CN115896015B - 一种髓系来源抑制性细胞的体外培养方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种小鼠原代髓系来源抑制性细胞(MDSC)的体外培养方法。其包括步骤：S11、取荷瘤小鼠脾脏，经物理研磨和过滤后获得脾脏细胞悬液；S12、将脾脏细胞悬液混合生物素偶联的红细胞表面抗原抗体，经孵育后磁选分离去除红细胞；S13、将去除红细胞的所述脾脏细胞与生物素偶联的T细胞表面抗原抗体混合，经孵育后磁选分离去除T细胞；S20、将SET加入含有GM‑CSF的培养基中培养。本发明描述了一种新型的原代MDSC的体外培养方法，保留了对MDSC生存有益的脾脏基底细胞，去除了对MDSC生存有害的T细胞，提供了支持MDSC生存的合适浓度的GM‑CSF，规避体内外研究差异的同时提高体外培养细胞的存活率。

Description

一种髓系来源抑制性细胞的体外培养方法

技术领域

本发明属于免疫细胞体外培养技术领域，尤其涉及一种髓系来源抑制性细胞(MDSC)的体外培养方法。

背景技术

20世纪70年代早期，零星发表了一些关于与肿瘤进展相关的免疫抑制性髓系细胞积累的报道。20世纪90年代末，Gr-1⁺CD11b⁺被认为是小鼠脾脏中免疫抑制性髓系细胞的特异性表面marker，这些细胞被证明与单核细胞和中性粒细胞在表型上相似，代表单核细胞和相对不成熟的中性粒细胞激活的病理状态。这些细胞大量积聚在脾脏和具有强免疫抑制活性的肿瘤中，在大多数小鼠肿瘤模型中能够重现。2007年，人们正式提出了骨髓源性抑制细胞的概念。髓系来源的抑制性细胞(Myeloid-Derived Suppressor Cell，MDSC)是在某些病理情况下产生的具有强大而广谱的免疫抑制功能细胞，是免疫***重要的负调控手段之一。

MDSC具有一套独特的表达谱和生化特征，可以通过特定的表面分子来区分。目前研究认为MDSC在小鼠中表型为CD11b⁺Gr-1⁺，根据其表面Ly6G和Ly6C的不同可进一步分为单核细胞来源的MDSC (Monocytic-MDSC，M-MDSC，CD11b⁺Ly6G^–Ly6C^high )和粒细胞来源的MDSC(Granulocytic-MDSC，G-MDSC，CD11b⁺Ly6G⁺Ly6C^low)两个亚群。M-MDSC主要通过升高精氨酸酶活性，以抗原非特异性的方式抑制T细胞功能；而G-MDSC则利用活性氧自由基ROS作为免疫介质，以抗原特异性的方式抑制T细胞反应。

MDSC参与了多种疾病的发生和发展。有证据表明MDSC与肿瘤病程的快速发展相关，在促肿瘤血管生成、耐药、转移等方面发挥突出作用。除了癌症，MDSC还涉及慢性炎症、感染、自身免疫性疾病、创伤、移植物抗宿主病等疾病。

尽管目前在MDSC相关领域的研究取得了重大的突破，但是由于MDSC细胞数量少、体外增殖困难，原代细胞培养的方法尚未有详尽描述。因此，在保持已分化的MDSC存活率前提下，开发一种简单快速体外培养技术，将具有重大的科学意义和开发价值。

专利文献CN108148801A中公开了多不饱和脂肪酸体外扩增髓系来源的抑制性细胞的方法，并具体公开了通过体外分化获得MDSC的方法，即通过采集小鼠股骨和胫骨中的骨髓细胞，再经过多不饱和脂肪酸(亚麻酸或亚油酸)与粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)联合处理6天，获得鼠髓系来源的抑制性细胞。

此发明中，亚麻酸ALA和亚油酸LA组相较于对照组能抑制未成熟CD11c⁺DCs 和CD11c⁺MHCII⁺DCs的分化，可提高MDSC在小鼠骨髓细胞所占的百分比(参见附图1)。

此发明利用多不饱和脂肪酸在体外在一定程度上引起G-MDSC扩增，但它有一定的局限性：

1.此发明是利用健康鼠的骨髓干细胞经过长达6天体外分化，此类MDSC可能和体内病理条件下的原代MDSC形态和功能上有一定的差距；

2.此发明主要是引起G-MDSC扩增，可能会引起MDSC两类亚群比例和体内的不一致，进而不能更准确的反映体内MDSC的生理状态；

3.此发明利用多不饱和脂肪酸在体外刺激MDSC的聚集，而在体内某些病理条件下，MDSC的分化、扩增及活化受多因素影响，机制复杂，两者可能存在着一定的不同；

4.此发明培养6天后，MDSC比例偏低，仅占所有细胞的约30%。

发明内容

本发明描述了一种新型的原代MDSC的体外培养方法，保留了对MDSC生存有益的脾脏基底细胞，去除了对MDSC生存有害的T细胞，提供了支持MDSC生存的合适浓度的GM-CSF，规避体内外研究差异的同时提高体外培养细胞的存活率。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案如下：

