CN115919722A - 一种香露兜叶提取物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种香露兜叶提取物的制备方法：取新鲜香露兜叶，经清洗、切段，低温干燥，用粉碎机粉碎，过筛，得香露兜叶粉；称取香露兜叶粉适量，加入适当料液比的溶剂进行提取，温度为50‑85℃，提取2次，每次1‑3h，提取完成，以4000r/min的速度离心5min，收集合并上清液，之后将上清液进行减压浓缩，浓缩至香露兜叶粉重量的3‑5倍，即得香露兜叶浓缩液；之后再加入适量稳定剂复溶，再加入活性炭放置4‑8h，膜过滤，即得成品。还公开了由上述方法得到的一种香露兜叶提取物及其在化妆品中的应用，在保证自身绿色天然、安全稳定的同时，还具有良好的保湿、舒缓功效。

Description

一种香露兜叶提取物及其制备方法与应用

技术领域

本发明公开了一种源自露兜树科露兜树属的植物提取物，具体地说，是一种香露兜叶提取物及其制备方法与应用，属于化妆品技术领域。

背景技术

随着化妆品工业的不断发展及生活压力导致的皮肤问题增多，越来越多的人开始使用化妆品，加之近几年行业化妆品种类的增多及选择差异性，化妆品功效原料开始逐渐受到人们关注，化妆品成分党也随之诞生。热门功效成分如烟酰胺、熊果苷应用广泛，天然功效植物原料如甘草、绿茶、积雪草、芦荟等成分也饱受追捧，化妆品创新也从产品创新渐渐转向原料创新。加之功效端需求的强劲，大众更加关注功效本身，开发出新的植物原料运用于化妆品，为行业产品增添活力，也成了众多公司及研究者开发的重点。

香露兜(Pandanus amaryllifolius Roxb)叶，又名斑兰叶、香兰叶，为露兜树科露兜树属香露兜的新鲜叶，原产于斯里兰卡、马来半岛及菲律宾，在东南亚地区分布广泛，是露兜树种中唯一一种叶片带有芳香气味的植物，其叶片含有一种特殊香气－粽香，目前在我国海南、云南等地已有引进栽培。香露兜叶里面富含亚油酸、角鲨烯、维生素K3、叶绿醇、草蒿脑等成分，运用于食品领域具有有降血脂、促进人体的新陈代谢，加快机体组织修复等作用，目前在食品领域已有较广泛的应用。但对于日化领域，关于香露兜叶应用于化妆品保湿、舒缓功效的研究也未有报道。

CN202010092512.0公开了一种斑兰叶制品及其制备方法，但该发明主要涉及食品加工领域，针对斑兰叶原料本身进行保色增香工艺优化，未涉及具体提取及日化领域使用。

CN202110386460.2公开了一种斑兰叶冻干粉及其制备工艺，主要涉及热带药用植物技术领域，对斑兰叶冻干粉的制备工艺进行阐述，也未涉及日化领域的功效及使用。

因此，开发一种香露兜叶提取物以运用于日化护肤领域，以增强行业产品创新力，十分具有必要性。

发明内容

针对上述不足，本发明的目的是提供一种香露兜叶提取物及其制备方法与应用，该提取物具有良好的滋润肌肤、抑制透明质酸酶活性、抑制炎症因子释放及优异的抗氧化的能力，可有效缓解肌肤干燥、敏感、瘙痒等症状，具有良好的保湿、舒缓功效。

为了达到上述目的，本发明提供的第一个技术方案是：一种香露兜叶提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：取新鲜香露兜叶，经清洗、切段，低温干燥，用粉碎机粉碎，过筛，得香露兜叶粉；

步骤二：称取香露兜叶粉适量，加入适当料液比的溶剂进行提取，温度为50-85℃，提取2次，每次1-3h，提取完成，以4000r/min的速度离心5min，收集合并上清液，之后将上清液进行减压浓缩，浓缩至香露兜叶粉重量的3-5倍，即得香露兜叶浓缩液；

