CN115867571A

CN115867571A - 高唾液酸化免疫球蛋白

Info

Publication number: CN115867571A
Application number: CN202180036166.7A
Authority: CN
Inventors: J·谢克
Original assignee: Momenta Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Momenta Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2020-05-19
Filing date: 2021-05-19
Publication date: 2023-03-28
Also published as: WO2021236765A1; MX2022014525A; CA3182136A1; BR112022023334A2; US20230192814A1; AU2021275115A1; KR20230012576A; JP2023526421A; CO2022016670A2; EP4153622A1

Abstract

本发明描述了用于制备高唾液酸化IgG的方法。

Description

高唾液酸化免疫球蛋白

优先权要求

本申请要求2020年5月19日提交的美国临时申请序列号63/026,826和2020年11月2日提交的美国临时申请序列号63/108,741的权益。上述临时申请的全部内容以引用方式并入本文。

技术领域

本公开涉及用于制备高唾液酸化IgG的方法。

背景技术

由人供体的混合血浆(例如，来自至少1,000个供体的混合血浆)制备的静脉内免疫球蛋白(IVIg)用于治疗各种炎性疾病。然而，IVIg制剂具有不同的限制，诸如功效可变、临床风险、高成本和供给有限。不同的IVIg制剂在临床上经常被当作可互换的产品，但众所周知，存在产品制剂的显著差异，这可影响在所选临床应用中的耐受性和活性。在当前的最大给药方案中，在许多情况下仅获得部分且不持续性的响应。此外，与高体积IVIg治疗相关联的长输注时间(4小时至6小时)会消耗输注中心的大量资源，并且不利地影响患者报告的结果，诸如生活的便利性和质量。

对Fc结构域唾液酸化的重要抗炎作用的鉴定已经呈现出开发更有效的免疫球蛋白疗法的机会。可商购获得的IVIg制剂通常在所存在的抗体的Fc结构域上表现出低水平的唾液酸化。具体地讲，它们在Fc区上表现出支链聚糖的低水平二唾液酸化。

Washburn等人(Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 112:E1297–E1306(2015))描述了一种受控的唾液酸化工艺，其用于生成高度四-Fc-唾液酸化的IVIg，并且示出该工艺得到具有一致增强的抗炎活性的产物。

发明内容

由ST6Ga1使用CMP-NANA作为底物驱动的唾液酸化反应具有对反应进行改善的特性，无论是通过二唾液酸化的总体水平，达到二唾液酸化的特定水平的时间，还是通过达到二唾液酸化的特定总体水平所需的酶和底物的量来评估，都具有挑战性。例如：(a)CMP-NANA是不完全稳定的并且即使在不存在任何酶的情况下也将自发地水解；(b)ST6Gal1被认为催化CMP-NANA的水解，但不有效加成到支链聚糖上的Gal；(c)胞苷单磷酸(CMP)(通过酶促加成或CMP-NANA水解产生的副产物)可充当ST6Gal1的竞争性抑制剂；(d)已经观察到CMP催化逆酶促反应以从新形成的聚糖中去除NeuAc。因此，随着时间的推移，副产物的水平将增加并且这可能导致期望的唾液酸化反应减慢或甚至逆转。

本公开至少部分地基于以下发现：例如，当与MOPS作为缓冲液相比时，在BIS-TRIS作为缓冲液的情况下，该逆反应要差得多。

因此，本文描述了制备高唾液酸化IgG(hsIgG)的方法，该方法包括：(a)提供混合IgG抗体；(b)将混合IgG抗体在包含β1,4-半乳糖基转移酶(B4GalT)或其酶活性部分、UDP-Gal或其盐、双(2-羟乙基)氨基三(羟甲基)甲烷(BIS-TRIS)缓冲液和MnCl₂的反应混合物中温育，从而制备半乳糖基化IgG抗体；以及(c)将半乳糖基化IgG抗体在包含ST6Gal或其酶活性部分、CMP-NANA或其盐、双(2-羟乙基)氨基三(羟甲基)甲烷(BIS-TRIS)缓冲液和MnCl₂的反应混合物中温育，从而制备hsIgG。

