CN115896293A - 个体化肿瘤生物免疫治疗的肿瘤突变基因转录肽链的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：个体化肿瘤生物免疫治疗的肿瘤突变基因转录肽链的方法，包括以下步骤：步骤一、获取肿瘤患者原发或转移病灶组织样本；步骤二、以此突变基因位点为基础，翻译其编码的包括突变位点的肽链序列；步骤三、根据患者HLA分型，进行结合能力检测，筛选较强结合能力的10‑20条肽链。与现有技术相比的优点在于：与目前普通生物免疫治疗方法CIK细胞、DC疫苗治疗相比，能使DC细胞负载个体化、肿瘤特异性的抗原，从而诱导高效、特异性T细胞免疫应答成为可能。负载个体化、肿瘤特异性抗原的DC细胞，以***内注射的方式注入体内，***选择肿瘤引流***，刺激体内T淋巴细胞聚集最丰富的T淋巴细胞。

Description

个体化肿瘤生物免疫治疗的肿瘤突变基因转录肽链的方法

技术领域

本发明涉及肿瘤治疗技术领域，具体是指个体化肿瘤生物免疫治疗的肿瘤突变基因转录肽链的方法。

背景技术

目前，全球恶性肿瘤发病率日趋上升，死亡率高，预后差。

手术，化疗，放疗等传统治疗方法治疗效果有限，患者5年生存率仍较低。尤其是放化疗副反应大，患者生活质量差，生存率低。

生物免疫治疗越来越成为***的热点，通过机体免疫***性杀伤肿瘤细胞，是未来***新的治疗方法。目前生物免疫***的方法较多，包括普通的CIK细胞免疫治疗，DC疫苗治疗等，但其治疗效果并不显著，患者生存率没有得到明显提高(参考文献Giraudo L,Gammaitoni L,Cangemi M,et al.Cytokine-induced killer cells asimmunotherapy for solid tumors:current evidences andperspectives.Immunotherapy.2015)。另有以非突变肿瘤高表达蛋白刺激的免疫细胞疫苗，研究有抗肿瘤免疫反应，但由于其非特异性表达，固然有副反应存在，包括视力模糊、听力下降、皮疹等(参考文献Beatriz M.Carreno,Vincent Magrini,Michelle BeckerHapak,et al.A dendritic cell vaccine increases the breadth and diversity ofmelanoma neoantigen-specific T cells.Science.2015May 15；348(6236):803-8.)。

生物免疫治疗本质也就是主要通过机体免疫***来杀伤肿瘤细胞，其中直接发挥作用的是杀伤性T细胞，而树突状细胞(DCs)是抗原提呈细胞(APCs)，主要功能是将抗原信息提呈给T细胞。T细胞不能直接应答未加工的蛋白，相反，它们需要辅助细胞以肽表位的呈递抗原，其中所述肽表位与MHC分子结合而呈现在细胞表面。在细胞之内内源性产生的抗原通常以I类途径呈递，且刺激细胞毒T淋巴细胞(CTL)的反应(主要是CD8+T细胞)，而外源性蛋白质在MHCII类区域内被加工，且诱导辅助T淋巴细胞(主要是CD4+T细胞)的应答。对原初始T细胞的刺激需要存在共刺激分子，其中共刺激分子作为初次免疫激活中的第二信号。APCs(例如B细胞和巨噬细胞)一般不能诱导初次应答。相反，树突状细胞从共刺激分子、粘附分子和MHCI类和MHCII类分子的组成型不可调型表达来挖掘潜能，其中所述共刺激分子、粘附分子和MHCI类和MHCII类分子对发育有效的细胞免疫是必须的。(参考文献Avigan，1999,13:51-64)。

DCs是引发初次免疫应答和耐受性发育所必需的的APC。DCs表达对原初始T细胞群刺激所必需的MHC。DCs的造血发育是明显不同的，并且可遵循几条前体途径，而其中一些途径是与单核细胞紧密相连的(参考文献Avigan，1999,13:51-64)。不同DC亚类具有不同的发育途径。一种DC亚类具有可在诱导对自身抗原的耐受性发挥作用的调节功能(参考文献Austyn,1998,Curr.opin.Hematol.5:3-15)。相反，DCs或其亚类也可参与诱导对自身蛋白质的免疫应答。人们认为，某些自身免疫应答是由于微环境组织损伤导致局部DC激活，然后与T细胞相互作用，从而引发免疫应答(参考文献Ibrahim，1995，Immunol，today.16:181-186)。因此，DCs引发T细胞应答的能力可被用于肿瘤疫苗中(参考文献Hart et al，Sem.Hematol.36:21-25,1999)。体外用一些肿瘤相关高表达蛋白诱导产生DCs，并输回患者体内，用作为肿瘤相对特异的T细胞诱导中的APCs(参考文献Brugger etal.Ann.N.Y.Acad.Sci.1999,872:363-371)。动物模型已经证实，DC肿瘤疫苗使T细胞的无反应性逆转并导致接下来的抗肿瘤效应(参考文献Tarte et al.Leukemia.1999,13:653-663；Colaco et al.Molec.Med.Today.1999,5:14-17；Timmerman etal.Ann.Rev.Med.1999,5:507-529；Hart etal.1999,36:21-25；Hermans etal.N.Z.Med.J.1998,111:111-113)。然而，肿瘤相关高表达蛋白诱导产生的DCs并不具有严格的特异性，肿瘤以外的组织细胞也表达同样的蛋白，因此，其副反应是个难题。