步骤三：之后再加入适量稳定剂复溶，再加入活性炭放置4-8h，膜过滤，即可得到香露兜叶提取物。

作为优选，所述步骤一中低温干燥温度为50-70℃，过筛目数为100-400目。

作为优选，所述所述步骤二中的料液比为1：(5-30)，

进一步的，提取溶剂为水、乙醇或乙醇水溶液。

进一步的，所述步骤二中的提取方式为加热搅拌提取或超声提取。

作为优选，所述步骤二中的香露兜叶浓缩液在进入步骤三之前还经过了醇沉或树脂纯化中的一个或多个步骤。

进一步的，所述醇沉的过程为加入2-4倍无水乙醇，低温放置8-16h，收集沉淀部分用水溶解，然后减压浓缩。

进一步的，所述树脂纯化的过程为将浓缩液加入树脂中，用去离子水冲洗至透明，后用乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液。

所用树脂为AB-8或D101大孔树脂，洗脱液浓度为30-85％乙醇溶液，然后减压浓缩。

作为优选，所述所述步骤三中的稳定剂为甘油、丁二醇、丙二醇中的一种或几种

进一步的，所述步骤三中的膜为微滤膜，孔径为0.2-1μm。

进一步的，所述步骤三中的活性炭，添加比例为0-1.5％。

本发明提供的第二个技术方案是：一种香露兜叶提取物，所述香露兜叶提取物是根据以上任一所述的制备方法所制得的。

本发明提供的第二个技术方案是：所述香露兜叶提取物的应用，所述香露兜叶提取物应用于化妆品中。

作为优选，所述化妆品是以所述的香露兜叶组合物为活性组分，加上药学或化妆品常规辅料或辅助成分制备而成的具有保湿、舒缓功效的皮肤外用制剂。

具体地，所述保湿、舒缓化妆品为化妆水、精华液、膏霜、面膜、啫喱中得一种或多种。

与现有技术相比，本发明具有的有益效果如下：

1、本发明所公开的香露兜叶提取物，具有良好的滋润肌肤、抑制透明质酸酶活性、抑制炎症因子释放及优异的抗氧化的能力，可有效缓解肌肤干燥、敏感、瘙痒等症状，具有良好的保湿、舒缓功效，真正意义上达到有效护肤的需求。

2、本发明所公开的香露兜叶提取物具有纯天然、无刺激、安全无毒的优点，可以达到安全护肤的需求，具有良好的推广前景与广阔的应用市场。

附图说明

图1是本发明功效测试中人体保湿测试结果的图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式，对本发明的权利要求做进一步的详细说明，但不构成对本发明的任何限制，任何人在本发明权利要求保护范围内所做的有限次的修改，仍在本发明的权利要求保护范围之内。

实施例1

本实施例公开了一种香露兜叶提取物的制备方法，具体步骤如下：

步骤一、取新鲜香露兜叶，经清洗、切段，60℃低温干燥，用粉碎机粉碎，过筛400目，得香露兜叶粉。

步骤二、称取香露兜叶粉10g，按照料液比1：20加入去离子水进行超声提取，超声功率为400W，温度为65℃，提取2次，每次2h，提取完成，以4000r/min的速度离心5min，收集合并上清液，之后将上清液进行减压浓缩，浓缩至50g水液，即得香露兜叶浓缩液。步骤三、之后再加入与香露兜叶浓缩液等质量的丁二醇复溶，0.45μm膜过滤，即可得到香露兜叶提取物。

实施例2

本实施例的一种香露兜叶提取物的制备方法，具体步骤如下：

步骤一、取新鲜香露兜叶，经清洗、切段，50℃低温干燥，用粉碎机粉碎，过筛200目，得香露兜叶粉。

步骤二、称取香露兜叶粉10g，加入料液比1：30加入去离子水进行超声提取，超声功率为500W，温度为75℃，提取2次，每次2h，提取完成，以4000r/min的速度离心5min，收集合并上清液，之后将上清液进行减压浓缩，浓缩至50g水液，即得香露兜叶浓缩液。步骤三、之后再加入与香露兜叶浓缩液等质量的甘油复溶，添加0.5％活性炭静置6h，1.0 μm膜过滤，即得。

