CN115887487A

CN115887487A - 鱼鳔多糖在制备抗口腔溃疡药物中的应用

Info

Publication number: CN115887487A
Application number: CN202211555201.9A
Authority: CN
Inventors: 任晓萌; 李国鹏; 李佳璐; 李树刚; 李明鑫; 夏效东
Original assignee: Dalian Polytechnic University
Current assignee: Dalian Polytechnic University
Priority date: 2022-12-06
Filing date: 2022-12-06
Publication date: 2023-04-04

Abstract

本发明公开了鱼鳔多糖在制备抗口腔溃疡药物中的应用，属于口腔护理技术领域。本发明的鱼鳔多糖在制备抗口腔溃疡药物中的应用，是以鱼鳔多糖为活性成分，该活性成分能够沾附于口腔创面，从而阻塞溃疡处的血管，鱼鳔多糖活性成分刺激血小板释放凝血分子，达到止血的效果；并且该鱼鳔多糖可以调节口腔中的菌群分布，进而促进溃疡组织的愈合及疮面的修复，温和无刺激，具有广泛的应用前景。

Description

鱼鳔多糖在制备抗口腔溃疡药物中的应用

技术领域

本发明属于口腔护理技术领域，特别是涉及鱼鳔多糖在制备抗口腔溃疡药物中的应用。

背景技术

口腔溃疡是口腔粘膜疾病中最常见的一种疾病，是一种由口腔黏膜损伤所引发的疾病。发病率很高，其发病特点为在局部形成溃疡后可继发感染，造成溃疡局部组织炎症和坏死。口腔溃疡病因复杂，与多种因素有关，如口腔细菌或病毒感染、免疫失调、创伤、营养缺乏等因素。口腔内的细菌，在正常情况下，对宿主有许多有益的生理作用:如抵抗外来致病菌，能产生多种营养物质，促进免疫反应，产生超氧化物歧化酶(SOD)，清除自由基(O2)，抗肿瘤等。

目前，大量多糖及其衍生物已被应用于各种医药领域。它们大多是植物性多糖，相对无毒，不会引起严重的副作用。鱼鳔多糖是鱼鳔重要的组成物质，含有丰富的高级胶原蛋白、黏多糖、维生素及钙、锌、铁、硒等多种微量元素；可以预防CCl₄引起的肝损伤，诱导结肠癌HCT-116细胞凋亡。然而，在治疗口腔溃疡方面未见有报道。

发明内容

为了克服现有技术存在的不足，本发明提供了一种鱼鳔多糖在制备抗口腔溃疡药物中的应用，该鱼鳔多糖可以消炎杀菌，促进溃疡组织的愈合及疮面的修复，温和无刺激，具有广泛的应用前景。

鱼鳔多糖对治疗口腔溃疡有正向作用，因为鱼鳔多糖具有亲水性，使其沾附于创面，从而阻塞血管，并刺激血小板释放凝血分子，从而达到止血的效果。同时在治疗口腔溃疡时，也将鱼鳔多糖中丰富的黏多糖等物质补充到大鼠体内，从而提高大鼠的免疫力，并且其主要成分黏多糖有抗炎杀菌的功能，从而改善大鼠口腔中的群落丰富度从而发挥治疗口腔溃疡的疗效。

本发明为实现上述目的，采用如下技术方案：

本发明的目的是提供一种鱼鳔多糖在制备抗口腔溃疡药物中的应用。

在一种实施方式中，所述鱼鳔多糖的制备包括如下步骤：

(1)将脱脂后的鱼鳔粉碎、过筛、加水溶解；然后再用冰醋酸调节溶液pH值为4.5～5，加入胃蛋白酶反应；反应结束后，用氢氧化钠溶液调节pH值为7～8，加入胰蛋白酶继续反应；反应结束后，调节pH值至中性，灭菌；