随着科学技术研究的不断发展，我们知道肿瘤是细胞无限制增生的结果，而细胞的生长是由基因决定的。人体内存在肿瘤基因和肿瘤抑制基因两大功能相异的基因群。肿瘤的发生就是由于肿瘤基因功能上调、肿瘤抑制基因功能受抑的结果。各种外界因素如放射线、致癌化学物、病毒等均是通过对基因的改变来诱生肿瘤的，基因的改变包括碱基突变、碱基交联、DNA断裂、DNA缺失等各种DNA损伤。基因治疗是以改变人的遗传物质为基础的生物医学治疗，是将人的正常基因或有治疗作用的基因通过一定方式导入人体靶细胞，直接针对疾病的根源——异常的基因本身而发挥治疗作用，从而达到治疗疾病的目的。基因疗法综合应用分子生物学、分子遗传学、分子病毒学、细胞生物学等学科的最新研究成果。基因疗法就是基因治疗产品进入细胞后再产生目的蛋白质或多肽，从而发挥特异的生物治疗作用。临床实验证明，基因治疗的疗效高于单纯放、化疗疗效约3倍；治疗非小细胞癌，60％的患者肿瘤完全消退或部分消退；对乳腺癌的疗效达到90％。

肺癌是发病率和死亡率增长最快，对人群健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一。近50年来许多国家都报道肺癌的发病率和死亡率均明显增高，男性肺癌发病率和死亡率均占所有恶性肿瘤的第一位，女性发病率占第二位，死亡率占第二位。肺癌的治疗也越来越成为肿瘤学专家研究的和关注的热点，目前对于早期肺癌，仍以手术治疗为主，放化疗为辅的综合治疗方法，然而肺癌患者的5年生存率仍非常低。对于晚期肺癌患者，失去手术治疗机会，以姑息性放化疗为主，其5年生存率还不足10％。因此寻找新的治疗方法，提高肺癌患者生存率，以及生活质量称为挑战。

DC细胞疫苗是另外一种较常见的生物治疗，DC细胞俗称树突状细胞，因成熟时伸出许多树突样或伪足样突起而得名。树突状细胞(DC)是人体内抗原递呈能力最强的细胞，通常情况下人体内的DC细胞数量很少，只有在抗原递呈细胞能正常发挥抗原递呈作用的时候，身体才能有效识别病原，激活获得性免疫***，产生正常的免疫反应。DC细胞疫苗治疗的主要思路是通过采用病人自体的单核细胞在体外培养诱导生成DC，然后负载相应的肿瘤抗原，制成负载肿瘤抗原的DC，再将这些DC细胞注入体内后刺激体内的肿瘤杀伤性淋巴细胞增殖，发挥长期肿瘤监视作用和肿瘤杀伤作用，达到消灭肿瘤的目的。然而，其使用的肿瘤抗原多是一些肿瘤细胞常见高表达蛋白，并不具有特异性，也并非只在肿瘤细胞内及表面表达。因此，这使得DC疫苗治疗疗效的发挥具有一定的局限性。

DC细胞与肿瘤的发生、发展有着密切关系，大部分实体瘤内浸润的DC数量多则患者预后好。有效的抗肿瘤免疫反应的核心是产生以CD8+T细胞为主体的细胞免疫应答，这也是DC作为免疫治疗手段的基础。美国杜克大学遗传和细胞治疗学中心的研究主任埃利-吉尔波瓦说过：“DC是激发机体免疫***激发抵御癌症侵袭最有效的途径之一。”“DC作为高度专职化的主要抗原递呈细胞，在诱导针对相关抗原的高效、特异性T细胞免疫应答中起到关键作用。”因此，使DC细胞负载个体化、肿瘤特异性的抗原是其诱导高效、特异性T细胞免疫应答的关键所在。

现有***的技术缺陷如下：

1.手术、放疗、化疗等传统疗法与部分靶向药对于实体肿瘤的疗效已到达瓶颈，副作用较大，且很容易发生耐药复发。

2.免疫检查点抑制疗法中，以PD-1/PD-L1抗体在疗效和应用范围上最为突出，然而PD-1/PD-L1抗体仅在部分肿瘤突变负荷较高或微卫星不稳定的实体瘤中有较好疗效，另外该疗法也依赖于肿瘤微环境中T细胞的状态和数量，大多数的实体瘤患者对此疗法并不响应，因此该疗法不能令大多数患者获益。

3.免疫细胞疗法中的CAR-T细胞在血液瘤中已取得了很大进展，但CRS、ICANS等毒性问题很严重。CAR-T在实体瘤中尚未取得理想疗效，其主要原因是实体瘤异质性较强，极难获得能够特异杀伤所有肿瘤细胞的同时对正常组织无毒性的CAR-T靶点；此外CAR-T细胞对实体瘤的浸润也不足。

4.免疫细胞疗法中的TCR-T细胞对肿瘤的识别是依靠TCR特异结合肿瘤细胞表面特定HLA分子呈递的单一抗原肽(包括癌睾抗原、组织抗原、新抗原等)，所以每个TCR-T疗法只适用于相应HLA亚型的人群(如临床上进展最快的NY-ESO-1TCR-T和MAGE-A4TCR-T只适用于HLA-A*02:01的患者，在中国人群中占比不足15％)，另外，与CAR-T相似，每个TCR-T疗法也只能识别单一的抗原表位，无法有效杀伤异质性较强的实体瘤。根据以上原因，尚处于临床试验阶段的TCR-T细胞即使能进入实体瘤治疗的临床应用，其应用范围也将十分狭窄。

