CN115916405A - 集成的合成和分析***及其使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明总体上涉及集成的合成和分析***及其使用方法。
Description
相关申请
本申请要求于2020年5月20日提交的美国临时专利申请序列号63/027,577的权益和优先权,该美国临时专利申请的内容通过援引以其全文并入本文。
政府利益
本发明是根据陆军研究室授予的W911NF-16-2-0020在政府支持下进行的。美国政府享有本发明的一定权利。
技术领域
本发明总体上涉及集成的合成和分析***及其使用方法。
背景技术
药物发现过程构成了整个制药行业的基础,涵盖了靶点发现和验证的早期研究阶段,直至药物候选化合物或先导化合物的识别。小型治疗药物候选物的最初识别是经由各种数据流来进行的。研究可能导致对于疾病进程的新见解,强调可以开发药物以进行干预的新型途径。替代性地,公司进行大规模基于试验和错误的项目以便识别可能感兴趣的分子化合物。这是在最初先导物发现期间最经常执行的过程,目的是将新型化合物带入直至临床前和临床试验。当进行对先导物的投资时,此时完全计算的风险分析可以增加成功的机会。
来自靶点识别和验证、苗头(hit)识别和验证、从苗头到先导物、先导物优化以及后期先导物优化的药物发现过程是切割并分段成不同手动过程和程序的手动驱动过程。因此,药物发现是费时低效并且不同步的过程,最终导致需要数年来开发商用药物。
发明内容
本发明提供了一种新型混合、高通量自动化仪器***,该***对于大量化合物的合成、表征和生物活性筛选是完全集成和自动化的。例如,该集成***可以合成和分析化合物库,并且随后对这些化合物进行各种生物测定。例如,该***可以合成化合物库,并且然后着手评估细胞毒性,以及对不同生物靶点的结合亲和力和激动剂/拮抗剂特性。以这种方式,本发明的***能够在药物发现过程中提供高感兴趣的化学候选先导物,这些化学候选先导物然后可以进行进一步的生物学和临床研究。另外,该平台通过高通量反应筛选提供有关合成路线优化的信息,从而允许在适当的监管设施中转化为大规模生产的最佳条件。因此,本发明的***协调、自动化和同步药物发现过程的许多方面,并显著提高了此类过程的效率。
在某些方面,本发明提供了包括多个不同的模块的集成的合成和分析***。例如,该***可以包括化学合成模块,该化学合成模块包括:用于在基板上生成离散斑点阵列的一种或多种仪器;以及解吸电喷雾电离(DESI)源,该DESI源用于解吸和电离化学分子并从每个离散斑点形成化学产物。该***还可以包括分析模块,该分析模块包括被定位成从每个斑点接收经解吸且经电离的化学产物的质谱仪。该***还可以包括温育模块,该温育模块被配置成用一种或多种生物材料温育化学产物以进行生物测定。该***还可以包括生物测定模块,该生物测定模块被配置成分析包括该化学产物的生物测定的结果。该***还可以包括控制装置,该控制装置包括:流体处理装置,该流体处理装置包括被配置成处理和移动基板并处理该化学合成模块、该温育模块和该生物测定模块之间的一种或多种流体的一个或多个机器人仪器;以及控制模块,该控制模块包括用于控制和协调该化学合成模块、该温育模块和该生物测定模块中的每个模块的操作的软件。
在某些实施例中,该控制模块进一步包括从每个斑点生成该化学产物的热图以说明每个斑点的该化学产物的成功形成的软件。然后该软件可以分析该热图并确定应重新扫描哪些化学产物用于结构信息。
在某些实施例中,该化学合成模块进一步包括:二位式DESI平台,其中,第一位置被配置用于分析该化学产物并且靠近该质谱仪的入口,并且第二位置被定位成远离该质谱仪的入口;以及开关,该开关由该控制模块控制以在第一位置与第二位置之间切换。
该温育模块可以经由软件进行编程,以运行要进行的任何生物测定所需的任何类型的温育。在示例性实施例中,该温育模块可配置成执行选自由以下组成的组的生物测定的温育:细胞毒性、酶再激活、抗生素活性、结合亲和力、酶抑制、抗病毒活性、激动作用/拮抗作用和/或血液/脑屏障渗透。在某些实施例中,该温育模块可操作地与该控制模块的流体处理装置和该化学合成模块的一个或多个流体处理仪器相关联。
在某些实施例中,该***进一步包括第二表征位置,该第二表征位置可由该控制模块的流体处理装置访问,并且可以可操作耦合到该控制模块。例如,该第二表征位置包括拉曼光谱仪(Raman spectrometer)。
在某些实施例中,该生物测定模块包括用于使用小体积样品实现快速原位样品净化和电离的多路复用感应纳米电喷雾和微电泳装置。在此类实施例中,该控制模块可以控制该多路复用感应纳米电喷雾和微电泳装置的操作。
本发明的另一方面提供了用于形成化学产物和对该化学产物进行一种或多种生物测定的方法。此类方法可以涉及:通过将解吸电喷雾电离(DESI)喷雾从DESI源引导到基板上以解吸和电离化学分子并形成化学产物,来在DESI液滴产物中形成化学产物,其中,对来自斑点阵列的表面的每个斑点进行形成步骤;在质谱仪中分析该化学产物,或替代性地或随后收集该化学产物;用一个或多个生物分子温育该化学产物;以及分析用该一个或多个生物分子温育该化学产物的结果。该方法的所有步骤均由集成的合成和分析***执行,该集成的合成和分析***包括流体处理装置和控制模块,该流体处理装置包括被配置成通过该方法的每个步骤处理和移动该化学产物的一个或多个机器人仪器,该控制模块包括用于控制和协调每个方法步骤的操作的软件。
在某些实施例中,该控制模块进一步包括从每个斑点生成该化学产物的热图以说明每个斑点的该化学产物的成功形成的软件。该软件分析该热图并确定应使用所提供的条件重新扫描哪些化学产物用于结构信息。
在某些实施例中,该形成步骤进一步利用:二位式DESI平台,其中,第一位置被配置用于分析该化学产物并且靠近该质谱仪的入口,并且第二位置被定位成远离该质谱仪的入口;以及开关,该开关由该控制模块控制以在第一位置与第二位置之间切换。
与生物测定相关联的任何温育都在本发明的范围内。在示例性实施例中,该温育用于选自由以下组成的组的一个或多个生物测定:细胞毒性、酶再激活、抗生素活性、结合亲和力、酶抑制、抗病毒活性、激动作用/拮抗作用、以及血液/脑屏障渗透。
在某些实施例中,该方法可以进一步包括第二表征位置中的第二表征步骤,该第二表征位置可由该控制模块的流体处理装置访问,并且可以可操作耦合到该控制模块。该第二表征可以包括通过拉曼光谱进行的分析。
在某些实施例中,分析该温育的结果包括使用多路复用感应纳米电喷雾和微电泳装置,以使用小体积样品实现快速原位样品净化和电离。在此类实施例中,该控制模块可以控制该多路复用感应纳米电喷雾和微电泳装置的操作。
本领域技术人员将理解,本文中的***和方法可以用于在任何类型的生物测定中合成和测试任何类型的化合物,并且化合物的类型和生物测定是本发明的非限制性方面。本发明例示了用于发现、合成和测试非成瘾性止痛药的化学产物。
附图说明
图1示出了新型混合、高通量自动化仪器***的示例性实施例。
图2A示出了示例性化学合成模块,并且图2B展示了此类模块中的示例性工作流程。
图3展示了可以由化学反应模块执行的各种不同示例性反应类型以及可以由此类模块生产的各种示例性化学产物类型。
图4A展示了二位式DESI平台,并且图4B示出了通过***的工作流程的附加方面。
图5以示例性方式展示了***的流体处理部件如何一起操作以在温育分子中制备化学产物和生物分子,用于在质谱仪中进行生物测定和随后的分析。
图6展示了另一个实施例中***的流体处理部件如何一起操作以在温育分子中制备化学产物和生物分子,用于在质谱仪中进行另一个生物测定和随后的分析。
图7示出了用于使用小体积样品实现快速原位样品净化和电离的多路复用感应纳米电喷雾和微电泳装置。
图8A展示了可以可选地经由本发明的***耦合和操作的第二表征位置,并且图8B示出了通过***的工作流程的附加方面。
图9至图10进一步示出了可以通过第二表征位置实现的表征和附加生物活性探索。