本文还描述了制备高唾液酸化IgG(hsIgG)的方法，该方法包括：(a)提供混合IgG抗体；(b)将混合IgG抗体在包含β1,4-半乳糖基转移酶(B4GalT)或其酶活性部分、UDP-Gal或其盐、ST6Gal或其酶活性部分、CMP-NANA或其盐、双(2-羟乙基)氨基三(羟甲基)甲烷(BIS-TRIS)缓冲液和MnCl₂的反应混合物中温育，从而形成hsIgG制剂。

本文还描述了制备高唾液酸化IgG(hsIgG)的方法，该方法包括：(a)提供混合IgG抗体；(b)将混合IgG抗体在包含β1,4-半乳糖基转移酶(B4GalT)或其酶活性部分、UDP-Gal或其盐、双(2-羟乙基)氨基三(羟甲基)甲烷(BIS-TRIS)缓冲液和MnCl₂的半乳糖基化反应混合物中温育，从而制备半乳糖基化IgG抗体；(c)将ST6Gal或其酶活性部分和CMP-NANA或其盐添加到所述半乳糖基化反应混合物中以制备唾液酸化反应混合物；以及(d)温育唾液酸化反应混合物，从而制备hsIgG

在一些实施方案中，B4GalT或其酶活性部分与SEQ ID NO:13具有至少85％同一性。

在一些实施方案中，ST6Gal或其酶活性部分包含与SEQ ID NO:19具有至少90％同一性的氨基酸序列。

在一些实施方案中，总温育时间小于72小时。

在一些实施方案中，包含ST6Gal或其酶活性部分的反应混合物的温育时间小于40小时。

在一些实施方案中，反应混合物中的每一种各自独立地包含约10mM至约500mM和约pH 5.5至约pH 8.5的BIS-TRIS。

在一些实施方案中，反应混合物各自独立地包含约50mM和约pH 7.3的BIS-TRIS缓冲液。

在一些实施方案中，混合IgG抗体以组合物形式提供，该组合物还包含约pH 7.2的BIS-TRIS缓冲液。

在一些实施方案中，反应混合物中的每一种各自独立地包含约1mM至约20mM的MnCl₂。

在一些实施方案中，反应混合物中的每一种各自独立地包含约4.5mM至约5.5mM的MnCl₂。

在一些实施方案中，反应混合物包含每克混合IgG抗体约0.038至约0.046UDP-Gal或其盐。

在一些实施方案中，反应混合物包含每克混合IgG抗体约0.1425至约0.1575CMP-NANA或其盐。

在一些实施方案中，在温育期间用附加的CMP-NANA或其盐补充包含CMP-NANA的反应混合物。

在一些实施方案中，添加到包含CMP-NANA的反应混合物的CMP-NANA或其盐的总量为约0.1425至约0.1575。

在一些实施方案中，以少于7份将CMP-NANA的总量添加到该唾液酸化反应混合物中。

在一些实施方案中，包含B4GalT或其酶活性部分的反应混合物包含每克混合IgG约7.2U至约8.8U B4GalT或其酶活性部分。

在一些实施方案中，包含ST6Gal1或其酶活性部分的反应混合物包含每克混合IgG约17.1U至约18.9U ST6Gal1或其酶活性部分。

在一些实施方案中，温育在约20℃至约50℃下进行。

在一些实施方案中，温育在约37℃下进行。

在一些实施方案中，IgG抗体包含从至少1000个供体中分离的IgG抗体。

在一些实施方案中，IgG抗体的至少50重量/重量％、55重量/重量％、60重量/重量％、65重量/重量％或70重量/重量％为IgG1抗体。

在一些实施方案中，供体受试者的至少90％已经暴露于病毒。

在一些实施方案中，hsIgG上的支链聚糖的约60％、65％、70％、75％、80％或85％在α1,3分支和α1,6分支两者上具有唾液酸。

在一些实施方案中，hsIgG上的支链Fc聚糖的约60％、65％、70％、75％、80％或85％在α1,3分支和α1,6分支两者上具有唾液酸。

在一些实施方案中，hsIgG的Fab结构域上的支链聚糖的至少60％、65％、70％、75％、80％或85％在α1,3臂和α1,6臂两者上具有通过NeuAc-α2,6-Gal末端键连接的唾液酸。

在一些实施方案中，hsIgG上的支链Fc聚糖的至少80％在α1,3分支和α1,6分支两者上具有唾液酸。

在一些实施方案中，hsIgG的Fab结构域上的支链聚糖的至少60％、65％、70％在α1,3臂和α1,6臂两者上具有通过NeuAc-α2,6-Gal末端键连接的唾液酸。

