CN115873816A

CN115873816A - 一种用于合成西格列汀的转氨酶突变体

Info

Publication number: CN115873816A
Application number: CN202111141071.XA
Authority: CN
Inventors: 王金刚; 韦炎龙; 梁岩
Original assignee: Shanghai Banglin Biotechnology Co ltd
Current assignee: Shanghai Banglin Biotechnology Co ltd
Priority date: 2021-09-28
Filing date: 2021-09-28
Publication date: 2023-03-31

Abstract

本发明公开了一种转氨酶突变体SEQ ID NO:3，该转氨酶突变体能够高效地将(2Z)‑4‑氧代‑4‑[3‑(三氟甲基)‑5,6‑二氢‑[1,2,4]***并[4,3‑a]吡嗪‑7‑(8H)‑基]‑1‑(2,4,5‑三氟苯基)丁‑2‑酮转化为西格列汀。

Description

一种用于合成西格列汀的转氨酶突变体

技术领域

本发明属于酶催化技术领域，具体地说，涉及一种转氨酶突变体、及其用于酶法催化法生产西格列汀的用途。

背景技术

西格列汀化学名称为7-[(3R)-3-氨基-1-氧代-4-(2,4,5-三氟苯基)丁基]-5,6,7,8-四氢-3-三氟甲基-1,2,4-***并[4,3-a]吡嗪，由美国默沙东公司(Merck)开发。其磷酸盐一水合物是首次用于II型糖尿病治疗的二肽基肽酶-4(DPP-4)抑制剂药物，具有安全性好、不良反应发生率低等优势。

自西格列汀公开以来，该产品的合成路线和工艺的开发研究近20年来未见间断。原研美国默沙东公司公开了第一条西格列汀的合成路线(参见专利文献CN1524082A)，该路线采用手性源诱导出手性α-氨基酸，随后经多步反应产生β-氨基酸构建西格列汀的手性中心。但反应需用到正丁基锂、重氮甲烷，且反应条件苛刻，难以大规模应用。专利文献CN10219102A、CN102030683A、WO2011049344A2和CN102485718A报道的合成路线也均是引入手性源合成西格列汀，但这些方法因存在副产物多、产物收率低、制备路线长、中间体不稳定、需用剧毒物质、原子经济性较差等问题，都未能实现工业应用。基因里克斯(英国)有限公司于2009年公开了专利WO20100131025A1，报道了一种手性诱导联合动力学拆分的方法合成西格列汀。该方法使用物料廉价且易获得，但是产品收率低导致其缺乏经济性。

目前，工业化生产西格列汀的方法有两种，为原研默沙东及其合作公司科德克希思公司开发。专利文献WO2004085378A1公开了一种不对称还原的方法合成西格列汀，其关键步骤是采用手性铑催化剂对烯胺进行不对称氢化来构建手性中心，具有路线简洁、步骤较少、转化率和光学纯度高等优点。另一条产业化路线是以Arthrobacter sp.(节杆菌)(R)-ω-转氨酶为研究对象，结合蛋白质结构计算机辅助设计、定点饱和突变以及全基因随机突变等策略，最终获得了能高效催化西格列汀前体酮合成西格列汀的新型转氨酶(Christopher K.Savile et al.Science 329,305(2010)，专利文献CN102405281A)。相比于化学合成法，利用酶法转化策略可使产物得率提高10～13％，生产效率提高53％，总废弃物排放减少19％，并且反应过程无需添加重金属。目前，生物酶法成为合成手性医药化学品或化学中间体的优选方案。

CN1832949A保护的西格列汀磷酸盐专利将于2024年到期，目前，急需开发一种国产化生物酶法合成西格列汀路线。

发明内容

发明人将酶法合成西格列汀路线的研究重点集中在转氨酶的改良方面。通过提高转氨酶催化西格列汀前体酮(化合物III)合成西格列汀(化合物IV)的酶活力和/或酶的立体选择性和/或酶对底物产物的耐受性，从而改进酶法合成西格列汀路线的经济性。

为此，发明人对于转氨酶的微生物来源进行了广泛筛选，并将节杆菌Arthrobacter sp.KNK168来源的转氨酶作为考察和改造对象，利用生物信息学手段，构建了计算机模拟的蛋白3D模型。经过对众多位点进行筛选，构建出一种酶活力显著提高的转氨酶，能够高效地催化西格列汀前体酮((2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]***并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮)发生转氨基反应，得到高光学纯度的西格列汀。具体地，本发明包含如下技术方案：

一种转氨酶突变体，其为节杆菌(Arthrobacter sp.KNK168)来源的野生型转氨酶氨基酸序列SEQ ID NO:1中下述位点的五个以上、优选十个以上、直至四十六个发生突变后所形成的突变体：F3、S8、E9、I10、V11、T22、Y23、D25、L28、D29、P30、A31、P33、I55、Y60、L61、H62、V65、V69、H71、N74、F88、I96、F122、S124、S126、I127、Y131、G136、K142、Y150、W156、D165、V199、H203、A209、L211、G215、S223、T268、E271、L273、T282、A284、S321、S323，该转氨酶突变体可用于将西格列汀前体酮转化为西格列汀。

上述的术语“突变”包括但不限于氨基酸的取代、缺失或添加。

优选地，上述突变选自下组：F3K、S8P、E9S、I10N、V11M、T22K、Y23F、D25E、L28G、D29S、P30A、A31D、P33N、I55V、Y60F、L61Y、H62T、V65A、V69T、H71S、N74H、F88Y、I96L、F122M、S124T、S126T、I127F、Y131L、G136F、K142N、Y150T、W156T、D165N、V199I、H203N、A209L、L211V、G215C、S223P、T268S、E271D、L273Y、T282S、A284G、S321P、S323Q。