5.免疫细胞疗法中的CIK细胞，其主要缺点为缺乏肿瘤靶向性，临床疗效不明显。CIK细胞，即细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokine-Induced Killer，CIK)，由于该细胞同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子，故又称为NK细胞(自然杀伤细胞)样T淋巴细胞，该细胞群是在多种细胞因子如IL-2、IFN-γ及某些单克隆抗体(如CD3单抗)的刺激下，由从外周血中分离出来的单个核细胞在体外培养扩增而成。此扩增的CIK细胞具有一定的杀肿瘤细胞的功能，然而并非特异性识别肿瘤细胞，其杀肿瘤细胞的能力有限，应用CIK技术数年来，其临床疗效并非十分显著。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服以上技术困难，提供一种个体化肿瘤生物免疫治疗的肿瘤突变基因转录肽链的方法。

为解决上述技术问题，本发明提供的技术方案为：

个体化肿瘤生物免疫治疗的肿瘤突变基因转录肽链的方法，包括以下步骤：

步骤一、获取肿瘤患者原发或转移病灶组织样本，具体如下：

1)阅读患者CT片，然后根据CT片显示病变的部位，选择相对舒适的***，测量病灶的最大直径，并在相当于病变的体表穿刺点区放置***后，行包括病灶上下层在内的CT扫描，直径>3cm者，层厚5mm，直径<3cm者，层厚2.5mm；确定穿刺点、进针方向、角度及深度，根据病灶位置选定穿刺针的型号和长度；在穿刺点常规消毒，用2％利多卡因行局部麻醉至胸膜，保留针头，再次局部扫描确认进针深度和角度；在患者屏气时快速进针至病灶内的位置，当穿刺针尖达到预定位置后切割取材；一般切割槽内可获得(1.0-2.0)

cmx0.1cm大小的线虫样组织标本，且把针头上残余组织一起用于提取DNA；

2)提取DNA具体步骤为：(a)15ml的离心管加入600μL胞核裂解液，冰上冷却；

(b)冷冻胞核裂解液中加入10-20mg新鲜或者解冻组织，小型匀浆机匀浆10秒，将裂解产物转移到1.5ml微量离心管中，﹙也可选择使用研钵或研杵研磨预先冷冻在液氮中的组织，研磨后，液氮挥发，转移大约10-20mg基本组织到含有600μL胞核裂解液的1.5ml微量离心管中﹚；(c)65℃孵育裂解产物15-30分钟；(d)胞核裂解产物中加入3μL核糖核酸酶溶液颠倒离心管2-5次混合，混合物37℃孵育15-30分钟，下步之前样本冷却至室温5分钟；(e)冷却至室温的样本，加入200μL蛋白沉淀液，高速强力涡旋振荡20秒，冰上冷却样本5分钟；(f)13000-16000xg离心4分钟，沉淀的蛋白可形成一种致密的白色颗粒；(g)小心将含有DNA的上清转移至含有600μL室温异丙醇的1.5ml干净微量离心管，留下蛋白颗粒；(h)轻柔颠倒混合溶液直到白色线状的DNA条带形成一种可见物；(i)

13000-16000xg室温离心1分钟，DNA可形成一种肉眼可见的白色小颗粒，小心倾析出上清；(j)加入600μL室温70％的乙醇，轻柔颠倒离心管数次以洗脱DNA，13000-16000xg室温离心1分钟；(k)用巴斯德吸管或测序移液管头小心抽吸乙醇，此时DNA颗粒非常松散，注意避免把颗粒抽吸到吸管中；(l)将离心管倒转在干净的吸水纸上，风干颗粒10-15分钟；(m)加100μLDNA再水化液65℃孵育1小时再水化DNA，周期性轻拍离心管混合溶液，也可选择，室温或4℃过夜孵育再水化DNA；(n)DNA保存在2-8℃；(o)将提取的DNA进行508个肿瘤发生发展相关基因检测或整体RNAseq或整体DNAseq检测，获取突变基因位点信息；

步骤二、以此突变基因位点为基础，翻译其编码的包括突变位点的肽链序列，具体步骤为：

1)以EGFR基因p.[L747_T751del]、p.[T790M]、p.[C797S]突变为例，从人类基因蛋白知识库中找出该基因翻译的氨基酸序列；

2)找到所对应的突变氨基酸位置，以此为中心，得到肽链序列；

步骤三、根据患者HLA分型，进行结合能力检测，筛选较强结合能力的10-20条肽链，具体方法为：

1)将HLA分型如HLA-A*11:01、HLA-B*51:01、HLA-C*01:03/HLA-C*15:02和HLA-DRB1*09:01/HLA-DQB1*03:03等和上述氨基酸链进行匹配，选择Affinity(nM)数值低于5000的氨基酸链；将获得的所有Affinity(nM)数值低于5000的氨基酸链，按数值高低排序和氨基酸的亲疏水性，挑取前10或20条氨基酸链；

步骤四、上述肽链可用于体内或体外刺激抗原提呈细胞(如树突状细胞)，进而体内或体外刺激杀伤性T细胞，用于个体化肿瘤生物免疫治疗；

具体体内刺激步骤为：

将所得肽链信息进行肽链合成，无菌，纯度>98％；溶解于PH值为7.4PBS，浓度2.5mg/ml，每次上臂皮下注射200ug后覆盖5％Aldaracream，每周一次，12周一周期。