在一些实施方案中，hsIgG上的支链Fc聚糖的至少85％在α1,3分支和α1,6分支两者上具有唾液酸。

在一些实施方案中，hsIgG上的支链Fc聚糖的至少90％在α1,3分支和α1,6分支两者上具有唾液酸。

本文还描述了用于制备免疫球蛋白G(IgG)的方法，该免疫球蛋白G具有非常高的Fc唾液酸化水平，具体地二唾液酸化水平(Asn297(EU编号)处聚糖的α1,3分支和α1,6分支两者上的唾液酸化)。本文所述的方法可提供高唾液酸化IgG(hsIgG)，其中Fc结构域上支链聚糖的大于70％在两个分支上(即，在α1,3分支和α1,6分支上)均被唾液酸化。HsIgG含有IgG抗体的不同混合物，主要是IgG1抗体的不同混合物。抗体的多样性很高。用于制备hsIgG的免疫球蛋白可以例如从人类混合血浆(例如，来自至少1,000至30,000个供体的混合血浆)获得。免疫球蛋白可以从IVIg获得，包括可商购获得的IVIg。hsIgG在Fc区上的支链聚糖上的唾液酸水平远高于IVIg。这产生在结构和活性两方面不同于IVIg的组合物。HsIgG可如WO2014/179601或Washburn等人(Proceedings of the National Academy of Sciences,USA 112:E1297–E1306(2015))中所述制备，上述文献均以引用方式并入本文。

本文描述了用于制备hsIgG的改进方法。

本文描述了一种制备高唾液酸化(hsIgG)的方法，所述方法包括：(a)提供IgG抗体的混合物；(b)将IgG抗体的混合物在包含β1,4-半乳糖基转移酶I(B4galt)和UDP-Gal的反应混合物中温育以制备半乳糖基化IgG抗体；(c)将半乳糖基化IgG抗体在包含ST6Gal1和CMP-NANA的反应混合物中温育，其中半乳糖基化反应混合物和唾液酸化反应混合物包含双(2-羟乙基)氨基三(羟甲基)甲烷(BIS-TRIS)缓冲液，由此形成hsIgG制剂。

还描述了一种制备高唾液酸化(hsIgG)的方法，该方法包括：(a)提供IgG抗体的混合物；(b)将IgG抗体的混合物在包含β1,4-半乳糖基转移酶I(B4GalT)、UDP-Gal、ST6Gal1和CMP-NANA的反应混合物中，在双(2-羟乙基)氨基三(羟甲基)甲烷(BIS-TRIS)缓冲液中，温育至少24小时，从而形成hsIgG制剂。

在各种实施方案中，B4GalT与SEQ ID NO:13具有至少85％同一性；ST6Gal1包含与SEQ ID NO:19具有至少90％同一性的氨基酸序列；步骤(b)进行至少8小时、12小时、18小时、24小时、30小时或40小时；步骤(c)进行至少8小时、12小时、18小时、24小时、30小时或40小时；步骤(c)包括将ST6Gal1和CMP-NANA添加到步骤(a)的反应混合物中；反应以10-500mM在pH 5.5-8.5下于BIS-TRIS中进行；反应混合物包含1-20mM的MnCl₂；该UDP-Gal以5μMUDP-Gal/g IgG抗体存在；CMP-NANA以5μM CMP-NANA/g IgG抗体存在；该温育在20℃-50℃下进行；该温育在30℃-45℃下进行；IgG抗体包含从至少1000个供体中分离的IgG抗体；IgG抗体的至少50重量/重量％、55重量/重量％、60重量/重量％、65重量/重量％或70重量/重量％为IgG1抗体；供体受试者的至少90％已经暴露于病毒；hsIgG制剂中的支链聚糖的约60％、65％、70％、75％、80％或85％在α1,3分支和α1,6分支两者上具有唾液酸；hsIgG制剂中的支链Fc聚糖的约60％、65％、70％、75％、80％或85％在α1,3分支和α1,6分支两者上具有唾液酸；Fab结构域上的支链聚糖的至少60％、65％、70％、75％、80％或85％在α1,3臂和α1,6臂两者上具有通过NeuAc-α2,6-Gal末端键连接的唾液酸；Fc结构域上的支链聚糖的至少60％、65％、70％、75％、80％或85％在α1,3臂和α1,6臂两者上具有通过NeuAc-α2,6-Gal末端键连接的唾液酸；在步骤(a)中温育12小时-30小时；并且在步骤(a)中温育20小时-40小时。