在一种优选的实施方式中，上述转氨酶突变体为SEQ ID NO:1的(F3K、S8P、E9S、I10N、V11M、T22K、Y23F、D25E、L28G、D29S、P30A、A31D、P33N、I55V、Y60F、L61Y、H62T、V65A、V69T、H71S、N74H、F88Y、I96L、F122M、S124T、S126T、I127F、Y131L、G136F、K142N、Y150T、W156T、D165N、V199I、H203N、A209L、L211V、G215C、S223P、T268S、E271D、L273Y、T282S、A284G、S321P、S323Q)突变体，相对于SEQ ID NO:1而言，发生了46个位点的氨基酸替换，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3：

MAKSADTPSNMYTHDTGLDYIKFSEYEGSADNNLAGGAAWIEGAFVPPSEARISVFDQGFYTSDATYTTFSVWHGNAFRLDDHIERLYSNAESMRLIPPLTQDEVKEIALELVAKTELREAMVTVTFTRGLSSTPFERDITNHRPQVYMTAVPYQTIVPFDRIRNGVHAMVAQSVRRTPRSSIDPQVKNFQWGDLIRAIQETNDRGFELPVLLDCDGLLAEGPGFNVVVIKDGVVRSPGRAALPGITRKTVLEIAESLGHEAILADISLADLYDADEVLGCSTGGGVWPFVSVDGNPISDGVPGPVTQSIIRRYWELNVEPSQLLTPVQY(SEQ ID NO:3)。

本发明的第二个方面提供了一种编码上述转氨酶突变体的基因。

优选地，编码转氨酶突变体SEQ ID NO:3的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

本发明的第三个方面提供了一种包含上述基因例如SEQ ID NO:4的质粒。该质粒包含用于表达上述基因例如SEQ ID NO:4的载体，优选载体是PET系列，比如载体是pET22b、pET24a、pET28a等，但并不受限于此。

本发明的第四个方面提供了一种用于表达上述转氨酶突变体的微生物。例如，该微生物是转化了上述质粒的转化子。

上述微生物可以选自大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

本发明的第五个方面提供了上述转氨酶突变体或者上述微生物在生产西格列汀中的用途。

具体地，在生产西格列汀中，以西格列汀前体酮((2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]***并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮)为底物原料，用上述转氨酶突变体或者微生物作为催化剂来催化2-位氨基化反应，得到西格列汀。

优选地，上述反应体系中包含磷酸吡哆醛作为辅酶。

上述反应体系中还可以包含邻苯二甲胺二盐酸、或者异丙胺和/或三乙醇胺作为氨基供体。

由于上述转氨酶突变体的热稳定性高，催化生产西格列汀时的酶反应温度可以为40-50℃，优选45℃左右。

反应体系pH值为8.0-9.0，优选8.5。

为了加快反应速度，可以在反应体系中加入有机溶剂作为底物的助溶剂，例如采用DMSO助溶。反应体系中DMSO浓度可以为10％-60％，优选60％。

进一步地，底物浓度可以为20-120g/L，优选100g/L左右。

本发明通过56轮突变筛选出的转氨酶突变体SEQ ID NO:3立体选择性高，相较野生型转氨酶SEQ ID NO:1的酶活力提高明显，催化合成的西格列汀(化合物IV)产物e.e.值高达99.95％以上，具有工业化应用的可行性。

附图说明

图1是实施例中HPLC检测西格列汀和西格列汀前体酮的保留时间的HPLC图。

具体实施方式

为了筛选酶活力高、能够高立体选择性地催化维生素西格列汀前体酮((2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]***并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮)生成西格列汀的转氨酶，发明人通过文献检索以及数据库检索分析，针对大量的微生物来源进行了筛选，选出了节杆菌Arthrobacter sp.KNK168(参见Microbialsynthesis of chiral amines by(R)-specific transamination with Arthrobactersp.KNK168.A.Iwasaki,et al.,Applied microbiology and biotechnology.2006,v.69,no.5,p499-505.DOI:10.1007/s00253-005-0002-1.A novel transaminase,(R)-amine:pyruvate aminotransferase,from Arthrobacter sp.KNK168(FERM BP-5228):purification,characterization,and gene cloning.A.Iwasaki,et al.,Appliedmicrobiology and biotechnology.2012,v.93,no.4,p1563-1573.)来源的野生型转氨酶，其氨基酸序列为SEQ ID NO:1：

MAFSADTSEIVYTHDTGLDYITYSDYELDPANPLAGGAAWIEGAFVPPSEARISIFDQGYLHSDVTYTVFHVWNGNAFRLDDHIERLFSNAESMRIIPPLTQDEVKEIALELVAKTELREAFVSVSITRGYSSTPGERDITKHRPQVYMYAVPYQWIVPFDRIRDGVHAMVAQSVRRTPRSSIDPQVKNFQWGDLIRAVQETHDRGFEAPLLLDGDGLLAEGSGFNVVVIKDGVVRSPGRAALPGITRKTVLEIAESLGHEAILADITLAELLDADEVLGCTTAGGVWPFVSVDGNPISDGVPGPVTQSIIRRYWELNVESSSLLTPVQY(SEQ ID NO:1)。

在本文中，术语“野生型”、“野生酶”、“野生型酶”表示相同的意义，都是指氨基酸序列为SEQ ID NO:1的转氨酶。有时为了表述方便起见，在本文中可以将野生型转氨酶与其突变体比如SEQ ID NO:3等统称为“转氨酶”。

