CN115919883B - 一种具有抗球形马拉色菌耐药性作用的组合物及其制备方法 - Google Patents
一种具有抗球形马拉色菌耐药性作用的组合物及其制备方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明涉及一种具有抗球形马拉色菌耐药性作用的组合物及其制备方法,该组合物用于治疗球形马拉色菌过度增殖引起的真菌感染性皮肤疾病,这对球形马拉色菌生物被膜感染引起的脂溢性皮炎的治疗具有显著作用;一种所述组合物的活性成分为诃子宁和丁香酚,其中,诃子宁与丁香酚的质量配比为1‑5:1;其制备方法包括以下步骤:诃子宁贮备液的制备、丁香酚贮备液的制备和组合物的制备;属于抗球形马拉色菌药物的技术领域。
Description
技术领域
本发明属于抗球形马拉色菌药物的技术领域,涉及一种具有抗球形马拉色菌耐药性作用的组合物及其制备方法。
背景技术
生物被膜是马拉色菌抗药性增强的重要机制,生物被膜中马拉色菌比浮游态马拉色菌的抗药性高几百倍,而抗药性是目前抗真菌治疗失败的重要原因。研究表明,球形马拉色菌附着在头皮表面,并产生核酸、蛋白质、多糖和脂类等胞外聚合物包裹真菌形成生物被膜。马拉色菌生物被膜是马拉色菌持续感染、马拉色菌抵抗宿主免疫反应、马拉色菌耐药性增强等现象的重要原因,即生物被膜使得常用抗真菌药物对真菌诱发的脂溢性皮炎等皮肤疾病的治疗效果极大降低。
面对脂溢性皮炎等皮肤疾病的困扰,开发新型具有生物被膜抑制或者清除作用的抗耐药制剂成为广大消费者的迫切需求。临床上通常采用酮康唑等抗菌药物治疗马拉色菌过度增殖引起的脂溢性皮炎等皮肤疾病,但酮康唑、咪康唑等大多溶解度差,对皮肤有刺激性,同时药物相互作用的副作用,限制了药物的实际应用。以往日用产品中添加抗菌剂吡啶硫酮锌,它虽然具有很好的抑菌活性,但存在强烈的脱脂作用,长期使用会引发头发干枯、断裂及头皮干燥等问题,反复使用易导致耐药;此外其对水生生物的毒性较大,具有生态危害性,已在欧盟被禁用。由此可见,现有的抗菌药物或者抗菌剂已不能满足广大消费者追求健康,绿色的愿望,开发安全、高效、经济、环保的具有清除微生物生物被膜作用的抗耐药制剂成为日用化学领域的研究热点。
诃子宁(chebulanin)属于酚酸类成分,具有抗氧化、抗炎、抗菌等多种生物活性,但诃子宁抑菌以及抑制真菌生物被膜作用尚未有研究报道。丁香酚(eugenol)是一种有机酚,具有解热镇痛、抗炎、麻醉、抗细菌、抗真菌、抗氧化、抗癌、驱蚊避虫等多种活性,已有研究报道丁香酚通过破坏微生物细胞壁和细胞膜结构达到杀菌效果,但丁香酚对球形马拉色菌生物被膜的抑制或者清除作用尚未见报道。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有抗球形马拉色菌耐药性作用的组合物,该组合物用于治疗马拉色菌过度增殖引起的真菌感染性皮肤疾病,这对马拉色菌生物被膜感染引起的脂溢性皮炎的治疗具有显著作用。
能够有效抑制球形马拉色菌生物被膜生成或清除已生成的球形马拉色菌生物被膜,进而发挥抗球形马拉色菌耐药性作用,并且对人体更加安全无刺激、无副作用,可用于治疗和/或预防球形马拉色菌及其生物被膜引起耐药性皮肤感染疾病药物的制备。
本发明的目的可以通过以下技术方案实现:
所述组合物的活性成分为诃子宁和丁香酚,其中,诃子宁与丁香酚的质量配比为1-5:1。
作为本发明的一种优选技术方案,所述活性成分的百分含量为0.0001-99%。
作为本发明的一种优选技术方案,所述组合物还包括二甲基亚砜或者辅料。
作为本发明的一种优选技术方案,所述组合物的剂型为胶囊剂、片剂、微囊制剂、注射剂、栓剂、喷雾剂或软膏剂。
