CN115887464A - 枸橼酸托法替尼碳酸钙脂质纳米喷雾剂及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种枸橼酸托法替尼碳酸钙脂质纳米喷雾剂及其制备方法与应用，具体地，本发明提供枸橼酸托法替尼和/或其药用盐在制备保护毛囊和/或预防斑秃和/或促进毛发再生的药物中的应用。本发明还提供一种药物制剂，所述药物制剂包括：1～4wt％的枸橼酸托法替尼；2～8wt％的碳酸钙纳米粒；1～5wt％的磷脂；0.5～4wt％的脂质材料；2％～6wt％的表面活性剂；余量为水。所述含枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂生物相容性好，本身具有pH敏感性可控制药物释放；脂质纳米粒中的脂质材料对毛囊具有亲和性，可以提高枸橼酸托法替尼对毛囊的靶向作用和渗透性，促进毛发的生长和发育。

Description

枸橼酸托法替尼碳酸钙脂质纳米喷雾剂及其制备方法与应用

技术领域

本发明专利涉及医药技术领域，尤其是指包含枸橼酸托法替尼的碳酸钙脂质纳米喷雾剂及其制备方法与应用。

背景技术

斑秃是皮肤科临床常见的一种突发的非瘢痕性炎症脱发疾病，其一般特征为一个或几个边界清楚的圆形或椭圆形区域出现毛发快速完全脱落。斑秃的患病率约为1～2％，发病以青壮年较为多见，对患者的心理、工作、以及社会活动造成较大影响。目前针对斑秃的治疗方法包括药物治疗，光化学疗法和生物免疫疗法，但是上述治疗选择在斑秃治疗中还存在部分缺陷。比如口服或局部皮脂类固醇丙酸氯倍他索可能会导致毛囊炎以及罕见的皮肤萎缩等不良反应，且停药后易复发；光化学疗法如使用补骨脂素联合紫外线A(PUVA)疗法在一些研究中能显著促进斑秃部位毛发再生但复发率高，且长期使用会导致不可接受的大量紫外线累积；免疫疗法如局部使用安曲林会导致刺激性皮炎，需要长时间维持治疗，疗效有限等。

斑秃的病因目前尚不完全清楚，可能涉及遗传易感性和环境诱因的结合，其中支持病因为自身免疫机制的证据占优势，认为毛囊免疫赦免功能被破坏是重要的发病机制之一。在斑秃患者中，炎性因子IFN-γ在这一患病过程中发挥了重要作用，而这一途径是通过JAK激酶介导的，因此JAK抑制剂疗法代表着一种新的斑秃治疗选择，目前只有巴瑞替尼(JAK抑制剂)被批准用于斑秃适应症。托法替尼(Tofacitinib，TFB)属于JAK抑制剂的一种，2012年被美国食品和药物监督管理局(FDA)批准应用于治疗甲氨蝶呤不耐受或反应不佳的中重度类风湿性关节炎。

因此，提供一种能有效治疗斑秃的药物及其制剂显得很有必要。

发明内容

发明人在研究过程中发现，枸橼酸托法替尼的分子结构小、易于皮肤内渗透，局部给药可能是一种治疗斑秃的有益手段，可以避免口服的副作用；但是由于皮肤的屏障功能，药物的渗透效果不理想，存在促毛发生长个体差异大、效果不理想的问题。

从化学药物治疗到手术植发治疗，防脱固发的技术发展已经走过近60年时光。如今随着纳米科技的迅速崛起，发明人尝试通过纳米靶向技术递送有效成分解决头皮毛囊唤醒、修复等核心问题。本专利中选用无定型碳酸钙脂质纳米粒作为活性成分载体，其具有较好的毛囊靶向性和透皮效率，通过毛囊靶向递送增加药物皮下和毛囊蓄积浓度；毛囊本身的结构决定了其可以作为一个弱酸性的储存药物的仓库，在酸性条件下控制药物释放激活毛***细胞相关信号通路，促进斑秃区域毛发的生长，提高药物治疗效果，降低药物全身不良反应。

