的制备。
将金标垫浸泡于封闭液中30min后，于37℃烘干。然后将制备好的金标记抗体均匀的铺在金标垫上，每毫升溶液铺20平方厘米，冷冻干燥，封装，置4℃备用。
2.1.4检测试纸的组装
将吸收垫(购自Millipore公司)、硝酸纤维素膜、金标垫、样品垫设置在不吸水的支撑薄片上，切成3mm宽的小条。每十小条一包，加入干燥剂，真空封装，得到所述检测试纸。
2.2抗体在胶体金检测中的应用
利用上述组装好的检测试纸条检测被检材料中是否含有流感B病毒抗原，从而确定专利中所得抗体对流感B病毒抗原检测的作用性。利用双抗体夹心法来检测被检材料中的是否含有流感B病毒抗原。检测时，流感B病毒抗原先和胶体金标记的流感B抗体结合形成流感B抗原-胶体金标记-流感B抗体复合物，由于毛细管作用，流感B抗原-胶体金标记流感B抗体复合物沿硝酸纤维素膜向前泳动，到达检测线时，流感B抗原-胶体金标记-流感B抗体复合物会与上述实施例制备得到的流感B抗体结合，形成流感B抗体-流感B抗原-胶体金标记-流感B抗体的复合物，从而富集在检测线上，形成红色沉淀线。未结合检测线上流感B抗体的流感B抗原-胶体金标记-流感B抗体复合物则通过检测线，被羊抗鼠IgG抗体捕获，富集在质控线上，形成红色沉淀线。当检测线与质控线同时有红色沉淀线时判为阳性结果。若样品中不含有流感B病毒抗原，未结合流感B病毒抗原的胶体金标记的流感B抗体到达检测线时，不会形成流感B抗体-流感B抗原-胶体金标记-流感B抗体的复合物，未结合流感B抗原的胶体金标记的流感B抗体复合物通过检测线，仅富集在质控线上形成红色沉淀线，此时判为阴性结果。
备注：金标显色以C加数字组成，C后面的数字越小表示显色越强，活性越高；C后面的数字越高表示显色越弱，活性越低；数字后带“+”比不带显色略强0.5-1C，数字后带“-”比不带显色略低 0.5-1C，“B”代表阴性。
表2
Figure BDA0003729637610000101
3.稳定性考核
将上述抗体置于4℃(冰箱)、-80℃(冰箱)、37℃(恒温箱)放置21天，取7天、14天、21 天样品进行状态观察，并对21天样品进行活性检测，结果显示三种考核条件下抗体放置21天均未见明显蛋白状态变化，活性也未随考核温度的升高呈下降趋势，说明上述抗体稳定。下表为抗体考核21天的酶免活性检测OD结果。
表3稳定性数据
Figure BDA0003729637610000102
Figure BDA0003729637610000111
以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
本申请涉及的部分氨基酸序列如下所示：
序列编号 序列片段
SEQ ID NO:1 DYNID
SEQ ID NO:2 DINPNNGGTIYTQKFKG
SEQ ID NO:3 GDNYGSSF
SEQ ID NO:4 RASQSIGTNIH
SEQ ID NO:5 YASESIS
SEQ ID NO:6 QQSNSWP 
SEQUENCE LISTING
<110> 东莞市朋志生物科技有限公司
<120> 抗乙型流感病毒抗体、检测乙型流感病毒的试剂和试剂盒
<130> P2022075CN01
<160> 12
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 1
Asp Tyr Asn Ile Asp
1               5
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 2
Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Thr Gln Lys Phe Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 3
<211> 8
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 3
Gly Asp Asn Tyr Gly Ser Ser Phe
1               5
<210> 4
<211> 11
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 4
Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn Ile His
1               5                   10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 5
Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser
1               5
<210> 6
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 6
Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro
1               5
<210> 7
<211> 455
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 7
Glu Ser Gln Ser Phe Pro Asn Val Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Ser
1               5                   10                  15
Pro Leu Ser Asp Lys Asn Leu Val Ala Met Gly Cys Leu Ala Arg Asp
            20                  25                  30
Phe Leu Pro Ser Thr Ile Ser Phe Thr Trp Asn Tyr Gln Asn Asn Thr
        35                  40                  45
Glu Val Ile Gln Gly Ile Arg Thr Phe Pro Thr Leu Arg Thr Gly Gly
    50                  55                  60
Lys Tyr Leu Ala Thr Ser Gln Val Leu Leu Ser Pro Lys Ser Ile Leu
65                  70                  75                  80
Glu Gly Ser Asp Glu Tyr Leu Val Cys Lys Ile His Tyr Gly Gly Lys
                85                  90                  95
Asn Arg Asp Leu His Val Pro Ile Pro Ala Val Ala Glu Met Asn Pro
            100                 105                 110
Asn Val Asn Val Phe Val Pro Pro Arg Asp Gly Phe Ser Gly Pro Ala
        115                 120                 125
Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys Glu Ala Thr Asn Phe Thr Pro Lys
    130                 135                 140
Pro Ile Thr Val Ser Trp Leu Lys Asp Gly Lys Leu Val Glu Ser Gly
145                 150                 155                 160
Phe Thr Thr Asp Pro Val Thr Ile Glu Asn Lys Gly Ser Thr Pro Gln
                165                 170                 175