一种具有抗球形马拉色菌耐药性作用的组合物的制备方法,所述制备方法包括以下步骤:
S1、诃子宁贮备液的制备:称取诃子宁溶解配置成浓度为12mg/mL的药物贮备液A;
S2、丁香酚贮备液的制备:称取丁香酚溶解配置成浓度为12mg/mL的药物贮备液B;
S3、组合物的制备:按诃子宁与丁香酚的质量配比为1-5:1,将药物贮备液A和药物贮备液B混合均匀,稀释后得到组合物。
作为本发明的一种优选技术方案,在步骤S3中,稀释后组合物的浓度为1.69-6.76ug/ml。
作为本发明的一种优选技术方案,所述组合物的应用是将组合物制成药物。
本发明的有益效果:
(1)本发明的组合物具有优异的协同效果,当诃子宁与丁香酚=1-5∶1时,混合使用时对抗球形马拉色菌耐药性的增效作用最明显。
(2)本发明制备的组合物对球形马拉色菌病具有较好的防治效果。
(3)本发明的组合物联合使用可减缓抗药性产生,降低用药剂量。
附图说明
图1为组合物C对黏附期生物被膜微观形态影响的实验结果的SEM图;在图1中,A为生长组;B为吡啶硫酮锌-MIC;C为组合物C-1/2MIC;D为组合物C-MIC;E为组合物C-2MIC。
图2为组合物C对聚集期生物被膜微观形态影响的实验结果的SEM图;在图2中,A为生长组;B为吡啶硫酮锌-MIC;C为组合物C-1/2MIC;D为组合物C-MIC;E为组合物C-2MIC。
图3为组合物C对成熟期生物被膜微观形态影响的实验结果的SEM图;在图3中,A为生长组;B为吡啶硫酮锌-MIC;C为组合物C-1/2MIC;D为组合物C-MIC;E为组合物C-2MIC。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明为实现预定发明目的所采取的技术手段及功效,以下结合实施例,对依据本发明的具体实施方式、结构、特征及其功效,详细说明如下。
试剂
XTT(北京酷来搏科技有限公司,CX30182035);结晶紫(美国Amresco公司,20181202);无水乙醇(天津市致远化学试剂有限公司,2016120149);吡啶硫酮锌(上海麦克林生化科技有限公司,批号:C10319727,纯度>96%);改良Dixon培养基(海博生物技术有限公司,批号:20190401);Gluta固定液(电镜专用,2.5%)(美国Solarbio公司,批号:20181201);叔丁醇(天津市致远化学试剂有限公司,批号:20171101532);PBS缓冲溶液(美国Hyclone公司,批号:A20181004);甲萘醌(上海阿拉丁生化科技股份有限公司,批号:C1517035)。
仪器
SW-CJ-1F超净工作台(苏净集团安泰公司);Memmert恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);YSQ-LS-18SI手提式压力蒸汽灭菌锅(上海***实业有限公司);电子天平(上海精科天美科学仪器有限公司);iMark酶标仪(美国BIO-RAD公司);JEM-2100HR冷场发射扫描电子显微镜(日本电子株式会社);96平底孔板(无锡耐思生物科技有限公司);90mm平皿(美国Coastar公司);48孔板(无锡耐思生物科技有限公司);14mm无菌爬片(上海WHB公司)。
受试菌株的菌液配置:在无菌工作台中,将马拉色菌甘油冻存菌株接种于改良Dixon琼脂平板上,置于32℃恒温培养箱中培养6~7天,然后放置于4℃冰箱中备用;实验前从琼脂平板上挑取单菌落接种于10mL改良Dixon液体培养基中,置于220r/min摇床中摇48h。采用菌液倍比稀释法进行菌液计数;计数后将菌液离心,吸弃上清液,无菌生理盐水重悬沉淀,配成终浓度为1×106CFU/mL菌液。