针对枸橼酸托法替尼局部治疗斑秃部位毛发再生应用方面的问题，本发明提供一种促进斑秃毛发再生的包含枸橼酸托法替尼的无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂，该脂质纳米粒具有毛囊靶向性和pH敏感控制释药能力，局部递送药物具有更高的皮内滞留量和更深的毛囊扩散深度，对比枸橼酸托法替尼溶液具有更好的促进斑秃部位毛发生长的效果。

本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题之一，由此，在本发明的第一方面，本发明提供枸橼酸托法替尼和/或其药用盐在制备保护毛囊和/或预防斑秃和/或促进毛发再生的药物中的应用。

在本发明的第二方面，本发明提供一种药物制剂，所述药物制剂包括：

1～4％(w/v)的枸橼酸托法替尼；

2～8％(w/v)的碳酸钙纳米粒；

1～5％(w/v)的磷脂；

0.5～4％(w/v)的脂质材料；

1～6％(w/v)的表面活性剂；

余量为纯水。

优选地，所述药物制剂包括：

1～2％(w/v)的枸橼酸托法替尼；

2％(w/v)的碳酸钙纳米粒；

2～2.5％(w/v)的磷脂；

1％(w/v)的脂质材料；

1.5％(w/v)的表面活性剂；

余量为纯水。

更优选地，所述药物制剂包括：

1％(w/v)的枸橼酸托法替尼；

2％(w/v)的无定型碳酸钙纳米粒；

2％(w/v)的大豆卵磷脂；

1％(w/v)的单硬脂酸甘油酯；

1.5％(w/v)的十二烷基硫酸钠；

余量为纯水。

在本发明的一种或多种实施方案中，所述药物制剂的剂型为喷雾剂。优选地，所述药物制剂的剂型为脂质纳米喷雾剂。

在本发明的一种或多种实施方案中，所述碳酸钙纳米粒为无定型碳酸钙纳米粒，其粒径为100～400nm；优选地，无定型碳酸钙纳米粒为200nm，所述枸橼酸托法替尼负载在所述无定型碳酸钙纳米粒上。

在本发明的一种或多种实施方案中，所述磷脂选自二硬脂酰基卵磷脂、二癸酰基卵磷脂、蛋黄卵磷脂和大豆卵磷脂中的至少一种；优选地，所述脂质材料选自单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、聚甘油脂肪酸酯中的至少一种。

