CN115887431B - 3-羟基梅笠草素在制备抗鸡球虫病的药物或者饲料中的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明属于兽用制药技术领域，公开了3‑羟基梅笠草素在制备抗鸡球虫病的药物或者饲料中的用途。本发明发现3‑羟基梅笠草素对球虫具有明显抑制作用，该抑制作用体现在3‑羟基梅笠草素在柔嫩艾美耳球虫的细胞培养模型上具有抑制柔嫩艾美耳球虫繁殖的效果，并且该抑制作用通过动物试验得以验证。针对3‑羟基梅笠草素的这一发现，扩展了3‑羟基梅笠草素的应用范围，为抗球虫药物的开发提供了新的方案。
Description
技术领域
本发明属于兽用制药技术领域，特别涉及3-羟基梅笠草素在制备抗鸡球虫病的药物或者饲料中的用途。
背景技术
3-羟基梅笠草素(3-Hydroxychimaphilin)，是一种主要来源于鹿蹄草科(Pyrolaceae)植物鹿蹄草的植物单体化物，其分子式为C12H10O3，分子量为202.21，CAS号为33253-99-5，化学结构如下式所示：
现有研究表明，3-羟基梅笠草素具有消炎、止痛、细胞毒、抗真菌活性、抗出血、抗血小板聚集和增强心肌收缩力作用等。梅笠草素主要来源于鹿蹄草科(Pyrolaceae)植物鹿蹄草。
鸡球虫病是一种严重危害养鸡业发展的寄生虫病，由一种或多种艾美耳球虫感染引起，所述多种球虫是顶复门、孢子虫纲、真球虫目、艾美耳科、艾美耳属的原虫。鸡球虫有7个种，包括柔嫩艾美耳球虫(Eimeria tenella)、毒害艾美耳球虫(E.necatrix)、布氏艾美耳球虫(E.brunetti)、堆型艾美耳球虫(E.acervulina)、巨型艾美耳球虫(E.maxima)、和缓艾美耳球虫(E.mitis)和早熟艾美耳球虫(E.praecox)。鸡感染球虫后，生产性能严重下降，饲料报酬降低，甚至引起死亡，导致严重的经济损失。柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)是危害最为严重的虫种之一，寄生于盲肠，可引起血便，食欲减退，消瘦等临床症状。
目前，鸡球虫病的防治仍主要依靠药物。已报道的抗球虫药多达40余种，现今广泛使用的有20种。由于抗球虫药物的长期使用，鸡球虫临床野毒虫株对传统抗球虫药物的抗药性日益严重，导致原有抗球虫药物的作用效果明显降低，使得临床上缺乏具有明确治疗效果的抗球虫药物。
发明内容
为了克服现有技术中存在的针对临床上缺乏有效防治鸡球虫病药物的缺点和不足，本发明的目的在于提供一种3-羟基梅笠草素在制备抗鸡球虫病的药物或者饲料中的用途。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
3-羟基梅笠草素在制备抗鸡球虫病的药物中的用途。所述鸡球虫优选为柔嫩艾美耳球虫。
本发明实施例充分证明了3-羟基梅笠草素作为药物，具有良好的抗柔嫩艾美耳球虫作用，且明显优于对照药物磺胺氯吡嗪钠，能够开发新的抗球虫药物，将为鸡球虫病的治疗提供新的药物。
3-羟基梅笠草素在制备抗鸡球虫病的饲料中的用途。所述鸡球虫优选为柔嫩艾美耳球虫。
本发明实施例充分证明了3-羟基梅笠草素作为饲料添加剂，具有良好的抗柔嫩艾美耳球虫作用，且明显优于对照药物磺胺氯吡嗪钠，能够开发新的抗球虫饲料，将为鸡球虫病的治疗提供新的药物。
本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：
本发明发现3-羟基梅笠草素对鸡球虫具有明显抑制作用，该抑制作用体现在3-羟基梅笠草素在柔嫩艾美耳球虫的细胞(例如MDBK细胞)培养模型上能有效抑制柔嫩艾美耳球虫的繁殖，并且，该抑制作用通过动物试验得以验证。针对3-羟基梅笠草素的这一发现，拓宽了3-羟基梅笠草素的应用范围，为抗球虫药物的开发提供了新的方案。
附图说明
图1为本发明实施例1中3-羟基梅笠草素对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)繁殖的影响图示；其中，横坐标是3-羟基梅笠草素的浓度，纵坐标是3-羟基梅笠草素对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)繁殖的抑制率图。
图2为本发明实施例1中阳性对照药物磺胺氯吡嗪钠对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)繁殖的影响图示；其中，横坐标是磺胺氯吡嗪钠浓度，纵坐标是磺胺氯吡嗪钠对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)繁殖的抑制率。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。