Thr Tyr Lys Val Ile Ser Thr Leu Thr Ile Ser Glu Ile Asp Trp Leu
            180                 185                 190
Asn Leu Asn Val Tyr Thr Cys Arg Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe
        195                 200                 205
Leu Lys Asn Val Ser Ser Thr Cys Ala Ala Ser Pro Ser Thr Asp Ile
    210                 215                 220
Leu Thr Phe Thr Ile Pro Pro Ser Phe Ala Asp Ile Phe Leu Ser Lys
225                 230                 235                 240
Ser Ala Asn Leu Thr Cys Leu Val Ser Asn Leu Ala Thr Tyr Glu Thr
                245                 250                 255
Leu Asn Ile Ser Trp Ala Ser Gln Ser Gly Glu Pro Leu Glu Thr Lys
            260                 265                 270
Ile Lys Ile Met Glu Ser His Pro Asn Gly Thr Phe Ser Ala Lys Gly
        275                 280                 285
Val Ala Ser Val Cys Val Glu Asp Trp Asn Asn Arg Lys Glu Phe Val
    290                 295                 300
Cys Thr Val Thr His Arg Asp Leu Pro Ser Pro Gln Lys Lys Phe Ile
305                 310                 315                 320
Ser Lys Pro Asn Glu Val His Lys His Pro Pro Ala Val Tyr Leu Leu
                325                 330                 335
Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn Leu Arg Glu Ser Ala Thr Val Thr
            340                 345                 350
Cys Leu Val Lys Gly Phe Ser Pro Ala Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu
        355                 360                 365
Gln Arg Gly Gln Leu Leu Pro Gln Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro
    370                 375                 380
Met Pro Glu Pro Gly Ala Pro Gly Phe Tyr Phe Thr His Ser Ile Leu
385                 390                 395                 400
Thr Val Thr Glu Glu Glu Trp Asn Ser Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val
                405                 410                 415
Val Gly His Glu Ala Leu Pro His Leu Val Thr Glu Arg Thr Val Asp
            420                 425                 430
Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu Tyr Asn Val Ser Leu Ile Met Ser
        435                 440                 445
Asp Thr Gly Gly Thr Cys Tyr
    450                 455
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 8
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
            20                  25                  30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
        35                  40                  45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
    50                  55                  60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65                  70                  75                  80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
                85                  90                  95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
            100                 105
<210> 9
<211> 120
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 9
Glu Val Leu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Asn Ile Asp Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Thr Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Asp Asn Tyr Gly Ser Ser Phe Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210> 10
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 10
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
            20                  25                  30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
            100                 105
<210> 11
<211> 575
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 11
Glu Val Leu Leu Gln Gln Ser Gly Pro Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala
1               5                   10                  15
Ser Val Lys Ile Pro Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr
            20                  25                  30
Asn Ile Asp Trp Val Arg Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile
        35                  40                  45
Gly Asp Ile Asn Pro Asn Asn Gly Gly Thr Ile Tyr Thr Gln Lys Phe
    50                  55                  60
Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65                  70                  75                  80
Met Glu Phe Arg Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Gly Asp Asn Tyr Gly Ser Ser Phe Leu Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Glu Ser Gln Ser Phe Pro Asn Val
        115                 120                 125
Phe Pro Leu Val Ser Cys Glu Ser Pro Leu Ser Asp Lys Asn Leu Val
    130                 135                 140
Ala Met Gly Cys Leu Ala Arg Asp Phe Leu Pro Ser Thr Ile Ser Phe
145                 150                 155                 160
Thr Trp Asn Tyr Gln Asn Asn Thr Glu Val Ile Gln Gly Ile Arg Thr
                165                 170                 175
Phe Pro Thr Leu Arg Thr Gly Gly Lys Tyr Leu Ala Thr Ser Gln Val
            180                 185                 190
Leu Leu Ser Pro Lys Ser Ile Leu Glu Gly Ser Asp Glu Tyr Leu Val
        195                 200                 205
Cys Lys Ile His Tyr Gly Gly Lys Asn Arg Asp Leu His Val Pro Ile
    210                 215                 220
Pro Ala Val Ala Glu Met Asn Pro Asn Val Asn Val Phe Val Pro Pro
225                 230                 235                 240
Arg Asp Gly Phe Ser Gly Pro Ala Pro Arg Lys Ser Lys Leu Ile Cys
                245                 250                 255
Glu Ala Thr Asn Phe Thr Pro Lys Pro Ile Thr Val Ser Trp Leu Lys
            260                 265                 270
Asp Gly Lys Leu Val Glu Ser Gly Phe Thr Thr Asp Pro Val Thr Ile
        275                 280                 285
Glu Asn Lys Gly Ser Thr Pro Gln Thr Tyr Lys Val Ile Ser Thr Leu
    290                 295                 300
Thr Ile Ser Glu Ile Asp Trp Leu Asn Leu Asn Val Tyr Thr Cys Arg
305                 310                 315                 320
Val Asp His Arg Gly Leu Thr Phe Leu Lys Asn Val Ser Ser Thr Cys
                325                 330                 335
Ala Ala Ser Pro Ser Thr Asp Ile Leu Thr Phe Thr Ile Pro Pro Ser
            340                 345                 350
Phe Ala Asp Ile Phe Leu Ser Lys Ser Ala Asn Leu Thr Cys Leu Val
        355                 360                 365
Ser Asn Leu Ala Thr Tyr Glu Thr Leu Asn Ile Ser Trp Ala Ser Gln
    370                 375                 380
Ser Gly Glu Pro Leu Glu Thr Lys Ile Lys Ile Met Glu Ser His Pro
385                 390                 395                 400
Asn Gly Thr Phe Ser Ala Lys Gly Val Ala Ser Val Cys Val Glu Asp
                405                 410                 415
Trp Asn Asn Arg Lys Glu Phe Val Cys Thr Val Thr His Arg Asp Leu
            420                 425                 430
Pro Ser Pro Gln Lys Lys Phe Ile Ser Lys Pro Asn Glu Val His Lys
        435                 440                 445
His Pro Pro Ala Val Tyr Leu Leu Pro Pro Ala Arg Glu Gln Leu Asn
    450                 455                 460
Leu Arg Glu Ser Ala Thr Val Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Ser Pro
465                 470                 475                 480
Ala Asp Ile Ser Val Gln Trp Leu Gln Arg Gly Gln Leu Leu Pro Gln
                485                 490                 495
Glu Lys Tyr Val Thr Ser Ala Pro Met Pro Glu Pro Gly Ala Pro Gly