实施例3

本实施例的一种香露兜叶提取物的制备方法，具体步骤如下：

步骤一、取新鲜香露兜叶，经清洗、切段，60℃低温干燥，用粉碎机粉碎，过筛400目，得香露兜叶粉。

步骤二、称取香露兜叶粉10g，加入料液比1：20加入去离子水进行加热搅拌提取，温度为65℃，提取2次，每次2h，提取完成，以4000r/min的速度离心5min，收集合并上清液，之后将上清液进行减压浓缩，浓缩至50g水液，即得香露兜叶浓缩液。

步骤三、之后再加入与香露兜叶浓缩液等质量的丁二醇复溶，添加0.1％活性炭静置4h， 0.45μm膜过滤，即得。

实施例4

本实施例的一种香露兜叶提取物的制备方法，具体步骤如下：

步骤一、取新鲜香露兜叶，经清洗、切段，70℃低温干燥，用粉碎机粉碎，过筛400目，得香露兜叶粉。

步骤二、称取香露兜叶粉10g，加入料液比1：15加入50％乙醇进行超声提取，超声功率为400W，温度为60℃，提取2次，每次2h，提取完成，以4000r/min的速度离心5min，收集合并上清液，之后将上清液进行减压浓缩，浓缩至50g水液，即得香露兜叶浓缩液。步骤三、之后再加入与香露兜叶浓缩液等质量的丙二醇、丁二醇(质量比1：1)复溶，添加1.0％活性炭静置8h，0.45μm膜过滤，即得。

实施例5

本实施例的一种香露兜叶提取物的制备方法，具体步骤如下：

步骤一、取新鲜香露兜叶，经清洗、切段，60℃低温干燥，用粉碎机粉碎，过筛400目，得香露兜叶粉。

步骤二、称取香露兜叶粉10g，加入料液比1：30加入70％乙醇进行加热搅拌提取，温度为55℃，提取2次，每次2h，提取完成，以4000r/min的速度离心5min，收集合并上清液，之后将上清液进行减压浓缩，浓缩至50g水液，即得香露兜叶浓缩液。

步骤三、之后再加入与香露兜叶浓缩液等质量的丙二醇复溶，添加0.5％活性炭静置6h， 1.0μm膜过滤，即得。

实施例6

本实施例的一种香露兜叶提取物的制备方法，具体步骤如下：

步骤一、取新鲜香露兜叶，经清洗、切段，70℃低温干燥，用粉碎机粉碎，过筛100目，得香露兜叶粉。

步骤二、称取香露兜叶粉10g，加入料液比1：10加入去离子水进行超声提取，超声功率为300W，温度为65℃，提取2次，每次2h，提取完成，以4000r/min的速度离心5min，收集合并上清液，之后将上清液进行减压浓缩，浓缩至50g水液，即得香露兜叶浓缩液。步骤三、之后再加入与与香露兜叶浓缩液等质量的甘油、丁二醇(质量比1：1)复溶，添加0.5％活性炭静置8h，0.45μm膜过滤，即得。

实施例7

本实施例的一种香露兜叶提取物的制备方法，具体步骤如下：

步骤一、取新鲜香露兜叶，经清洗、切段，60℃低温干燥，用粉碎机粉碎，过筛400目，得香露兜叶粉。

步骤二、称取香露兜叶粉10g，加入料液比1：15加入去离子水进行超声提取，超声功率为400W，温度为65℃，提取2次，每次2h，提取完成，以4000r/min的速度离心5min，收集合并上清液，之后将上清液进行减压浓缩，浓缩至50g水液，即得香露兜叶浓缩液1。香露兜叶浓缩液1加入3倍量95％乙醇进行醇沉，低温放置12h，过滤取沉淀，再加入去离子水溶解，浓缩至30g水液，得香露兜叶浓缩液2。