在高唾液酸化IgG中，Fc区上的支链聚糖的至少60％(例如，65％、70％、75％、80％、82％、85％、87％、90％、92％、94％、95％、97％、98％至最多且包括100％)通过NeuAc-α2,6-Gal末端键进行二唾液酸化(即，在α1,3分支和α1,6臂两者上)。在一些实施方案中，Fc区上的支链聚糖的少于50％(例如，少于40％、30％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％)通过NeuAc-α2,6-Gal末端键进行单唾液酸化(即，仅在α1,3分支上或仅在α1,6分支上唾液酸化)。

在一些实施方案中，多肽源自血浆，例如人血浆。在某些实施方案中，多肽绝大多数是IgG多肽(例如，IgG1、IgG2、IgG3或IgG4或它们的混合物)，但是可存在痕量的其它多肽，含有痕量的其它免疫球蛋白亚类。

如本文所用，术语“抗体”是指包括至少一个免疫球蛋白可变区，例如，提供免疫球蛋白可变结构域或免疫球蛋白可变结构域序列的氨基酸序列的多肽。例如，抗体可以包括重(H)链可变区(在本文中缩写为V_H)和轻(L)链可变区(在本文中缩写为V_L)。在另一个示例中，抗体包括两个重(H)链可变区和两个轻(L)链可变区。术语“抗体”涵盖抗体的抗原结合片段(例如，单链抗体、Fab、F(ab')₂、Fd、Fv和dAb片段)以及完整抗体，例如，IgA、IgG、IgE、IgD、IgM类型(以及它们的亚型)的完整免疫球蛋白。免疫球蛋白的轻链可以是κ型或λ型。

如本文所用，术语“恒定区”是指对应于或源自抗体的一个或多个恒定区免疫球蛋白结构域的多肽。恒定区可以包括以下免疫球蛋白结构域中的任何或所有免疫球蛋白结构域：C_H1结构域、铰链区、C_H2结构域、C_H3结构域(源自IgA、IgD、IgG、IgE或IgM)和C_H4结构域(源自IgE或IgM)。

如本文所用，术语“Fc区”是指两个“Fc多肽”的二聚体，每个“Fc多肽”包括除第一恒定区免疫球蛋白结构域之外的抗体恒定区。在一些实施方案中，“Fc区”包括通过一个或多个二硫键、化学接头或肽接头连接的两个Fc多肽。“Fc多肽”是指IgA、IgD和IgG的最后两个恒定区免疫球蛋白结构域，以及IgE和IgM的最后三个恒定区免疫球蛋白结构域，并且还可包括这些结构域的柔性铰链N-末端的部分或全部。对于IgG，“Fc多肽”包含免疫球蛋白结构域Cgamma2(Cγ2)和Cgamma3(Cγ3)以及Cgamma1(Cγ1)与Cγ2之间的铰链的下部。虽然Fc多肽的边界可以变化，但通常将人IgG重链Fc多肽定义为包含从P232开始至其羧基末端的残基，其中根据EU体系进行编号(Edelman等人，Proc.Natl.Acad.USA,63,78-85(1969))。对于IgA，Fc多肽包含免疫球蛋白结构域Calpha2(Cα2)和Calpha3(Cα3)以及Calpha1(Cα1)与Cα2之间的铰链的下部。Fc区可以是合成的、重组的或由天然来源诸如IVIg生成。

如本文所用，“聚糖”是糖，其可以是糖残基的单体或聚合物，诸如至少三种糖，并且可以是直链或支链的。“聚糖”可包括天然糖残基(例如，葡萄糖、N-乙酰葡糖胺、N-乙酰神经氨酸、半乳糖、甘露糖、岩藻糖、己糖、***糖、核糖、木糖等)和/或改性糖(例如，2'-氟核糖、2'-脱氧核糖、磷酸甘露糖、6'磺基N-乙酰葡糖胺等)。术语“聚糖”包括糖残基的均聚物和杂聚物。术语“聚糖”还涵盖糖缀合物(例如多肽、糖脂、蛋白聚糖等)的聚糖组分。该术语还涵盖游离聚糖，包括已从糖缀合物裂解或以其他方式释放的聚糖。

