CN115895982B - 一株耐砷发酵产氢气细菌、筛选及应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于环境微生物筛选技术领域，公开一株耐砷发酵产氢气细菌、筛选及应用。取采集的高砷沉积物样本在厌氧手套箱中加入含As⁵⁺厌氧发酵培养基中，置于35℃摇床振荡暗培养，富集传代后将振荡培养得到的菌液，使用无菌无氧胰蛋白胨溶液稀释，取稀释菌液涂布到梭菌增殖培养基上，置于厌氧生化培养箱避光培养；将生长出的菌落，进行单菌落挑取，接种到液体发酵培养基中，置于摇床振荡培养，重复涂布、挑菌液培过程三次得到耐砷纯菌株。该菌株能在含有200mg/L的As³⁺液体培养基中存活，具有较好的耐砷性，革兰氏染色实验阳性，经16s·rDNA序列鉴定得出该耐砷菌株为典型发酵菌丁酸梭菌，为微生物修复砷污染环境提供菌种资源。

Description

一株耐砷发酵产氢气细菌、筛选及应用

技术领域

本发明属于环境微生物筛选技术领域，具体涉及一株耐砷发酵细菌的筛选及在修复砷污染环境下的发酵应用。

背景技术

冶金和采矿等工业活动不断向自然环境中排放重金属砷，而砷因其高毒性和生物累积性使得砷污染防治修复问题日渐紧迫。自然环境中的砷及其化合物经过迁移转化最终富集到土壤、沉积物等厌氧环境中，而厌氧条件下厌氧发酵是最为重要的过程，为后续的硫酸盐还原、硫酸盐还原菌生物成矿过程提供氢气、电子供体、碳源等能源。

综上所述，耐砷发酵产氢气细菌的发现，在现有的微生物治理砷污染环境方面有重要意义。

发明内容

本发明的目的为筛选出一株具有耐砷特性的发酵细菌，为砷污染环境修复提供应用。

为实现上述应用目的，本发明的技术方案：

一株耐砷发酵细菌(Clostridium butyricum)，该耐砷发酵细菌已于2023年1月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.26434。

上述的耐砷发酵细菌的应用，所述耐砷发酵细菌具有200mg/L的As³⁺耐性，用于砷污染环境微生物修复。

上述的耐砷发酵细菌的筛选方法，包括以下步骤：

第一步，取采集的高砷沉积物样品加入到五价砷发酵培养基中，并置于35℃摇床振荡避光培养；

第二步，将振荡培养后的耐砷发酵细菌液传代至五价砷发酵培养基中，置于35℃摇床振荡避光培养20h，重复该步骤三次，得到五价砷发酵培养基富集菌液；

第三步，将富集得到的菌液用质量体积比为0.1％的无氧无菌胰蛋白胨溶液稀释，涂布到半固体梭菌增殖培养基上，置于35℃厌氧生物培养箱中恒温避光培养；

第四步，挑取单菌落至液体发酵培养基中，置于35℃摇床振荡避光培养；

第五步，将第四步得到的菌液用质量体积比为0.1％无氧无菌胰蛋白胨溶液稀释，涂布到梭菌增殖半固体培养基上，置于35℃厌氧生物培养箱中恒温避光培养；

第六步，重复第四步、第五步三次，获得纯菌株。

进一步，第三步中，取菌液用无菌无氧质量体积比为0.1％无氧无菌胰蛋白胨溶液稀释10²-10⁸倍，取10⁵、10⁶、10⁷、10⁸菌液涂布于平板直径9cm的梭菌增殖半固体培养上，涂布菌液体积为100μL，置于35℃厌氧生物培养箱中培养，培养时间24-48h。

进一步，第四步中，挑取出的单菌落在厌氧箱中接种于盛装液体发酵培养基的西林瓶中，将接种后的密闭西林瓶置于35℃恒温振荡摇床，转速100r/min，培养时间24h。

进一步，第一步中，取0.14g高砷沉积物样品于无菌厌氧手套箱中，加入盛装无菌厌氧液体发酵培养基的西林瓶中，置于35℃摇床100r/min振荡避光培养。

进一步，第一步和第二步中，五价砷发酵培养基中的组分：葡萄糖10.0g、胰蛋白胨1.0g、酵母膏2.0g、氯化钠4.0g、氯化镁0.1g、L-半胱氨酸0.5g、磷酸氢二钾1.5g、碳酸氢钠10.0g、刃天青0.5mg、砷酸钠166.5mg、超纯水1L、pH 6.80-7.20。

进一步，第三步中，梭菌增殖半固体培养基中的组分：牛肉粉10.0g、胰蛋白胨10.0g、酵母粉3.0g、可溶淀粉1.0g、氯化钠5.0g、醋酸钠3.0g、L-半胱氨酸0.5g、刃天青1.0mg、葡萄糖5.0g、琼脂8.0g、超纯水1L、pH 6.60-7.00。

进一步，第四步中，液体发酵培养基中的组分：葡萄糖10.0g、胰蛋白胨1.0g、酵母膏2.0g、氯化钠4.0g、氯化镁0.1g、L-半胱氨酸0.5g、磷酸氢二钾1.5g、碳酸氢钠10.0g、刃天青0.5mg、超纯水1L、pH 6.80-7.20。