图11A示出了从***获得的数据可以如何用于确定结构-生物活性相关性,并且图11B示出了使用本发明的***的工作流程中的最终步骤。
图12展示了化学合成模块中的示例性工作流程。
图13小图A至小图C示出了浸渍即走(dip-and-go)多路复用纳米ESI***。小图A)从96孔板尖端装载纳米ESI发射器(10s)。小图B)原位电泳净化;值得注意的是,对所有发射器同时执行(10s)。小图C)发射器的顺序MS分析(40s)。给出的所有时间均用于12个发射器。
图14是示出在某些实施例中用于实施本发明的***和方法的示例性数据分析模块的图示。
具体实施方式
本发明总体上涉及集成的合成和分析***及其使用方法。图1示出了新型混合、高通量自动化仪器***的示例性实施例。如图1所示,***可以包括化学合成模块,该化学合成模块包括:用于在基板上生成离散斑点阵列的一种或多种仪器;以及解吸电喷雾电离(DESI)源,该DESI源用于解吸和电离化学分子并从每个离散斑点形成化学产物。该***还可以包括分析模块,该分析模块包括被定位成从每个斑点接收经解吸且经电离的化学产物的质谱仪。该***还可以包括温育模块,该温育模块被配置成用一种或多种生物材料温育化学产物以进行生物测定。该***还可以包括生物测定模块,该生物测定模块被配置成分析包括该化学产物的生物测定的结果。该***还可以包括控制装置,该控制装置包括:流体处理装置,该流体处理装置包括被配置成处理和移动基板并处理该化学合成模块、该温育模块和该生物测定模块之间的一种或多种流体的一个或多个机器人仪器;以及控制模块,该控制模块包括用于控制和协调该化学合成模块、该温育模块和该生物测定模块中的每个模块的操作的软件。
图1还包括***的可选方面,该可选方面可选地为第二表征位置,该第二表征位置可由控制模块的流体处理装置访问,并且可以可操作耦合到该控制模块。如图1中的示例所示,第二表征位置可以包括拉曼光谱仪,该拉曼光谱仪只是第二表征位置的可能选项中示例性的并且非限制性的。
图2A示出了示例性化学合成模块,并且图2B展示了此类模块中的示例性工作流程。该模块是高通量平台,该高通量平台组合了一组相互关联的方法,其中可以使用质谱法产生在其中发生加速反应的液滴和薄膜,同时或随后使用质谱法分析液滴和/或薄膜中的产物分布。此平台对许多不同的化学和生物***具有广泛的适用性。流体处理***控制样品处理并产生各种大小的微孔板,此处例示为384孔板。使用钉扎设备的流体处理***与微孔板相互作用以产生具有离散斑点的基板,例如使用钉扎设备。DESI源被集成为***的一部分并将DESI活性喷雾排出物依次引导到斑点中的每个斑点上。喷雾排出物解吸并电离来自每个斑点的分析物,这些分析物被引导到质谱仪中以进行分析。此高通量***能够在能够24小时连续操作的***中以1秒/反应(或更快)筛选感兴趣的反应产物。
如图2A所示,在某些实施例中,该控制模块进一步包括从每个斑点生成该化学产物的热图,以说明每个斑点的该化学产物的成功形成的软件。然后该软件可以分析该热图并确定应重新扫描哪些化学产物用于结构信息。
在化学合成模块中可以进行许多不同的化学合成和反应。图3展示了可以由化学反应模块执行的各种不同示例性反应类型以及可以由此类模块生产的各种示例性化学产物类型。
在某些实施例中,该化学合成模块进一步包括:二位式DESI平台,其中,第一位置被配置用于分析该化学产物并且靠近该质谱仪的入口,并且第二位置被定位成远离该质谱仪的入口;以及开关,该开关由该控制模块控制以在第一位置与第二位置之间切换(图4A)。为了实现特性的高通量筛选,***被配置成允许使用DESI喷雾角度切换方法(如本文所述)收集合成产物。简而言之,使用了新的DESI平台,其具有两个位置(分析:靠近MS入口,以及收集:远离MS)。分析位置用于高密度板中的反应筛选,而收集位置用于将产物沉积在低密度孔板上。使用这种方法,也许所筛选的反应中有10%会在典型板中产生热点,并且大约1ng至2ng的产物将被沉积。
然后图4B示出了本发明的***和方法内的工作流程的附加方面。此时,已经确定了热点(感兴趣的化合物),并且***通过控制模块和流体处理装置以及可选地化学模块的仪器,准备使用温育模块来温育化学产物和生物分子用于生物测定。该温育模块可以经由软件进行编程,以运行要进行的任何生物测定所需的任何类型的温育。在示例性实施例中,该温育模块可配置成执行选自由以下组成的组的生物测定的温育:细胞毒性、酶再激活、抗生素活性、结合亲和力、酶抑制、抗病毒活性、激动作用/拮抗作用和/或血液/脑屏障渗透。在某些实施例中,该温育模块可操作地与该控制模块的流体处理装置和该化学合成模块的一个或多个流体处理仪器相关联。图4B展示了示例性生物测定,例如细胞毒性,这在以下示例中更详细地描述。
图5以示例性方式展示了***的流体处理部件如何一起操作以在温育分子中制备化学产物和生物分子,用于在质谱仪中进行生物测定和随后的分析。图6展示了另一个实施例中***的流体处理部件如何一起操作以在温育分子中制备化学产物和生物分子,用于在质谱仪中进行另一个生物测定和随后的分析。
在某些实施例中,该生物测定模块包括用于使用小体积样品实现快速原位样品净化和电离的多路复用感应纳米电喷雾和微电泳装置。在此类实施例中,该控制模块可以控制该多路复用感应纳米电喷雾和微电泳装置的操作。这在图7中展示。
图8A展示了可以可选地经由本发明的***耦合和操作的第二表征位置,并且图8B示出了通过***的工作流程的附加方面。第二表征位置可由该控制模块的流体处理装置访问,并且可以可操作耦合到该控制模块。如图8A中的示例所示,该第二表征位置包括拉曼光谱仪。图9至图10进一步示出了可以通过第二表征位置实现的表征和附加生物活性探索。
图11A示出了从***获得的数据可以如何用于确定结构-生物活性相关性,并且图11B示出了使用本发明的***的工作流程中的最终步骤。特别地,可以实施深度学习方法和基于神经网络的模型来揭示结构-生物活性相关性。
流体处理
本领域已知的任何流体处理仪器可以用于本发明的***中。在某些实施例中,流体处理仪器是如贝克曼库尔特公司(Beckman Coulter)生产和销售的Biomek液体处理器(例如I系列)。此类液体处理器的描述描述于例如美国专利号10,274,505;10,048,284;9,910,054;9,519,000;9,506,943;9,482,684;9,446,418;9,285,382;9,274,132;9,140,715;9,046,506;9,046,455;8,996,320;8,973,736;8,962,308;8,956,570;8,932,541;8,840,848;6,841,379;以及5,737,498,这些美国专利中的每个美国专利的内容通过援引以其全文并入本文。
微电泳
微电泳探针和***进一步描述于例如美国专利申请公开号2019/0019662中,该美国专利申请的内容通过援引以其全文并入本文。在某些方面,本发明利用电泳力在化学分析之前置换干扰溶液相离子,即,将溶液相离子移动到远离喷雾器的溶液区域。在某些实施例中,本发明的探针采用两个电极来产生电泳场,通过该电泳场,比如H+、Na+、K+、Br-、Cl-、乙酸盐-、甲酸盐-等离子可以***纵。除了H+和OH-,这些溶液相离子通过使单个分析物(M)具有多个信号(例如,M+H+、M+Na+和M+K+)或完全抑制分析物信号,来在质谱(MS)分析期间引起有害影响。这些加合物不仅会降低分析物的信号,还会导致团簇形成、光谱堵塞和MS分析仪灵敏度降低。本发明的电泳探针从发生分析喷雾的区域去除离子。去除不是永久性的,而是持续很长时间,并且因此允许在正常条件下进行质谱测定。