本发明的转氨酶突变体SEQ ID NO:3的氨基酸数量有330个，且结构明确，因此本领域技术人员很容易获得其编码基因、包含这些基因的表达盒和质粒、以及包含该质粒的转化体。这些基因、表达盒、质粒、转化体可以通过本领域技术人员所熟知的基因工程构建方式获得。

为了在基因工程中最常用的大肠杆菌中最佳地表达转氨酶，可以对这些酶的表达基因进行了密码子优化。密码子优化是可用于通过增加感兴趣基因的翻译效率使生物体中蛋白质表达最大化的一种技术。不同的生物体由于突变倾向和天然选择而通常示出对于编码相同氨基酸的一些密码子之一的特殊偏好性。例如，在生长快速的微生物如大肠杆菌中，优化密码子反映出其各自的基因组tRNA库的组成。因此，在生长快速的微生物中，氨基酸的低频率密码子可以用用于相同氨基酸的但高频率的密码子置换。因此，优化的DNA序列的表达在快速生长的微生物中得以改良。

例如，为了在大肠杆菌中表达转氨酶，经密码子优化的野生转氨酶SEQ ID NO:1的编码基因可以是SEQ ID NO:2；转氨酶突变体SEQ ID NO:3的编码基因可以是SEQ ID NO:4。

上述转化体宿主可以使任何适合表达转氨酶的微生物，包括细菌和真菌。优选微生物是枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母、或者大肠杆菌，优选大肠杆菌，更优选大肠杆菌BL21(DE3)。

当作为生物催化剂用于生产西格列汀时，本发明的转氨酶可以呈现酶的形式或者菌体的形式。所述酶的形式包括游离酶、固定化酶，包括纯化酶、粗酶、发酵液、载体固定的酶等；所述菌体的形式包括存活菌体、死亡菌体、固定化菌体等。

当微生物比如枯草芽孢杆菌、毕赤酵母、酿酒酵母或者大肠杆菌不再进行发酵增殖、而是用于酶催化反应时，本身就是一种天然的固定化酶，而且不需要进行破碎处理、甚至提取纯化处理，就可以作为一种酶制剂用于催化反应。由于反应底物和反应产物都是小分子化合物，可以很方便地穿过菌体的生物屏障--细胞膜，因此不需要对菌体进行破碎处理，这在经济方面是有利的。

以下结合具体实施例对本发明做进一步详细说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。

实施例

本文中涉及到多种物质的添加量、含量及浓度，其中所述的百分含量，除特别说明外，皆指质量百分含量。

材料和方法

实施例中的全基因合成、引物合成及测序皆由苏州金唯智生物科技有限公司完成。

实施例中的分子生物学实验包括质粒构建、酶切、连接、感受态细胞制备、转化、培养基配制等等，主要参照《分子克隆实验指南》(第三版)，J.萨姆布鲁克，D.W.拉塞尔(美)编著，黄培堂等译，科学出版社，北京，2002)进行。必要时可以通过简单试验确定具体实验条件。

PCR扩增实验根据质粒或DNA模板供应商提供的反应条件或试剂盒说明书进行。必要时可以通过简单试验予以调整。

LB培养基：10g/L胰蛋白胨，5g/L酵母提取物，10g/L氯化钠，pH7.2。(LB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

TB培养基：24g/L酵母提取物、12g/L胰蛋白胨、16.43g/L K₂HPO₄.3H₂O、2.31g/LKH₂PO₄、5g/L甘油，pH7.0-7.5。(TB固体培养基另加20g/L琼脂粉。)

HPLC检测底物和产物色谱条件：色谱柱C18(4.6×250mm，5μm)；流动相A为50mM磷酸二氢钾溶液(pH3.00)，流动相B为乙腈，流动相A：流动相B＝1：1；流速1.0mL/min；检测波长为254nm。

HPLC手性检测色谱条件：色谱柱CHIRALPAK AD-H(4.6×250mm，5μm)；流动相为正己烷：乙醇：三乙胺(40：60：0.1)；流速为0.7mL/min，检测波长为268nm。

需说明的是，为描述方便起见，在实施例中，可将菌株编号、质粒编号、酶编号、酶编码基因编号共用一个编号，这是本领域技术人员容易理解的，即同一个编号在不同环境中可以指代不同的生物形式。

实施例1：野生型转氨酶基因重组大肠杆菌的构建

对于野生酶SEQ ID NO:1，根据大肠杆菌密码子偏好性进行密码子优化，得到编码基因SEQ ID NO:1，委托苏州金唯智生物科技有限公司合成SEQ ID NO:2并克隆到质粒pET28a的NcoI、BamHI位点，获得质粒pET-ATA1。

通过电转化将重组质粒pET-ATA1转化表达宿主大肠杆菌BL21(DE3)，得到表达野生转氨酶的重组大肠杆菌EcATA1。

实施例2：第1轮和第2轮随机突变点文库建立及高通量筛选

2.1易错PCR法构建随机突变点库

以质粒pET-ATA1为模板，利用易错PCR技术构建随机突变体文库。

设计如下引物对ATA-5/ATA-3：

正向引物ATA-5：5’-CTTTAAGAAGGAGATATACCATG-3’，

反向引物ATA-3：5’-GAGCTCGAATTCGGATCCTTA-3’。

以质粒pET-ATA1为模板，进行PCR扩增，获得约1.0kb的转氨酶突变体DNA序列。

50μL易错PCR反应体系包括：10ng质粒(pET-ATA1)模板，50pmol一对引物ATA-5和ATA-3，1×Taq buffer，0.2mM dGTP，0.2mM dATP，1mM dCTP，1mM dTTP，7mM MgCl₂，(0mM、0.05mM、0.1mM、0.15mM、0.2mM)MnCl₂，2.5个单位的Taq酶(Takara)。

