CN115873928A - 一种基于双链环模板的滚环扩增方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种基于双链环模板的滚环扩增方法及其应用，所述方法包括：根据靶标核酸设计捕获探针，所述捕获探针从5’端到3’端依次包括：5’端互补序列P‑lig、中间的骨架序列P‑bb和3’端互补序列P‑ext；所述捕获探针的5’端互补序列P‑lig和3’端互补序列P‑ext分别于靶标核酸的两端互补，所述捕获探针的骨架序列P‑bb不与靶标核酸互补；采用捕获探针捕获靶标核酸，对捕获反应的产物进行延伸处理，所述捕获探针的3’端互补序列P‑ext沿靶标核酸进行延伸，所述靶标核酸的3’端沿捕获探针进行延伸，延伸结束后进行连接处理，得到双链环模板；利用滚环扩增酶对双链环模板进行滚环扩增。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种基于双链环模板的滚环扩增方法及其应用。
背景技术
随着二代测序技术(NGS)成本的不断降低，NGS被越来越广泛地应用在临床实践当中。NGS技术相对传统PCR、qPCR和芯片技术，有着无以伦比的通量优势，即它可以一次检测大量靶标位点。
一般NGS的建库方法有扩增子法和杂交捕获法。这两种方法各有优缺点，例如扩增子法的优点是样本的投入量低(10ng及以上)，实验流程短，成本也相对较低；缺点则是能检测的靶点有限，多重引物设计技术含量高。常规杂交捕获的优点则是检测的靶点多，但是探针订购成本和试剂成本都较高，实验流程复杂，样本投入量也相对扩增子法较多(100ng及以上)，由于捕获产物的特异性稍弱，要求的NGS下机数据量也较多，市场上亟需成本低，流程简单的捕获技术。
滚环扩增(Rolling Cycle Amplification，RCA)是一种恒温扩增技术，不同于聚合酶链式反应(polymerase chain reaction，PCR)技术，RCA无需昂贵的PCR仪器，在水浴或者金属浴条件下就能进行反应。RCA以单链环状DNA为模板，在链置换活性聚合酶的作用下，通过引物与模板环退火而进行滚环式DNA合成。RCA技术已被广泛应用于POCT和野外检测领域。例如，人体中寨卡病毒和线虫检测、食品安全检测和野外水质检测。滚环扩增产物由于会把同个靶标扩增成千上百倍线性串联体，在用于NGS建库后检测时，相比于非滚环建库产物具有高准确度、低数据重复率和低标签跳跃的数据优点。
CN113667716A公开了一种基于滚环扩增的测序文库的构建方法及其应用。该测序文库的构建方法包括：提供闭合环状的双链DNA、cDNA或RNA分子；利用特异性引物，进行滚环扩增，从而每个环仅扩增得到一条含多拷贝的单链DNA产物作为第一链；以第一链为模版，产生互补的第二链，从而获得双链DNA产物。一般滚环扩增采用的是单链环模板滚环，以单链环为模板的情况下的滚环扩增产物的产量有限。
因此，开发一种低成本、实验流程简单、扩增效率高、易于适配自动化设备的滚环扩增的技术，在核酸检测中具有重要应用价值。
发明内容
针对现有技术存在的不足，本发明的目的在于提供一种基于双链环模板的滚环扩增方法及其应用。本发明设计了一种捕获靶标核酸后形成环状双链并结合滚环扩增的方法，所述方法的优点在于探针合成成本低，试剂成本低，扩增效率高，实验流程简单，易于适配自动化设备，可随时依据产品需求添加探针的数目，并能用滚环技术放大靶标产物。双链设计增加了可扩增的模板，可提高检测的灵敏度，同时也使探针设计更具灵活性。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种基于双链环模板的滚环扩增方法，所述滚环扩增方法包括如下步骤：
(1)根据靶标核酸设计捕获探针，所述捕获探针分为三部分，所述捕获探针从5’端到3’端依次包括：5’端互补序列P-lig、中间的骨架序列P-bb和3’端互补序列P-ext；所述捕获探针的5’端互补序列P-lig和3’端互补序列P-ext分别于靶标核酸的两端互补，所述捕获探针的骨架序列P-bb不与靶标核酸互补；