在本发明的一种或多种实施方案中，所述磷脂和脂质材料质量比为0.5～4:1；优选为2～2.5:1。

在本发明的一种或多种实施方案中，所述表面活性剂选自月桂酰氨乙基硫酸钠、硫酸化脂肪酸钠和十二烷基硫酸钠中的至少一种。

在本发明的第三方面，本发明提供一种在本发明第二方面所述的药物制剂在制备保护毛囊和/或预防斑秃和/或促进毛发再生的药物中的应用。

在本发明的第四方面，本发明提供一种在本发明第二方面所述的药物制剂的制备方法，包括以下步骤：

1)称取枸橼酸托法替尼、无定型碳酸钙纳米粒、磷脂、脂质材料和表面活性剂；

2)将磷脂和脂质材料溶于三氯甲烷中，超声处理，得到脂质混合物；

3)将枸橼酸托法替尼加入乙醇中，加热冷凝回流，待枸橼酸托法替尼溶液冷却后，加入无定型碳酸钙纳米粒，搅拌，得到负载枸橼酸托法替尼的无定型碳酸钙纳米粒的溶液；

4)将步骤2)中的脂质混合物缓慢加入步骤3)的负载枸橼酸托法替尼的无定型碳酸钙纳米粒的溶液中；

5)将步骤4)中得到的反应液进行旋蒸处理，将表面活性剂配成1～4wt％水溶液，加入旋蒸处理后的混合液中，定容，超声处理，得到所述药物制剂。

在本发明的一种或多种实施方案中，所述步骤2)中，超声处理为在功率为800～1600W的超声波下超声10～30分钟；

优选地，所述步骤3)中，所述加热冷凝回流为，在50～65℃下冷凝回流0.5～2h；所述搅拌为在30～50℃下搅拌2～4h；

优选地，所述步骤4)中，所述反应为在35～50℃下搅拌反应2～4h；

优选地，所述步骤5)中，所述旋蒸处理为在38～50℃下旋蒸30～60分钟；所述超声为在功率为800～1600W超声波下，超声10～30分钟。

本发明的有益效果在于：

1、本发明提供枸橼酸托法替尼和/或其药用盐在制备保护毛囊和/或预防斑秃和/或促进毛发再生的药物中的应用。

2、本发明提供一种含枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂，其采用的载体为无定型碳酸钙纳米粒，其生物相容性好，易于合成，且本身具有pH敏感性；脂质纳米粒中的脂质材料对毛囊具有亲和性，可以提高枸橼酸托法替尼对毛囊的靶向作用和渗透性，增加枸橼酸托法替尼在皮肤和毛囊中的滞留量。同时毛囊本身类似于漏斗状的结构可以作为弱酸性的储存药物的仓库，在酸性条件下控制枸橼酸托法替尼的释放激活并刺激毛***细胞，抑制JAK1/3通道，减少IFN-γ的表达，使得毛囊上皮细胞免受杀伤性T细胞的识别并攻击，缓解斑秃的症状，促进毛发的生长和发育。

3、本发明还提供上述含枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂的制备方法，该制备方法操作简单，易于工业化。

附图说明

图1自左向右依次为实施例3制备得到的枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂样品3A，3B和3C粒径图；

图2为实施例3制备得到的枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂3B的透射电镜图；

图3为实施例3制备得到的枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂3B的体外稳定性结果图；

图4为实施例3制备得到的枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂3B在不同pH下的体外释药行为结果图；

图5为无定型碳酸钙脂质纳米载体在离体猪耳皮肤毛囊的渗透行为示意图，其中图5a为横切图，图5b为纵切图；

图6为人毛囊器官的保护与修复实验；

图7为促进斑秃模型小鼠毛发再生评价图，其中，图7a为各治疗组对斑秃模型小鼠毛发再生比较；图7b为各治疗组斑秃模型小鼠毛发再生评分；

图中，凡以上图中显示星号，即为通过Graphpad Prism 8计算显著性差异P值所得，其中*表示为P＜0.1，**表示为P＜0.01，***表示为P＜0.001，****表示为P＜0.0001，ns为无显著性差异。

具体实施方式

以下结合具体实施例和附图对本发明作进一步说明，但下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限制本发明的范围。以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行，使用的方法如无特别说明，均为本领域公知的常规方法，使用的耗材和试剂如无特别说明，均为市场购得。除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

实施例1

本实施例提供一种促进斑秃毛发再生的包含枸橼酸托法替尼的无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂，包含以下组分：

1)1％(w/v)的枸橼酸托法替尼；

2)2％(w/v)的无定型碳酸钙纳米粒；

3)2.5％(w/v)的蛋黄卵磷脂；

4)1％(w/v)的聚甘油脂肪酸酯；

5)1.5％(w/v)的月桂酰氨乙基硫酸钠；

6)余量为纯水；

本实施例还提供一种促进斑秃毛发再生的包含枸橼酸托法替尼的无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂的制备方法，包括以下步骤：

1)称取450mg蛋黄卵磷脂，200mg聚甘油脂肪酸酯溶于100mL三氯甲烷中，在功率为800W超声波下，超声30分钟得到脂质混合物；

2)将200mg枸橼酸托法替尼加入100mL无水乙醇中，在60℃下冷凝回流2h，待枸橼酸托法替尼溶液冷却后，加入400mg粒径为200nm的无定型碳酸钙纳米粒，40℃下搅拌2h，得到含有负载枸橼酸托法替尼的碳酸钙纳米粒的溶液；

3)将步骤1)中的脂质混合物转移至恒压漏斗中，缓慢加入步骤2)得到的含有负载枸橼酸托法替尼的碳酸钙纳米粒的溶液中，边加边搅拌，40℃下反应2h，得到混合液；

4)将步骤3)中得到的混合液在40℃下旋蒸30min去除有机相(乙醇和三氯甲烷)成膜，加入20mL 1.5(w/v)％月桂酰氨乙基硫酸钠溶液水化，在功率为800W超声波下超声30分钟，分散，定容至20mL，得到负载枸橼酸托法替尼的无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂样品1。

实施例2

本实施例提供一种促进斑秃毛发再生的包含枸橼酸托法替尼的无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂，包含以下组分：