所述选择相对舒适的***如仰卧位、侧卧位或俯卧位。

所述获取突变基因位点信息，包括碱基置换突变、移码突变、缺失突变和***突变等。

所述步骤二中的肽链序列包括长度为8-11个氨基酸的短肽或17-25个氨基酸的长肽，具体为：LTSTVQLIM，ESPKANKEI，IPVAIKESPK，VKIPVAIKESPKANKEI，SLLDYVREHK，MPFGSLLDYV，LMPFGSLLDYV，QLMPFGSLL，IMQLMPFGSLLDYVREH和LLGRNSFELRVCACPGR等。

在留下蛋白颗粒时需注意，一些含有蛋白颗粒的上清可能仍留在原管中，将这些残留液体留在原管中以免沉淀的蛋白污染DNA溶液。

本发明与现有技术相比的优点在于：

1、本发明带来的有益效果直接反映为实体瘤患者的临床获益，宏观上表现为，治疗后经CT检查结果显示肿瘤明显缩小，甚至消失，部分肿瘤密度变淡。这一宏观技术效果，是由本技术特征产生的细胞水平微观技术效果所导致的：通过测序和免疫原性鉴定等从患者肿瘤中发现的新抗原肽，在输注患者后能被其树突状细胞的HLA分子呈递，激活肿瘤新抗原特异T细胞，使其大量扩增、分化并获得更强的抗肿瘤能力，我们在治疗后患者外周血中检测到肿瘤新抗原特异CD8+Tetramer+T细胞比例明显提高，反映了这一微观技术效果；这些肿瘤新抗原特异T细胞能够浸润至肿瘤内，直接精准地识别肿瘤，释放穿孔素和颗粒酶B，或通过死亡受体通路，直接引发肿瘤细胞死亡，此外，还释放IFN-γ等细胞因子，招募其他免疫细胞协同攻击肿瘤，我们在治疗后患者外周血中检测到T细胞分泌特异性IFN-γ水平具有明显升高趋势，反映了这一微观技术效果。与现有技术相比，本技术方案疗效更明显，而且对于肿瘤的杀伤作用更精确，对正常组织无伤害，因此也更安全。

2、本发明主要通过肿瘤发病相关突变基因，寻求以此突变基因为基础的精准生物免疫治疗。也就是寻找每个患者每个肿瘤细胞的基因突变信息，其转录的蛋白具有绝对特异性，通过MHC分子限制检测分析后，诱导个体化肿瘤特异性DCs，使其与T细胞互相作用，产生特异性杀伤肿瘤细胞的效果。

3、本发明与目前普通生物免疫治疗方法CIK细胞、DC疫苗治疗相比，能使DC细胞负载个体化、肿瘤特异性的抗原，从而诱导高效、特异性T细胞免疫应答成为可能。负载个体化、肿瘤特异性抗原的DC细胞，以***内注射的方式注入体内，***选择肿瘤引流***，刺激体内T淋巴细胞聚集最丰富的T淋巴细胞。带有肿瘤特异抗原信息的T细胞，循环至肿瘤区域，进行杀伤肿瘤。其作用特异且较强，杀伤活力更强，远优于传统的LAK细胞和细胞因子γ干扰素、白细胞介素2等；杀瘤谱广，经过MHC限制筛选，与MHC分子结合能力强，具有特异性杀肿瘤的作用，对多重耐药肿瘤细胞敏感，杀瘤活性不受环孢素A(CsA)和FK506等免疫抑制剂的影响，能抵抗肿瘤细胞引发的效应细胞Fas-FasL凋亡；毒副作用小，无严重不良反应。其特征还具有可有清除手术、放疗后残余的癌细胞及微小病灶，预防肿瘤的复发和转移；可与放疗及其他肿瘤微创治疗联合使用，能降低放疗的毒副作用的感染率，提高放化疗的疗效；可用于放、化疗无效的患者，或对化疗药物产生耐药性的患者的治疗；对于失去手术机会或已复发转移的晚期肿瘤患者，能迅速缓解其临床症状，延长生存期；大部分患者出现瘤体减小甚至消失或长期带瘤生存的治疗效果；由于本个体化DC细胞具有免疫调节和体细胞修复作用，在***的同时，大部分患者尤其是放化疗后的患者，可出现消化道症状减轻或消失，皮肤有光泽，黑斑淡化，静脉曲张消失，等表现，及精神状态或体力明显恢复等现象，从而提高肿瘤患者的生存质量，延长生存期。因此，个体化DC细胞技术有望成为新一代的肿瘤过继细胞免疫治疗的首选方案。