为了执行脱盐过程,将空心导管和电极***具有远端尖端的质谱探针的空心体中。空心导管是导电的,并且可以可操作耦合到电源和容纳液体样品的储液器。空心导管的远端位于空心体中,以与从空心导管排出的液体样品接触。单独的电极放置在发射器的后部,不与液体样品接触,而是电感连接(例如,电极的远端距空心体的远端尖端的距离不同于电极的远端距空心导管的远端的距离,例如,更远)。当空心导管将液体样品从储液器输送到空心体时,向空心导管施加电压。当液体样品流经空心导管并进入空心体时,空心导管使液体样品极化。这产生了溶液的电荷体,该电荷体经由外部空心导管连接到电源的一极。以这种方式,液体样品可以充当电极。当适当的电势(例如,DC电势)施加到电极时,离子迁移到毛细管的后部,远离空心体的尖端。短时间后,电极关闭,同时电压仍供应到空心导管,即使空心导管中没有流动或液体,也会继续将电荷赋予空心体中的液体样品。产生的光谱具有主要与质子化分子(M+H+)相关的信号,以及由分子的阳离子加合物或阳离子盐簇产生的最小信号。相同的实验可以应用于使用电极上相反极性的负离子。本发明的质谱探针已被用于提高分析废物流中常见的治疗药物、肽、蛋白质和污染物的分析性能。
在某些实施例中,本发明探针是电泳、多电极质谱探针(例如,纳米ESI探针),该探针无需添加任何化学改性剂即可快速对基质脱盐。如本文所述,该设置是小毛细管,可以含有液体,比如水。可选地经由注射泵(例如,样品储液器)将分析物输送到毛细管的尖端,连接到绝缘熔融石英线(例如,导电空心导管)两分钟(4μL/分钟)。高压连接器HV1经由注射泵通过传导溶剂绝缘线,将1.5kV输送到毛细管的前部。在某些实施例中,HV1可以等同于任何基于喷雾的电离源中的典型喷雾电压。第二电极HV2位于玻璃毛细管内部,但不与溶剂接触(约5mm气隙)。如所示,HV1和HV2各自终止于距空心毛细管的远端尖端不同的距离。在示例实施例中,HV2终止于比HV1更靠近毛细管的后部。
质谱探针的主体是空心单一体。这是示例性的并且不是在所有实施例中都是必需的。在本发明的上下文中,单一是指质谱探针的主体壁没有包括断裂、切口或断开区域。相反,探针的壁从探针的远端尖端连续延伸到探针的后部,没有任何断裂、切口或脱节区域。以这种方式,质谱探针可以在不形成连接到脱节的非单一探针主体的部分所需要的液桥或任何其他连接器的情况下操作。类似地,本发明的方法可以在不需要在探针中设置液桥的情况下执行。
在不限于任何特定理论或作用机制的情况下,源内脱盐通常分三个步骤进行。对于正模式分析,HV1被设置为(+)1.5kV,并且注射泵如上所述运行。在步骤l期间收集的数据是典型的光谱,该光谱包含M+H+、M+Na+和M+K+种类。接下来,将第二电势HV2电感施加到溶剂弯月面的后部,范围为-3kV至-5kV。开启时,由于高负电场将正离子隔离到毛细管的后部,正离子信号耗尽。一段时间后(例如,1分钟(示例性时间段)),来自HV2的电压被移除(电压终止),并且溶液相离子进入发射器的前端;然而,由于迁移性,质子在Na+和K+之前到达发射器的尖端,导致光谱主要包含质子化离子。
解吸电喷雾电离
解吸电喷雾电离(DESI)描述于例如Takats等人(美国专利号7,335,897)中,该美国专利的内容通过援引以其全文并入本文。DESI允许在大气压下或在减压的环境条件下电离和解吸材料(分析物)。DESI***通常包括用于通过将液滴输送到雾化气体中来生成DESI活性喷雾的设备。该***还包括用于将DESI活性喷雾引导到表面上的装置。应当理解,DESI活性喷雾在与表面接触的点处可以包括带电液滴和不带电液滴两者或带电液滴和不带电液滴中的任一者、气态离子、雾化气体的分子以及附近大气的分子。气动辅助喷雾被引导到样品材料的表面上,在该表面上喷雾与一种或多种分析物(如果存在于样品中的话)相互作用,并生成一种或多种分析物的解吸离子。可以将解吸离子引导到质量分析器以进行质量分析、引导到IMS设备以按大小进行分离并测量产生的电压变化、引导到火焰分光计用于进行光谱分析等。
在该***中,由常规电喷雾设备生成喷雾。设备包括喷雾毛细管,液体溶剂穿过该喷雾毛细管被供给。周围的雾化器毛细管形成环形空间,比如氮气(N2)等雾化气体穿过该环形空间被高速供给。在一个示例中,液体是水/甲醇混合物,并且气体是氮气。电源经由金属连接元件将高压施加至液体溶剂。快速流动的雾化气体与离开毛细管的液体相互作用的结果形成了包括液滴的DESI活性喷雾。DESI活性喷雾也可以包括中性大气分子、雾化气体、以及气态离子。尽管已经描述了电喷雾设备,但是任何能够生成由雾化气体射流携带的液滴流的设备都可以用来形成DESI活性喷雾。
喷雾被引导到样品材料上,在本示例中,该样品材料支撑在表面上。通过离子转移线收集离开样品的解吸离子并将其引入到质谱仪的大气入口或接口以进行分析,该离子转移线被定位在距样品足够近的位置以收集解吸离子。表面可以是可移动平台,或者可以安装在可以通过众所周知的驱动装置在x、y或z方向上移动的可移动平台上,以在不同区域解吸和电离样品,有时用于创建样品成分分布的地图或图像。平台的电势和温度也可以通过已知手段来控制。质谱仪中常见的任何大气接口均适用于在本发明中使用。使用典型的加热毛细管大气接口已经获得了良好的结果。使用经由由金属或绝缘体制成的延长的柔性离子转移线进行采样的大气接口也已经获得了良好的结果。
多路复用和感应充电
在某些实施例中,在本发明的***和方法中使用样品装载和分析的多路复用,可选地使用感应充电进行分析。此类方法描述于例如美国专利申请公开号2020/0381238中,该美国专利申请的内容通过援引以其全文并入本文。在某些实施例中,感应DC nESI电离源包括3D电控移动平台、发射器固持器和弹簧针固持器。在此类实施例中,发射器固持器预装载了96个发射器和样品。发射器固持器通过3D打印连接器附接到3D移动台。发射器固持器被设计成易于与移动台附接并从其拆卸以便于样品引入和清洁。发射器固持器的前部(面向MS入口的一侧)具有96个孔以固持96个发射器。在孔内部,存在96个长度与发射器固持器的长度相同的单独电极。当将发射器装载到固持器中时,这些电极被***到发射器中但不到达样品溶液。电极的另一端从后部(与MS入口相对的一侧)开始并且焊接到具有96个孔的PCB。在PCB上,存在通过焊接与96个电极电接触的96个隔离的铜层。放置在PCB后面的弹簧针电极与MS入口对齐。弹簧针电极的位置由3D移动台的固定臂上的弹簧针固持器固定。弹簧针电极接触PCB。当设备运行时,运动控制***首先到达右上方的起点,并在竖直的y方向上移动以寻找第一行发射器,并且然后在水平的x方向上移动以依次分析第一行中的样品。当发射器与MS入口对齐时,弹簧针接触PCB上的对应铜层并向电极施加2kV到3.5kV电压,以诱导发射器的尖端中的样品的DC nESI电离。应注意,电极不接触样品,因此电离被诱导。由于感应nESI中的流速非常低,因此尽管样品体积非常小,但仍有足够的时间记录高质量的MS数据。
为了解决传统nESI工作流程呈现的样品引入问题,开发了使用多路复用***的“浸渍即走”策略。在这种方法中,将96个尖端大小为20微米的发射器预装载到发射器固持器中。固持器的大小被设计成与标准96孔板的大小相对应,并且每个发射器的位置与96孔板中每个孔的位置相对应。为了装载样品,固持发射器固持器并使带有发射器的一侧面向96孔板,降低固持器并允许每个发射器被浸没到样品溶液中10秒钟并且然后抬起固持器。此程序可以手动地完成,或者可以用机器人完成。引入到发射器中的样品溶液量为大约100nL。样品装载量可以通过使用不同的装载时间而变化。
在样品分析之前可以对发射器上的样品应用诱导电泳清洁(“脱盐”)以实现具有复杂基质的样品的更好的分析性能。通过同时向电极施加电压(例如,大于5kV,极性与nESI分析所用极性相同或相反),在发射器尖端中的样品中诱导的高电场将导致电泳。离子迁移率大的离子(比如溶液中的来自简单盐的阴离子和阳离子)将朝向溶液的两端迁移,从而使离子迁移率小的物质(比如肽)将基本上保持在其原始位置并将经历选择性电离。