1)2％(w/v)的枸橼酸托法替尼；

2)2％(w/v)的无定型碳酸钙纳米粒；

3)2％(w/v)的二硬脂酰基卵磷脂；

4)1％(w/v)的硬脂酸；

5)1.5％(w/v)的硫酸化脂肪酸钠；

6)余量为纯水；

本实施例还提供上述促进斑秃毛发再生的包含枸橼酸托法替尼的无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂的制备方法，包括以下步骤：

1)称取400mg二硬脂酰基卵磷脂，100mg硬脂酸溶于100mL三氯甲烷中，在功率为800W超声波下，超声30分钟得到脂质混合物；

2)将400mg枸橼酸托法替尼加入100mL无水乙醇中，在60℃下冷凝回流2h，待枸橼酸托法替尼溶液冷却后，加入400mg粒径为200nm的无定型碳酸钙纳米粒，40℃下搅拌2h，得到负载枸橼酸托法替尼的碳酸钙纳米粒的溶液；

3)将步骤1)中的脂质混合物转移至恒压漏斗中，缓慢加入步骤2)的载枸橼酸托法替尼的碳酸钙纳米粒的溶液中，边加边搅拌，40℃下反应2h，得到混合液；

4)将步骤3)中得到的混合液40℃旋蒸30min去除有机相(乙醇和三氯甲烷)成膜，加入20mL 1.5(w/v)％的硫酸化脂肪酸钠溶液水化，在功率为800W超声波下，超声30分钟分散，定容至20mL，得到负载枸橼酸托法替尼的无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂样品2。

实施例3

本实施例提供一种促进斑秃毛发再生的包含枸橼酸托法替尼的无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂的制备方法，包含以下组分：

1)1％(w/v)的枸橼酸托法替尼

2)2％(w/v)的无定型碳酸钙纳米粒

3)2％(w/v)的大豆卵磷脂

4)1％(w/v)的单硬脂酸甘油酯

5)1.5％(w/v)的十二烷基硫酸钠

6)余量为纯水

包括以下步骤

1)分别称取三份400mg大豆卵磷脂、200mg单硬脂酸甘油酯分别溶于100mL三氯甲烷中，在功率为800W超声波下，超声30分钟得到脂质混合物；

2)将三份200mg枸橼酸托法替尼加入100mL无水乙醇中，在60℃下冷凝回流2h，待枸橼酸托法替尼溶液冷却后制备成相同三批枸橼酸托法替尼乙醇溶液，向上述乙醇溶液中加入400mg粒径分别为100、200和400nm的无定型碳酸钙纳米粒，40℃下搅拌2h，得到负载枸橼酸托法替尼的碳酸钙纳米粒的溶液1，2和3；

3)取步骤1)中的脂质混合物转移至恒压漏斗中，分别缓慢加入步骤2)得到的负载枸橼酸托法替尼的碳酸钙纳米粒的溶液1，2和3中，边加边搅拌，40℃下反应2h，得到混合物1，2和3；

4)将步骤3)中得到的混合物1，2和3在40℃下旋蒸30min去除有机相(乙醇和三氯甲烷)，加入20mL 1.5(w/v)％的十二烷基硫酸钠溶液水化，在功率为800W超声波下超声30分钟分散，定容至20mL，得到负载枸橼酸托法替尼的无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂样品3A，3B和3C。

实施例4：枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂特性评价

A.枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂的粒径和形貌表征

将上述实施例3中所得枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂样品3A，3B和3C样品分别稀释100倍，通过使用美国马尔文公司的激光粒度仪测定粒径，枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂3A,3B和3C样品的粒径分别为145.9nm，286nm和459nm，多分散系数(PDI)分别为0.121，0.254和0.312，结果如图1所示；图1自左向右依次为实施例3制备得到的枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂样品3A，3B和3C粒径图。

将上述实施例3中所得枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂样品3B稀释10倍，使用2％磷钨酸按体积比为1:1混合染色后，滴加到铜网上通过透射电子显微镜观察形貌，结果如图2所示，枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米粒呈大小均一的类球形。

B.枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂的稳定性考察

按照实施例3所述方法制备3批枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂样品3B，将三批枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂置于4℃冰箱，在1天，3天，5天，7天，15天，30天测定其粒径和分散系数，其结果见图3，由图可知，枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂在一月内粒径和分散性无变化，具有较好的稳定性。