PCR反应条件为：95℃5min；94℃30s，55℃30s，72℃2min/kbp，30个循环；72℃10min。

对PCR产物电泳、胶回收(Axygen DNA凝胶回收试剂盒AP-GX-50)。以质粒pET-ATA1为模板，以约1.0kb的上述回收产物(随机突变片段)作为大引物，用KOD-plus DNA聚合酶做MegaPrimer PCR：94℃5min；98℃10s，60℃30s，68℃2min/kb，25个循环；68℃10min。DpnI限制性内切酶(Thermo公司)消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到超过10⁴个克隆的随机突变库。

2.2突变体库的高通量筛选

挑取随机突变库中的单菌落至96孔板(每孔含有110μL的液体LB-Kan培养基)，在37℃、400rpm条件下孵育5h后，从每孔中取出60μL的菌液到96孔深孔板(每孔含有240μL的液体TB-Kan-0.2mM IPTG)，在25℃、400rpm条件下孵育12～16h。在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清培养液。随后，用预冷的生理盐水洗涤菌体，在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清液。每孔加200μL酶反应液(70mM三乙醇胺、70mM邻苯二甲胺二盐酸、0.5g/L磷酸吡哆醛、5g/L化合物III、10％二甲基亚砜(DMSO))，调pH值为8.5进行反应。重悬菌体，在45℃、250rpm条件下孵育1～5h，检测475nm波长数值。

选择活力明显提升的菌株进行核酸测序，确定氨基酸突变位点，同时HPLC检测这些菌种反应产物的ee值，选择产物ee值大于99.95％，且酶活力改善最高的菌株作为下一轮随机突变体库建库的出发菌株。委托苏州金唯智生物科技有限公司对酶活力改善最高的菌株进行基因组测序比对，确定其氨基酸序列改变情况。重复随机突变库建立和以化合物III为底物的高通量反应筛选。筛选结果参见表1。

表1、第1轮到第2轮随机突变库高通量筛选结果

备注：“-”代表没有发生反应；“+”代表相对于出发菌株的反应吸光值的差值大于0小于0.05；“++”代表相对于出发菌株的反应吸光值的差值大于0.05小于0.1；“+++”代表相对于出发菌株的反应吸光值的差值大于0.1小于0.2；“++++”代表相对于出发菌株的反应吸光值的差值大于0.2。

实施例3：第3轮至第14轮随机突变点文库建立及高通量筛选

3.1易错PCR法构建随机突变点库

参照实施例2的方法构建转氨酶随机突变点文库，得到约10⁴个克隆菌株。

3.2基于EcATA5的突变体库的高通量筛选

挑取突变体库的单菌落至96孔板(每孔含有110μL的液体LB-Kan培养基)，在37℃、400rpm条件下孵育5h后，从每孔中取出60μL的菌液到96孔深孔板(每孔含有240μL的液体TB-Kan-0.2mM IPTG)，在25℃、400rpm条件下孵育12～16h。在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清培养液。随后，用预冷的生理盐水洗涤菌体，在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清液。每孔加200μL酶反应液(70mM三乙醇胺、70mM邻苯二甲胺二盐酸、0.5g/L磷酸吡哆醛、10g/L化合物III、10％二甲基亚砜(DMSO)，调pH值为8.5进行反应。重悬菌体，在45℃、250rpm条件下孵育5小时，检测475nm波长数值。

3.3选择活力明显提升的菌株进行核酸测序，确定氨基酸突变位点，同时HPLC检测这些菌种反应产物的ee值，选择产物ee值大于99.95％，且活力改善最高的菌株作为下一轮随机突变体库建库的出发菌株，重复随机突变库建立及以化合物III为底物的高通量反应筛选。筛选结果参见表2。

表2、第3轮到第14轮随机突变库高通量筛选结果

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备注：“-”代表没有发生反应；“+”代表酶活力相对于各自出发菌株提高的百分比大于0％小于等于50％；“++”代表酶活力相对于各自出发菌株提高的百分比大于50％小于等于100％；“+++”代表酶活力相对于各自出发菌株提高的百分比大于100％小于等于200％；“++++”代表酶活力相对于各自出发菌株提高的百分比大于200％。

实施例4：第15轮至第17轮随机突变点文库建立及高通量筛选

1、易错PCR法构建随机突变点库

参照实施例2的方法构建转氨酶随机突变点文库。

2、基于EcATA30的突变体库的高通量筛选

挑取单菌落至96孔板(每孔含有110μL的液体LB-Kan培养基)，在37℃、400rpm条件下孵育5h后，从每孔中取出60μL的菌液到96孔深孔板(每孔含有240μL的液体TB-Kan-0.2mMIPTG)，在25℃、400rpm条件下孵育12～16h。在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清培养液。随后，用预冷的生理盐水洗涤菌体，在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清液。每孔加200μL酶反应液(70mM三乙醇胺、70mM邻苯二甲胺二盐酸、0.5g/L磷酸吡哆醛、20g/L化合物III、50％二甲基亚砜(DMSO)，调pH值为8.5进行反应。重悬菌体，在45℃、250rpm条件下孵育5小时，检测475nm波长数值。