本发明的目的在于提供一种新的治理砷污染环境微生物修复方法，所述治理环境砷污染的方法使用所述耐砷细菌的筛选方法。

本发明的有益效果：本发明的优点为筛选方法成本低廉，为微生物修复砷污染环境提供耐砷发酵菌种资源。

附图说明

图1是本发明提供的耐砷发酵细菌的筛选方法与流程。

图2是本发明实施的耐砷发酵细菌三价砷胁迫下生长曲线。

图3是本发明实施的耐砷发酵细菌无机三价砷抑制浓度拟合情况。

图4是本发明实施的耐砷发酵细菌产丁酸情况。

图5是本发明实施的耐砷发酵细菌产乳酸情况。

图6是本发明实施的70mL体系下耐砷发酵细菌产氢气量。

具体实施方式

为使本发明的目的、实验方案更为清晰，对本发明进行进一步说明，针对现有微生物修复砷污染环境菌种资源不足问题，本发明提供了一种耐砷发酵细菌的筛选及应用。

本发明提供了一株耐砷发酵细菌，具体为耐砷发酵丁酸梭菌(Clostridiumbutyricum)在修复砷污染环境中的应用，所述丁酸梭菌(Clostridium butyricum)的保藏编号为CGMCC NO.26434。

本发明所述耐砷发酵丁酸梭菌其16s·rDNA优选序列如下所示：

GTTTGATCCTGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAGCGATG

AAGCTCCTTCGGGAGTGGATTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTCATAGAGGGGAATAGCCTTTCGAAAGGAAGATTAATACCGCATAAGATAGTAGTATCGCATGGTACAGCAATTAAAGGAGTAATCCGCTATGAGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGGGAAACCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGTGATGACGGCCTTCGGATTGTAAAACTCTGTCTTTAGGGACGATAATGACGGTACCCTAAGGAGGAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGATTTACTGGGCGTAAAGGGAGCGTAGGTGGATATTTAAGTGGGATGTGAAATACTCGGGCTTAACCTGGGTGCTGCATTCCAAACTGGATATCTAGAGTGCAGGAGAGGAAAGGAGAATTCCTAGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATTAGGAAGAATACCAGTGGCGAAGGCGCCTTTCTGGACTGTAACTGACACTGAGGCTCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAATACTAGGTGTAGGGGTTGTCATGACCTCTGTGCCGCCGCTAACGCATTAAGTATTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGATTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCAGCGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCTAGACTTGACATCTCCTGAATTACTCTGTAATGGAGGAAGCCACTTCGGTGGCAGGAAGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATTGTTAGTTGCTACCATTTAGTTGAGCACTCTAGCGAGACTGCCCGGGTTAACCGGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGTCTAGGGCTACACACGTGCTACAATGGTCGGTACAATGAGATGCAACCTCGCGAGAGTGAGCAAAACTATAAAACCGATCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGAAACTCGCCTACATGAAGCTGGAGTTGCTAGTAATCGCGAATCAGAATGTCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTGGCAATACCCAAAGTTCGTGAGCTAACCGGTAAGAG

实施例1

本发明所述耐砷丁酸梭菌分离筛选自葫芦岛市锦州湾地区，葫芦岛市锌厂排污口下游的高砷污染河口沉积物，对于所述筛选方法除非特殊说明，均为本领域技术人员公知方法。

如图1所示，本发明提供的耐砷发酵丁酸梭菌筛选方法包括以下步骤:

菌群活化：取0.2％质量体积比沉积物样品接种至五价砷浓度为60mg/L的无菌无氧发酵培养基，35℃摇床振荡暗培养；

富集培养：取活化好的菌液，依照1％体积比例加入到五价砷浓度为60mg/L的无菌无氧发酵培养基，35℃摇床振荡暗培养，重复3次；

梯度稀释平板涂布：取富集后菌液，用0.1％质量体积比无氧无菌胰蛋白胨溶液稀释10²-10⁸，取10⁵-10⁸涂布到RCM半固体培养基上，置于35℃厌氧生物培养箱中恒温避光培养；

菌株挑取、活化：挑取平板上单菌落至液体发酵培养基，35℃摇床振荡暗培养；

重复平板涂布、菌种挑取活化三次，得到纯菌株；

总DNA提取；

16s·rDNA序列鉴定。

实施例2

结合实施例对本发明提供的耐砷发酵丁酸梭菌在修复砷污染环境中的应用进行详细的说明。

三价砷梯度胁迫实验：将筛选所得的耐砷发酵丁酸梭菌使用液体发酵培养基活化10h后，1％体积比接种至含0、10、50、80mg/L的新鲜液体发酵培养基中，通过测定吸光度值OD₆₀₀得出生长曲线(见图2)，可以看出80mg/L的三价砷浓度对耐砷发酵丁酸梭菌的吸光度值影响不明显。

实施例3

耐砷发酵丁酸梭菌三价砷抑制浓度实验：将筛选所得的耐砷发酵丁酸梭菌使用发酵培养基活化10h后，1％体积比接种至含0、100、150、200mg/L无机三价砷(As³⁺)的新鲜液体发酵培养基中，通过生长峰值干重测量实验，进行抑制浓度的拟合(见图3)，可以看出耐砷发酵丁酸梭菌无机三价砷(As³⁺)的50％抑制浓度、90％抑制浓度(IC50、IC90)约为120、200mg/L。

实施例4

耐砷发酵丁酸梭菌产丁酸、乳酸、氢气实验：将将筛选所得的耐砷发酵丁酸梭菌使用发酵培养基活化10h后，1％体积比接种至液体发酵培养基中，取顶空气体测量常压下体积后，取上清液应用高效液相色谱仪测定其产丁酸情况(见图4)，应用生化分析仪测定其产乳酸情况(见图5)，应用气相色谱仪测定产氢浓度，最终得到氢气产量(见图6)。

Claims (2)

1.一株丁酸梭菌(Clostridium butyricum)CXL-1，其特征在于，该丁酸梭菌已于2023年1月保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCCNO.26434。

2.权利要求1所述的丁酸梭菌在砷污染环境微生物修复中的应用。