实施例5：枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂体外释药评价

采用透析法评价枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂在不同pH释放介质中的体外释药行为。取上述实施例3中所得枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂样品3B(2mL)3份于透析袋(分子量为3500Da)中，分别置于150mL的PBS缓冲液中(pH5.5/6.5/7.4)，在温度为32℃、转速为100rpm的条件下恒温震荡，分别于0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h时间点取释放介质2mL后及时补充相同量释放介质，使用紫外分光光度法计算枸橼酸托法替尼的累计释放量。由图4可知，随着pH的降低枸橼酸托法替尼的累积释放量明显升高，在酸性环境(pH＝5.5)的释放介质中枸橼酸托法替尼的累计释放量是中性释放介质(pH＝7.4)的2倍，有良好的pH敏感控制释放行为。

实施例6：枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂的体外透皮评价

枸橼酸托法替尼溶液的配制：取200mg枸橼酸托法替尼加入20mL 1.5％(w/v)SDS溶液，在功率为800W超声波下超声30分钟分散，得1％(w/v)的枸橼酸托法替尼溶液。

使用新鲜的C57BL/6小鼠背部皮肤，处理后固定在Franz扩散池的供给池和接收池之间，PBS缓冲液(0.1M，pH＝6.8)作为接收液，分别取1mL实施例1、实施例2和实施例3所得枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂样品1，2，和3A，3B，3C作用于供给池的皮肤角质层面，对照为同体积1％(w/v)枸橼酸托法替尼溶液，于32℃磁力搅拌(800rpm)下进行透皮实验，在设定的时间点0.5h、1h、2h、4h、8h、12h、24h分别取2mL释放介质同时补充同体积新鲜空白介质；采用高效液相色谱法分别测定各样品不同时间点释放介质中枸橼酸托法替尼的渗透量和释放24h后皮肤中枸橼酸托法替尼的滞留量。

结果见表1，比较不同脂质纳米喷雾处方制备枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾样品1、样品2和样品3B，结果显示：采用实施例3处方制备的枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾在稳态透皮速率和24h皮肤滞留量显著高于实施例1和实施例2处方制备的样品，但枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾(载体组)都显著高于对照托法替尼溶液组，表明无定型碳酸钙脂质纳米具有较好的透皮和皮下靶部位蓄积能力，优选实施例3无定型碳酸钙脂质纳米喷雾处方；与对照组枸橼酸托法替尼溶液比较，枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾(载体组)可以显著增强枸橼酸托法替尼的稳态透皮速率和皮内滞留量，枸橼酸托法替尼的脂质纳米喷雾剂3B的稳态透皮速率为25.13μg·cm^-2·h^-1，是枸橼酸托法替尼溶液组(溶液组)的1.8倍，24h皮内滞留量为339.0μg/g，为枸橼酸托法替尼溶液组的3.9倍。此外，单因素考察中发现不同粒径无定型碳酸钙制备的枸橼酸托法替尼脂质纳米喷雾在稳态透皮速率和24h皮肤滞留量两个透皮评价指标上也有显著差异，使用200nm无定型碳酸钙制备的枸橼酸托法替尼的脂质纳米喷雾剂在24h皮肤滞留量上分别是使用100nm和使用400nm的1.31倍和1.56倍，表明使用200nm无定型碳酸钙制备的枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾在皮下靶部位蓄积更多的药物，优选实施例3B处方。

表1托法替尼溶液和无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂体外透皮结果(n＝3)