3、选择活力明显提升的菌株进行核酸测序，确定氨基酸突变位点，同时HPLC检测这些菌种反应产物的ee值，选择产物ee值大于99.95％，且活力改善最高的菌株作为下一轮随机突变体库建库的出发菌株，重复随机突变库建立及以化合物III为底物的高通量反应筛选。筛选结果参见表3。

表3、第15轮到第17轮随机突变库高通量筛选结果

实施例5：基于EcATA35构建转氨酶定点饱和突变文库及筛选

5.1构建突变体ATA35第3、6、7、9、29、32、151、156、157、158、159、283、285位氨基酸定点饱和突变文库

以质粒pET-ATA35为模板，设计如下表4所示引物对进行环状PCR扩增。

50μLPCR反应体系包括：10ng模板，10pmol的引物对，1xKODplus buffer，0.2mMdNTP，1.5mM MgSO₄，1个单位的KOD-plus DNA聚合酶。

PCR反应条件为：95℃3min；98℃10s，57℃30s，68℃2min/kbp，30个循环；68℃10min。

50μl扩增后PCR，直接加入1μl DpnI限制性内切酶(Thermo公司)消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，得到超过10³个克隆的随机突变库。

表5、定点饱和突变库相关引物列表

备注：其中N代表A/T/C/G。

5.2饱和突变体库的高通量筛选

挑取单菌落至96孔板(每孔含有110μL的液体LB-Kan培养基)，在37℃、400rpm条件下孵育5h后，从每孔中取出60μL的菌液到96孔深孔板(每孔含有240μL的液体TB-Kan-0.2mMIPTG)，在25℃、400rpm条件下孵育12～16h。在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清培养液。随后，用预冷的生理盐水洗涤菌体，在4℃、4000rpm条件下离心10min收集菌体，去除上清液。每孔加200μL酶反应液(100mM三乙醇胺、1M异丙胺、0.5g/L磷酸吡哆醛、50g/L化合物III、50％二甲基亚砜(DMSO)，调pH值为8.5。)重悬菌体，在45℃、250rpm条件下孵育3小时，进行反应，取样HPLC测定产物量，化合物III与化合物IV的出峰时间如图1所示。突变体的酶活和产物的R型光学纯度(e.e.值)如表5所示。

表5、基于EcATA35的单点饱和突变体库高通量筛选结果

备注：酶活定义为在45℃和pH 8.5条件下，每小时催化底物生成1μmoL的R型产物所需酶量定义为一个酶活单位(U)。

从表5中可以看出，菌株EcATA41的酶活相对最高，对其作进一步突变。

实施例6：基于EcATA35构建双位点突变体

以质粒pET-ATA41为模板，设计引物对W156T-5/W156T-3进行PCR扩增获得W156T突变体，PCR产物为约6.3kb装载转氨酶突变体ATA48(ATA41-W156T)的质粒；设计引物对G285V-5/G285V-3进行PCR扩增获得G285V突变体，PCR产物为约6.3kb装载转氨酶突变体ATA49(ATA41-G285V)的质粒。引物序列如表6所示。

50μL PCR反应体系包括：10ng模板，10pmol的引物对，1xKOD plus buffer，0.2mMdNTP，1.5mM MgSO₄，1个单位的KOD-plus DNA聚合酶。

DpnI限制性内切酶(Thermo公司)消化质粒模板，电转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)，获得菌株。

表6、定向突变相关引物列表

实施例7：基于EcATA35的单位点和双位点突变体用于西格列汀的合成

7.1重组蛋白的表达及酶反应体系的配制

挑取基因工程菌单菌落至5mL含有Kan的液体LB培养基中，在37℃、220rpm条件下过夜培养。次日，按照体积浓度为1v/v％的接种量转接至含有100mL液体TB培养基的摇瓶中，37℃、220rpm条件下培养至OD_600nm为0.6～0.8时，加入诱导剂IPTG(终浓度0.2mM)，随后在25℃、220rpm条件下诱导培养15h。在4℃、4000rpm条件下离心收集菌体细胞，去除上清培养液，再用生理盐水洗涤细胞，在4℃、4000rpm条件下离心收集细胞，去除上清液。随后，用pH值为8.5的三乙醇胺-盐酸溶液重悬细胞。摇瓶水平50mL全细胞催化反应，体系包括：100mM三乙醇胺、1M异丙胺、0.5g/L磷酸吡哆醛、50g/L化合物III(酶促反应前溶于DMSO中，分批加入到反应体系中)、60％二甲基亚砜(DMSO)、2g细胞量、pH值为8.5(浓盐酸或异丙胺调pH值)，在45℃、300rpm条件下孵育15h。

7.2酶法不对称合成西格列汀结果

酶反应结束后，在6000rpm条件下离心10min，取上清液。用浓盐酸上清液调pH至2～3，另取1M HCL 50mL加入至上步沉淀中，搅拌5min，离心收集上清，合并两次上清液，45℃搅拌循环加热维持1h，然后冷却至室温。加入25ml异丙醇(IPA)，搅拌均匀，再加入25mL乙酸异丙酯(IPAc)，搅拌均匀后用10M的NaOH调节pH至11，然后再搅拌5min。溶液加入50mL体积比为80：20的IPAc/IPA混合液，室温搅拌5min，在6000rpm条件下离心10min，取上层液体。向上层液体中加入30mL饱和食盐水，室温搅拌5min，6000rpm条件下离心10min，稀释合适的浓度用HPLC检测，结果如表7所示。