附图说明

图1是本发明的工作原理图。

图2是本发明的应用流程图。

图3是本发明的技术路线图。

图4是本发明的疫苗前后ELISA检测特异性IFN-γ分泌情况图。

图5是本发明的疫苗前后肺部肿瘤大小变化情况图。

具体实施方式

在本发明的描述中，需要理解的是，“等”的含义是两个或两个以上。另外，术语“包括”及其任何变形，意图在于覆盖不排他的包含。

下面结合实施方式和说明书附图对本发明做进一步的详细说明。

个体化肿瘤生物免疫治疗的肿瘤突变基因转录肽链的方法，包括以下步骤：

步骤一、获取肿瘤患者原发或转移病灶组织样本，具体如下：

1)阅读患者CT片，然后根据CT片显示病变的部位，选择相对舒适的***如仰卧位、侧卧位或俯卧位，测量病灶的最大直径，并在相当于病变的体表穿刺点区放置***后，行包括病灶上下层在内的CT扫描，直径>3cm者，层厚5mm，直径<3cm者，层厚2.5mm。确定穿刺点、进针方向、角度及深度，根据病灶位置选定穿刺针的型号和长度。在穿刺点常规消毒，用2％利多卡因行局部麻醉至胸膜，保留针头，再次局部扫描确认进针深度和角度。在患者屏气时快速进针至病灶内的位置，当穿刺针尖达到预定位置后切割取材。一般切割槽内可获得(1.0-2.0)cmx0.1cm大小的线虫样组织标本，且把针头上残余组织一起用于提取DNA。

2)提取DNA具体步骤为：(a)15ml的离心管加入600μL胞核裂解液，冰上冷却。

(b)冷冻胞核裂解液中加入10-20mg新鲜或者解冻组织，小型匀浆机匀浆10秒。将裂解产物转移到1.5ml微量离心管中。﹙也可选择，使用研钵或研杵研磨预先冷冻在液氮中的组织。研磨后，液氮挥发，转移大约10-20mg基本组织到含有600μL胞核裂解液的1.5ml微量离心管中。﹚(c)65℃孵育裂解产物15-30分钟。(d)胞核裂解产物中加入3μL核糖核酸酶溶液颠倒离心管2-5次混合。混合物37℃孵育15-30分钟。下步之前样本冷却至室温5分钟。(e)冷却至室温的样本，加入200μL蛋白沉淀液，高速强力涡旋振荡20秒。冰上冷却样本5分钟。(f)13000-16000xg离心4分钟。沉淀的蛋白可形成一种致密的白色颗粒。(g)小心将含有DNA的上清转移至含有600μL室温异丙醇的1.5ml干净微量离心管。

﹙留下蛋白颗粒﹚注意：一些含有蛋白颗粒的上清可能仍留在原管中。将这些残留液体留在原管中以免沉淀的蛋白污染DNA溶液。(h)轻柔颠倒混合溶液直到白色线状的DNA条带形成一种可见物。(i)13000-16000xg室温离心1分钟。DNA可形成一种肉眼可见的白色小颗粒。小心倾析出上清。(j)加入600μL室温70％的乙醇，轻柔颠倒离心管数次以洗脱DNA。13000-16000xg室温离心1分钟。(k)用巴斯德吸管或测序移液管头小心抽吸乙醇。此时DNA颗粒非常松散，注意避免把颗粒抽吸到吸管中。(l)将离心管倒转在干净的吸水纸上，风干颗粒10-15分钟。(m)加100μL DNA再水化液65℃孵育1小时再水化DNA。周期性轻拍离心管混合溶液。也可选择，室温或4℃过夜孵育再水化DNA。(n)DNA保存在2-8℃下。提取的DNA由华大基因公司或其他基因分析公司进行508个肿瘤发生发展相关基因检测或整体RNAseq或整体DNAseq检测，获取突变基因位点信息，包括碱基置换突变、移码突变、缺失突变和***突变等。

步骤二、以此突变基因位点为基础，翻译其编码的包括突变位点的肽链序列(长度为8-11个氨基酸的短肽或17-25个氨基酸的长肽)。具体步骤为：

1)以EGFR基因p.[L747_T751 del]、p.[T790M]、p.[C797S]突变为例，从人类基因蛋白知识库中找出该基因翻译的氨基酸序列；

2)找到所对应的突变氨基酸位置，以此为中心，我们得到肽链序列。

步骤三、根据患者HLA分型，进行结合能力检测，筛选较强结合能力的10-20条肽链。具体方法为：将HLA分型如HLA-A*11:01、HLA-B*51:01、HLA-C*01:03/HLA-C*15:02和HLA-DRB1*09:01/HLA-DQB1*03:03等和上述氨基酸链进行匹配，选择Affinity(nM)数值低于5000的氨基酸链。将获得的所有Affinity(nM)数值低于5000的氨基酸链，按数值高低排序和氨基酸的亲疏水性，挑取前10或20条氨基酸链。例如：

氨基酸序列	Affinity(nM)
		LTSTVQLIM	583.57
ESPKANKEI	3433.04
		IPVAIKESPK	561.27
VKIPVAIKESPKANKEI	2902.6
		SLLDYVREHK	100.49
MPFGSLLDYV	194.14
		LMPFGSLLDYV	1703.29
QLMPFGSLL	N/A
		IMQLMPFGSLLDYVREH	324.1/339.1

步骤四、上述肽链可用于体内或体外刺激抗原提呈细胞(如树突状细胞)，进而体内或体外刺激杀伤性T细胞，用于个体化肿瘤生物免疫治疗。

具体体内刺激步骤为：

将所得肽链信息进行肽链合成，无菌，纯度>98％。溶解于PH值为7.4PBS(Hyclone，美国)，浓度2.5mg/ml，每次上臂皮下注射200ug后覆盖5％ Aldara cream(iNovaPharmaceuticals Australia Pty Ltd.，澳大利亚)，每周一次，12周一周期。