实施例7：无定型碳酸钙脂质纳米载体在离体猪耳皮肤毛囊的渗透行为

按照实施例3中样品3B的制备方法，不同之处在于使用20mg罗丹明B代替枸橼酸托法替尼制备罗丹明B无定型碳酸钙脂质纳米粒。

选用新鲜猪耳皮肤(取自当地屠宰场)，冷水洗净后纸巾擦干，修剪猪耳毛发至1～2mm，并标记2cm×3cm区域3块，在不同区域1，2，3分别涂抹100μL PBS(对照组)，0.1％(w/v)罗丹明B溶液(罗丹明B溶液组)和0.1％(w/v)罗丹明B无定型碳酸钙脂质纳米粒(罗丹明B脂质纳米载体组)，随后置于32℃恒温孵育6h，使用磷酸盐缓冲液洗净皮肤表面多余的罗丹明B，并将用药区域皮肤组织用手术刀从下面的软骨中小心分离，使用冷冻切片机制备横切以及纵切的皮肤冷冻切片，使用荧光显微镜观察荧光扩散到毛囊的深度。结果如图5所示，其中，图5a为不同处理组的横切图，图5b为不同处理组的纵切图，由图5a横切图可知，罗丹明B溶液组的皮肤中罗丹明B主要分布在皮肤表面和角质层(100μm)，而罗丹明B无定型碳酸钙脂质纳米粒中的罗丹明B可以达到毛囊的皮脂腺部位(700μm)，表明无定型碳酸钙脂质纳米载体组的渗透效果好，能将药物递送到毛囊更深处，表现出良好的毛囊渗透性和毛囊靶向性；图5b在不同处理组毛囊的纵切图中，荧光标记的无定型碳酸钙脂质纳米载体显示更深的渗透能力和更强的荧光强度。

实施例8：枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂对人毛囊器官的保护与修复测试

在人头皮毛囊中，在毛囊免疫崩溃干扰下才能检测到大量主要组织相容性复合体(MHC)I和II类的表达；本实验取正常男性健康人头皮完整生长型Ⅳ的毛囊24根，共分为8组，每组3根毛囊。即修复组四个：空白组、干扰素-γ处理组、枸橼酸托法替尼溶液组和枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂组；保护组四个：空白组、干扰素-γ处理组、枸橼酸托法替尼溶液组和枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂组；修复组中空白组加入空白培养基孵育6天，其余三组用干扰素-γ处理毛囊4天以诱导免疫崩溃，然后分别加入空白培养基，枸橼酸托法替尼溶液以及实施例制备的枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾样品B孵育2天；保护组中空白组与修复组的处理方式相同，其余三组先使用空白培养基，枸橼酸托法替尼溶液组和枸橼酸托法替尼脂质纳米喷雾剂分别处理毛囊2天，然后各组加入干扰素-γ干扰4天。保护组和修复组治疗结束后，取出毛囊进行包埋以及冰冻切片，进行免疫组化荧光染色检测MHC-Ⅰ类分子的表达。结果如图6，由图可知，对于枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂组或枸橼酸托法替尼溶液组并不具备修复已经损伤的毛囊，但是却可以保护毛囊使其免受IFN-γ的损伤，这对于预防斑秃的发生具有重要意义。

实施例9：橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂对环磷酰胺诱导斑秃模型小鼠毛发再生的影响

将上述实施例3中步骤4所得的含枸橼酸托法替尼的无定型碳酸钙脂质纳米喷雾样品3B作为样品考察其对环磷酰胺诱导斑秃模型小鼠毛发再生的影响。

C57BL/6小鼠20只(7周龄，雌性，体质量18±2g，武汉疾病与控制中心提供)，给小鼠腹腔注射***钠麻醉后，使用剃毛器剃毛，脱毛面积为2cm×3cm，随后给脱毛区域涂上脱毛膏，等待2min后使用PBS洗净。剃毛后当小鼠背部皮肤开始变黑，正常对照组(4只小鼠)不做任何处理，其余组小鼠单剂量腹腔注射环磷酰胺150mg/kg，4～5d后小鼠头部和背部毛发开始出现脱落，成功诱导严重的毛发脱落，制备出生长期秃发动物模型。造模小鼠随机分为4组，每组4只，即模型组，枸橼酸托法替尼溶液组(溶液组)，市售枸橼酸托法替尼口服组和枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂组(脂质纳米载体组)。模型组，枸橼酸托法替尼溶液组和枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂组每天分别在背部脱毛区域的皮肤局部给予生理盐水，1％(w/v)枸橼酸托法替尼溶液组，1％(w/v)枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾样品B各0.1mL，市售口服组每天灌胃3％(w/v)托法替尼混悬液1mL(使用0.9％ NaCl作为溶剂将托法替尼片配制成3％(w/v)的混悬液)，持续给药21天拍照观察小鼠背部毛发的变化。最后使用Image J进行分析，对给药第21天时黑色毛发再生情况进行数据量化，并评分。评分标准为:0级：无新黑毛再生；1级：新生黑发占脱发总面积的0-20％；2级：20-40％的黑发再生；3级：新生黑发再生40-60％；4级：60-80％的黑发再生：5级：80-100％的黑发再生。