为了进行离线电泳清洁,固持发射器固持器并允许PCB的铜层接触连接到电源的高压输出的铜板。在距离发射器尖端0.5cm至1cm的距离处,放置另一个接地的铜板以便在样品溶液中建立较大的电势变化以启动电泳。电泳维持10秒并且然后将发射器固持器重新安装到3D移动台平台的背面上。按照A部分中描述的相同步骤,记录清洁的样品的光谱。此方法更方便但稍慢(因为清洁会稍微减慢用于电离的运动率)。
离线清洁的替代方案是使用一个用于清洁的HV电源以及第二个用于电离的HV电源进行在线清洁。为了进行在线电泳清洁,将发射器固持器附接到移动台。在进行清洁时,移动台允许发射器固持器从左向右移动。弹簧针固持器上的左弹簧针供应-6kV电压以诱导对指向接地的对电极的样品的电泳清洁。随后,在清洁之后,发射器移动并与MS入口对齐,在该点处,施加到弹簧针固持器上的具有2kV至3.5kV电压的右弹簧针电极通过A中描述的相同过程对发射器中的样品启动感应nESI分析。此方法更快并且样品筛选率可以被最大化。
如上所述,感应充电在多路复用分析设置中可以是有用的。感应充电进一步描述于例如美国专利号9,184,036中,该美国专利的内容通过援引以其全文并入本文。在感应充电中,探针包括喷雾发射器和电压源并且探针被配置成使得电压源不与喷雾发射器或由喷雾发射器发射的喷雾接触。以此方式,离子通过感应充电产生,即,使用感应方法对初级微液滴充电。这使得液滴产生与样品引入***的打开同步(并且也与雾化气体的脉冲同步)。由于缺乏物理接触,可以实施感应nESI以用于各种nESI阵列。示例包括圆形和线性模式。在示例性旋转阵列中,距每个喷雾发射器约2mm放置的电极进而供应有2kV至4kV正脉冲(10Hz至3000Hz),从而给出一系列离子信号。使用在相邻nESI发射器中诱导产生的电压可以在线性阵列中产生同时或顺序的离子信号。可以在正检测模式和负检测模式两者下观察纳米电喷雾羽流并在质谱中检测分析物。在电泳净化工作模式下,直流电压源(1.5kV至6kV)用于诱导纳米电喷雾。与由交流电流电压感应的先前示例不同,感应电场在此模式下保持相同的方向,这确保了高效的电泳清洁性能。
离子阱和质谱仪
本领域已知的任何离子阱均可以用于本发明的***中。示例性离子阱包括双曲线离子阱(例如,美国专利号5,644,131,该美国专利的内容通过援引以其全文并入本文)、圆柱形离子阱(例如,Bonner等人,International Journal of Mass Spectrometry and IonPhysics[国际质谱法与离子物理学杂志],24(3):255-269,1977,该文献的内容通过援引以其全文并入本文)、线性离子阱(Hagar,Rapid Communications in Mass Spectrometry[质谱法快讯],16(6):512-526,2002,该文献的内容通过援引以其全文并入本文),以及直线形离子阱(美国专利号6,838,666,该美国专利的内容通过援引以其全文并入本文)。
任何质谱仪(例如,微型质谱仪的台式质谱仪)均可以用于本发明的***中并且在某些实施例中,该质谱仪是微型质谱仪。例如在Gao等人,(Anal.Chem.[分析化学]2008,80,7198-7205.)中描述了示例性微型质谱仪,该文献的内容通过援引以其全文并入本文。与用于具有数千瓦功率的实验室规模仪器的泵送***相比,微型质谱仪通常具有较小的泵送***,比如具有仅5L/分钟(0.3m3/小时)的隔膜泵和11L/秒的涡轮泵的18W泵送***,该***描述于Gao等人。其他示例性微型质谱仪描述于例如Gao等人,(分析化学2008,80,7198-7205.),Hou等人,(分析化学,2011,83,1857-1861.),以及Sokol等人,(Int.J.MassSpectrom.[国际质谱学杂志],2011,306,187-195)中,这些文献中的每个文献的内容通过援引以其全文并入本文。
迷你12的控制***(Linfan Li,Tsung-Chi Chen,Yue Ren,Paul I.Hendricks,R.Graham Cooks和Zheng Ouyang,“Miniature Ambient Mass Analysis System[微型环境质量分析***]”分析化学2014,86 2909-2916,DOI:10.1021/ac403766c;以及860.PaulI.Hendricks,Jon K.Dalgleish,Jacob T.Shelley,Matthew A.Kirleis,MatthewT.McNicholas,Linfan Li,Tsung-Chi Chen,Chien-Hsun Chen,Jason S.Duncan,FrankBoudreau,Robert J.Noll,John P.Denton,Timothy A.Roach,Zheng Ouyang和R.GrahamCooks,“Autonomous in-situ analysis and real-time chemical detection using abackpack miniature mass spectrometer:concept,instrumentation development,andperformance[使用背负式微型质谱仪进行自主原位分析和实时化学检测:概念、仪器开发和性能]”分析化学2014,862900-2908DOI:10.1021/ac403765x,这些文献中的每个文献的内容通过援引以其全文并入本文),以及迷你10的真空***(Liang Gao,Qingyu Song,Garth E.Patterson,R.Graham Cooks和Zheng Ouyang,“Handheld Rectilinear Ion TrapMass Spectrometer[手持直线形离子阱质谱仪]”,分析化学,78(2006)5994-6002DOI:10.1021/ac061144k,该文献的内容通过援引以其全文并入本文)可以组合以产生如图9所示的微型质谱仪。其尺寸可能类似于鞋盒(H20cm×W25cm×D35cm)。在某些实施例中,微型质谱仪使用双LIT配置,该配置描述于例如Owen等人(美国专利申请序列号14/345,672)和Ouyang等人(美国专利申请序列号61/865,377)中,这些美国专利申请中的每个美国专利申请的内容通过援引以其全文并入本文。
***架构
在某些实施例中,可以使用自动化***和计算设备来执行本发明的***和方法。特别地,本文所描述的本发明的各方面可以使用任何类型的包括处理器(例如中央处理单元)的计算设备(比如计算机)或计算设备的任何组合来执行,其中每个设备执行过程或方法的至少一部分。在一些实施例中,本文所描述的***和方法可以使用手持设备来控制,例如,智能平板电脑、或智能手机或为***制造的专用设备。
本发明的***和方法可以使用软件、硬件、固件、硬接线或其中任何项的组合来执行。实施功能的特征也可以在物理上位于不同的位置,包括被分布成使得功能的部分在不同的物理位置处实施(例如,成像装置在一个房间中,并且主机工作站在另一个房间中,或者在单独的建筑物中,例如,利用无线或有线连接)。
举例来说,适用于执行计算机程序的处理器包括通用和专用微处理器,以及任何类型的数字计算机的任何一个或多个处理器。通常,处理器将从只读存储器或随机存取存储器或两者接收指令和数据。计算机的基本元件是用于执行指令的处理器以及用于存储指令和数据的一个或多个存储器设备。通常,计算机还将包括用于存储数据的一个或多个大容量存储设备(例如,磁盘、磁光盘或光盘)或者可操作耦合到一个或多个大容量存储设备,以从大容量存储设备接收数据或向大容量存储设备传递数据或两者。适用于实施计算机程序指令和数据的信息载体包括所有形式的非易失性存储器,包括例如半导体存储器设备(例如,EPROM、EEPROM、固态驱动器(SSD)和闪速存储器设备);磁盘(例如,内部硬盘或可移动盘);磁光盘;以及光盘(例如,CD和DVD盘)。处理器和存储器可以由专用逻辑电路来补充或结合在其中。