步骤三、之后再加入与香露兜叶浓缩液2等质量的甘油、丁二醇(质量比1：1)复溶，0.45μm膜过滤，即得。

实施例8

本实施例的一种香露兜叶提取物的制备方法，具体步骤如下：

步骤一、取新鲜香露兜叶，经清洗、切段，60℃低温干燥，用粉碎机粉碎，过筛400目，得香露兜叶粉。

步骤二、称取香露兜叶粉10g，加入料液比1：15加入去离子水进行超声提取，超声功率为400W，温度为65℃，提取2次，每次2h，提取完成，以4000r/min的速度离心5min，收集合并上清液，之后将上清液进行减压浓缩，浓缩至50g水液，即得香露兜叶浓缩液1。将香露兜叶浓缩液1加入AB-8型大孔树脂中，用去离子水冲洗至透明，再加入70％乙醇进行洗脱，收集洗脱液，减压浓缩至30g水液，即得香露兜叶浓缩液2。

步骤三、之后再加入与与香露兜叶浓缩液2等质量的甘油、丁二醇(质量比1：1)复溶， 0.45μm膜过滤，即得。

为了证明本发明的效果，下面给出本申请的对比实验例：

对比例1

本对比例的一种香露兜叶提取物的制备方法，具体步骤如下：

步骤一、取新鲜香露兜叶，经清洗、切段，60℃低温干燥，用粉碎机粉碎，即得香露兜叶粉。

步骤二、称取香露兜叶粉10g，加入料液比1：5加入70％乙醇进行加热搅拌提取，温度为45℃，提取2次，每次2h，提取完成，以4000r/min的速度离心5min，收集合并上清液，之后将上清液进行减压浓缩，浓缩至50g水液，即得香露兜叶浓缩液。

步骤三、之后再加入与与香露兜叶浓缩液等质量去离子水复溶，添加2.0％活性炭静置8h， 3μm膜过滤，即得。

对比例2

本对比例的一种香露兜叶提取物的制备方法，具体步骤如下：

步骤一、取新鲜香露兜叶，经清洗、切段，80℃干燥，用粉碎机粉碎，过筛100目，得香露兜叶粉。

步骤二、称取香露兜叶粉10g，加入料液比1：10加入20％丁二醇溶液进行超声提取，超声功率为200W，温度为40℃，提取1次，每次1h，提取完成，以4000r/min的速度离心5min，收集合并上清液，之后将上清液进行减压浓缩，浓缩至50g水液，即得香露兜叶浓缩液。

步骤三、之后再加入与与香露兜叶浓缩液等质量的甘油复溶，添加0.1％活性炭静置8h， 1.0μm膜过滤，即得。

对比例3

本对比例的一种香露兜叶提取物的制备方法，具体步骤如下：

步骤一、取新鲜香露兜叶，经清洗、切段，50℃低温干燥，用粉碎机粉碎，即得香露兜叶粉。

步骤二、称取香露兜叶粉10g，加入料液比1：8加入去离子水进行加热搅拌提取，温度为90℃，提取1次，每次1h，提取完成，以4000r/min的速度离心5min，收集合并上清液，之后将上清液进行减压浓缩，浓缩至50g水液，即得香露兜叶浓缩液。

步骤三、之后再加入与与香露兜叶浓缩液等质量的去离子水复溶，添加2.0％活性炭静置 1h，0.45μm膜过滤，即得。

为了更好的说明本发明的优点，下面给出本发明提供的香露兜叶提取物的功效实验：

试验1、保湿功效研究——称重法

根据化妆品成分吸湿、保湿性能的差异，不同的保湿剂分子对水分子的作用不同，吸收水分和保持水分的能力不同。作用力大的，对水分子结合力强，吸收和保持水分的量也比较大，封闭性好的，水分散失的也少。利用胶带模仿角质层、表皮等的生物材料，在胶带上涂布化妆品，模拟实际化妆品的应用状况。在恒温恒湿的条件下一定时间后，称量样品，计算样品质量的变化，通过与具有保湿功效的对照物进行比较，评价样品保湿的性能。