实验受试菌株:
1株限制性马拉色菌(Malasseziarestricta)(临床株编号CICC33081):购自中国工业微生物菌种保藏中心;1株球形马拉色菌(Malasseziaglobosa)(临床株编号MC14)、5株糠秕马拉色菌(Malasseziafurfur)(临床株编号Y17d,Y19a,Y19b,Y17c,Y17e):均购自中国医学科学院皮肤研究所;1株***滑念珠菌(Candidaparapsilosis)(质控标准株编号ATCC22019):购自广东省微生物菌种保藏中心。
培养基的制备:
改良Dxion液体培养基(mDxion,pH6.0-6.2)和改良Dxion琼脂培养基(Dxion,pH6.0-6.2):按照使用说明配备,准确称取培养基颗粒66.0g(琼脂培养基则再加入15g琼脂)置于烧杯中,加入去离子水900mL,使用玻璃棒搅拌至颗粒溶解完全,pH值调节至6.1±0.1,分装至锥形瓶并以橡胶塞封口,牛皮纸紧密包扎封口处,121℃高压灭菌30min,冷却后置于4℃冰箱保存备用。
构建生物被膜:
相关研究表明了,球形马拉色菌MC14生物被膜黏附期、聚集期和成熟期分别为0~48h、48~120h和120~168h,因此,生物被膜黏附期、聚集期和成熟期的给药时间分别为24h、96h和168h。
将1×106CFU/mL的MC14菌液取200μL接种至平底96孔板中,根于32℃分别培养24h、96h、168h后结束培养(每隔48h更换一次培养基),分别得到黏附、聚集和成熟期的MC14生物被膜。
(一)参照例1
测试诃子宁、丁香酚、吡啶硫酮锌和酮康唑对马拉色菌不同菌株的影响
实验方法
诃子宁贮备液的制备:称取诃子宁6mg,加入0.5mL二甲基亚砜溶解配置成浓度为12mg/mL的药物贮备液,现配现用。
丁香酚贮备液的制备:称取丁香酚6mg,加入0.5mL二甲基亚砜溶解配置成浓度为12mg/mL的药物贮备液,现配现用。
吡啶硫酮锌贮备液的制备:称取吡啶硫酮锌粉末20mg,加入2mL二甲基亚砜溶解配置成浓度为10mg/mL的药物贮备液,置于4℃冰箱内避光保存,备用。
酮康唑贮备液的制备:称取酮康唑粉末50mg,加入0.5mL二甲基亚砜溶解配置成浓度为100mg/mL的药物贮备液,置于4℃冰箱内避光保存,备用。
微量稀释法测定最小抑菌浓度(MIC)
参照美国临床实验室标准化协会(CLSI)制定的M27-A3方案微量稀释法对马拉色菌的以上7种菌株进行体外药敏试验;其具体步骤如下:
最小抑菌浓度MIC值的测定,马拉色菌药敏实验,取上述浓度为1×106CFU/mL菌液备用。用改良Dixon(mDixon)液体培养基于96孔板上的第1至第10列对药品贮备液进行二倍稀释(稀释浓度为12~0.023μg/mL),第11列为生长对照孔,加入100μL改良Dixon(mDixon)液体培养基;第12列为空白对照,加入200μL改良Dixon(mDixon)液体培养基。然后再于第1-11列各孔中加入100μL接种菌液,将96孔板于32℃恒温孵育7d,以肉眼观察,无菌生长的各孔中,药物浓度最低的孔的药物浓度即为试验药物对受试菌的最小抑菌浓度(Minimuminhibitoryconcentration,MIC)。
质量控制:为了明确药敏性试验操作是在可接受的标准内进行,测试结果可信,在每次测定时应进行质量控制,质量控制株采用***滑念珠菌(ATCC22019),质控药物为酮康唑,在平行操作条件下,质量控制株的48h后MIC为0.06~0.25μg/mL范围内,如此则视为测定结果有效可信。