为了提供与用户的交互,本文描述的主题可以在计算机上实现,该计算机具有用于向用户显示信息的I/O设备(例如,CRT、LCD、LED或投影设备)、以及用户可以通过其向计算机提供输入的输入或输出设备(比如键盘和定点设备(例如,鼠标或轨迹球))。也可以使用其他类型的设备来提供与用户的交互。例如,提供给用户的反馈可以是任何形式的感觉反馈,(例如,视觉反馈、听觉反馈或者触觉反馈),并且可以用任何形式,包括声学、语音或者触觉输入接收来自用户的输入。
本文描述的主题可以在计算***中实现,该计算***包括后端部件(例如,数据服务器)、中间件部件(例如,应用服务器)或前端部件(例如,具有图形用户界面或网络浏览器的客户端计算机,用户可以通过该图形用户界面或网络浏览器与本文描述的主题的实施方式进行交互),或者这种后端部件、中间件部件和前端部件的任何组合。***的部件可以通过任何形式或介质的数字数据通信(例如,通信网络)通过网络互连。例如,参考数据集可以存储在远程位置处并且计算机通过网络进行通信以访问参考集,以将源自女性受试者的数据与参考集进行比较。然而,在其他实施例中,参考集本地存储在计算机内并且计算机访问CPU内的参考集以将受试者数据与参考集进行比较。通信网络的示例包括蜂窝网络(例如,3G或4G)、局域网(LAN)和广域网(WAN)(例如,互联网)。
本文描述的主题可以被实施为一个或多个计算机程序产物,比如在信息载体(例如,非暂时性计算机可读介质)中有形地实施的一个或多个计算机程序,该一个或多个计算机程序用于由数据处理装置(例如,可编程处理器、计算机或多个计算机)执行或用于控制该数据处理装置的操作。计算机程序(也称为程序、软件、软件应用程序、应用程序、宏或代码)可以用任何形式的编程语言(包括编译或解释语言(例如,C、C++、Perl))编写,并且可以以任何形式部署,包括作为独立程序或作为模块、部件、子例程或适合在计算环境中使用的其他单元。本发明的***和方法可以包括用本领域已知的任何合适的编程语言,包括但不限于C、C++、Perl、Java、ActiveX、HTML5、可视化Basic或JavaScript编写的指令。
计算机程序不一定对应于文件。程序可以存储在保存其他程序或数据的文件或文件的一部分中,存储在专用于所讨论的程序的单个文件中,或者存储在多个协同文件(例如,存储一个或多个模块、子程序或部分代码的文件)中。计算机程序可以部署为在一台计算机上或在一个站点的多台计算机上执行,或者分布在多个站点上并通过通信网络互连。
文件可以是数字文件,例如,存储在硬盘驱动器、SSD、CD或其他有形的非暂时性介质上。可以通过网络将文件从一个设备发送到另一个设备(例如,通过网络接口卡、调制解调器、无线卡等,作为从服务器发送到客户端的分组)。
根据本发明的对文件进行写入涉及例如通过添加、移除或重新排列颗粒对有形的非暂时性计算机可读介质进行转换(例如,通过读/写头将具有净电荷或偶极矩的有形的非暂时性计算机可读介质转换为磁化模式),然后这些模式表示用户所期望的和对用户有用的关于客观物理现象的新信息搭配。在一些实施例中,写入涉及有形的非暂时性计算机可读介质中的材料的物理转化(例如,具有某些光学特性,使得光学读/写设备然后可以读取新的和有用的信息搭配,例如,刻录CD-ROM)。在一些实施例中,写入文件包括转换物理闪速存储器装置(比如NAND闪速存储器设备),并且通过转化由浮栅晶体管制成的存储器单元阵列中的物理元件来存储信息。写入文件的方法在本领域是众所周知的,并且例如可以由程序手动或自动调用,或者由软件的保存命令或编程语言的写入命令调用。
适合的计算设备通常包括大容量存储器、至少一个图形用户界面、至少一个显示设备,并且通常包括设备之间的通信。大容量存储器展示了一种类型的计算机可读介质,即计算机存储介质。计算机存储介质可以包括以任何方法或技术实现的用于存储信息(比如计算机可读指令、数据结构、程序模块或其他数据)的易失性、非易失性、可移动和不可移动介质。计算机存储介质的示例包括RAM、ROM、EEPROM、闪速存储器或其他存储器技术、CD-ROM、数字多功能盘(DVD)或其他光存储设备、磁带盒、磁带、磁盘存储设备或其他磁存储设备、射频识别标签或芯片、或任何其他可以用于存储所需信息并且可以由计算设备访问的介质。
如本领域技术人员所认识对于本发明的方法的执行是必要的或最适合的,本发明的计算机***或机器包括一个或多个处理器(例如,中央处理单元(CPU)、图形处理单元(GPU)或两者)、主存储器和静态存储器,其通过总线彼此通信。
在图14中所示的示例性实施例中,***200可以包括计算机249(例如,膝上型电脑、台式电脑或平板电脑)。计算机249可以被配置成通过网络209通信。计算机249包括一个或多个处理器259和存储器263以及输入/输出机构254。在本发明的方法采用客户端/服务器架构的情况下,可以使用服务器213执行本发明的方法的步骤,该服务器包含处理器221和存储器229中的一个或多个,能够获得数据、指令等,或者通过接口模块225提供结果,或者将结果作为文件217提供。服务器213可以通过计算机249或终端267通过网络209参与,或者服务器213可以直接连接到终端267,该服务器包括一个或多个处理器275和存储器279,以及输入/输出机构271。
对于I/O 249、237或271中的任一个,根据本发明的***200或机器可以进一步包括视频显示单元(例如,液晶显示器(LCD)或阴极射线管(CRT))。根据本发明的计算机***或机器还可以包括字母数字输入设备(例如,键盘)、光标控制设备(例如,鼠标)、磁盘驱动单元、信号生成设备(例如,扬声器)、触摸屏、加速度计、麦克风、蜂窝射频天线和网络接口设备,该网络接口设备可以是例如网络接口卡(NIC)、Wi-Fi卡或蜂窝调制解调器。
根据本发明的存储器263、279或229可以包括机器可读介质,其上存储有使本文所描述的方法或功能中的任何一个或多个方法或功能具体化的一组或多组指令(例如,软件)。在计算机***执行软件期间,软件还可以完全或至少部分地驻留在主存储器和/或处理器内,该主存储器和处理器也构成机器可读介质。软件可以进一步经由网络接口设备通过网络发送或接收。
示例
本发明现在在本文中描述了以示例性方式用于合成和分析可以用作非成瘾性止痛药的新化合物的用途。
示例1
阿片类物质危机在北美有据可查并且是严重的流行事件,正在世界各地迅速扩散。目前被认为是严重的突发公共卫生事件。这种流行事件的起源可以在阿片类物质的处方中找到,这种处方在20世纪末作为急性慢性疼痛的治疗方案而急剧增加。今天,这一挑战要复杂得多,有着多种持续力并且对于人群有着更高的风险。举例而言,比如强合成阿片类物质(如芬太尼(fentanyl)及其类似物)的街头供应,尤其是在更传统和较弱的制剂(例如,***(heroin))中作为添加剂。直到2013年,这些化合物仅在零星爆发中出现,但从那时起,合成阿片类物质在美国每个州都造成了死亡,并渗透到传统的街头毒品供应中,对毫无戒心的消费者来说尤其危险。此外,将其列为列入清单物质是无效的,因为由于一些药物受到管制,市场上出现了新的合成阿片类物质(其无法通过传统药物测试方法检测到)。
在这种情况下,至关重要的是将阿片类物质危机作为化学问题来解决,因此需要新的化学知识作为其解决方案的一部分,而这些知识只能够通过化学实验获得。在此前提下,提出了一项化学研究,最终针对以下主要目标:通过促进开发非成瘾性但高效的止痛药,以及更高效的过量逆转策略和提高的司法鉴定检测新的合成阿片类物质的能力,使用能够对大量新的阿片类物质相关化合物进行合成、表征和生物分析的自动化高通量平台,来解决阿片类物质流行事件。图1描述了此平台。