            500                 505                 510
Phe Tyr Phe Thr His Ser Ile Leu Thr Val Thr Glu Glu Glu Trp Asn
        515                 520                 525
Ser Gly Glu Thr Tyr Thr Cys Val Val Gly His Glu Ala Leu Pro His
    530                 535                 540
Leu Val Thr Glu Arg Thr Val Asp Lys Ser Thr Gly Lys Pro Thr Leu
545                 550                 555                 560
Tyr Asn Val Ser Leu Ile Met Ser Asp Thr Gly Gly Thr Cys Tyr
                565                 570                 575
<210> 12
<211> 214
<212> PRT
<213> Artificial
<220>
<223> 人工序列
<400> 12
Asp Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Val Ser Phe Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Gly Thr Asn
            20                  25                  30
Ile His Trp Tyr Gln Gln Arg Thr Asn Gly Ser Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Lys Tyr Ala Ser Glu Ser Ile Ser Gly Ile Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Ser Leu Ser Ile Asn Ser Val Glu Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Ile Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Asn Ser Trp Pro Tyr
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Asp Ala Ala
            100                 105                 110
Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly
        115                 120                 125
Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile
    130                 135                 140
Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu
145                 150                 155                 160
Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser
                165                 170                 175
Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr
            180                 185                 190
Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser
        195                 200                 205
Phe Asn Arg Asn Glu Cys
    210

Claims (10)

1.一种抗乙型流感病毒抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段包括：
a)氨基酸序列如SEQ ID NO:1至3所示的HCDR1、HCDR2、HCDR3，和氨基酸序列如SEQ IDNO:4至SEQ ID NO:6所示的LCDR1、LCDR2和LCDR3；或
b)氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示的重链可变区，和氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示的轻链可变区；或
c)氨基酸序列与b)所示序列具有80％以上同一性的重链可变区和轻链可变区，且包括a)所示序列的HCDR1至HCDR3和LCDR1至LCDR3；或
d)氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示的重链，和氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的轻链。
2.根据权利要求1所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述抗体或其功能性片段还包含恒定区；
可选地，所述恒定区包括重链恒定区和/或轻链恒定区；
可选地，所述重链恒定区选自IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA、IgM、IgE或IgD的重链恒定区；所述轻链恒定区选自κ型或λ型轻链恒定区；
可选地，所述恒定区选自IgM的重链恒定区；
可选地，所述恒定区的种属来源为牛、马、猪、绵羊、山羊、大鼠、小鼠、狗、猫、兔、驴、鹿、貂、鸡、鸭、鹅或人；
可选地，所述恒定区的种属来源为小鼠；
可选地，所述重链恒定区序列如SEQ ID NO:7所示或与其具有至少80％同一性；
可选地，所述轻链恒定区序列如SEQ ID NO:8所示或与其具有至少80％同一性。
3.根据权利要求1至2任一所述的抗体或其功能性片段，其特征在于，所述功能性片段选自所述抗体的F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv和scFv中的任意一种。
4.一种抗体偶联物，其特征在于，所述抗体偶联物包括权利要求1至3任一项所述的抗体或其功能性片段；
可选地，所述抗体偶联至生物素或生物素衍生物；
可选地，所述抗体偶联至固相；
可选地，所述抗体偶联至标记物；
可选地，所述标记物选自荧光染料、酶、放射性同位素、化学发光试剂和纳米颗粒类标记物；优选为胶体金。
5.一种检测乙型流感病毒的试剂或试剂盒，其特征在于，所述试剂或试剂盒包括权利要求1至3任一项所述的抗体或其功能性片段或权利要求4所述的抗体偶联物。
6.一种检测乙型流感病毒的方法，其特征在于，包括：
使权利要求1至3任一项所述的抗体其功能性片段、权利要求4所述的抗体偶联物或权利要求5所述的试剂或试剂盒与待检测样品中的乙型流感病毒接触形成免疫复合物；
优选地，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与所述抗体或其功能性片段结合；
优选地，所述免疫复合物还包括第二抗体，所述第二抗体与乙型流感病毒结合。
7.一种核酸，其特征在于，其编码权利要求1至3任一项所述的抗体或其功能性片段。
8.一种载体，其特征在于，其含有权利要求7所述的核酸。
9.一种细胞，其特征在于，其含有权利要求7所述的核酸或权利要求8所述的载体。
10.一种制备权利要求1至3任一项所述的抗体或其功能性片段的方法，其特征在于，其包括：培养权利要求9所述的细胞。
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