(2)采用捕获探针捕获靶标核酸，对捕获反应的产物进行延伸处理，所述捕获探针的3’端互补序列P-ext沿靶标核酸进行延伸，所述靶标核酸的3’端沿捕获探针进行延伸，延伸结束后进行连接处理，得到双链环模板；
(3)利用滚环扩增酶对双链环模板进行滚环扩增。
优选地，步骤(1)中，所述捕获探针的5’端互补序列P-lig的末端碱基和靶标核酸的5’端的末端碱基为经过磷酸化处理的碱基。
优选地，步骤(1)中，所述捕获探针的长度为60-90bp，例如可以是60bp、65bp、70bp、75bp、80bp、85bp或90bp等，所述捕获探针的GC含量为20-80％，例如可以是20％、30％、40％、50％、60％、70％或80％等，其中，5’端互补序列P-lig和3’端互补序列P-ext的长度各自独立的为20-30bp，例如可以是20bp、21bp、22bp、23bp、24bp、25bp、26bp、27bp、28bp、29bp或30bp等。
优选地，步骤(2)中，采用捕获探针捕获靶标核酸的具体步骤包括：
将捕获探针、靶标核酸与捕获缓冲液混合，于50-60℃(例如可以是50℃、51℃、52℃、53℃、54℃、55℃、56℃、57℃、58℃、59℃或60℃等)捕获反应5-60min，例如可以是5min、10min、20min、30min、40min、50min或60min等；所述捕获缓冲液中捕获探针的终浓度为0.1-10pmol/μL，例如可以是0.1pmol/μL、0.5pmol/μL、1pmol/μL、2pmol/μL、3pmol/μL、4pmol/μL、5pmol/μL、6pmol/μL、7pmol/μL、8pmol/μL、9pmol/μL或10pmol/μL等，所述捕获缓冲液中靶标核酸的终浓度为0.05-5pmol/μL，例如可以是0.05pmol/μL、0.1pmol/μL、0.5pmol/μL、1pmol/μL、2pmol/μL、3pmol/μL、4pmol/μL或5pmol/μL等；所述捕获缓冲液包括无核酸酶水、TE buffer或taq酶反应缓冲液中任意一种或至少两种的组合。
优选地，步骤(2)中，所述延伸处理的具体步骤包括：
采用DNA聚合酶对捕获反应的产物进行延伸处理，所述捕获探针的3’端互补序列P-ext沿靶标核酸进行延伸，所述靶标核酸的3’端沿捕获探针进行延伸；所述延伸处理的温度为50-65℃，例如可以是50℃、52℃、54℃、55℃、56℃、58℃、60℃、62℃或65℃等，所述延伸处理的时间5-60min，例如可以是5min、10min、20min、30min、40min、50min或60min等；所述延伸处理采用的DNA聚合酶为phusion High-Fidelity DNA聚合酶，所述DNA聚合酶的使用量为1-3μL，例如可以是1μL、1.5μL、2μL、2.5μL或3μL等。
优选地，步骤(2)中，所述连接处理的具体步骤包括：
采用DNA连接酶对延伸处理的产物进行连接处理，所述DNA连接酶连接捕获探针的5’端互补序列P-lig的末端碱基和3’端互补序列P-ext的延伸后末端碱基；所述DNA连接酶连接靶标核酸的5’端的末端碱基和3’端的延伸后末端碱基；所述连接处理的温度为20-37℃，例如可以是20℃、22℃、24℃、25℃、26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、35℃或37℃等，所述连接处理的时间为5-60min，例如可以是5min、10min、20min、30min、40min、50min或60min等；所述连接处理采用的DNA连接酶为T4 DNA连接酶，所述T4 DNA连接酶的使用量为1-5μL，例如可以是1μL、2μL、3μL、4μL或5μL等。
优选地，步骤(3)中，所述滚环扩增的具体步骤包括：
采用滚环扩增酶在滚环扩增引物的引导下对双链环模板进行滚环扩增，得到扩增的靶标产物；所述滚环扩增的温度为30-65℃，例如可以是30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃或65℃等，所述滚环扩增的时间为10-120min，例如可以是10min、20min、40min、60min、80min、100min或120min等。