在第一步骤中,本发明的***用于通过修饰药理活性骨架来合成大量阿片类物质相关化合物的纳克量。所得的化合物将不会被纯化,而是将使用串联质谱(MS/MS)进行初步原位分子结构表征。化合物的细胞毒性和与阿片受体的结合亲和力也将被原位测量。高感兴趣的化合物(低细胞毒性,高结合亲和力)将以更大但亚毫克规模制备,并且经由本发明的***,其拉曼光谱和阿片受体激动剂/拮抗剂特性也将被原位测量。疼痛和过量治疗取得进展已被广泛认为是抗击阿片类物质危机的基本方面。首先,这些进展允许开出更安全的镇痛药处方,使得可以防止阿片类物质滥用,同时解决慢性疼痛患者的治疗需求。其次,这些进展使得可用更强的拮抗剂,这些拮抗剂可以用于高效地抵消高效能阿片类物质过量并且从而有助于挽救生命。
接下来,本发明的***将用于使用高通量筛选方法所生成的大量数据集来构建包含大量阿片类化合物的光谱、结构和生物活性的库。这将表示大大改善早期检测出新的合成阿片类物质的司法鉴定能力,从而允许在将新物质引入街头毒品市场后作出迅速和知情的反应。这些库还允许特别地通过基于新颖的从头计算和机器学习的计算机研究来了解阿片类物质化学和生化活性并且了解阿片类物质与分子结构的关系。
在追求这两个特定目标的过程中,将测试以下假设:对疼痛抑制具有高效能的非成瘾性化合物之间存在结构/活性关系,并且这种联系也可能体现在阿片受体激动剂/拮抗剂特性中。此外,作为该项目的输出,期望i)一组具有作为有效止痛药或过量治疗的高潜力的被表征(结构和生物活性)的新阿片类物质,以及ii)关于应该允许快速扩大规模和进一步测试的最佳合成条件的指导。作为附加的辅助输出,iii)期望,与结构、生物活性和光谱(MS/MS和拉曼)相关的新合成阿片类物质的综合库将扩展当前用于阿片类物质检测的数据集,从而提高司法鉴定检测街头毒品供应中新引入的阿片类物质的能力。这些结果反映了解决阿片类物质危机的提议的转化重点。最后,设想本发明的***将提供能够自动化高通量合成、分析和性质筛选的独特平台。
为了解决不断发展和演变的阿片类物质流行事件,必须从多个角度解决这一问题。特别地,应在获得疼痛治疗和预防流行事件之间保持微妙的平衡。在这方面,要解决的最紧迫的问题之一是更安全的止痛药的可用性。开发非成瘾性但高效能的阿片类物质镇痛剂至关重要,因为据报道大约三分之一的美国人口经历过慢性疼痛,并且疼痛缓解是医疗保健的重要组成部分。在此背景下,所提出的研究旨在通过实施快速和高通量平台来合成、表征和生物活性筛选大量新阿片类物质,从而做出重大贡献。特别地,对细胞毒性以及针对不同阿片受体的结合亲和力和激动剂/拮抗剂特性的评估,应该提供高感兴趣的候选物作为潜在的非成瘾性止痛药,然后这些药物可以进行进一步的生物学和临床研究。另外,平台将通过高通量反应筛选提供有关合成路线优化的信息-在适当的监管设施(非本人的)中可以转化为大规模生产的最佳条件。此外,使用这种高通量方法将提供附加的候选物,例如将强μ拮抗剂识别为高效能、过量逆转治疗。这是抗击阿片类物质危机的第二个关键目标,这与常见拮抗剂(例如,纳洛酮(naloxone))压制比如芬太尼及其一些类似物等合成阿片类物质的强大效果的效率低下有关,这尤其是需要立即并且有效治疗的环境中的主要问题。因此,值得注意的是,该高通量平台可以如何为更安全的止痛药和更高效的过量逆转策略做出巨大贡献,从而改善患者护理并挽救生命。另外,值得注意的是,可以以多快的速度(目前的合成筛选速率高达每小时6,144个反应)和超少量(表示为“定制”,即仅合成足以评估结构和生物活性)执行此类反应筛选。阿片类物质危机中的第三个相关问题与检测新合成的阿片类物质的司法鉴定能力有关。目前,执行库匹配以匹配从样品中的化合物获得的分析信息(即,保留时间、质荷比、MS/MS片段)。只有当分析物先前已被表征并且在数据库条目中时,此过程才有效。然而,主要的担忧来自秘密合成并引入街头的新化合物。这些未列入清单物质在常规药物筛选测试中通常未被发现,并且因此可能在充分检测到之前导致致命的爆发。美国的芬太尼(2006年)、乙酰芬太尼(acetylfentanyl)(2013年)、卡芬太尼(carfentanyl)(2016年)和U47700(2016年)就是这种情况。此处,建议使用从大量新阿片类物质的高通量合成和表征中收集的大量数据来创建广泛的光谱库,其中包含尚未引入街头的新合成药物的分析数据。通过这种方式,执法部门和公共卫生当局将具有检测药物供应中的新化合物的早期能力,并且因此防止潜在的爆发。
总体而言,所提出的研究策略旨在促进非成瘾性止痛药、高效能过量逆转治疗和有效检测新的阿片类物质引入。因此,研究表示了一种基于化学实验的转化多靶点研究方法,该方法解决了多方面化学危机-阿片类物质流行事件的几个关键方面。最终,通过促进(i)患者获得更安全的镇痛药,(ii)第一反应者获得有效的过量逆转干预,以及(iii)同时,执法部门获得早期检测新合成阿片类物质的广泛工具,正在全面面对这一突发公共卫生事件,并有助于其更快地解决。
示例2
所提出的研究方法在图11B中作为工作流程以图形方式描绘,重点在于:(i)大量阿片类物质的高通量合成和原位表征(结构和生物活性),以及(ii)广泛库的创建,这些库中包含大量阿片类物质的光谱、结构和生物活性。以下示例中描述了不同活性。
示例3
高通量化学转化将在针对阿片类物质的药理学并且特别是阿片类物质相关性选择的分子骨架上执行,以便构建此类化合物的大群体。起始材料将基于文献检索,但一些材料可能会由合作者建议。转化将以纳克级执行,使用本发明的***的高通量化学模块通过自动化MS和MS/MS进行产物表征。在DESI分析过程中产生的液滴中,将加速反应。将评估各种条件(化学计量、溶剂、pH、催化剂等),使得快速MS分析可以用于确定产生最高纯度产物的最高相对量的条件。这种反应条件的选择本身就是纯化步骤,因为只有产生足够纯度产物的混合物才会经历进一步的步骤。在此阶段,MS/MS将用于确认身份。此时的目标将是产生少量纯度适中的衍生化合物,用于原位生物活性筛选(热点)。
化学模块通常遵循三个主要步骤进行自动化、高通量反应筛选,如图12所示。(i)通过自动化液体处理***将反应溶液添加到384孔主反应板中;然后,混合后,使用商用机器人电镀***(贝克曼Biomek i7)将少量反应混合物点样到微量滴定板上,这允许点样反应体积低至5nL,位置准确度为100-μm并且每板密度高达6,144个反应斑点。(ii)在整个板上扫描DESI源以解吸并加速反应,然后通过质谱仪对其产物进行采样和分析。DESI允许高达每小时6,144个斑点的扫描速度,并且还允许快速溶剂切换,这可以定制DESI条件以最大化动态信号。(iii)使用自制的软件包CHRIS分析获得的光谱,该软件包分配峰值强度并将其转换为板上每个斑点的是/否(或更细粒度的)输出,从而创建热图。如果输出为正,则可以重新分析斑点以获得结构表征(MS/MS)。
注意到与传统的构效关系方法相比,该高通量策略以其纳克级的速度和操作而突出。在考虑感兴趣的化合物的法律规定时,小规模是相当大的优势。另外,以这种规模工作使得该方法是“测量用”策略,其中化合物以尽可能小的规模合成,仅足以查询其有关光谱特性和生物活性的有用信息。
通过对铃木交叉偶联、烷基溴的N-烷基化、亲核芳香族取代(SNAr)和N-酰化等的探索,证明了该方法的成功。具体示例是对优化条件(溶剂、浓度和亚硝化试剂)进行快速但广泛的筛选,用于新合成洛莫司汀(Lomustine),治疗脑肿瘤和霍奇金病(Hodgkin’sdisease)的重要药物。表1提供了该项目的一些潜在相关分子骨架和转化的示例。
表1
示例4
通过修饰感兴趣的分子骨架而产生的新阿片类化合物(热点)的性质将以在线、高通量的方式进行初步检查,无需进一步修改。在此第一表征阶段,将确定细胞毒性和与阿片受体的结合亲和力,这两者都是评估新合成化合物的潜在效率的基本参数。为了实现这些特性的高通量筛选,本发明的***允许使用DESI喷雾角度切换方法收集合成的产物(图4A)。简而言之,使用了新的DESI平台,其具有两个位置(分析:靠近MS入口,以及收集:远离MS)。分析位置将用于高密度板中的反应筛选,而收集位置将用于将产物沉积在低密度孔板上。使用这种方法,也许所筛选的反应中有10%会在典型板中产生热点,并且大约1ng至2ng的产物将被沉积。