实施例1
一、实验材料
(1)3-羟基梅笠草素购自MCE公司，磺胺氯吡嗪钠购自Merck公司。
(2)球虫卵囊：柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)广东株孢子化卵囊，由广东省农业科学院动物卫生研究所保存，使用前在无球虫雏鸡体内复壮。
(3)细胞：MDBK细胞(即牛肾细胞)，由广东省农业科学院动物卫生研究所保存。
二、实验方法：
以E.tenella MDBK细胞培养模型评价抗球虫效果，具体评价步骤包括：
(1)用0.25％的胰蛋白酶消化液消化生长至融合状态达到80％以上的MDBK细胞，以4×105个/孔的细胞浓度铺板12孔细胞培养板，置于37℃含5％CO2的培养箱中培养24h。
(2)待12孔培养板的细胞生长至融合状态达80％及以上时，每孔接种10×104个子孢子/ml，4h后弃去培养基，以PBS洗涤3次，洗掉悬浮的子孢子，每孔加入5％胎牛血清的MEM培养基。
(3)试验分组：
3-羟基梅笠草素组，设5个药物浓度梯度，具体为0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM，每个浓度梯度设3个重复；
阳性对照(磺胺氯吡嗪钠)组，设5个药物浓度梯度，具体为0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM，每个浓度梯度设3个重复；
空白对照组：参照待测药物组(即3-羟基梅笠草素组)和阳性对照组加入待测药物和阳性对照药物的体积，添加等体积的培养基，该培养基为5％胎牛血清的MEM培养基，设3个重复。
(4)置于37℃含5％CO2的培养箱中继续培养，培养48h后弃去培养基，PBS洗涤3次，提取各孔样品的总RNA。以RT-PCR检测各试验药物对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)繁殖的影响。
Real-time PCR引物如下。
特异性扩增柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)actin引物，
EtActin-F：5’-CACCACCGCCGAGAAAGA-3’(SEQ ID NO.1)，
EtActin-R：5’-GAACAACATTG-CCGTAGAGG-3’(SEQ ID NO.2)；
特异性扩增宿主细胞actin引物，
Bactin-F：5’-GGATGAGGCTCAGAGCAAGAGA-3’(SEQ ID NO.3)，
Bactin-R：5’-TCGTCCCAGTTGGTG-ACGAT-3’(SEQ ID NO.4)。
以ΔΔCT方法计算各试验药物对细胞培养水平上柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)生长发育的效果。
Real-time PCR反应体系如表1和表2。
表1、Real-time RT-PCR反应体系
表2、Real-time PCR反应程序如下：
评价指标：通过Real-time RT-PCR获得实验组和对照组的ΔCT＝CT[Et actin]-CT[H actin]，ΔΔCT＝ΔCT[exp]-ΔCT[ref]，最终获得待筛选药物的抗球虫作用效果：
三、实验结果：
结果见图1和图2，图1为3-羟基梅笠草素对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)繁殖的影响；图中，横坐标是3-羟基梅笠草素的浓度，纵坐标是3-羟基梅笠草素对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)繁殖的抑制率；图2为阳性对照药物磺胺氯吡嗪钠对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)繁殖的影响；图中，横坐标是磺胺氯吡嗪钠浓度，纵坐标是磺胺氯吡嗪钠对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)繁殖的抑制率。