具体体外刺激步骤为：

第0天

1.1使用COBE Spectra血液分析***(CaridianBCT，Inc.美国)进行单核细胞分离采集过滤血量2500-3500ml。

1.2准备2ml无菌样本，分1ml进行细胞计数，并进行活性检测(流式/7-ADD)。

1.3计算分离DC细胞样本的体积：总有核细胞7X109/计算浓度。

1.4把细胞转入300ml的转移袋内，转移至GMP实验室。

1.5准备1L DC-CM培养液，500mlX2份。

1.6用60ml的注射器把样本从转移袋移出，并分装在4个200ml的离心管内。

1.7每管加入100-150mlHBSS,合上盖，并轻轻混匀。

1.8降速离心，15min，800rpm(137Xg)，室温。

1.9用2ml无菌枪头转移上清液，重悬细胞在100-150mlHBSS,封盖，混匀。

2.0降速离心10min，1000rpm(214Xg)，室温。

2.1用2ml无菌枪头转移上清液，重悬细胞于30mlDC-CM培养液中。

2.2将细胞从4个离心管转移至500ml离心管内，并用10mlDC-CM冲洗原离心管，并转入500ml离心管，封盖，混匀。

2.3用3ml注射器转移0.5ml至12X75mm小管内，进行计数。

2.4计算需要的培养瓶数：TNC/1.75X108＝需要的培养瓶数。

2.5计算DC-CM的体积需要量：(加到稀释细胞的体积1.75X107/ml)：培养瓶需要的数量X10mlDC-CM＝需要的DC-CM体积。

2.6用25ml吸管，加15mlDC-CM至每一个培养瓶。

2.7用10ml或25ml吸管，加10ml重悬好的样本(1.75X107/ml)到每一个培养瓶，用盖封紧。

2.8摇匀培养瓶。是液体铺满整个瓶底。

2.9把培养瓶放到培养箱内(37℃,5％ CO2；±10℃，±0.5％ CO2)，2小时30min±，让细胞贴壁。

3.0把IMDM放入培养箱(37℃,5％ CO2；±10℃，±0.5％ CO2)，用35mlIMDM冲洗培养瓶2次。需要的IMDM体积＝培养瓶数量X70mlIMDM

3.1冲洗培养瓶以后，加50ml细胞因子的DC-CM：需要的IMDM＝培养瓶数量X50ml

3.2加入IL-4和GM-CSF的浓度都是1000IU/ml。

3.3稀释IL-4，用1％HAS在PBS里面至1000IU/ml。

3.4每次操作5-10个培养瓶以减少暴露于空气中的时间。

3.5把培养瓶从培养箱中拿出，轻轻摇晃培养瓶。

3.6用2ml吸管吹掉贴壁的细胞，不要碰到瓶壁。

3.7加35ml温IMDM到每一个培养瓶，注意：从瓶壁的无细胞的一侧加。

3.8松一下瓶盖，轻轻瑶培养瓶，使仍贴壁的细胞下来。

3.9轻轻瑶培养瓶，避免细胞贴在壁上。

4.0放平培养瓶。

4.1用2ml吸管，转移IMDM，注意倾斜培养瓶。

4.2用35mlIMDM再冲洗一次。

4.3加50ml含有细胞因子的DC-CM到每一个培养瓶，封盖

4.4轻轻放平培养瓶，是液体盖住瓶底。

4.5把培养瓶放入培养箱(37℃,5％ CO2；±10℃，±0.5％ CO22)。

第6天：加成熟混合液

4.6用1％HSA-PBS稀释IL-1β、TNF-α、IL-6至25ug/ml。

4.7如果培养瓶数量少于50，配制50个培养瓶的细胞因子。

4.8终浓度：IL-1β10ng/ml、INF-α10ng/ml、IL-6 15ng/ml。

4.9稀释细胞因子于44ml DC-CM,至最后体积50ml。

5.0用无菌吸管吸1ml含有细胞因子的DC-CM至每一个培养瓶。

5.1混匀培养瓶内的液体(加入细胞因子后)。

5.2把培养瓶放入培养箱(37℃,5％ CO2；±10℃，±0.5％ CO2)。

第7-8天：准备肽链脉冲培养液(PPM)

5.3计算需要的PPM的量：培养瓶数量X30ml+300ml＝需要的PPM的量

5.4将培养瓶从培养箱取出，将瓶内细胞转移至500ml无菌离心管。(用25ml吸管或直接倒入，3个培养瓶转入一个500ml离心管)。

5.5用吸管吸1ml至12X75mm管进行计数，并进行支原体、衣原体检测。

5.6降速离心1200rpm(309Xg)，7min，室温(多个管的话，同时离心)。

5.7用30ml PPM冲洗培养瓶，并把冲洗液转入500ml离心管。

5.8降速离心冲洗液，1200rpm(309Xg),7min，室温。

5.9用2ml吸管移走冲洗液和收获管的上清液，用10mlPPM重悬细胞。

6.0转移收获管DC细胞到一个新的200ml离心管。

6.1转移冲洗管DC细胞到一个新的200ml离心管。

6.2降速离心，1200rpm(309Xg)，7min，室温

6.3用2ml吸管转移所有的上清，并用25ml PPM重悬细胞，将收获的收获管DC细胞和冲洗管DC细胞合并入同一管，注明：DC细胞管。

6.4封盖，离心并混匀。

6.5取出1管冻存的个体化特异性肽链，用DC-PPM溶解肽链。

6.6加肽链至DC管，浓度为5ug/ml。

6.7松盖后放入培养箱(37℃,5％ CO2；±10℃，±0.5％ CO2)，每30min取出培养箱，混匀，总时间1.5小时。

6.8取0.2ml重悬的DC细胞，转移至12X75mm管中，进行内毒素检测评估。

6.9降速离心，1200rpm(309Xg)，7min，室温。

7.0用2ml吸管去掉上清液。

7.1收获个体化特异性DC细胞，计数并溶解于1mlPBS溶液中。

7.2肿瘤引流***或其他内注射。

试剂和器材

IMDM培养液(规格500ml，Invitrogen#31980)