细胞毒性将通过组合alamarBlue和CFDA-AM测定进行评估(图4A、图5和图6),该组合因其相对低成本、简单性、可重复性和灵敏度而得到广泛认可。这些测试一起评估代谢活性和膜完整性。通过在***内耦合荧光酶标仪,以高通量方式实施该测定,其控制已整合到现有和已自动化的***中。具体地,所收集的产物的板将由化学合成模块的机械臂和/或控制模块的流体处理装置转移到外部温育位置,在那里阿片类物质将与已建立的系(例如,3T3、HaCaT、HepG2)-温育模块的培养细胞一起温育过夜。然后,温育板将由同一机械臂转移到荧光读取器的托盘(配置为表征位置)。在读取器中,并且使用仪器的内置试剂分配器、振荡器和温育箱,将加入测定试剂,并将在读取前温育培养物1小时到4小时。所有这些事件都将由控制模块编程和触发,控制模块也将处理所收集的数据。
化合物与不同阿片受体的结合亲和力将使用在线、竞争性结合测定进行评估(图4A、图5和图6)。在这些实验中,使用多通道DESI液体处理***,阿片受体的重组膜制剂和每个受体特定的阿片类肽(例如用于μ-OR的DAMGO)将在收集后就添加到喷雾沉积化合物中,而无需从收集位置移除板。然后,板将通过机械臂转移到温育位置。用冷缓冲液淬灭温育后,化学合成模块将对孔进行筛选。使用DESI,可以确定游离阿片类肽(即感兴趣化合物的竞争者)的浓度。这进而允许估计分析物的结合亲和力-游离肽浓度越大,阿片类分析物对受体的亲和力就越高。请注意,这种方法遵循确定阿片类物质结合亲和力的成熟方案的化学原理,但与使用放射性标记化合物和闪烁计数的传统方法形成鲜明对比。使用DESI-MS进行测定简化了程序,允许高通量筛选,并且无需购买和使用放射性物质。所提出的策略将通过评估已知阿片类的结合亲和力的一般趋势,并将其与文献中可得的信息加以证实来验证。另外,阳性(即,已知的阿片受体强激动剂和拮抗剂)和阴性对照(非阿片类化合物)将作为实验验证的一部分进行测试。
展示出非细胞毒性和高结合亲和力的化合物将被认为是高感兴趣的候选物,并且这些化合物将被选择经历下一阶段,使用其最佳合成条件(即,产生热点的条件),并且延长喷雾沉积时间,使得在低密度板中收集10ng至20ng。
高感兴趣的候选化合物将通过拉曼光谱原位表征,通过将拉曼酶标仪耦合到***作为机械臂可访问的另一个表征位置(第二表征位置;图8A)。读取器的控制将完全集成到控制模块中。在感兴趣的情况下,也可以使用将在此阶段收集的亚毫克量的产物进行非原位核磁共振(NMR)表征。获得高感兴趣的候选化合物的拉曼光谱有两个主要好处:(i)进一步的结构表征和与理论光谱的比较,以确认产物标识,以及(ii)将拉曼光谱添加到所提出的阿片类物质的广泛库中。这与拓展阿片类物质检测的司法鉴定能力高度相关,特别是考虑到缉获药物分析科学工作组(SWGDRUG)指出,缉获的药物分析必须使用两种分析技术,这一要求可以很容易地将拉曼与MS耦合。因此,大量阿片类物质的拉曼和MS/MS光谱的可用性表示了与司法鉴定的库匹配的明显优势,特别是对于尚未引入的合成化合物,然后可以更早地识别和确认这些化合物,从而满足现行法规。
最后,在此阶段将评估高感兴趣的候选物的激动剂/拮抗剂特性(图9至图10)。这是相关的,因为高亲和力的阿片受体配体可以在结合时诱导受体上的不同类型的反应。在阿片受体的事例中,该阿片类物质是七个跨膜跨越的G蛋白偶联受体超家族的一部分,其激活意味着与受体相关的G蛋白的构象变化。这种变化最初诱导二磷酸胍(GDP)的释放以及其三磷酸类似物(GTP)的摄取,然后导致G蛋白α和βγ亚基的解离,并且因此,导致另外的下游代谢效应,最终导致阿片类物质消费的宏观效应,如镇痛和欣快。阿片受体的激动剂(例如,***(morphine)、芬太尼)在结合时诱导这种反应,而拮抗剂(例如,纳洛酮)尽管与受体结合良好,但不会产生相同的效果。这就是为什么强拮抗剂用于治疗阿片类物质过量,而部分激动剂是阿片类物质依赖/成瘾处理的一部分。因此,强/弱激动剂/拮抗剂的区分是重要的任务,可以通过评估阿片类分析物结合后诱导的激活反应来完成。
阿片受体激活测定将通过在GTPγS(GTP的不可水解类似物)存在下用不同的阿片受体膜制剂温育高感兴趣的靶点来执行,使得在激活时阿片受体G蛋白复合物将GDP释放到培养基中并吸收GTPγS,降低其游离浓度。与结合亲和力测定类似,试剂/受体将由DESI液体处理***添加到收集位置。然后,将板来回转移到温育位置,并使用DESI测定GTPγS。在这种情况下,其浓度的降低将与由感兴趣的阿片类化合物结合而诱导的阿片受体激活程度相关。另外,可以监测GDP水平的增加,使得受体激活有两个分子指标。这些指标中的任意个的较大变化都将意味着阿片类分析物具有更强的激动剂特性,而与阴性对照相比,没有变化将代表强拮抗剂特性(到这个阶段,所有高感兴趣的候选物将被筛选为阿片受体的高亲和力配体)。然后,将分配每种分析物相对于已知的强激动剂/拮抗剂诱导的激活程度。还将对这些已知化合物进行测试,并根据文献中报告的趋势对其相对激活程度进行基准测试,作为对所提出的方法的验证。与结合测定一样,相关需要强调的是,所提出的方法遵循既定方案中使用的化学关系,但通过去除放射性标记材料的使用简化了工作流程,并且本发明的***带来了高通量筛选的优势。
通过评估其生物激动剂或拮抗剂特性(针对不同的阿片受体),候选分子可以根据其潜力高效地定向到进一步的研究,例如μ-阿片受体强拮抗剂作为潜在的高效过量逆转治疗。使用该高通量方法合成的大量感兴趣的化合物的生物学表征具有巨大的价值。特别地,该价值是显而易见的,因为已经广泛认识到阿片类物质的药效学,即使是结构密切相关的药效学,也可能完全不同,并且因此这些药物可能引起不同的反应,例如,更高或相当的镇痛但成瘾更少。此外,这种对多种化合物在不同受体上的活性的快速、高通量和无偏倚测试,与对典型化合物(主要是μ阿片受体)的传统研究以及将这些结论外推到结构相关的家族形成鲜明对比。该方法有可能更容易地揭示疼痛或过量治疗的新型可能候选物,从而深入了解阿片类物质的结构与生物活性之间仍然模糊的关系。
示例5
关于大量阿片类物质的结构、光谱和生物活性的数据,将被适当处理并高效地相互连接,以便生成新的合成阿片类物质的数据库(图11A)。这可能要归功于将所有不同的仪器集成于具有通用控制***的独特平台。通过该高通量筛选方法获得的扩展库***的可用性在于街头毒品市场中尚不存在的化合物,这表示了早期检测最近引入的合成阿片类物质的优势。另外,将有机会使用两种不同的分析技术-MS/MS和拉曼进行识别/确认。
示例6
将执行从头计算,并且将包括:(i)对实验考虑分子的结构生成置信度,(ii)预测与阿片受体的分子相互作用,以及(iii)在模拟中训练机器学***衡格林函数(non-equilibrium Green’s functions,NEGF)的新型算法,这些算法快速并且能够明确考虑溶剂和周围分子。这些工具缩小了分子过程中有限温度和能量交换的差距,而最先进的DFT工具只考虑完全冻结的结构,不允许分子与其环境之间的能量交换。集成在这些工具套件中的开放边界条件应成功模拟比最先进的DFT工具可以覆盖的结构大得多的结构;因此,阿片受体和相互作用的阿片类物质可以在完整的量子力学描述中合适地进行模拟。另外,将实施深度学***台提供的足够大且足够全面的数据集进行训练,则这种类型的预测能力将通过算法实现。这些算法将有利于近似模型,比如部分电荷自洽DFT,以获得快速和近似的猜测,使得分子候选物越接近要求,可以应用的搜索模型就越精细。这种类型的能力将允许快速识别混合物中的未知阿片类物质,也协助计算机确定非成瘾性、高效、止痛化合物。
示例7