一种髓系来源抑制性细胞的体外培养方法，包括步骤：

S10、制取去除红细胞和T细胞的荷瘤小鼠脾脏细胞SET；

S20、将SET加入含有GM-CSF的培养基中培养。

一些技术方案中，步骤S10具体为：

S11、取荷瘤小鼠脾脏，经物理研磨和过滤后获得脾脏细胞悬液；

S12、将脾脏细胞悬液混合生物素偶联的红细胞表面抗原抗体，经孵育后磁选分离去除红细胞；

S13、将去除红细胞的所述脾脏细胞与生物素偶联的T细胞表面抗原抗体混合，经孵育后磁选分离去除T细胞。

一些技术方案中，步骤S13中采用mouse CD3ε分选试剂盒对步骤S12中得到的脾脏细胞进行去除T细胞的处理。

一些技术方案中，步骤S20中：

所述培养基主要由RPMI1640、FBS (Fetal Bovine Serum)、PS (Penicillin-Streptomycin)及GM-CSF(Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor)组成。

一些技术方案中，所述GM-CSF的浓度为2.5 ng/ml ~ 10 ng/ml。

一些技术方案中，利用流式细胞术检测体外培养的髓系来源抑制性细胞的存活率。

本发明采用以上技术方案至少具有如下的有益效果：

1．本专利选用荷瘤小鼠脾脏内的MDSC，是在体内环境中完成分化产生的原代细胞。相较于由小鼠骨髓细胞经体外诱导分化的MDSC，本发明所选用的MDSC有以下优点：1）能够更全面的反映体内肿瘤条件下MDSC的功能，克服了体外单因素刺激分化的偏向性；2）减少体外、体内研究的差距，体外研究其功能、炎症和自身免疫性等疾病的关系时，结果更加准确、真实；3）可随时取用，对时长较长或间隔取样的试验，可保证样品的一致性；

2．本专利针对细胞分选过程、体外培养条件、培养方式等环节逐个优化，由原代MDSC体外培养存活率低于10%提高到了约80%。具体的，首先选择荷瘤小鼠体内的脾脏MDSC，无需体外诱导分化；其次，在SET的培养体系中保留了对MDSC生存有益的脾脏基底细胞，去除了对MDSC生存有害的T细胞；最后，在体外培养时选用合适浓度的GM-CSF刺激因子，所获得的培养体系规避了体内外研究差异的同时提高体外培养细胞的存活率。

附图说明

为了更清楚的说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图及其标记作简单的介绍，显而易见地，下面描述的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域的普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

图1为专利文献CN108148801A中多不饱和脂肪酸体外扩增髓系来源的抑制性细胞实验结果；

图2为本申请中描述的一种髓系来源抑制性细胞的体外培养方法流程图；

图3为本申请中描述的不同GM-CSF的浓度影响MDSC体外培养存活率的实验结果；

图4为本申请中描述的流式细胞术检测接种时SE，SET和MDSC中各组分比例的示意图；

图5为本申请中描述的SE，SET和MDSC体外培养3天后MDSC存活率的实验对照结果。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。实施例中所用到的各种常用试剂，均为市售产品。