(2)将步骤(1)灭菌处理后的溶液离心，取上清，旋转浓缩，再加入无水乙醇进行醇沉，醇沉之后复溶，脱蛋白、透析、冷冻干燥即得。

在一种实施方式中，步骤(1)所述加水溶解过程中，水和鱼鳔的液料比为25～30:1，ml:g。

在一种实施方式中，步骤(1)所述胃蛋白酶的加入量为鱼鳔重量的4～6％。

在一种实施方式中，步骤(1)所述加入胃蛋白酶反应是在37℃反应2～5h。

在一种实施方式中，步骤(1)所述胰蛋白酶的加入量为鱼鳔重量的4～6％。

在一种实施方式中，步骤(1)所述胰蛋白酶继续反应是在在37℃反应2～5h。

在一种实施方式中，步骤(1)所述灭菌是将反应溶液加热至80～90℃进行灭菌处理。

在一种实施方式中，步骤(2)所述离心的条件为：8000～10000r/min的速度离心15～20min。

在一种实施方式中，步骤(2)所述旋转浓缩是将反应溶液浓缩到原来体积的十分之一。

在一种实施方式中，步骤(2)所述脱蛋白是将复溶之后的溶液经过Sevega方法反复脱蛋白。

在一种实施方式中，所述药物为膜剂、粉剂、粒剂中的一种或多种。

在一种实施方式中，所述鱼鳔多糖是通过提高黄单胞菌(Xanthomonadales)、β-变形菌(Betaproteobacteriales)、厚壁菌(Firmicutes)、乳酸菌(Lactobacillales)、鞘脂杆菌(Sphingobacteriales)、微球菌(Micrococcales)、肠杆菌(Enterobacteriales)、假单胞菌(Pseudomonadales)、放线菌(Actinomycetales)的丰富度来促进溃疡愈合。

一种抗口腔溃疡的牙膏，所述牙膏含有鱼鳔多糖。

一种抗口腔溃疡制剂，所述制剂含有鱼鳔多糖。

本发明的有益效果：

(1)本发明的采用鱼鳔多糖制备抗口腔溃疡制剂，该制剂在使用过程中无不良反应；并且鱼鳔处理组与自愈组相比，溃疡的愈合时间明显缩短，具有促进溃疡愈合的临床疗效。

(2)与现有技术相比，本发明将鱼鳔多糖作为主要的黏膜修复成分，消炎杀菌，促进溃疡组织的愈合及疮面的修复，且无任何毒副作用，对口腔溃疡的治疗效果与市售的西瓜霜相当。

附图说明

图1为本发明实施例1各处理组大鼠的进食量变化数据图；

图2为本发明实施例1各处理大鼠的口腔溃疡伤口愈合数据图；

图3为本发明实施例1各处理大鼠的口腔溃疡伤口愈合时间数据图；

图4为本发明实施例1各处理大鼠的口腔菌群Venn图；

图5为本发明实施例1各处理大鼠的口腔菌群的群落丰富度图；

图6为本发明实施例1各处理大鼠的口腔菌群的状堆叠图；

图7为本发明实施例1各处理大鼠的口腔菌群的群落热图。

具体实施方式

以下结合实验对本发明作进一步详细描述，所述实验只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实验中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

1、胃蛋白酶和胰蛋白酶：胃蛋白酶(Sigma 9001-75-6≥500U/mg)；胰蛋白酶(Sigma9002-07-7 1000-2000BAEE U/mg)；

2、Sevega方法：将提取液与Sevage试剂[氯仿：正丁醇＝5：1(V/V)]5：1混合，振荡，离心，变性后的蛋白质介于提取液与Sevage试剂交界处。

3、西瓜霜的来源：市售产品，有效成分：西瓜霜，草珊瑚，金银花，薄荷脑，板蓝根，野菊花。

4、多糖含量测定：

苯酚-硫酸法：准确配制1mg/mL的葡萄糖标准溶液。分别精确移取1mg/mL葡萄糖标准液0.00、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00mL于8个10mL容量瓶中，去离子水定容。各取2mL溶液，再加入浓度为5％的苯酚1mL，混合均匀后迅速加入浓硫酸5mL，摇匀后置沸水浴中15min，冷却至室温(20℃)，在490nm下测吸光度，以葡萄糖浓度(mg/mL)为横坐标绘制标准曲线，构建定量模型；然后依据测定样品的吸光度，计算出样品中多糖含量。

实施例1

一种鱼鳔多糖的制备，具体方法如下：

将成品鱼鳔用蒸馏水反复冲洗，剪成数段，用二倍体积丙酮浸泡，期间反复搅拌进行脱脂24h，接着在烘箱内45℃烘干。用粉碎机粉碎30g鱼鳔，过100目筛，放入烧杯中，加入30倍量的蒸馏水；然后，用冰醋酸将溶液的pH值调节至4.5，再加入相当于鱼鳔添加量4％的胃蛋白酶。在37℃下反应2h，用0.1mol/L NaOH将pH值调至8，然后加入相当于鱼鳔添加量4％的胰蛋白酶；37℃反应2h后，用冰醋酸将pH值调至中性，再调至80℃灭酶1h。