认识到将有一些项目需要进一步考虑。首先,热点的纯度低。这一困难可以通过物理上(反应混合物)和数字上(MS/MS谱图)纯化来解决。物理净化可以通过在加热的微量滴定板中按比例放大产物合成并使用微尺度固相萃取在线纯化产物来原位进行。数字清洁将通过适当的光谱操作进行,重点是优先考虑质荷比值中的信息,而不是强度规模。然而,预计通过对几种反应条件的高通量评估,一些斑点将产生相对纯的产物。其次,该合成方法在覆盖潜在化合物方面可能存在差距。考虑认为,通过不断努力扩大可以使用本发明的***来筛选的反应和骨架的类型,这个问题将得到缓解。第三,该高通量筛选策略缺乏标准。在这种情况下,如果需要半定量分析,例如评估和比较不同热点的产物产量,计划将适当的内标预装载到微量滴定板中。第四,由于灵敏度限制,所提出的生物测定需要大量化合物。如有必要,可以使用优化的合成条件(例如,产生热点的条件)延长喷雾沉积时间,从而简单地制造更多的材料。即使在这种情况下,材料的数量仍将低于低毫克水平,并且将与监管机构合作,以确保即使这些数量也得到适当处理。如果进一步的测定或广泛的生物学研究(如疼痛抑制和成瘾倾向的研究)需要更大的数量(数十毫克),则需要解决监管障碍。科学障碍的问题不太令人担忧;从高通量筛选到流动化学的按比例放大已经在几种小分子合成中得到证明。
最后,认识到了由于电离抑制或高化学噪声,基质的复杂性可能会使DESI在生物测定中的使用复杂化。在这方面,建议使用多路复用纳米电喷雾方法,直接从微量滴定板浸渍即走,来分析复杂的混合物(图7和图13小图A至小图C)。这一***将多路复用感应纳米电喷雾与微电泳耦合,以使用小体积样品(50nL)实现快速原位样品净化和电离。微量滴定板的孔中的样品只需将发射器浸入样品溶液中,即可装入定制的发射器阵列中。抽吸的毛细管力装载50nL至100nL的样品溶液,取决于发射器尖端的大小(直径20μm至35μm)。另外,使用场扩增允许超灵敏分析(生物培养基中的1nM)。该***的实用性和性能已经通过其成功用于抑制BACE1酶,阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease)的靶标的药物的生物活性评估得到证明。与LC-MS相比,抑制曲线的获得时间几乎缩短了两个数量级(360个样品/小时与8个样品/小时相比较),并且结果相同。同样,观察到基质峰的去除以及信噪比增强(全扫描模式下从小于3增加到20),分析物信号增加了100倍,原因如下:(i)场放大电泳的堆垛效果,以及(ii)原位电泳净化后离子抑制效果的改善。该策略将以自动化方式实施,使得板传输、流体、仪器和来自浸渍即走***的数据将完全由控制模块的软件控制。此外,这种缓解策略将使用不同的质谱仪,特别地可用的四极杆飞行时间(qToF)来实施。
援引并入
在整个本披露内容中已经参考和引用了其他文件,比如专利、专利申请、专利公开物、杂志、书籍、论文、网页内容。出于所有目的将所有这些文件特此通过援引以其全文并入本文。
等同物
在不脱离本发明的精神或本质特性的情况下,可以以其他特定的形式实施本发明。因此,前述实施例在所有方面都被认为是说明性的而非限制本文所描述的本发明。
Claims (20)
1.一种集成的合成和分析***,所述***包括:
化学合成模块,所述化学合成模块包括:用于在基板上生成离散斑点阵列的一种或多种仪器;以及解吸电喷雾电离DESI源,所述DESI源用于解吸和电离化学分子并从每个离散斑点形成化学产物;
分析模块,所述分析模块包括被定位成从每个斑点接收经解吸且经电离的化学产物的质谱仪;
温育模块,所述温育模块被配置成用一种或多种生物材料温育所述化学产物,以进行生物测定;
生物测定模块,所述生物测定模块被配置成分析包括所述化学产物的所述生物测定的结果;以及
控制装置,所述控制装置包括:流体处理装置,所述流体处理装置包括被配置成处理和移动基板并处理所述化学合成模块、所述温育模块和所述生物测定模块之间的一种或多种流体的一个或多个机器人仪器;以及控制模块,所述控制模块包括用于控制和协调所述化学合成模块、所述温育模块和所述生物测定模块中的每个模块的操作的软件。
2.如权利要求1所述的集成的合成和分析***,其中,所述控制模块进一步包括从每个斑点生成所述化学产物的热图以说明每个斑点的所述化学产物的成功形成的软件。
3.如权利要求2所述的集成的合成和分析***,其中,所述软件分析所述热图并确定应重新扫描哪些化学产物用于结构信息。
4.如权利要求1所述的集成的合成和分析***,其中,所述化学合成模块进一步包括:
二位式DESI平台,其中,第一位置被配置用于分析所述化学产物并且靠近所述质谱仪的入口,并且第二位置被定位成远离所述质谱仪的入口;以及
开关,所述开关由所述控制模块控制以在所述第一位置与所述第二位置之间切换。
5.如权利要求1所述的集成的合成和分析***,其中,所述温育模块能够被配置成执行选自由以下组成的组的生物测定的温育:细胞毒性、酶再激活、抗生素活性、结合亲和力、酶抑制、抗病毒活性、激动作用/拮抗作用、以及血液/脑屏障渗透。
6.如权利要求1所述的集成的合成和分析***,其中,所述温育模块可操作地与所述控制模块的流体处理装置和所述化学合成模块的一个或多个流体处理仪器相关联。
7.如权利要求1所述的集成的合成和分析***,其中,所述***进一步包括第二表征位置,所述第二表征位置能够由所述控制模块的流体处理装置访问,并且能够可操作耦合到所述控制模块。
8.如权利要求1所述的集成的合成和分析***,其中,所述第二表征位置包括拉曼光谱仪。
9.如权利要求1所述的集成的合成和分析***,其中,所述生物测定模块包括用于使用小体积样品实现快速原位样品净化和电离的多路复用感应纳米电喷雾和微电泳装置。
10.如权利要求1所述的集成的合成和分析***,其中,所述控制模块控制所述多路复用感应纳米电喷雾和微电泳装置的操作。
11.一种用于形成化学产物和对所述化学产物进行一种或多种生物测定的方法,所述方法包括以下操作:
通过将解吸电喷雾电离DESI喷雾从DESI源引导到基板上以解吸和电离化学分子并形成化学产物,来在DESI液滴产物中形成化学产物,其中,对来自斑点阵列的表面的每个斑点进行形成步骤;
在质谱仪中分析所述化学产物;
收集所述化学产物;
用一个或多个生物分子温育所述化学产物;以及
分析用所述一个或多个生物分子温育所述化学产物的结果;
其中,所述方法的所有步骤均由集成的合成和分析***执行,所述集成的合成和分析***包括流体处理装置和控制模块,所述流体处理装置包括被配置成通过所述方法的每个步骤处理和移动所述化学产物的一个或多个机器人仪器,所述控制模块包括用于控制和协调每个方法步骤的操作的软件。
12.如权利要求11所述的方法,其中,所述控制模块进一步包括从每个斑点生成所述化学产物的热图以说明每个斑点的所述化学产物的成功形成的软件。
13.如权利要求12所述的方法,其中,所述软件分析所述热图并确定应重新扫描哪些化学产物用于结构信息。
14.如权利要求11所述的方法,其中,所述形成步骤进一步利用:
二位式DESI平台,其中,第一位置被配置用于分析所述化学产物并且靠近所述质谱仪的入口,并且第二位置被定位成远离所述质谱仪的入口;以及
开关,所述开关由所述控制模块控制以在所述第一位置与所述第二位置之间切换。
15.如权利要求11所述的方法,其中,所述温育用于选自由以下组成的组的一个或多个生物测定:细胞毒性、酶再激活、抗生素活性、结合亲和力、酶抑制、抗病毒活性、激动作用/拮抗作用、以及血液/脑屏障渗透。
16.如权利要求11所述的方法,其中,所述方法进一步包括第二表征位置中的第二表征步骤,所述第二表征位置能够由所述控制模块的流体处理装置访问,并且能够可操作耦合到所述控制模块。
17.如权利要求11所述的方法,其中,所述第二表征包括通过拉曼光谱进行的分析。
18.如权利要求1所述的方法,其中,分析所述温育的结果包括使用多路复用感应纳米电喷雾和微电泳装置,以使用小体积样品实现快速原位样品净化和电离。
19.如权利要求18所述的方法,其中,所述控制模块控制所述多路复用感应纳米电喷雾和微电泳装置的操作。
20.如权利要求11所述的方法,其中,所述化学产物是非成瘾性止痛药。
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