HBSS溶液(规格100ml，Sigma3H6648-100ml)

IL-4细胞因子(规格50ug，CellGenix#10030-050)

IL-1B细胞因子(规格50ug，CellGenix#1011-050)

TNF-α细胞因子(规格50ug，CellGenix#1006-050)

HAS(规格50ml，Baxter NDC 0944-0490-02)

PBS(规格500ml，Hyclone#SH300280)

0.22μm过滤器(Millipore#SCPU111RE)

2ml吸管(Falcon#357558)

5ml吸管(Falcon#357543)

10ml吸管(Falcon#357551)

25ml吸管(Corning#4251)

50ml吸管(Corning#4051)

50ml离心管(Sarstedt#62.547.004)

200ml离心管(Nunc#376813)

500ml离心管(Corning#07-200-621)

20μL枪头(Rainin#RT-L10F)

200μL枪头(Rainin#RT-L200F)

1000μL枪头(Rainin#RT-L1000F)

1ml注射器(BD#309602)

10ml注射器(BD#309585)

60ml注射器(BD#309653)

无菌12X75mm圆底管(Faclon#352058)

移液器(Fisher#13-711-20)

Bactec瓶(BD#442192和442193)

DC-CM配制

500ml IMDM+10ml过滤过的Human AB血清+1.5ml庆大霉素(10mg/ml)+0.5ml 2-mercaptoethanol(1000X)。

肽链刺激液PPM配制

500ml IMDM+10ml过滤过的Human AB血清+0.5ml 2-mercaptoethanol(1000X)。

下面将以举例的形式介绍本发明所取得的反应效果：

病例：患者XXX,女，61岁，左肺腺癌根治术后，化疗6个周期后，左肺肿物碘125粒子植入术后，口服分子靶向药吉非替尼后进展。左肺内多发转移，右肺转移。行右肺肿瘤穿刺活检，进行508肿瘤相关基因检测，结果如下：

基因	氨基酸突变
		EGFR	L747_T751 del
EGFR	T790M
		EGFR	C797S
TP53	V272L

用本发明获得并筛选的特异性肽链及其对应的HLA如下：

序号	氨基酸序列	HLA
			1	LTSTVQLIM	HLA-C*15:02
2	ESPKANKEI	HLA-C*15:02
			3	IPVAIKESPK	HLA-A*11:01
4	VKIPVAIKESPKANKEI	DRB1*09:01
			5	SLLDYVREHK	HLA-A*11:01
6	MPFGSLLDYV	HLA-B*51:01
			7	LMPFGSLLDYV	HLA-B*51:01
8	QLMPFGSLL	HLA-C*01:03/HLA-C*15:02
			9	IMQLMPFGSLLDYVREH	HLA-DRB1*09:01/HLA-DQB1*03:03
10	LLGRNSFELRVCACPGR	HLA-DRB1*09:01/HLA-DQB1*03:02

用10条特异性肿瘤抗原肽治疗，每周1次，共12周。ELISA检测疫苗前、3周后、7周后、11周后特异性IFN-γ分泌，并同样的时间点影像学观察肿瘤大小变化(见图1和图2)。结果如下：

如图1所示，肽链9和10条肽链样本，与疫苗治疗前相比，疫苗治疗后11周T细胞分泌特异性IFN-γ水平具有明显升高趋势，意味着患者外周血T细胞杀肿瘤能力明显增强。

由图2可见，疫苗治疗前，左肺肿瘤大小1X1cm(图A)，右下肺肿瘤大小约1.5X2cm(图B)；疫苗治疗后3周，左肺肿瘤大小1X1cm(图C)，右下肺肿瘤大小约3X3cm(图D)，此时考虑特异性T细胞进入肿瘤所引起；疫苗治疗后7周，左肺肿瘤大小1X1cm(图E)，右下肺肿瘤大小约1.3X1.9cm(图F)，肿瘤缩小，密度变淡；疫苗治疗后11周，左肺肿瘤大小1X1cm(图G)，右下肺肿瘤大小约1.3X1.9cm(图H)，肿瘤较疫苗前缩小，密度进一步变淡。

以上对本发明及其实施方式进行了描述，这种描述没有限制性。如果本领域的普通技术人员受其启示，在不脱离本发明创造宗旨的情况下，不经创造性的设计出与该技术方案相似实施例，均应属于本发明的保护范围。

Claims (5)