采用graphpadprism8.0软件进行分析。用one-wayANOVA方法进行统计分析,各组数据均以值表示,以p-value<0.05表示有统计学意义,实验结果如表1。
表1诃子宁和丁香酚MIC(μg/ml)值(n=6,)
实验结果如表1所示,限制性马拉色菌MR、球形马拉色菌MC14、糠秕马拉色菌Y17c、糠秕马拉色菌Y17d、糠秕马拉色菌Y17e、糠秕马拉色菌Y19a、糠秕马拉色菌Y19b中,诃子宁对球形马拉色菌MC14的抑制效果最佳,MIC值为5.72±3.33μg/mL。丁香酚也对球形马拉色菌MC14的抑制效果最佳,MIC值为1.03±0.17μg/mL。
诃子宁和丁香酚具有较好的抑制马拉色菌的作用,且对球形马拉色菌MC14的抑制作用更加明显,后续的实验将选择球形马拉色菌MC14作为实验受试菌株。球形马拉色菌是脂溢性皮炎、花斑癣等皮肤疾病的主要致病菌之一,而本研究数据显示诃子宁和丁香酚对球形马拉色菌具有较好的抑制作用,这对研究诃子宁和丁香酚预防或者治疗球形马拉色菌感染引发的相关皮肤病的应用上具有重大意义。
吡啶硫铜锌和酮康唑对球形马拉色菌MC14的MIC值分别为1.04±0.37μg/mL和4.22±1.75μg/mL,吡啶硫铜锌对球形马拉色菌MC14的抑制作用优于酮康唑,因此,后续的实验研究选择吡啶硫铜锌作为阳性对照药物。
综合以上分析,后续实验将选择球形马拉色菌MC14作为实验供试菌,选择吡啶硫酮锌作为阳性对照药物,并将进一步构建球形马拉色菌生物被膜用于后续研究。
(二)参照例2
实验药物的制备
诃子宁和丁香酚组合物的制备:设置生长对照组、吡啶硫铜锌组、诃子宁组、丁香酚组、组合物A(诃子宁:丁香酚=5:1)、组合物B(诃子宁:丁香酚=3:1)、组合物C(诃子宁:丁香酚=1:1),将诃子宁与丁香酚的实验贮备液进行稀释,得到MIC的诃子宁和丁香酚,再按照上述实验分组组合成不同比例的诃子宁和丁香酚的组合物,组合物现配现用。
实验步骤
采用结晶紫半定量实验测定组合物A-C对黏附期生物被膜基质的影响
药物处理:按上述方法建立黏附期生物被膜后,吸弃培养基,用PBS漂洗;分别加入200μL梯度浓度药物供试液(即加入MIC的诃子宁、丁香酚和吡啶硫铜锌,加入上述的组合物A-C)。以只加200μL的培养基为生长对照组,32℃培养5天,吸弃培养基和药液,PBS漂洗,用作后续测定。
药物处理后,每孔加200μL的2.5%戊二醛固定液固定30min吸弃固定液;每孔加入200μL的0.1%结晶紫溶染色15min,用PBS冲洗掉未染色染液;每孔加入200μL的95%乙醇进行溶解,取100μL用酶标仪在波长为595nm处测OD值,记录实验结果。实验重复三次每次三组平行。
统计数据分析
本参照例中所得数据采用graphpadprism8.0软件进行分析。用one-wayANOVA方法进行统计分析,各组数据均以表示,以p-value<0.05表示有统计学意义;测试结果如表2所示。
表2组合物A-C对黏附期生物被膜基质的影响(n=5,)
注:用one-wayANOVA方法进行统计分析时,样品组与生长对照组相比,显著性以*表示,*p-value<0.05表示具有显著性差异,**p-value<0.01表示有极显著性差异。样品组与诃子宁组相比,显著性以#表示,#p-value<0.05表示具有显著性差异,##p-value<0.01表示有极显著差异。
实验结果见表2,与生长对照组相比,组合物A能显著降低黏附期生物被膜基质(P<0.01),组合物B能显著降低黏附期生物被膜基质(P<0.001),组合物C能显著降低黏附期生物被膜基质(P<0.0001)。
所有的实验组中,与生长对照相比,组合物A-C对球形马拉色菌黏附期生物被膜基质的下调率均优于诃子宁和丁香酚,说明诃子宁和丁香酚组合后抑制黏附期生物被膜基质更加明显。