优选地，所述滚环扩增酶包括phi29DNA聚合酶、BstDNA聚合酶、BsuDNA聚合酶或VentDNA聚合酶中任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述滚环扩增引物包括：与捕获探针的序列互补的扩增引物P1b，和与靶标核酸的序列互补的扩增引物T1b。
第二方面，本发明提供第一方面所述的基于双链环模板的滚环扩增方法在核酸扩增中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
(1)本发明采用90bp以及90bp以下长度的捕获探针对靶标核酸进行捕获，捕获探针的长度低于常规商业化的100-120bp，捕获探针的合成成本低，同时无需复杂的杂交反应液和纯化等试剂，也大幅降低了试剂成本；
(2)本发明首次提出双链(即探针和模板)都延伸和连接的并进行滚环扩增的方法，本发明的滚环扩增方法实验操作流程简单，滚环扩增前只需两步，即退火捕获和延伸连接，就可完成靶标模板的大量扩增，后期适配自动化仪器具有优势；
(3)本发明的滚环扩增方法的实验过程中间无纯化步骤，减少因纯化带来的模板丢失，降低成本，简化步骤；本发明的滚环扩增方法中对酶的组合和用量进行了优化，扩增效率更高；
(4)本发明的滚环扩增方法是双链环滚环扩增，比单链环滚环扩增可用的模板多一倍，扩增效率更高，产物量更多，可以有效提高检测的灵敏度，同时可使探针设计更灵活，具有广阔的应用前景。
附图说明
图1为实施例1中滚环扩增产物的片段分析结果图；
图2为实施例1-4中的滚环扩增产物的琼脂糖胶电泳图；
图3实施例5中琼脂糖凝胶电泳15min的电泳图；
图4实施例5中琼脂糖凝胶电泳30min的电泳图；
图5实施例7中滚环扩增的产物的琼脂糖胶电泳图；
图6实施例8中不同GC含量的探针对应的RCA产物琼脂糖胶电泳15min的电泳图；
图7实施例8中不同GC含量的探针对应的RCA产物琼脂糖胶电泳30min的电泳图；
图8实施例9中不同退火长度的RCA产物琼脂糖凝胶电泳15min的电泳图；
图9实施例9中更换电泳液后不同退火长度的RCA产物琼脂糖凝胶电泳15min的电泳图；
图10实施例9中不同退火长度的RCA产物琼脂糖凝胶电泳30min的电泳图；
图11实施例9中更换电泳液后不同退火长度的RCA产物琼脂糖凝胶电泳30min的电泳图；
图12实施例10中MCA对RCA影响琼脂糖凝胶电泳为15min的电泳图；
图13实施例10中MCA对RCA影响琼脂糖凝胶电泳为30min的电泳图；
图14实施例11中反应时间对MCA影响琼脂糖凝胶电泳为15min的电泳图；
图15实施例11中反应时间对MCA影响琼脂糖凝胶电泳为30min的电泳图；
图16实施例12中滚环扩增的产物的琼脂糖胶电泳图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购获得的常规产品。
1、本发明中所使用的核酸序列如表1所示：
表1
实施例1
本实施例提供了一种基于双链环模板的滚环扩增方法，双链环扩增相比单链环的优势是所用的DNA模板也同样参与滚环扩增，可以增加靶标产物的模板，提高后续检测的灵敏度。故而本实施例展示双链环扩增的可行性方案。
1、捕获靶标核酸
将捕获探针、靶标核酸与捕获缓冲液混合，在PCR仪器中60℃温浴15min获得捕获产物，所述捕获的反应体系如表2所示。
表2
| 成份 | 存储浓度 | 输入量μL |
| P1 | 1pm/μL | 4 |
| T1 | 1pm/μL | 2 |
| Phusion酶缓冲液 | 10× | 2 |
| H<sub>2</sub>O | / | 10 |
| 总计 | / | 18 |
2、延伸处理
采用DNA聚合酶对捕获反应的产物进行延伸处理，所述捕获探针的3’端互补序列P-ext沿靶标核酸进行延伸，所述靶标核酸的3’端沿捕获探针进行延伸。所述延伸的反应体系如表3所示，Phusion酶的货号：F530L。
表3
| 成份 | 存储浓度 | 输入量μL |
| 捕获产物 | / | 18 |
| Phusion酶 | 1U/μL | 1 |
| DNTP | 10mM | 1 |
| 总计 | / | 20 |