将灭菌后得到的提取液在高速离心机中以8000r/min的速度离心20min，取上清，将沉淀按照上述提取方法重复两次，合并上清液，在50℃旋转蒸发浓缩至原体积的十分之一，再加入2倍体积的无水乙醇，醇沉之后用少量蒸馏水复融，然后经过Sevega方法反复脱蛋白，经透析袋(截留分子量3500Da)流水透析72h后，冷冻干燥(-50℃干燥4h，-40℃干燥4h，-35℃干燥6h，-30℃干燥6h，-25℃干燥82，-20℃干燥8h，-10℃干燥8h，-50℃干6h,0℃干燥6h,4℃干燥6h)后，即得到黄色粉末状鱼鳔多糖。

将上述制备的鱼鳔多糖采用苯酚硫酸法测定多糖含量，其中多糖含量32％；具体组分如下表所示：

多糖含量	蛋白含量	硫酸根含量	糖醛酸含量	多酚含量
					32％	8％	9％	4％	10％

实施例2

实施例1制备的鱼鳔多糖在制备抗口腔溃疡药物中的应用。

用塑料胶头滴管沿着吸入口大约5mm左右处切开，内置小棉球，使小棉球底部与滴管下口平，继而在管内滴入已经配好的无颗粒的90％石炭酸溶液至刚浸透小棉球位置，然后将内有石炭酸的滴管下端平置与成年雄性SD大鼠右侧口角约为3mm处20s，即见该区有直径约3mm的白色灼伤，用生理盐水冲洗形成溃疡；第二天观察口腔溃疡情况，测量创面大小，将溃疡面较大或较小的大鼠从实验组中剔除，即大鼠口腔溃疡模型的建立成功。

实验处理共分4组，每组处理7只大鼠；具体分组如下：

(1)空白组(NC)：采用正常大鼠，不做溃疡处理，每天与其他三组进行相同的麻醉处理；

(2)自愈组(OU)：采用大鼠空腔溃疡模型大鼠，与其他三组进行相同的麻醉处理；

(3)西瓜霜处理组(OU-W)：对口腔溃疡的大鼠，从模型建立的第二天开始用干燥棉签均匀蘸取0.1g/kg(每kg重的大鼠，用药量为0.1g)西瓜霜粉末，轻轻的涂在已麻醉的大鼠的口腔创口处，至粉末完全覆盖创口；

(4)鱼鳔多糖处理组(OU-F)：对口腔溃疡的大鼠，从模型建立的第二天用干燥棉签均匀蘸取0.1g/kg(每kg重的大鼠，用药量为0.1g)鱼鳔多糖粉末轻轻的涂在已麻醉的大鼠的口腔创口处，至粉末完全覆盖创口；

在实验过程中，每天给大鼠称重，每天记录食物的摄入量，在实验的第4天进行口腔菌群的分离，并记录伤口愈合时间。所有动物实验均由大连工业大学动物伦理委员会批准，实验均按照国家动物实验研究所指导方针进行。

结果测定分析

1、大鼠进食量的变化

造模成功后，大鼠精神状态差，活动减少，进食量也相应的降低；但随着西瓜霜和鱼鳔多糖的点涂治疗，患有口腔溃疡的大鼠进食量也在慢慢恢复；详细结果如图1所示：随着处理时间的延长，自愈组、西瓜霜处理组和鱼鳔多糖处理组相较于空白组，耗粮量有一个很明显的下降；而鱼鳔多糖处理组大鼠在耗粮量方面呈现良好的恢复趋势。

2、大鼠口腔创面愈合程度

使用游标卡尺测量创面大小，并记录数据，结果如图2所示；

从图2可知，西瓜霜处理组的大鼠自治疗后，大鼠精神状态有所改善，活动量相对增多，创面大小明显减少，治疗两天后，创面由假膜覆盖，创面充血明显改善；四天后假膜脱落，溃疡面积明显缩小，充血水肿消失，并有1个溃疡愈合；鱼鳔多糖治疗后，大鼠的精神状态有所改善，活动量相对增多，创面大小明显减少，两天后溃疡面积明显缩小，充血水肿消失，在第四天并有溃疡愈合。自愈组在前三天创面大小都呈现上涨的趋势，从第三天开始呈现下降的趋势。