(三)参照例3
实验试剂及药物制备
组合物C的制备:将诃子宁与丁香酚的实验贮备液进行稀释,再按照诃子宁:丁香酚=1:1的比例制备组合物C,组合物C现配现用。
结晶紫溶液的制备:称取结晶紫0.1g溶解于10mL95%乙醇中配置成均一稳定溶液A,称取0.8g草酸胺溶解于40mL双蒸水中配制成溶液B。将溶液A,B混合,保存于棕色瓶中48h后即可使用。
实验步骤
采用结晶紫半定量实验测定组合物C对黏附和聚集期生物被膜基质的影响
药物处理:按上述方法建立黏附和聚集期的生物被膜后,吸弃培养基,用PBS漂洗;分别加入200μL梯度浓度药物供试液(组合物C-1/2MIC、组合物C-MIC、组合物C-2MIC浓度分别等于1.69μg/mL、3.38μg/mL、6.76μg/mL,吡啶硫铜锌-MIC的浓度等于1.04μg/mL)。以只加200μL的培养基为生长对照组,32℃培养5d,吸弃培养基和药液,PBS漂洗,用作后续测定。
构建黏附和聚集期生物被膜并进行药物处理后,每孔加200μL的2.5%戊二醛固定液固定30min吸弃固定液;每孔加入200μL的0.1%结晶紫溶染色15min,用PBS冲洗掉未染色染液;每孔加入200μL的95%乙醇进行溶解,取100μL用酶标仪在波长为595nm处测OD值,记录实验结果。实验重复三次每次三组平行。
统计数据分析
本参照例中所得数据采用graphpadprism8.0软件进行分析。用one-wayANOVA方法进行统计分析,各组数据均以表示,以p-value<0.05表示有统计学意义;结晶紫半定量实验测定组合物C对黏附和聚集期生物被膜基质影响的结果,实验结果如表3和表4所示。
表3组合物C对黏附期生物被膜基质的影响(n=5,)
注:用one-wayANOVA方法进行统计分析时,样品组与生长对照组相比,显著性以*表示,*p-value<0.05表示具有显著性差异,**p-value<0.01表示有极显著差异。样品组与吡啶硫铜锌组相比,显著性以#表示,#p-value<0.05表示具有显著性差异,##p-value<0.01表示有极显著差异。
实验结果见表3,与生长对照组相比,组合物C-1/2MIC能显著降低黏附期生物被膜基质(P<0.01),组合物C-MIC能显著降低黏附期生物被膜基质(P<0.0001),组合物C-2MIC能显著降低黏附期生物被膜基质(P<0.0001)。
与生长对照组相比,组合物C-1/2MIC、组合物C-MIC、组合物C-2MIC对生物被膜基质的下调率分别为13.51%、22.52%、30.18%,13.51%<22.52%<30.18%,即组合物C对生物被膜基质抑制作用呈现剂量依赖性。
表4组合物C对聚集期生物被膜基质的影响(n=5,)
注:用one-wayANOVA方法进行统计分析时,样品组与生长对照组相比,显著性以*表示,*p-value<0.05表示具有显著性差异,**p-value<0.01表示有极显著差异。样品组与吡啶硫铜锌组相比,显著性以#表示,#p-value<0.05表示具有显著性差异,##p-value<0.01表示有极显著差异。
实验结果见表4,与生长对照组相比,组合物C-1/2MIC能显著降低聚集期生物被膜基质(P<0.05),组合物C-MIC和组合物C-2MIC均能显著降低聚集期生物被膜基质(P<0.0001)。与Control组相比,组合物C-1/2MIC、组合物C-MIC、组合物C-2MIC对生物被膜基质的下调率分别为11.54%、18.85%、29.62%,11.54%<18.85%<29.62%,即组合物C对生物被膜基质抑制作用呈现剂量依赖性。