表7、基于EcATA35的单位点和双位点突变体的酶活

从表7中可以看出，菌株EcATA48的酶活相对最高，对其作进一步突变。

实施例8：基于EcATA48构建单位点、双位点、三位点突变体

以质粒pET-ATA48为模板，设计引物对F3K-5/F3K-3进行PCR扩增获得F3K突变体，PCR产物为约6.3kb装载转氨酶突变体ATA50(ATA48-F3K)的质粒；设计引物对E9S-5/E9S-3进行PCR扩增获得E9S突变体，PCR产物为约6.3kb装载转氨酶突变体ATA51(ATA48-E9S)的质粒；设计引物对G285V-5/G285V-3进行PCR扩增获得G285V突变体，PCR产物为约6.3kb装载转氨酶突变体ATA52(ATA48-G285V)的质粒。以质粒pET-ATA52为模板，设计引物对F3K-5/F3K-3进行PCR扩增获得F3K突变体，PCR产物为约6.3kb装载转氨酶突变体ATA53(ATA52-F3K)的质粒；设计引物对E9S-5/E9S-3进行PCR扩增获得E9S突变体，PCR产物为约6.3kb装载转氨酶突变体ATA54(ATA52-E9S)的质粒。以质粒pET-ATA50为模板，设计引物对E9S-52/E9S-32进行PCR扩增获得E9S突变体，PCR产物为约6.3kb装载转氨酶突变体ATA55(ATA50-E9S)的质粒以质粒pET-ATA55为模板，设计引物对G285V-5/G285V-3进行PCR扩增获得G285V突变体，PCR产物为约6.3kb装载转氨酶突变体ATA56(ATA55-G285V)的质粒。引物序列如表8所示。

表8、定向突变相关引物列表

/>

实施例9：基于EcATA48单位点、双位点、三位点突变体用于西格列汀的合成

参照实施例7进行重组蛋白的表达以及酶反应体系的配制，进行反应，结果如表9所示。

表9、基于EcATA48的单位点和双位点突变体的酶活

菌种编号	转氨酶编号	突变位点	酶活(U)	e.e.值
					EcATA48	ATA48	/	191.29	>99.95％
EcATA50	ATA50	F3K	204.68	>99.95％
					EcATA51	ATA51	E9S	200.85	>99.95％
EcATA52	ATA52	G285V	187.46	>99.95％
					EcATA53	ATA53	G285V、F3K	195.12	>99.95％
EcATA54	ATA54	G285V、E9S	198.94	>99.95％
					EcATA55	ATA55	F3K、E9S	216.16	>99.95％
EcATA56	ATA56	F3K、E9S、G285V	202.77	>99.95％

从表7中可以看出，菌株EcATA55的酶活相对最高。转氨酶突变体ATA55的氨基酸序列为SEQ ID NO:3，对应的密码子优化的编码基因的核酸序列为SEQ ID NO:4。

实施例10：转氨酶突变体ATA55用于西格列汀的合成

在1L反应体系中利用表达转氨酶突变体SEQ ID NO:3的EcATA55全细胞催化西格列汀前体酮不对称合成西格列汀。总反应体系包括100mM三乙醇胺、1M异丙胺、0.5g/L磷酸吡哆醛、100g/L化合物III、25g细胞(湿重)，水相与DMSO体积比为4：6。初始反应体系中含有300mL DMSO，100g化合物III溶于300mL DMSO中，以1mL/min的流速流加到反应体系中。利用盐酸或异丙胺控制反应体系的pH值在8.5左右。反应8-12h结束。

HPLC检测结果显示，反应12h后，产物摩尔生成率超过95％，产物e.e.值大于99.95％。

综上所述，本发明对于野生型转氨酶SEQ ID NO:1先后采用邻苯二甲胺二盐酸和异丙胺为氨基供体经过多轮的突变，筛选得到的转氨酶突变体SEQ ID NO:3的相比野生酶有了大幅度提高。催化西格列汀前体酮反应的转化率高，合成的西格列汀光学活性高，e.e.值高达99.95％以上，已经具备工业化应用的可行性。

序列表

<110> 上海邦林生物科技有限公司

<120> 一种用于合成西格列汀的转氨酶突变体

<130> SHPI2110376

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 330

<212> PRT

<213> Arthrobacter sp. KNK168

<400> 1

Met Ala Phe Ser Ala Asp Thr Ser Glu Ile Val Tyr Thr His Asp Thr

1 5 10 15

Gly Leu Asp Tyr Ile Thr Tyr Ser Asp Tyr Glu Leu Asp Pro Ala Asn

20 25 30

Pro Leu Ala Gly Gly Ala Ala Trp Ile Glu Gly Ala Phe Val Pro Pro

35 40 45

Ser Glu Ala Arg Ile Ser Ile Phe Asp Gln Gly Tyr Leu His Ser Asp

50 55 60

Val Thr Tyr Thr Val Phe His Val Trp Asn Gly Asn Ala Phe Arg Leu

65 70 75 80

Asp Asp His Ile Glu Arg Leu Phe Ser Asn Ala Glu Ser Met Arg Ile

85 90 95

Ile Pro Pro Leu Thr Gln Asp Glu Val Lys Glu Ile Ala Leu Glu Leu

100 105 110

Val Ala Lys Thr Glu Leu Arg Glu Ala Phe Val Ser Val Ser Ile Thr

115 120 125

Arg Gly Tyr Ser Ser Thr Pro Gly Glu Arg Asp Ile Thr Lys His Arg

130 135 140

Pro Gln Val Tyr Met Tyr Ala Val Pro Tyr Gln Trp Ile Val Pro Phe

145 150 155 160

Asp Arg Ile Arg Asp Gly Val His Ala Met Val Ala Gln Ser Val Arg

165 170 175

Arg Thr Pro Arg Ser Ser Ile Asp Pro Gln Val Lys Asn Phe Gln Trp

180 185 190

Gly Asp Leu Ile Arg Ala Val Gln Glu Thr His Asp Arg Gly Phe Glu

195 200 205

Ala Pro Leu Leu Leu Asp Gly Asp Gly Leu Leu Ala Glu Gly Ser Gly

210 215 220

Phe Asn Val Val Val Ile Lys Asp Gly Val Val Arg Ser Pro Gly Arg

225 230 235 240

Ala Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys Thr Val Leu Glu Ile Ala Glu