3、大鼠口腔溃疡愈合时间

如图3，自愈合组大鼠口腔溃疡愈合的时间为12天，西瓜霜处理组大鼠口腔溃疡的平均愈合时间为6.7天；鱼鳔多糖处理组大鼠口腔溃疡的平均愈合时间为6.7天；说明鱼鳔多糖对大鼠口腔溃疡有明显的促进愈合作用，在药效上能够达到市面上的西瓜霜同等水平。

4、口腔溃疡大鼠的口腔菌群分布情况

取各处理组大鼠的口腔溃疡部分进行16SRNA测序分析；

对测序结果进行Alpha多样性分析，对大鼠口腔菌群样品进行组间物种的比较。其中，图4阐明了正常大鼠和口腔溃疡大鼠的口腔菌群的组成存在着明显的不同，表明了口腔溃疡会影响口腔菌群的数量以及群落组成。

组间样品的chao1指数表示，如图5所示，与正常对照组相比较，自愈组的口腔群落多样性明显降低，鱼鳔处理组组与西瓜霜处理组的大鼠口腔群落数量同样降低，但降低的幅度小于自愈组，从此图上观察，鱼鳔处理组与西瓜霜处理组的大鼠在口腔菌群数量方面无显著差异。大鼠空白组口腔菌群的均一性和多样性较高，对大鼠进行口腔溃疡的造模后，发现自愈组口腔菌群的群落丰富度明显降低。

在门水平上，通过状堆叠图对群落组成进行研究，如图6所示。各组的样本中丰度较高的是放线菌门(Actinobacteriota)、拟杆菌门(Bacteroidota)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、蓝细菌门(Cyanobacteria)。各个样本之间变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)丰度无显著差异；鱼鳔处理组和自愈组相较于空白组和西瓜霜处理组大鼠的放线菌门(Actinobacteriota)的丰度有所增加；自愈组、西瓜霜处理组、鱼鳔处理组相较于空白组蓝细菌门(Cyanobacteria)的丰度明显降低。

根据群落热图分析，如图7所示；可以得到，与空白组相比较，阳性对照组、鱼鳔处理组、自愈组的红蝽菌(Coriobacteriales)、鞘脂单胞菌(Sphingomonadales)、根瘤菌(Rhizoblales)的丰富度均呈降低的趋势，鱼鳔组相较于自愈组黄单胞菌(Xanthomonadales)、β-变形菌(Betaproteobacteriales)、厚壁菌(Firmicutes)、乳酸菌(Lactobacillales)、鞘脂杆菌(Sphingobacteriales)、微球菌(Micrococcales)、肠杆菌(Enterobacteriales)、假单胞菌(Pseudomonadales)、放线菌(Actinomycetales)的丰富度呈现出升高的趋势。鱼鳔处理组的β-变形菌(Betaproteobacteriales)相较于其他三组，丰富度呈增多的趋势。自愈组与空白组相比假单胞菌(Pseudomonadales)呈现升高的趋势。

虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

Claims

1.鱼鳔多糖在制备抗口腔溃疡药物中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述鱼鳔多糖的制备包括如下步骤：

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述加水溶解过程中，水和鱼鳔的液料比为25～30:1，ml:g。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述灭菌是将反应溶液加热至80～90℃进行灭菌处理。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述旋转浓缩是将反应溶液浓缩到原来体积的十分之一。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述脱蛋白是将复溶之后的溶液经过Sevega方法反复脱蛋白。

7.根据权利要求1～6任一所述的应用，其特征在于，所述鱼鳔多糖是通过提高黄单胞菌、β-变形菌、厚壁菌、乳酸菌、鞘脂杆菌、微球菌、肠杆菌、假单胞菌、放线菌的丰富度来促进溃疡愈合。

8.根据权利要求1～6任一所述的应用，其特征在于，所述药物为膜剂、粉剂、粒剂中的一种或多种。

9.一种抗口腔溃疡的牙膏，其特征在于，所述牙膏含有鱼鳔多糖。

10.一种抗口腔溃疡制剂，其特征在于，所述制剂含有鱼鳔多糖。