综合表3和表4的实验结果分析可知,对于黏附和聚集期的生物被膜,与生长对照组相比,三个浓度的组合物C均能抑制生物被膜基质,且对黏附和聚集期的生物被膜基质清除的效果均为组合物C-1/2MIC<组合物C-MIC<组合物C-2MIC,即组合物C对黏附和聚集期的生物被膜均具有优异的清除作用,并且呈现浓度依赖性。
与生长对照组相比,组合物C-2MIC对黏附期生物被膜基质下调率为30.18%,而吡啶硫铜锌组对生物被膜的下调率为42.34%。与生长对照组相比,组合物C-2MIC对聚集期生物被膜基质下调率为29.62%,而吡啶硫铜锌组对生物被膜的下调率为38.08%。上述数据说明组合物C-2MIC与吡啶硫铜锌相似,即对黏附期和聚集期生物被膜基质均有较稳定的清除作用。
本研究采用结晶紫半定量黏附实验测定组合物C对生物被膜成熟期影响时,由于活细胞、死细胞、细胞外基质的影响使OD值超出酶标仪的检测范围,故只检测药物对生物被膜黏附期和聚集期的影响。
(四)参照例4
采用活菌计数法测定组合物C对黏附、聚集、成熟期生物被膜活菌量的影响
药物处理:按上述方法建立黏附、聚集、成熟期的生物被膜后,吸弃培养基,用PBS漂洗;分别加入200μL梯度浓度药物供试液(组合物C-1/2MIC、组合物C-MIC、组合物C-2MIC浓度分别等于1.69μg/mL、3.38μg/mL、6.76μg/mL,吡啶硫铜锌-MIC的浓度等于1.04μg/mL)。以只加200μL的培养基为生长对照组,32℃培养5d,吸弃培养基和药液,PBS漂洗,用作后续测定。
构建黏附、聚集、成熟期的生物被膜并进行药物处理后,加适量无菌生理盐水合理稀释取100μL点在固体培养基上涂布均匀,分别放置在32℃和35℃的培养箱中培养5d和24h后,观察并计算平板上菌落数目,以log10CFU/mL推算出每毫升菌液的活菌数。实验重复三次每次三组平行。
活菌计数法测定组合物C对黏附、聚集、成熟期生物被膜活菌量影响的结果,其实验结果分别如表5、表6、表7所示。
表5组合物C对黏附期生物被膜活菌量的影响(n=5,)
注:用one-wayANOVA方法进行统计分析时,样品组与生长对照组相比,显著性以*表示,*p-value<0.05表示具有显著性差异,**p-value<0.01表示有极显著差异。样品组与吡啶硫铜锌组相比,显著性以#表示,#p-value<0.05表示具有显著性差异,##p-value<0.01表示有极显著差异。
实验结果见表5,与生长对照组相比,组合物C-1/2MIC能降低黏附期生物被膜活菌量(P<0.05),组合物C-MIC能显著降低黏附期生物被膜活菌量(P<0.01),组合物C-2MIC能显著降低黏附期生物被膜活菌量(P<0.0001)。
与生长对照组相比,组合物C-1/2MIC、组合物C-MIC、组合物C-2MIC对黏附期生物被膜活菌量的下调率分别为6.96%、10.89%、21.00%,且6.96%<10.89%<21.00%,即随着浓度增大,组合物C对黏附期生物被膜活菌量的下调率增加。
表6组合物C对聚集期生物被膜活菌量的影响(n=5,)
注:用one-wayANOVA方法进行统计分析时,样品组与生长对照组相比,显著性以*表示,*p-value<0.05表示具有显著性差异,**p-value<0.01表示有极显著差异。样品组与吡啶硫铜锌组相比,显著性以#表示,#p-value<0.05表示具有显著性差异,##p-value<0.01表示有极显著差异。
实验结果见表6,与生长对照组相比,组合物C-1/2MIC能降低聚集期生物被膜活菌量(P<0.05),组合物C-MIC能显著降低聚集期生物被膜活菌量(P<0.01),组合物C-2MIC均能显著降低聚集期生物被膜活菌量(P<0.0001),与吡啶硫铜锌组相比,组合物C-MIC和组合物C-2MIC降低聚集期生物被膜活菌量没有显著性差异(P>0.05)。