实验步骤：将恒温恒湿箱调节至测试所需温湿度，温度：20℃±2℃，相对湿度：60％±5％。取玻璃板和3M胶布，将3M胶布贴于玻璃板上，称量，精确至0.0001g，记为M0。取适量样品(0.1g—0.2g)，均匀涂抹于贴有3M胶带的玻璃板上，称量，精确至0.0001g，记为M1，放入恒温恒湿箱中；在放置时间2小时、4小时、8小时后，分别取出玻璃板，称量，精确至0.0001g，记为(M2)，称量后立即放入恒温恒湿箱中。对照物10％甘油采取相同操作。测试均进行平行测定。

保湿率计算公式：

保湿率(％)＝[(M2-M0)/(M1-M0)]×100％

式中：M0——3M胶布的玻璃板质量质量(g)；M1——涂样后3M胶布玻璃板质量(g)；M2——恒温恒湿箱中放置若干小时后质量(g)。取平行测定结果的算术平均值为测定结果，结果保留后一位小数点，相对偏差<5％。

判定原则：测定受试样品在设定的温湿度条件下，与具有保湿功效的阳性对照进行比对，判断不同时间受试样品与阳性对照的保湿率水平，来确认产品是否具有保湿性能。

对实施例及对比例的保湿功效进行测试，保湿率(％)结果如下：

表1保湿率测试结果

由表1可知，实施例1-8及对比例2在2h、4h及6h的保湿率均在40％以上，表明制备的香露兜叶提取物具有较好的保湿效果，就具体实施例而言，实施例1-8的保湿率均远高于阳性对照10％的甘油，表明在此工艺下制得的香露兜叶提取物具有良好的保湿功效。并且与对比例相比，所有实施例2h、4h、6h的保湿率均高于对比例1、3，表明按规定保护工艺制得的提取物普遍具有更好的保湿功效，制得的香露兜叶提取物保湿率较高，具有良好的物理保湿效果。

试验2、保湿功效研究——人体测试

试验方法：通过30名受试者手臂前臂内侧涂抹样品，测试涂抹前后皮肤的角质层含水量，并与自身使用前进行比较，验证产品的保湿效果。使用方法：单侧手臂使用样品，用量2mg/cm2。测试部位：前臂屈侧。环境条件：本次测试环境要求为温度20℃-22℃，湿度40％-60％。并使用皮肤水分含量测试仪Corneometer测试皮肤角质层含水量，测试次数为3次，分别于0h、4h、8h进行测试。

样品准备：取上述实施例1的香露兜叶提取物，加入去离子水稀释至5％浓度，充分搅拌均匀，即得香露兜叶保湿水。并以不涂抹区域为空白对照，按上述方法进行香露兜保湿水功效测试。

数据统计：统计分析软件为SPSS，采用Shapiro-WilkTest进行数据改善值正态分布的显著性检验，Sig.(双侧)＞0.01，则呈正态分布，进行配对t检验。Sig.(双侧)＜ 0.01，则呈非正态分布，进行Wilcoxon检验。若P＞0.05，表示无显著性差异，记为“n.s.”；若P＜0.05表示有显著性差异，且0.01≤P＜0.05，记“*”；0.001≤P＜0.01，记“**”；p＜0.001，记：“***”。变化率(百分比)＝(使用后数据均值-使用前数据均值)/使用前数据均值*100％。测试结果如图1所示。

如图1可知，在0-8h内，随着时间的推移，空白区域4h、8h角质层含水量分别降低3.28％、1.85％，含水量呈平稳微降趋势。香露兜保湿水区域则呈现出较好的保湿效果，在4h、8h皮肤角质层含水量分别为27.52、27.41，与使用前相比，分别提升了16.61％、16.14％，且P＜0.0001，具有极显著差异，表明此保湿水具有良好的保湿效果，香露兜叶提取物具有良好的短效保湿功效。