分别计算各组药物对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)的抑制作用，3-羟基梅笠草素对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)的繁殖具有明显的抑制效果，其MIC50值为5.5μM；阳性对照药物磺胺氯吡嗪钠对柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)具有抑制效果，其MIC50值为8.62μM。以上结果表明，3-羟基梅笠草素具有良好的抗柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)作用，且明显优于阳性对照药物磺胺氯吡嗪钠。
根据图1和图2可知，随着3-羟基梅笠草素浓度的增加，其抑制柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)繁殖的作用增强，3-羟基梅笠草素的作用具有浓度依赖性，具有良好的抗柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)作用。
实施例2
一、实验材料：
(1)散剂型的制备：取1g3-羟基梅笠草素(含量不低于99％)和99g淀粉混匀，制备3-羟基梅笠草素散剂型；
(2)对照药物：常规抗球虫药物三字球虫粉(30％磺胺氯吡嗪钠)，由上海诺华动物保健有限公司生产。
(3)球虫卵囊：柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)广东株孢子化卵囊，由广东省农业科学院动物卫生研究所保存，使用前在无球虫雏鸡体内复壮。
(4)雏鸡：岭南黄肉鸡，由广东省农业科学院动物科学研究所提供，饲养于已消毒的专用动物房内；鸡笼和所用器皿均严格消毒，自由采食和饮用纯净水；试验前观察雏鸡有无临床症状及连续2天检查粪便有无球虫卵囊，备用。
(5)饲料：由广东省新南都饲料科技有限公司定制育雏料，不含任何抗球虫药物。
二、实验方法：
(1)分组：按试验分组及处理将150只岭南黄肉鸡饲养至14日龄，逐只称重，淘汰弱雏和体重过大者，将剩余雏鸡随机分成4组，每组30只，并适当调整使每组雏鸡总体重大致相等。
(2)处理：除第1组(空白对照)外，第2～4组雏鸡一次性经口灌服柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)孢子化卵囊l×105个/羽；攻虫当天，第3～4组分别饲喂含抗球虫药物的饲料7天，试验鸡的分组情况及药物的用法用量见表3。
表3、实验分组情况
备注：表中“g/kg”指每1kg饲料含有的药物重量。
每天观察并记录鸡群的精神状况、采食量、粪便情况等；对死亡雏鸡称重，剖检，若为柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)感染引起死亡则病变记分为+4分；所有雏鸡于感染后第7天逐只称重，剖检，进行盲肠病变记分；最后计算各组雏鸡的增重和饲料报酬。
药效判定方法及标准抗球虫指数(ACI)按美国默克公司推荐的公式计算：
ACI＝(相对增重率+存活率)－(卵囊值+病变值)；
相对增重率(％)＝(试验组增重÷空白对照组增重)×100％；
存活率(％)＝(各组存活雏鸡数÷各组雏鸡总数)×100％。
病变按五级记分：
①无卵囊，盲肠正常，为0分；
②有卵囊，盲肠黏膜稍增厚，有少量散在出血或少量血样肠内容物，为+1分；
③有卵囊，盲肠黏膜增厚，有明显出血或明显血样肠内容物，为+2分；
④有卵囊，盲肠黏膜增厚，有大量凝血块或血样肠芯，为+3分；
⑤雏鸡因球虫病死亡或有大量卵囊，盲肠外观呈酱油色(或小肠中部有点状坏死灶，黏膜面呈绯红色)，肠管明显肿大，内容物形成明显的血样肠芯，为+4分；
病变值＝每组平均病变记分×10；
卵囊值由盲肠内容物克粪便卵囊数(OPG)换算而来。
药效判定标准是ACI<120为无效，120～160为弱效，160～180为中效，180以上为强效。
三、实验结果：
临床症状观察：接种柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)孢子化卵囊的对照组(第2组)第2天，病鸡出现精神沉郁，采食量下降；对照组(第2组)第5天出现明显血便，并出现死亡，随后血便逐渐减少。
分别计算各组的抗球虫指数，结果见表4。第4组的抗球虫指数(ACI)为172.3，高于对照药物第3组，具有良好的抗柔嫩艾美耳球虫(E.tenella)作用，且优于常规抗球虫药物三字球虫粉。
表4、各组抗球虫指数
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (2)
1.3-羟基梅笠草素在制备抗柔嫩艾美耳球虫的药物中的用途。
2.3-羟基梅笠草素在制备抗柔嫩艾美耳球虫的饲料中的用途。
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