245 250 255

Ser Leu Gly His Glu Ala Ile Leu Ala Asp Ile Thr Leu Ala Glu Leu

260 265 270

Leu Asp Ala Asp Glu Val Leu Gly Cys Thr Thr Ala Gly Gly Val Trp

275 280 285

Pro Phe Val Ser Val Asp Gly Asn Pro Ile Ser Asp Gly Val Pro Gly

290 295 300

Pro Val Thr Gln Ser Ile Ile Arg Arg Tyr Trp Glu Leu Asn Val Glu

305 310 315 320

Ser Ser Ser Leu Leu Thr Pro Val Gln Tyr

325 330

<210> 2

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 2

atggcgttta gcgcggatac gtctgaaatt gtgtataccc atgataccgg cctggattat 60

attacatata gcgattatga attagatccg gccaaccctc tggcgggcgg cgcggcgtgg 120

attgaaggcg cgtttgtgcc gccgagcgaa gcgcgcatta gcatttttga tcaaggctat 180

ctgcatagcg atgtgaccta taccgtgttt catgtgtgga acggcaacgc gtttcgcctg 240

gatgatcata ttgaacgcct gtttagcaac gcggaaagta tgcgcattat tccgccgctg 300

acccaagatg aagtgaaaga aattgcgctg gaactggtgg cgaaaaccga actgcgcgaa 360

gcgtttgtga gtgtgagtat cacccgcggc tatagcagca ccccgggcga acgcgatatt 420

accaaacatc gcccgcaagt gtatatgtat gcggtgccgt atcagtggat tgtgccgttt 480

gatcgcattc gcgatggcgt tcatgcgatg gtggcgcaga gcgtgcgccg caccccgcgc 540

agcagcattg atccgcaagt gaaaaacttt cagtggggcg atctgattcg cgcggtacaa 600

gaaacccatg atcgcggctt tgaagcgccg ctgttactgg atggcgatgg cctgctggcg 660

gaaggctcag gctttaacgt ggttgtgatt aaagatggcg tggtgcgcag cccgggccgc 720

gcggcgctgc cgggcattac ccgcaaaacc gtgctggaaa ttgcggaaag cctgggccat 780

gaagcgattc tggcggatat taccctggcg gaactgctgg atgcggatga agtgctgggc 840

tgcaccaccg cgggcggcgt gtggccattc gtgagcgtgg atggtaaccc gattagcgat 900

ggtgtgccgg gtccggtgac gcagagcatt attcgccgct attgggaact gaacgtggaa 960

tcaagtagcc tgctgacccc ggtgcagtat taa 993

<210> 3

<211> 330

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Met Ala Lys Ser Ala Asp Thr Pro Ser Asn Met Tyr Thr His Asp Thr

1 5 10 15

Gly Leu Asp Tyr Ile Lys Phe Ser Glu Tyr Glu Gly Ser Ala Asp Asn

20 25 30

Asn Leu Ala Gly Gly Ala Ala Trp Ile Glu Gly Ala Phe Val Pro Pro

35 40 45

Ser Glu Ala Arg Ile Ser Val Phe Asp Gln Gly Phe Tyr Thr Ser Asp

50 55 60

Ala Thr Tyr Thr Thr Phe Ser Val Trp His Gly Asn Ala Phe Arg Leu

65 70 75 80

Asp Asp His Ile Glu Arg Leu Tyr Ser Asn Ala Glu Ser Met Arg Leu

85 90 95

Ile Pro Pro Leu Thr Gln Asp Glu Val Lys Glu Ile Ala Leu Glu Leu

100 105 110

Val Ala Lys Thr Glu Leu Arg Glu Ala Met Val Thr Val Thr Phe Thr

115 120 125

Arg Gly Leu Ser Ser Thr Pro Phe Glu Arg Asp Ile Thr Asn His Arg

130 135 140

Pro Gln Val Tyr Met Thr Ala Val Pro Tyr Gln Thr Ile Val Pro Phe

145 150 155 160

Asp Arg Ile Arg Asn Gly Val His Ala Met Val Ala Gln Ser Val Arg

165 170 175

Arg Thr Pro Arg Ser Ser Ile Asp Pro Gln Val Lys Asn Phe Gln Trp

180 185 190

Gly Asp Leu Ile Arg Ala Ile Gln Glu Thr Asn Asp Arg Gly Phe Glu

195 200 205

Leu Pro Val Leu Leu Asp Cys Asp Gly Leu Leu Ala Glu Gly Pro Gly

210 215 220

Phe Asn Val Val Val Ile Lys Asp Gly Val Val Arg Ser Pro Gly Arg

225 230 235 240

Ala Ala Leu Pro Gly Ile Thr Arg Lys Thr Val Leu Glu Ile Ala Glu

245 250 255

Ser Leu Gly His Glu Ala Ile Leu Ala Asp Ile Ser Leu Ala Asp Leu

260 265 270

Tyr Asp Ala Asp Glu Val Leu Gly Cys Ser Thr Gly Gly Gly Val Trp

275 280 285

Pro Phe Val Ser Val Asp Gly Asn Pro Ile Ser Asp Gly Val Pro Gly

290 295 300

Pro Val Thr Gln Ser Ile Ile Arg Arg Tyr Trp Glu Leu Asn Val Glu

305 310 315 320

Pro Ser Gln Leu Leu Thr Pro Val Gln Tyr

325 330

<210> 4

<211> 993

<212> DNA

<213> 人工序列()