在PCR仪器中设置温浴条件如下：60℃、10min，72℃、10min获得延伸产物。
3、连接处理
采用DNA连接酶对延伸处理的产物进行连接处理，所述DNA连接酶连接捕获探针的5’端互补序列P-lig的末端碱基和3’端互补序列P-ext的延伸后末端碱基；所述DNA连接酶连接靶标核酸的5’端的末端碱基和3’端的延伸后末端碱基；所述连接的反应体系如表4所示，T4连接酶的货号：M2200V。
表4
| 成份 | 存储浓度 | 输入量μL |
| 延伸产物 | / | 20 |
| T4连接酶缓冲液 | 10× | 2 |
| T4连接酶 | 5U/μL | 1 |
| 总计 | / | 23 |
在PCR仪器中设置温浴条件如下：22℃，20min，获得连接产物。
4、滚环扩增处理
采用滚环扩增酶在滚环扩增引物的引导下对双链环模板进行滚环扩增，得到扩增的靶标产物；所述滚环扩增的反应体系如表5所示，phi29酶的货号：EP0091。
表5
| 成份 | 存储浓度 | 输入量μL |
| 连接产物 | / | 23 |
| T1b | 10μM | 1 |
| P1b | 10μM | 1 |
| phi29酶缓冲液 | 10× | 4 |
| phi29酶 | 10U/μL | 3 |
| dNTP | 10mM | 4 |
| DTT(二硫苏糖醇) | 100mM | 2 |
| H<sub>2</sub>O | / | 3 |
| 总计 | / | 40 |
T1b(SEQ ID NO:6)、P1b(SEQ ID NO:5)分别为滚环扩增的引物序列。在PCR仪器中设置温浴条件如下：30℃，30min，获得滚环扩增的产物。
对滚环扩增的产物进行片段分析(Qsep100)，片段分析的分析图如图1所示，从图1中可以看出1000bp以后有大量核酸片段。
实施例2
本实施例提供了一种基于双链环模板的滚环扩增方法，所述滚环扩增方法与实施例1的区别在于，延伸处理过程中采用的DNA聚合酶为Hifi Seq Hotstart DNA聚合酶(厂家：菲鹏，货号MD063)，其余步骤参照实施例1。
实施例3
本实施例提供了一种基于双链环模板的滚环扩增方法，所述滚环扩增方法与实施例1的区别在于，延伸处理过程中采用的DNA聚合酶为Anpfu Hotstart DNA聚合酶(厂家：菲鹏，货号MD036)，其余步骤参照实施例1。
实施例4
本实施例提供了一种基于双链环模板的滚环扩增方法，所述滚环扩增方法与实施例1的区别在于，延伸处理过程中采用的DNA聚合酶为
High-Fidelity DNA聚合酶(厂家：New England BioLabs，货号M0491S)，其余步骤参照实施例1。
将实施例1-4中的滚环扩增产物进行琼脂糖胶电泳，电泳结果如图2所示，图2中，泳道0：ladder；泳道1：Hifi酶对应的产物；泳道2：Anpfui酶对应的产物；泳道3：Q5i酶对应的产物；泳道4：phusioni酶对应的产物；从图2中可知，phusion酶对应的产物在孔口附近有RCA扩增产物，Q5酶对应的产物有弱微的产物，但是Hifi酶和Anpfu酶对应的产物无RCA产物，说明phusion酶在基于双链环模板的滚环扩增方法中具有较好的扩增效率。
实施例5
本实施例测试phi29酶量对RCA扩增产物影响。
本实施例将滚环扩增中的部分参数按表6进行调整，具体变化包括：将phi29酶量从3μL增大到5μL，进行差异对比，将dNTP的量从4μL增大到12μL探究dNTP的量对RCA扩增产物影响。
参照实施例1的方法进行滚环扩增，滚环扩增体系中Phi29和dNTP的用量如表6所示，其余组分的使用量参照实施例1，并对扩增后的产物进行琼脂糖凝胶电泳。
表6
| 组分 | 1号 | 2号 | 3号 | 4号 |
| Phi29 | 3μL | 5μL | 3μL | 3μL |
| dNTP | 4μL | 4μL | 7μL | 12μL |
| 产物浓度ng/μL | 24.4 | 24.8 | 30 | 26 |
1号为对照；
2号为将酶量加大到5μL，体系变为42μL；
3号为将dNTP加大至7μL，水减少3μL，体系为40μL；
4号为将dNTP加大至12μL，体系变为45μL。