与生长对照组相比,组合物C-1/2MIC、组合物C-MIC、组合物C-2MIC对聚集期生物被膜活菌量的下调率分别为7.96%、11.57%、14.93%,且14.93%>11.57%>7.96%,即随着浓度增大,组合物C对聚集期生物被膜活菌量的下调率增加。
表7组合物C对成熟期生物被膜活菌量的影响(n=5,)
注:用one-wayANOVA方法进行统计分析时,样品组与生长对照组相比,显著性以*表示,*p-value<0.05表示具有显著性差异,**p-value<0.01表示有极显著差异。样品组与吡啶硫铜锌组相比,显著性以#表示,#p-value<0.05表示具有显著性差异,##p-value<0.01表示有极显著差异。
实验结果见表7,与生长对照组相比,组合物C-2MIC均能显著降低成熟期生物被膜活菌量(P<0.05),与吡啶硫铜锌组相比,组合物C-1/2MIC、组合物C-MIC、组合物C-2MIC降低成熟期生物被膜活菌量没有显著性差异(P>0.05)。
与生长对照组相比,组合物C-1/2MIC、组合物C-MIC、组合物C-2MIC对成熟期生物被膜活菌量的下调率分别为1.41%、4.13%、8.38%,且8.38%>4.13%>1.41%,即随着浓度增大,组合物C对成熟期生物被膜活菌量的下调率增加。
综合表5、表6和表7的实验结果分析可知,对于黏附、聚集期和成熟期的生物被膜,组合物C降低生物被膜的活菌量作用效果依次为黏附期>成熟期>聚集期。与生长对照组相比,三个浓度的组合物C均能下调不同生长阶段生物被膜活菌量,并且组合物C对不同时期生物被膜的清除效果均为组合物C-2MIC>组合物C-MIC>组合物C-1/2MIC,即组合物C对黏附、聚集期和成熟期的生物被膜均具有优异的清除作用,并且呈现浓度依赖性。
对聚集期生物被膜活菌量,与吡啶硫铜锌组相比,组合物C-MIC和组合物C-2MIC降低生物被膜活菌量没有显著性差异(P>0.05)。对成熟期生物被膜活菌量,与吡啶硫铜锌组相比,组合物C-1/2MIC、组合物C-MIC、组合物C-2MIC降低生物被膜活菌量没有显著性差异(P>0.05)。
(五)参照例5
采用扫描电子显微镜(SEM)观察组合物C对不同时期生物被膜微观形态影响
药物处理:按上述方法建立黏附、聚集、成熟期的生物被膜后,吸弃培养基,用PBS漂洗;分别加入500μL梯度浓度药物供试液(组合物C-1/2MIC、组合物C-MIC、组合物C-2MIC浓度分别等于1.69μg/mL、3.38μg/mL、6.76μg/mL,吡啶硫铜锌-MIC的浓度等于1.04μg/mL)。以只加500μL的培养基为生长对照组,32℃培养5d,吸弃培养基和药液,PBS漂洗,用作后续测定。
制备样品并用扫描电子显微镜(SEM)观察。按上述方法处理样品后,取出爬片,用PBS漂洗,用2.5%戊二醛固定液于4℃固定过夜;随后通过系列梯度乙醇(30%、50%、70%、80%、90%、95%和100%)对样品进行脱水,各浓度乙醇脱水重复2次,每次15min,其中100%乙醇脱水每次30min,最后以100%叔丁醇置换乙醇2次,每次30min。室温挥干,喷金进行SEM观察。每次操作设置3组平行,每次实验重复3次。置于×3000倍电镜下观察生物被膜形态结构的变化,分析供试药物对生物被膜的清除作用。