结果如图7a所示，各给药组毛发生长变黑的速度为：正常组＞枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂组＞枸橼酸托法替尼溶液组＞市售口服组＞模型组，表明造模后枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂组对比枸橼酸托法替尼溶液组以及市售口组组在小鼠斑秃区域有更好的毛发再生效果，证明了制备无定型碳酸钙脂质纳米载体的优越性；在给药21天后，小鼠黑色毛发再生评分结果见图7b，正常组≥枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂组＞市售口服组＞枸橼酸托法替尼溶液组＞模型组，在治疗结束后，枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂组小鼠的黑色毛发再生评分与正常组接近，并且无定型碳酸钙脂质纳米载体组对比市售口组的效果更好，说明枸橼酸托法替尼无定型碳酸钙脂质纳米喷雾剂对于环磷酰胺诱导斑秃模型小鼠具更好的诱导毛发再生的效果。

尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.枸橼酸托法替尼和/或其药用盐在制备保护毛囊和/或预防斑秃和/或促进毛发再生的药物中的应用。

2.一种药物制剂，其特征在于，所述药物制剂包括：

1～4％(w/v)的枸橼酸托法替尼；

2～8％(w/v)的碳酸钙纳米粒；

1～5％(w/v)的磷脂；

0.5～4％(w/v)的脂质材料；

1～6％(w/v)的表面活性剂；

余量为水。

3.根据权利要求2所述的药物制剂，其特征在于，所述药物制剂的剂型为喷雾剂；优选地，所述药物制剂的剂型为脂质纳米粒喷雾剂。

4.根据权利要求2所述的药物制剂，其特征在于，所述碳酸钙纳米粒的粒径为100～400nm；优选地，无定型碳酸钙纳米粒为200nm，所述枸橼酸托法替尼负载在所述碳酸钙纳米粒上。

5.根据权利要求2所述的药物制剂，其特征在于，所述磷脂选自二硬脂酰基卵磷脂、二癸酰基卵磷脂、蛋黄卵磷脂和大豆卵磷脂中的至少一种；优选地，所述脂质材料选自单硬脂酸甘油酯、硬脂酸、聚甘油脂肪酸酯中的至少一种。

6.根据权利要求2所述的药物制剂，其特征在于，所述磷脂和脂质材料质量比为0.5～4:1。

7.根据权利要求2所述的药物制剂，其特征在于，所述表面活性剂选自月桂酰氨乙基硫酸钠、硫酸化脂肪酸钠和十二烷基硫酸钠中的至少一种。

8.一种权利要求2～7任一项所述的药物制剂在制备保护毛囊和/或预防斑秃和/或促进毛发再生的药物中的应用。

9.一种权利要求2～7任一项所述的药物制剂的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

1)称取枸橼酸托法替尼、碳酸钙纳米粒、磷脂、脂质材料和表面活性剂；

2)将磷脂和脂质材料溶于三氯甲烷中，超声处理，得到脂质混合物；

3)将枸橼酸托法替尼加入乙醇中，加热冷凝回流，待枸橼酸托法替尼溶液冷却后，加入碳酸钙纳米粒，搅拌，得到负载枸橼酸托法替尼的碳酸钙纳米粒的溶液；

4)将步骤2)中的脂质混合物缓慢加入步骤3)的负载枸橼酸托法替尼的碳酸钙纳米粒的溶液中；

5)将步骤4)中得到的反应液进行旋蒸处理，将表面活性剂配成1～4wt％水溶液，加入旋蒸处理后的混合液中，定容，超声处理，得到所述药物制剂。

10.根据权利要求9所述的药物制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤2)中，超声处理为在功率为800～1600W的超声波下超声10～30分钟；

优选地，所述步骤3)中，所述加热冷凝回流为，在50～65℃下冷凝回流0.5～2h；所述搅拌为在30～50℃下搅拌2～4h；

优选地，所述步骤4)中，所述反应为在35～50℃下搅拌反应2～4h；

优选地，所述步骤5)中，所述旋蒸处理为在38～50℃下旋蒸30～60分钟；所述超声为在功率为800～1600W超声波下，超声10～30分钟。

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