琼脂糖凝胶电泳的结果如图3和图4所示，图中，泳道1-4对应表6中的1号-4号滚环扩增体系的产物。图3为琼脂糖凝胶电泳15min的电泳图，图4为琼脂糖凝胶电泳30min的电泳图。从图3和图4可知，增大Phi29酶量至5μL后，RCA扩增产物无明显变化；Phi29酶量为3μL可能为最适合浓度。Phi29浓度一定时，将dNTP增大到7μL和12μL时，对RCA产物无影响，RCA产物亮度主要由Phi29酶决定。
实施例6
本实施例提供了一种基于双链环模板的滚环扩增方法，所述滚环扩增方法与实施例1的区别在于，捕获靶标核酸过程中采用的捕获探针为P3-T(SEQ ID NO：3)，其余步骤参照实施例1。
实施例7
本实施例提供了一种基于双链环模板的滚环扩增方法，所述滚环扩增方法与实施例1的区别在于，捕获靶标核酸过程中采用的捕获探针为P3-A(SEQ ID NO：4)，其余步骤参照实施例1。
实施例1和实施例6-7中所使用的捕获探针及其对应的捕获序列长度如表7所示。
表7
| 名称 | 探针总长(bp) | 捕获序列长度(bp) |
| P1 | 90 | 60 |
| P3-T | 78 | 60 |
| P3-A | 78 | 40 |
将实施例1和实施例6-7中的滚环扩增的产物进行琼脂糖胶电泳，电泳结果如图5所示，图5中，泳道0：ladder；泳道1：P3-T探针的产物；泳道2：P3-A探针的产物；泳道3：P1探针的产物。从图5中可知，P3-A探针和P3-T探针的滚环扩增产物产量都低于P1探针，同时P3-A也比P3-T的产量略低。故而说明探针的长度和捕获的长度对滚环扩增产物的产量都有影响。
实施例8
本实施例测试退火部分不同探针GC含量对RCA的影响
实验步骤：本实施例提供了一种基于双链环模板的滚环扩增方法，所述滚环扩增方法与实施例1的区别在于，捕获靶标核酸过程中采用的捕获探针和靶标核酸配对方式是表8中的5种，分别为P6Pi-T6，P7Pi-T7，P3Pi-T3，P8Pi-T8，P9Pi-T9，对应的核苷酸序列如表10所示，其余步骤参照实施例1。
表8
| 序号 | GC含量 | P(捕获探针) | T(靶标核酸) |
| 1 | 0.76 | P6Pi | T6 |
| 2 | 0.6 | P7Pi | T7 |
| 3 | 0.4 | P3Pi | T3 |
| 4 | 0.3 | P8Pi | T8 |
| 5 | 0.2 | P9Pi | T9 |
表9
| NO. | 1号 | 2号 | 3号 | 4号 | 5号 |
| 探针 | P6Pi | P7Pi | P3Pi | P8Pi | P9Pi |
| 模板 | T6 | T7 | T3 | T8 | T9 |
| 产物浓度ng/μL | 32.2 | 32.6 | 27.8 | 22.6 | 21.6 |
表10
实验结果如图6和图7所示，图6为不同GC含量的探针对应的RCA产物琼脂糖胶电泳15min的电泳图，图7为不同GC含量的探针对应的RCA产物琼脂糖胶电泳30min的电泳图。从图6和图7可知，对照3号GC含量为40％能扩增出RCA产物，其余探针模板不能扩增出RCA产物。
实施例9
本实施例对比不同的退火长度条件下，探针对RCA产物影响
实验步骤参照实施例1，所使用的探针如表11所示。
表11
| 序号 | 探针 |
| 1 | P3Pi-15bp 30bp |
| 2 | P3Pi-30bp 15bp |
| 3 | P3Pi-15bp 15bp |
| 4 | P3Pi-30bp 8bp |
| 5 | P3Pi-8bp 30bp |
| 6 | P3Pi-8bp 8bp |
| 7 | 阴性 |
| 8 | 阳性 |
表11中，序号1对应的探针P3Pi-15bp 30bp是指5’端P-lig长度为15bp，P-ext长度为30bp，序号2对应的探针P3Pi-30bp 15bp是指5’端P-lig长度为30bp，P-ext长度为15bp，序号3、4、5、6的探针描述类似。