本申请涉及的缩略语和关键术语定义为：

MDSC：Myeloid-Derived Suppressor Cells，骨髓源性抑制细胞；

GM-CSF：Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子；

SET：Spleen cells with Erythrocytes and T cells removed，去除红细胞和T细胞的脾脏细胞；

SE：Spleen cells with Erythrocytes removed，去除红细胞的脾脏细胞；

M-MDSC：Monocytic-MDSC，单核细胞来源的MDSC；

G-MDSC：Granulocytic-MDSC，粒细胞来源的MDSC；

PBS：Dulbecco's Phosphate Buffered Saline，磷酸缓冲盐溶液；

FBS：Fetal Bovine Serum，胎牛血清；

PS：Penicillin-Streptomycin，青霉素链霉素双抗。

在本申请一实施例中，提供一种髓系来源抑制性细胞的体外培养方法，具体由原代髓样抑制细胞模拟体内生存环境在体外进行培养。

参见图2，MDSC的体外培养包括以下步骤：

S11、取荷瘤小鼠脾脏，利用物理研磨和过滤的方法获得脾脏细胞悬液。

S12、将脾脏细胞悬液混合生物素偶联的红细胞表面抗原抗体，经孵育后磁选分离去除红细胞。

S13、将去除红细胞的所述脾脏细胞与生物素偶联的T细胞表面抗原抗体混合，经孵育后磁选分离去除T细胞。

步骤S13中采用mouse CD3ε分选试剂盒对步骤S12中得到的脾脏细胞进行去除T细胞的处理，而后获得去除红细胞和T细胞的荷瘤小鼠脾脏细胞SET。

S20、将 SET 加入含有GM-CSF的培养基中培养，其中，GM-CSF的浓度为2.5 ng/ml~ 10 ng/ml。

荷瘤小鼠脾脏中含有一定数量的MDSC，如果分离纯粹的MDSC进行体外培养，则存活率偏低，结果参见图3，示出在培养三天后，MDSC的体外存活率低于10%。同时，培养基中GM-CSF的浓度高于10 ng/ml时，其生存率显著降低，而在5 ng/ml GM-CSF的条件下，体外培养的MDSC存活率最高。因此除非特定指出，本案后续的体外培养条件选取中，GM-CSF为5ng/ml 。

由于纯粹的原代MDSC生存率不佳，本申请在MDSC中尝试了保留脾脏细胞中的其它组分。参见图4，示出了去除红细胞的脾脏细胞(SE)、去除了红细胞和T细胞的脾脏细胞(SET)和MDSC在接种时的各组分的比例。培养3天后再次使用流式细胞术分析MDSC的存活率，见表1。图4中Gr-1 (Gr-1_APC-Cy7-H)为MDSC的表面标记物，CD3ε (CD3-PE-H)为T细胞标记物。在接种时MDSC含有96.74%的Gr-1阳性细胞，但是在培养3天后其存活率只有13~17%；在接种时SE含有60.65%的Gr-1阳性细胞，在培养3天后其存活率只有24~32%；在接种时SET含有65.46%的Gr-1阳性细胞，在培养3天后其存活率达到了77~91%。MDSC的存活率结果也显示于图5，MDSC的存活率=培养后存活的MDSC数量/接种时的MDSC数量，0.1 M和0.2 M指接种时的总细胞数量为0.1×10⁶和0.2×10⁶每孔。由此可见，在MDSC培养基中保留Gr-1和CD3ε双阴性的基底细胞对MDSC的生存有益，而CD3ε阳性的T细胞对MDSC的生存有害；与其它条件相比，SET体系显著提高了MDSC的体外培养存活率。

表1为本申请中描述的SE，SET和MDSC在接种时和培养3天后的活细胞和MDSC的数量。

本申请综合对细胞分选过程、体外培养条件及方式等环节进行优化，使原本MDSC体外培养存活率10%提高到了80%。具体为：1）避免选用体外分化的MDSC，而是选用原代MDSC，减少由体外分化带来的细胞形态和功能改变，能够真实反映病理条件下体内MDSC的功能；2）保留了对MDSC生存有益的脾脏基底细胞，去除了对MDSC生存有害的T细胞；3）提供了支持MDSC生存的合适浓度的GM-CSF，解决了原代细胞体外培养生存率低的问题，提高了后续试验的稳定性。

为了充分展示本申请技术方案及明晰本发明技术效果，借助以下一具体示例进行阐述。

一、体外培养荷瘤小鼠来源的髓系抑制细胞试验方案

步骤一、脾脏细胞悬液的获取：取一只 4T1 小鼠脾脏至PBS暂时保存。取70 um细胞滤器(Titan，2037011)于50 ml离心管(Titan，02046665)内，1ml PBS 润湿细胞滤器，将脾脏置于细胞滤器上，使用2 ml注射器(Titan，02026617-TS069-008)的柱塞轻柔缓慢研磨脾脏，PBS冲洗至50 ml离心管内。

步骤二、脾脏细胞中去除红细胞：将上述细胞悬液于4℃，离心5 min。弃上清，每10⁸个细胞中加入400 ul MACS buffer (PBS + 2% FBS + 2 mM EDTA) 重悬，加入2ul生物素偶联的红细胞表面抗原单克隆抗体TER119 (Biotin anti-mouse TER-119，Biolegend，116204)，轻柔混合均匀，4℃孵育5 min。抗体孵育完毕后，每10⁸个细胞中加5-10 ml MACS buffer，于4℃，/>离心5 min，弃上清。每10⁸个细胞重悬于300 ul MACSbuffer中，加100 ul Anti-Biotin MicroBeads (Miltenyi，130-090-485)，轻柔混合均匀，4℃孵育10 min。孵育期间，将LS Columns (Miltenyi，130-042-401)安装于磁力架(QuadroMACS^TMSeparator，Miltenyi，130-090-976)上，加入5 ml MACS buffer平衡分离柱。孵育结束后，全部细胞悬液转移至分离柱内，收集流出液。分离柱内所有液体流尽后，用5ml MACS buffer再次冲洗分离柱，继续收集流出液。所收集到的流出液中的细胞即为去除红细胞的脾脏细胞。