组合物C对黏附期生物被膜微观形态影响的实验结果见图1。生长组生物被膜形态结构完整如图1(A)。随着药物浓度的增加,细胞数量依次减少,视野中的生物被膜结构分布相对松散,胞外聚合物的分泌减少如图1(C、D、E)。与生长组比较,组合物C-MIC和组合物C-2MIC作用后,生物被膜破坏严重,胞外聚合物大面积消失。与吡啶硫铜锌组相比,组合物C-MIC和组合物C-2MIC的细胞间胞外聚合物和细胞数量减少。
组合物C对聚集期生物被膜微观形态影响的实验结果见图2。生长组生物被膜形态结构完整如图2(A),随着药物浓度的增加,细胞数量依次减少,即胞外聚合物的分泌减少如图2(C、D、E)。与生长组比较,组合物C-2MIC作用后如图2(E),生物被膜量减少,细胞数量部分减少,胞外聚合物明显消失,可见部分细胞破裂皱缩变形。与吡啶硫铜锌组相比,组合物C-MIC和组合物C-2MIC的细胞间胞外聚合物和细胞数量减少。
组合物C对成熟期生物被膜微观形态影响的实验结果见图3。生长组生物被膜形态结构完整如图3(A)。随着药物浓度的增加,细胞数量依次减少,胞外聚合物的分泌减少如图3(C、D、E)。与生长组比较,吡啶硫铜锌组、不同浓度的组合物C作用后,生物被膜部分减少。
综合上述分析可知,组合物C对球形马拉色菌的黏附期、聚集期和成熟期生物被膜的生成有较好的抑制作用,一定浓度的组合物C对球形马拉色菌不同生长阶段的生物被膜有较好的清除作用。对球形马拉色菌的抑制作用黏附期﹥聚集期>成熟期,表明组合物C能够有效抑制球形马拉色菌的初期生长,从而抑制了球形马拉色菌的进一步过度增殖引起的相关皮肤疾病的发生和发展。组合物C表现出了较好的预防球形马拉色菌过度增殖以及因过度增殖引起的相关疾病的发生。
致病菌生物被膜的形成会增强致病菌定植在人体表面的顽固性,组合物C对球形马拉色菌不同生长阶段的生物被膜的清除作用,表现出了对已形成的具有一定顽固性耐药性的生物被膜,可以有效破坏球形马拉色菌的生物被膜,从而更加深入地抑制或杀死球形马拉色菌,进而能够在一定程度上克服因球形马拉色菌生物被膜形成而导致的相关皮肤感染疾病的耐药性问题。
以上所述,仅是本发明的较佳实施例而已,并非对本发明作任何形式上的限制,虽然本发明已以较佳实施例揭示如上,然而并非用以限定本发明,任何本领域技术人员,在不脱离本发明技术方案范围内,当可利用上述揭示的技术内容做出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例,但凡是未脱离本发明技术方案内容,依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简介修改、等同变化与修饰,均仍属于本发明技术方案的范围内。
Claims (4)
1.一种具有抗球形马拉色菌耐药性作用的组合物,其特征在于,所述组合物的活性成分为诃子宁和丁香酚,其中,诃子宁与丁香酚的质量配比为1-5:1;所述活性成分的百分含量为0.0001-99%。
2.根据权利要求1所述的一种具有抗球形马拉色菌耐药性作用的组合物,其特征在于:所述组合物还包括二甲基亚砜或者辅料。
3.一种如权利要求1~2任一项所述的具有抗球形马拉色菌耐药性作用的组合物的制备方法,其特征在于,所述制备方法包括以下步骤:
S1、诃子宁贮备液的制备:称取诃子宁溶解配置成浓度为12mg/mL的药物贮备液A;
S2、丁香酚贮备液的制备:称取丁香酚溶解配置成浓度为12mg/mL的药物贮备液B;
S3、组合物的制备:按诃子宁与丁香酚的质量配比为1-5:1,将药物贮备液A和药物贮备液B混合均匀,稀释后得到组合物。
4.根据权利要求3所述的一种具有抗球形马拉色菌耐药性作用的组合物的制备方法,其特征在于:在步骤S3中,稀释后组合物的浓度为1.69-6.76ug/ml。
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