试验3、DPPH自由基清除实验

准确称取DPPH试剂41.67mg，定容至100mL棕色容量瓶，取其中5mL用无水乙醇定容至50mL棕色容量瓶，得到DPPH测试液(0.1mmol/L)。分别移取1mLDPPH测试液，按表2所示分别加入0.5mL4％浓度实施例1-8及对比例1-3中制得的提取液。充分混合后在暗处静置30min，以无水乙醇为空白对照，于517nm处测定其吸光度，并设置维生素C为对照，按照以下公式计算各样品4％浓度对DPPH的清除率：

DPPH清除率(％)＝[1-(As-Ar)/A0]×100％

式中：As——提取液与DPPH反应体系的吸光度；Ar——提取液-无水乙醇的吸光度； A0——空白对照无水乙醇的吸光度。

表2反应液组成

吸光度	提取液加入量(mL)	DPPH测试液(mL)	无水乙醇(mL)
				A0	0	1	0.5
Ar	0.5	0	1
				As	0.5	1	0

线粒体在电子传递的过程中产生的自由基会攻击细胞膜、蛋白质甚至DNA，导致细胞的衰老甚至死亡，与多种疾病都有紧密关系。抑制自由基活性可以有效缓解外界刺激后产生的过量自由基作用下细胞结构功能的退化，进而维护包括皮肤在内各种器官的正常屏障结构。清除率越高，表明其抗氧化程度越好，对皮肤的屏障修复也有促进作用。

表3 DPPH自由基清除实验结果

样品名称	DPPH清除率
		维生素C	85.63％
实施例1	82.24％
		实施例2	80.53％
实施例3	78.65％
		实施例4	83.63％
实施例5	86.26％
		实施例6	76.72％
实施例7	70.24％
		实施例8	87.46％
对比例1	70.34％
		对比例2	55.36％
对比例3	68.57％

由表3可知，实施例1-8及对比例1-3制得的香露兜样品，其对DPPH自由基清除率均在50％以上，普遍清除率在70％以上，清除率较好，实施例1-8清除率要高于对比例1-3，表明按特定工艺制得的提取物具有更好的抗氧化功效。实施例5及实施例8对DPPH 自由基清除率高达85％以上，高于阳性对照维生素C，综上表明香露兜叶提取物对DPPH 自由基清除率良好，具有良好的抗氧化能力，可有效缓解外界刺激后产生的过量自由基作用下细胞结构功能的退化，具有较好的促进皮肤屏障修复功效。

试验4、透明质酸酶活性抑制试验

透明质酸是组织基质内限制水分及其他胞外物质扩散的成分，被透明质酸酶水解后，细胞间则变为非粘性，引起细胞脱颗粒和合成的新介质渗出，发挥生物效应，导致速发型过敏反应的发生。透明质酸酶是过敏反应的参与者，与过敏有强相关作用，可通过抑制透明质酸酶的活性来缓解过敏现象及改善皮肤。

考察实验例1-8及对比例1-3的体外抗敏功效，采用透明质酸酶抑制法。取0.1mLCaCl2 溶液(0.25mmol/L)和0.5mL透明质酸酶液(100U/mL)于37℃水浴反应20min；加入提取液 0.5mL，保温20min；再加入0.5mL透明质酸钠溶液(0.5g/L),反应30min后取出冷却5min；加入0.1mL氢氧化钠溶液(4mol/L)和0.5mL乙酰丙酮溶液(3.5mL乙酰丙酮溶于50mL的 1.0mol/L碳酸钠溶液中)，沸水浴15min后立即转移至冰水浴5min；滴加1mL埃尔利希试剂(0.8g对-二甲基氨基苯甲醛溶于15mL浓盐酸和15mL无水乙醇中)，并用3mL无水乙醇稀释，25℃放置20min显色，于540nm处测定其吸光度，并以甘草酸二钾为对照。按照以下公式计算对透明质酸酶抑制率：