1.个体化肿瘤生物免疫治疗的肿瘤突变基因转录肽链的方法，其特征在于，包括以下步骤：

步骤一、获取肿瘤患者原发或转移病灶组织样本，具体如下：

1)阅读患者CT片，然后根据CT片显示病变的部位，选择相对舒适的***，测量病灶的最大直径，并在相当于病变的体表穿刺点区放置***后，行包括病灶上下层在内的CT扫描，直径>3cm者，层厚5mm，直径<3cm者，层厚2.5mm；确定穿刺点、进针方向、角度及深度，根据病灶位置选定穿刺针的型号和长度；在穿刺点常规消毒，用2％利多卡因行局部麻醉至胸膜，保留针头，再次局部扫描确认进针深度和角度；在患者屏气时快速进针至病灶内的位置，当穿刺针尖达到预定位置后切割取材；一般切割槽内可获得(1.0-2.0)

cmx0.1cm大小的线虫样组织标本，且把针头上残余组织一起用于提取DNA；

2)提取DNA具体步骤为：(a)15ml的离心管加入600μL胞核裂解液，冰上冷却；

(b)冷冻胞核裂解液中加入10-20mg新鲜或者解冻组织，小型匀浆机匀浆10秒，将裂解产物转移到1.5ml微量离心管中，﹙也可选择使用研钵或研杵研磨预先冷冻在液氮中的组织，研磨后，液氮挥发，转移大约10-20mg基本组织到含有600μL胞核裂解液的1.5ml微量离心管中﹚；(c)65℃孵育裂解产物15-30分钟；(d)胞核裂解产物中加入3μL核糖核酸酶溶液颠倒离心管2-5次混合，混合物37℃孵育15-30分钟，下步之前样本冷却至室温5分钟；(e)冷却至室温的样本，加入200μL蛋白沉淀液，高速强力涡旋振荡20秒，冰上冷却样本5分钟；(f)13000-16000xg离心4分钟，沉淀的蛋白可形成一种致密的白色颗粒；(g)小心将含有DNA的上清转移至含有600μL室温异丙醇的1.5ml干净微量离心管，留下蛋白颗粒；(h)轻柔颠倒混合溶液直到白色线状的DNA条带形成一种可见物；(i)13000-16000xg室温离心1分钟，DNA可形成一种肉眼可见的白色小颗粒，小心倾析出上清；(j)加入600μL室温70％的乙醇，轻柔颠倒离心管数次以洗脱DNA，13000-16000xg室温离心1分钟；(k)用巴斯德吸管或测序移液管头小心抽吸乙醇，此时DNA颗粒非常松散，注意避免把颗粒抽吸到吸管中；(l)将离心管倒转在干净的吸水纸上，风干颗粒10-15分钟；(m)加100μLDNA再水化液65℃孵育1小时再水化DNA，周期性轻拍离心管混合溶液，也可选择，室温或4℃过夜孵育再水化DNA；(n)DNA保存在2-8℃；(o)将提取的DNA进行508个肿瘤发生发展相关基因检测或整体RNAseq或整体DNAseq检测，获取突变基因位点信息；

步骤二、以此突变基因位点为基础，翻译其编码的包括突变位点的肽链序列，具体步骤为：

1)以EGFR基因p.[L747_T751del]、p.[T790M]、p.[C797S]突变为例，从人类基因蛋白知识库中找出该基因翻译的氨基酸序列；

2)找到所对应的突变氨基酸位置，以此为中心，得到肽链序列；

步骤三、根据患者HLA分型，进行结合能力检测，筛选较强结合能力的10-20条肽链，具体方法为：

1)将HLA分型如HLA-A*11:01、HLA-B*51:01、HLA-C*01:03/HLA-C*15:02和HLA-DRB1*09:01/HLA-DQB1*03:03等和上述氨基酸链进行匹配，选择Affinity(nM)数值低于5000的氨基酸链；将获得的所有Affinity(nM)数值低于5000的氨基酸链，按数值高低排序和氨基酸的亲疏水性，挑取前10或20条氨基酸链；

步骤四、上述肽链可用于体内或体外刺激抗原提呈细胞(如树突状细胞)，进而体内或体外刺激杀伤性T细胞，用于个体化肿瘤生物免疫治疗；

具体体内刺激步骤为：

将所得肽链信息进行肽链合成，无菌，纯度>98％；溶解于PH值为7.4PBS，浓度2.5mg/ml，每次上臂皮下注射200ug后覆盖5％Aldaracream，每周一次，12周一周期。

2.根据权利要求1所述的个体化肿瘤生物免疫治疗的肿瘤突变基因转录肽链的方法，其特征在于：所述选择相对舒适的***如仰卧位、侧卧位或俯卧位。

3.根据权利要求1所述的个体化肿瘤生物免疫治疗的肿瘤突变基因转录肽链的方法，其特征在于：所述获取突变基因位点信息，包括碱基置换突变、移码突变、缺失突变和***突变等。

4.根据权利要求1所述的个体化肿瘤生物免疫治疗的肿瘤突变基因转录肽链的方法，其特征在于：所述步骤二中的肽链序列包括长度为8-11个氨基酸的短肽或17-25个氨基酸的长肽，具体为：LTSTVQLIM，ESPKANKEI，IPVAIKESPK，VKIPVAIKESPKANKEI，SLLDYVREHK，MPFGSLLDYV，LMPFGSLLDYV，QLMPFGSLL，IMQLMPFGSLLDYVREH和LLGRNSFELRVCACPGR等。

5.根据权利要求1所述的个体化肿瘤生物免疫治疗的肿瘤突变基因转录肽链的方法，其特征在于：在留下蛋白颗粒时需注意，一些含有蛋白颗粒的上清可能仍留在原管中，将这些残留液体留在原管中以免沉淀的蛋白污染DNA溶液。

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