将滚环扩增的产物进行琼脂糖胶电泳，电泳结果如图8、图9、图10和图11所示，图8-11中，泳道1-8分别对应表10中的序号1-8。图8为不同退火长度的RCA产物琼脂糖凝胶电泳15min的电泳图，图9为更换电泳液后不同退火长度的RCA产物琼脂糖凝胶电泳15min的电泳图，图10为不同退火长度的RCA产物琼脂糖凝胶电泳30min的电泳图，图11为更换电泳液后不同退火长度的RCA产物琼脂糖凝胶电泳30min的电泳图。从图中可知，退火长度对RCA扩增产物没有明显得规律，不同长度都可以产生RCA产物。
实施例10
本实施例测试MCA(多引物滚环扩增)对RCA产物影响
实验步骤：
实验步骤参照实施例1，完成滚环扩增处理后，另外的按表12添加引物、phi29扩增酶和dNTP，30℃反应1h，用Qubit测定产物浓度，并用琼脂糖凝胶电泳检查产物。
表12
| NO. | 1号 | 2号 | 3号 | 4号 |
| P3b-MCA | 0μL | 2μL | 2μL | 2μL |
| phi29 | 0μL | 0μL | 3μL | 3μL |
| dNTP | 0μL | 0μL | 0μL | 2μL |
| 产物浓度ng/μL | 29.8 | 29 | 20.8 | 24 |
1号为对照；
2号为RCA扩增后加2μL P3b-MCA；
3号为RCA扩增后加2μL P3b-MCA，3μL phi29；
4号为RCA扩增后加2μL P3b-MCA，3μL phi29，2μL dNTP。
实验结果如图12和图13所示，图12为电泳时间为15min的3％浓度的琼脂糖电泳图，图13为电泳时间为30min的3％浓度的琼脂糖电泳图。从图12和图13可知，与1号对照相比，RCA产物，4号增加引物，phi29酶量，dNTP量再次反应1h后，RCA产物相对多些。RCA产物总体相差不大。
实施例11
本实施例测试反应时间对MCA的影响，按表12添加引物、phi29扩增酶和dNTP后将反应时间提高到3h。
实验步骤：实验步骤参照实施例1，完成滚环扩增处理后，另外的按表13添加引物、phi29扩增酶和dNTP，30℃反应3h，用Qubit测定产物浓度，并用琼脂糖凝胶电泳检查产物。
表13
| NO. | 1号 | 2号 | 3号 | 4号 |
| P3b-MCA | 0 | 2 | 2 | 2 |
| phi29 | 0 | 0 | 3 | 3 |
| dNTP | 0 | 0 | 0 | 2 |
| 产物浓度ng/μL | 18.2 | 58.2 | 48.4 | 40 |
1号为对照；
2号RCA扩增后加2μL P3b-MCA；
3号RCA扩增后加2μL P3b-MCA，3phi29；
4号RCA扩增后加2μL P3b-MCA，3phi29，2dNTP。
实验结果如图14和图15所示，图14为电泳时间为15min的3％浓度的琼脂糖电泳图，图15为电泳时间为30min的3％浓度的琼脂糖电泳图。从图14和图15可知，在增加引物，Phi29酶，dNTP，多扩增3h后，与泳道1(1号对照相比)，泳道1(2号)、泳道3(3号)、泳道4(4号)上方条带更亮，RCA产物更多。将时间增大到3h后，RCA产物有明显提高。
实施例12
一般滚环扩增采用的是单链环模板滚环，本实施例展示了P3-A探针在单链环和双链环情况下的滚环扩增产物的产量。
具体的操作步骤参照实施例1，不同的是单链环所用T1的5’末端碱基非磷酸化处理，而双链环T1的5’末端碱基需磷酸化处理。
将实施例1和实施例12中的滚环扩增的产物进行琼脂糖胶电泳，电泳结果如图16所示，图16中，泳道1：单链P3-A探针的产物；泳道2：双链P3-A探针的产物；由图16可知，P3-A探针双链环(2号孔)的产物显著多于单链环(1号孔)，说明P3-A 40bp的捕获区域在双链环的条件下比单链环可得到更多的产物。对于无法满足60bp长的捕获靶标模板可以采取40bp长捕获探针外加双链环扩增的方式提高滚环扩增产物的产量，这有利于探针的设计灵活性。
综上，本发明设计了一种捕获靶标核酸后形成环状双链并结合滚环扩增的技术，优点是探针合成成本低，试剂成本低，实验流程简单，易于适配自动化设备，可随时依据产品需求添加探针的数目，并能用滚环技术放大靶标产物。双链设计增加了可扩增的模板，可提高检测的灵敏度，同时也使探针设计更具灵活性，在核酸检测中具有重要的应用前景。