透明质酸酶抑制率＝{[(A－B)－(C－D)]/(A-B)}×100％

式中：A——对照溶液吸光度(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液)；B——对照空白溶液吸光度(用醋酸缓冲溶液代替样品溶液及酶液)；C——样品溶液吸光度；D——样品空白溶液吸光度(用醋酸缓冲溶液代替酶液)。

以0.3％的甘草酸二钾为阳性对照，考察3％各实施例、对比例样品对透明质酸酶的抑制率，结果如表4所示：

表4透明质酸酶抑制率实验结果

由表4可知，实施例1-8及对比例1-3制得的香露兜样品，其对透明质酸酶均有抑制作用，且抑制率均在15％以上，实施例1-8抑制率要高于对比例1-3，表明按特定工艺制得的提取物具有更好的抑制透明质酸酶通路功效。并且，实施例1-7对透明质酸酶的抑制率均接近30％,比阳性对照略低，表明香露兜叶提取物对透明质酸酶抑制良好，可抑制细胞脱颗粒和合成的新介质渗出，缓解过敏现象，具有良好的舒缓、抗敏功效。

试验5、舒缓功效体外测试-巨噬细胞炎症模型试验

采用小鼠巨噬细胞，利用LPS诱导RAW264.7细胞产生过敏反应，释放NO(一氧化氮)和炎症因子(IL-6)，通过检测样品对NO含量和IL-6含量的抑制作用评价样品的舒缓功效。选择实施例1制得的组合物进行试验，具体步骤如下：

1、细胞毒性检测：调整RAW264.7细胞悬液浓度加入96孔细胞板，37℃，5％ CO₂条件下培养过夜用于检测。试验样品用细胞培养基稀释成不同浓度分别加入细胞板中， 37℃，5％ CO₂条件下培养20～48h。弃去培养液，用PBS清洗1-2次，加入MTT工作溶液继续培养，培养结束后弃去培养基，加入DMSO，振荡混匀后，在570nm处测定吸光值，根据结果计算细胞毒性，并结合细胞形态，筛选出无明显细胞毒性的样品浓度供下一步实验。

2、NO释放试验：调整RAW264.7细胞悬液浓度加入96孔细胞板，37℃，5％ CO₂条件下培养过夜用于检测。试验样品用含LPS的细胞培养基稀释为无细胞毒性的浓度后加样，用含LPS的培养基作为阴性对照(NC)，无LPS的细胞培养基作空白对照(BC)，加样后细胞继续培养20～24h，作用结束后，取50μl培养液放入新的细胞板，加入等体积的Griess试剂，充分混合后，于暗处反应10min，在540nm处检测OD值。

3、IL-6炎症因子测试试验：调整RAW264.7细胞悬液浓度加入96孔细胞板，37℃，5％CO2条件下培养过夜用于检测。试验样品用含LPS的细胞培养基稀释为无细胞毒性的浓度后加样，用含LPS的培养基作为阴性对照(NC)，无LPS的细胞培养基作空白对照 (BC)，加样后细胞继续培养20～24h，作用结束后，取上清，按照IL-6Elisa试剂盒操作规程进行实验。

NO相对含量(％)＝OD_样品/OD_NC×100％

NO抑制率(％)＝(OD_NC-OD_样品)/OD_NC×100％

式中，OD_样品指样品组的OD值均值，OD_NC为阴性对照组的OD值均值。

当空白对照组(BC组)的NO相对含量≤50％时，试验成立。用GraphPad Prism软件进行统计及显著性分析，计算P值，P＜0.01表示具有显著性差异。当P＜0.01且NO 抑制率≥10％时，可判定为样品具有舒缓功效。

炎症因子IL-6下调率计算公式：

下调率(％)＝(1-T/C)×100％

其中：

T——实验组炎症因子IL-6平均值

C——模型组炎症因子IL-6平均值

样品组的IL-6含量与阴性对照(NC)相比，具有显著性差异(P＜0.05)，且样品组的IL-6含量均低于阴性组(NC)时，可判定样品具有舒缓功效，否则样品判为无舒缓功效。