步骤三、去除CD3ε T细胞：采用mouse CD3ε分选试剂盒 (Miltenyi，130-094-973)对步骤二中得到的细胞进行去除T细胞的处理。具体来说，将步骤二中得到的细胞于4℃，离心5 min，弃上清。向每10⁷个细胞中加100 ul MACS buffer重悬，加入10 ul生物素标记的抗CD3ε抗体，轻柔混合均匀，4℃孵育10 min。每10⁷个细胞中加1-2 ml MACSbuffer进行稀释，再于4℃，/>离心5 min，弃上清。每10⁷个细胞中加80 ul MACSbuffer重悬，加20 ul Anti-Biotin MicroBeads，轻柔混合均匀，4℃孵育15 min。孵育完成后，每10⁷个细胞中加1-2 ml MACS buffer，于4℃，/>离心5 min，弃上清。离心期间，安装LS Columns于磁力架上，5 ml MACS buffer平衡分离柱。离心结束后，每/>个细胞中加100 ul MACS buffer重悬，再转移至分离柱内，收集流出液。分离柱内所有液体流尽后，用5 ml MACS buffer再次冲洗分离柱，收集流出液。所收集到的所有流出液中的细胞的即为去除红细胞和T细胞的脾脏细胞(SET)。

步骤四、细胞培养：上述细胞于4℃，，离心5 min，弃上清。按照每毫升10⁶个细胞的密度用RPMI1640 (Gibco，11875119) + 10% FBS(Fetal Bovine Serum，BiologicalIndustries，1822477) + 1% PS (Penicillin-Streptomycin, Gibco， 15140-122) + 5ng/ml GM-CSF重悬细胞。每孔取100 ul细胞悬液铺至96孔平底细胞培养板(Corning)，培养基补至200 ul。该板培养于37℃、5％二氧化碳培养箱。

二、流式细胞术检测体外培养的髓系来源抑制细胞存活率

步骤五、MDSC体外存活率检测：试验方案一中培养2-3天的细胞取出检测存活率，移液器反复吹打96孔培养板中的细胞至完全重悬，转移至96孔V底板，室温，，离心5 min去上清，每孔加入100 ul Stain Buffer (PBS + 2% FBS) + 1ul TruStain FcX™(Biolegend，101320)，室温孵育10 min。室温，/>，离心5 min去上清，每孔加入100ul Stain Buffer + 0.1ul LIVE/DEAD Fixable Violet Dead Cell Stain (Invitrogen，2116142) + 1 ul APC/Cyanine7 anti-mouse Ly6G/Ly6C(Gr-1)(Biolegend，108424)，4℃孵育30 min，于室温，/>，离心5 min去上清，100 ul Stain Buffer重悬细胞，流式检测仪检测。分析结果见图5，表明采用磁珠分选原代SET后，培养三天，MDSC仍保持较高的存活率。

需要指出的是，尽管上述培养方法中将各个步骤按照特定的先后顺序进行了描述，但是本领域技术人员可以理解，为了实现本发明的效果，不同的步骤之间并非必须按照这样的顺序执行，其可以同时(并行)执行或以其他顺序执行，这些变化都在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种髓系来源抑制性细胞的体外培养方法，其特征在于，包括步骤：

S10、制取去除红细胞和T细胞的荷瘤小鼠脾脏细胞SET；

S20、将SET加入含有GM-CSF的培养基中培养。

2.根据权利要求1所述的一种髓系来源抑制性细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤S10具体为：

S11、取荷瘤小鼠脾脏，经物理研磨和过滤后获得脾脏细胞悬液；

S12、将脾脏细胞悬液混合生物素偶联的红细胞表面抗原抗体，经孵育后磁选分离去除红细胞；

S13、将去除红细胞的所述脾脏细胞与生物素偶联的T细胞表面抗原抗体混合，经孵育后磁选分离去除T细胞。

3.根据权利要求2所述的一种髓系来源抑制性细胞的体外培养方法，其特征在于，

步骤S13中采用mouse CD3ε分选试剂盒对步骤S12中得到的脾脏细胞进行去除T细胞的处理。

4.根据权利要求1所述的一种髓系来源抑制性细胞的体外培养方法，其特征在于，步骤S20中：

所述培养基主要由RPMI1640、FBS (Fetal Bovine Serum)、PS (Penicillin-Streptomycin)及GM-CSF (Granulocyte-macrophage Colony Stimulating Factor)组成。

5.根据权利要求4所述的一种髓系来源抑制性细胞的体外培养方法，其特征在于，

所述GM-CSF的浓度为2.5 ng/ml ~ 10 ng/ml。

6.根据权利要求1-5任一所述的一种髓系来源抑制性细胞的体外培养方法，其特征在于，

利用流式细胞术检测髓系来源抑制性细胞的存活率。