申请人声明，以上所述仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，所属技术领域的技术人员应该明了，任何属于本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
Claims (10)
1.一种基于双链环模板的滚环扩增方法，其特征在于，所述滚环扩增方法包括如下步骤：
(1)根据靶标核酸设计捕获探针，所述捕获探针分为三部分，所述捕获探针从5’端到3’端依次包括：5’端互补序列P-lig、中间的骨架序列P-bb和3’端互补序列P-ext；所述捕获探针的5’端互补序列P-lig和3’端互补序列P-ext分别于靶标核酸的两端互补，所述捕获探针的骨架序列P-bb不与靶标核酸互补；
(2)采用捕获探针捕获靶标核酸，对捕获反应的产物进行延伸处理，所述捕获探针的3’端互补序列P-ext沿靶标核酸进行延伸，所述靶标核酸的3’端沿捕获探针进行延伸，延伸结束后进行连接处理，得到双链环模板；
(3)利用滚环扩增酶对双链环模板进行滚环扩增。
2.根据权利要求1所述的基于双链环模板的滚环扩增方法，其特征在于，步骤(1)中，所述捕获探针的5’端互补序列P-lig的末端碱基和靶标核酸的5’端的末端碱基为经过磷酸化处理的碱基。
3.根据权利要求1所述的基于双链环模板的滚环扩增方法，其特征在于，步骤(1)中，所述捕获探针的长度为60-90bp，所述捕获探针的GC含量为20-80％，其中，5’端互补序列P-lig和3’端互补序列P-ext的长度各自独立的为20-30bp。
4.根据权利要求1所述的基于双链环模板的滚环扩增方法，其特征在于，步骤(2)中，采用捕获探针捕获靶标核酸的具体步骤包括：
将捕获探针、靶标核酸与捕获缓冲液混合，于50-60℃捕获反应5-60min；所述捕获缓冲液中捕获探针的终浓度为0.1-10pmol/μL，所述捕获缓冲液中靶标核酸的终浓度为0.05-5pmol/μL；所述捕获缓冲液包括无核酸酶水、TE buffer或taq酶反应缓冲液中任意一种或至少两种的组合。
5.根据权利要求1所述的基于双链环模板的滚环扩增方法，其特征在于，步骤(2)中，所述延伸处理的具体步骤包括：
采用DNA聚合酶对捕获反应的产物进行延伸处理，所述捕获探针的3’端互补序列P-ext沿靶标核酸进行延伸，所述靶标核酸的3’端沿捕获探针进行延伸；所述延伸处理的温度为50-65℃，所述延伸处理的时间5-60min；所述延伸处理采用的DNA聚合酶为phusion High-Fidelity DNA聚合酶，所述DNA聚合酶的使用量为1-3μL。
6.根据权利要求1所述的基于双链环模板的滚环扩增方法，其特征在于，步骤(2)中，所述连接处理的具体步骤包括：
采用DNA连接酶对延伸处理的产物进行连接处理，所述DNA连接酶连接捕获探针的5’端互补序列P-lig的末端碱基和3’端互补序列P-ext的延伸后末端碱基；所述DNA连接酶连接靶标核酸的5’端的末端碱基和3’端的延伸后末端碱基；所述连接处理的温度为20-37℃，所述连接处理的时间为5-60min；所述连接处理采用的DNA连接酶为T4 DNA连接酶，所述T4DNA连接酶的使用量为1-5μL。
7.根据权利要求1所述的基于双链环模板的滚环扩增方法，其特征在于，步骤(3)中，所述滚环扩增的具体步骤包括：
采用滚环扩增酶在滚环扩增引物的引导下对双链环模板进行滚环扩增，得到扩增的靶标产物；所述滚环扩增的温度为30-65℃，所述滚环扩增的时间为10-120min。
8.根据权利要求7所述的基于双链环模板的滚环扩增方法，其特征在于，所述滚环扩增酶包括phi29DNA聚合酶、BstDNA聚合酶、BsuDNA聚合酶或VentDNA聚合酶中任意一种或至少两种的组合。
9.根据权利要求7所述的基于双链环模板的滚环扩增方法，其特征在于，所述滚环扩增引物包括：与捕获探针的序列互补的扩增引物P1b，和与靶标核酸的序列互补的扩增引物T1b。
10.权利要求1-9中任一项所述的基于双链环模板的滚环扩增方法在核酸扩增中的应用。
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