<400> 4

atggcgaaga gcgcggatac gccttcgaat atgtataccc atgataccgg cctggattat 60

attaaattta gcgaatatga aggatccgcg gacaacaatc tggcgggcgg cgcggcgtgg 120

attgaaggcg cgtttgtgcc gccgagcgaa gcgcgcatta gcgtttttga tcaaggcttt 180

tatactagcg atgcgaccta taccacgttt tctgtgtggc acggcaacgc gtttcgcctg 240

gatgatcata ttgaacgcct gtatagcaac gcggaaagta tgcgccttat tccgccgctg 300

acccaagatg aagtgaaaga aattgcgctg gaactggtgg cgaaaaccga actgcgcgaa 360

gcgatggtga ctgtgacttt cacccgcggc cttagcagca ccccgttcga acgcgatatt 420

accaaccatc gcccgcaagt gtatatgact gcggtgccgt atcagacgat tgtgccgttt 480

gatcgcattc gcaatggcgt tcatgcgatg gtggcgcaga gcgtgcgccg caccccgcgc 540

agcagcattg atccgcaagt gaaaaacttt cagtggggcg atctgattcg cgcgatacaa 600

gaaaccaatg atcgcggctt tgaactgccg gtgttactgg attgcgatgg cctgctggcg 660

gaaggcccag gctttaacgt ggttgtgatt aaagatggcg tggtgcgcag cccgggccgc 720

gcggcgctgc cgggcattac ccgcaaaacc gtgctggaaa ttgcggaaag cctgggccat 780

gaagcgattc tggcggatat ttccctggcg gatctgtacg atgcggatga agtgctgggc 840

tgctccaccg ggggcggcgt gtggccattc gtgagcgtgg atggtaaccc gattagcgat 900

ggtgtgccgg gtccggtgac gcagagcatt attcgccgct attgggaact gaacgtggaa 960

ccaagtcaac tgctgacccc ggtgcagtat taa 993

Claims

1.一种转氨酶突变体，其为节杆菌(Arthrobacter sp.KNK168)来源的野生型转氨酶氨基酸序列SEQ ID NO:1中下述位点的五个以上发生突变后所形成的突变体：F3、S8、E9、I10、V11、T22、Y23、D25、L28、D29、P30、A31、P33、I55、Y60、L61、H62、V65、V69、H71、N74、F88、I96、F122、S124、S126、I127、Y131、G136、K142、Y150、W156、D165、V199、H203、A209、L211、G215、S223、T268、E271、L273、T282、A284、S321、S323，该转氨酶突变体可将西格列汀前体酮(2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]***并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮转化为西格列汀。

2.如权利要求1所述的转氨酶突变体，其特征在于，所述突变选自下组：F3K、S8P、E9S、I10N、V11M、T22K、Y23F、D25E、L28G、D29S、P30A、A31D、P33N、I55V、Y60F、L61Y、H62T、V65A、V69T、H71S、N74H、F88Y、I96L、F122M、S124T、S126T、I127F、Y131L、G136F、K142N、Y150T、W156T、D165N、V199I、H203N、A209L、L211V、G215C、S223P、T268S、E271D、L273Y、T282S、A284G、S321P、S323Q。

3.如权利要求2所述的转氨酶突变体，其特征在于，其氨基酸序列为SEQ ID NO:3，其为SEQ ID NO:1的(F3K、S8P、E9S、I10N、V11M、T22K、Y23F、D25E、L28G、D29S、P30A、A31D、P33N、I55V、Y60F、L61Y、H62T、V65A、V69T、H71S、N74H、F88Y、I96L、F122M、S124T、S126T、I127F、Y131L、G136F、K142N、Y150T、W156T、D165N、V199I、H203N、A209L、L211V、G215C、S223P、T268S、E271D、L273Y、T282S、A284G、S321P、S323Q)突变体。

4.编码如权利要求3所述转氨酶突变体的基因。

5.如权利要求4所述的基因，其特征在于，编码转氨酶突变体SEQ ID NO:3的基因的核苷酸序列为SEQ ID NO:4。

6.一种用于表达如权利要求3所述转氨酶突变体的微生物。

7.如权利要求1-3中任一项所述转氨酶突变体或者如权利要求6所述微生物在生产西格列汀中的用途。

8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，以(2Z)-4-氧代-4-[3-(三氟甲基)-5,6-二氢-[1,2,4]***并[4,3-a]吡嗪-7-(8H)-基]-1-(2,4,5-三氟苯基)丁-2-酮为反应底物，采用如权利要求1-3中任一项所述转氨酶突变体或者如权利要求6所述微生物催化氨基转移反应，得到西格列汀。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，反应体系中包含磷酸吡哆醛作为辅酶。

10.如权利要求9所述的用途，其特征在于，反应体系中还包含邻苯二甲胺二盐酸、或者异丙胺和/或三乙醇胺作为氨基供体。