经细胞毒性检测可知，当样品浓度为2.0029％时，细胞活力为92.87％，无明显细胞毒性，因此选择2％的浓度进行实验，测试结果如下表5和表6：

表5样品对炎症介质NO含量实验结果

组别	均值	SD	P值	显著性	抑制率(％)
						BC	15.87	0.24	/	/	/
NC	100.00	3.34	＜0.0001	****	0.00
						PC	65.01	0.51	＜0.0001	****	34.99％
实施例1	34.94	1.35	＜0.0001	****	65.06％

表5为炎症介质NO释放试验检测结果，由检测结果可知，NC组与BC组相比，P＜0.0001，结果呈现极显著差异，且BC组的NO相对含量≤50％，表明试验成立。经过测试，样品组实施例1与NC组相比，其对NO的抑制率为65.06％，P＜0.0001，结果有显著性差异，表明实施例1对NO释放抑制良好，具有良好的舒缓功效。

表6样品对炎症因子IL-6含量实验结果

表6为炎症因子IL-6释放试验检测结果，由检测结果可知，NC组与BC组相比，IL-6上调率为12035.56％，且P＜0.005，结果呈现显著性差异，说明试验成立。经过测试，样品组实施例1与NC组相比，IL-6下调率为26.79％，P＜0.01，结果有显著性差异，表明实施例1对炎症因子IL-6抑制良好，具有良好的舒缓功效。

综上所述，本发明将特色植物香露兜叶在化妆品技术领域进行研究，并通过加热搅拌 /超声提取、浓缩、膜过滤等提取纯化技术制备得到香露兜叶提取物，该提取物具有良好的保湿、舒缓、抗氧化等效果，可有效缓解肌肤干燥、敏感、瘙痒等症状，深层次改善皮肤状态，具有良好的效果。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种香露兜叶提取物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一：取新鲜香露兜叶，经清洗、切段，低温干燥，用粉碎机粉碎，过筛，得香露兜叶粉；

步骤二：称取香露兜叶粉适量，加入适当料液比的溶剂进行提取，温度为50-85℃，提取2次，每次1-3h，提取完成，以4000r/min的速度离心5min，收集合并上清液，之后将上清液进行减压浓缩，浓缩至香露兜叶粉重量的3-5倍，即得香露兜叶浓缩液；

步骤三：之后再加入适量稳定剂复溶，再加入活性炭放置4-8h，膜过滤，即可得到香露兜叶提取物。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤一中低温干燥温度为50-70℃，过筛目数为100-400目。

3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中的料液比为1：(5-30)，提取溶剂为水、乙醇或乙醇水溶液，提取方式为加热搅拌提取或超声提取。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤二中的香露兜叶浓缩液在进入步骤三之前还经过了醇沉或树脂纯化中的一个或多个步骤。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述醇沉的过程为加入2-4倍无水乙醇，低温放置8-16h，收集沉淀部分用水溶解，然后减压浓缩。

6.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述树脂纯化的过程为将浓缩液加入树脂中，用去离子水冲洗至透明，后用乙醇水溶液洗脱，收集洗脱液。所用树脂为AB-8或D101大孔树脂，洗脱液浓度为30-85％乙醇溶液，然后减压浓缩。

7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述步骤三中的稳定剂为甘油、丁二醇、丙二醇中的一种或多种，所述步骤三中的膜为微滤膜，孔径为0.2-1μm，所述步骤三中的活性炭添加比例为0-1.5％。

8.一种香露兜叶提取物，其特征在于，所述香露兜叶提取物是根据权利要求1-7中任一所述的制备方法所制得的。

9.一种根据权利要求1-7中任一所述的制备方法所制得的香露兜叶提取物的应用，其特征在于，所述香露兜叶提取物应用于化妆品中，所述化妆品是以所述的香露兜叶提取物为活性组分，加上药学或化妆品常规辅料或辅助成分制备而成的具有保湿、舒缓功效的皮肤外用制剂。

10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述保湿、舒缓化妆品为化妆水、精华液、膏霜、面膜、啫喱中得一种或多种。

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