如本文所用，术语“糖蛋白类”是指含有共价连接到一个或多个糖部分(即，聚糖)的肽主链的蛋白质。糖部分可为单糖、二糖、低聚糖和/或多糖的形式。糖部分可包含糖残基的单条非支链，或者可包含一条或多条支链。糖蛋白可包含O连接的糖部分和/或N连接的糖部分。

如本文所用，“IVIg”是从至少1,000个人供体的血浆中提取的混合的多价IgG(包括所有四种IgG亚组)的制剂。IVIg被批准作为免疫缺陷患者的血浆蛋白替代疗法。IVIg Fc聚糖唾液酸化的水平在IVIg制剂之间有所不同，但通常小于20％。二唾液酸化水平通常远低于20％。如本文所用，术语“源自IVIg”是指通过操纵IVIg产生的多肽。例如，从IVIg纯化多肽(例如，富集唾液酸化IgG或经修饰的IgG(例如，酶促唾液酸化的IVIg IgG))。

如本文所用，“Fc多肽的N-糖基化位点”是指聚糖与之N-连接的Fc多肽内的氨基酸残基。在一些实施方案中，Fc区包含Fc多肽的二聚体，并且Fc区包含两个N-糖基化位点，每个Fc多肽上一个。

如本文所用，“支链聚糖的百分比(％)”是指聚糖X相对于所存在的聚糖总摩尔数的摩尔数，其中X表示感兴趣的聚糖。

术语“药物有效量”或“治疗有效量”是指在治疗患有本文所述的疾病或病症的患者有效的量(例如，剂量)。本文还应当理解，“药物有效量”可解释为赋予所需治疗效果的量，以单剂量或任何剂量或途径单独服用或与其他治疗剂组合服用。

“药物制剂”和“药物产品”可包括在含有该制剂或产品以及使用说明的试剂盒中。

“药物制剂”和“药物产品”通常是指其中已经实现最终预定水平的唾液酸化并且不含工艺杂质的组合物。为此，“药物制剂”和“药物产品”基本上不含ST6Gal1和/或唾液酸供体(例如，胞苷5'-单磷酸-N-乙酰神经氨酸)或其副产物(例如，胞苷5'-单磷酸)。

“药物制剂”和“药物产品”通常基本上不含其中产生糖蛋白的细胞的其他组分(例如内质网或细胞质蛋白和RNA，如果是重组的话)。

所谓“纯化的”(或“分离的”)是指多核苷酸或多肽从存在于其天然环境中的其他组分中去除或分离。例如，分离的多肽是与产生其的细胞的其他组分(例如，内质网或细胞质蛋白和RNA)分离的多肽。分离的多核苷酸是与其他核组分(例如，组蛋白)和/或与上游或下游核酸分离的多核苷酸。分离的多核苷酸或多肽可至少60％不含、或至少75％不含、或至少90％不含、或至少95％不含所指出的多核苷酸或多肽的天然环境中存在的其他组分。

如本文所用，术语“唾液酸化”是指具有末端唾液酸的聚糖。术语“单唾液酸化”是指例如在α1,3分支或α1,6分支上具有一个末端唾液酸的支链聚糖。术语“二唾液酸化”是指在两个臂(例如α1,3臂和α1,6臂两者)上具有末端唾液酸的支链聚糖。

附图说明

图1示出了包含两个N-乙酰氨基葡萄糖和三个甘露糖残基的短的支链核心低聚糖。分支之一在本领域中被称为“α1,3臂”，并且第二分支被称为“α1,6臂”。正方形：N-乙酰氨基葡萄糖；深灰色圆圈：甘露糖；浅灰色圆圈：半乳糖；菱形：N-乙酰神经氨酸；三角形：岩藻糖。

图2示出了IVIg中存在的常见Fc聚糖。正方形：N-乙酰氨基葡萄糖；深灰色圆圈：甘露糖；浅灰色圆圈：半乳糖；菱形：N-乙酰神经氨酸；三角形：岩藻糖。

图3示出了免疫球蛋白(例如IgG抗体)如何通过进行半乳糖基化步骤，接着进行唾液酸化步骤而被唾液酸化。正方形：N-乙酰氨基葡萄糖；深灰色圆圈：甘露糖；浅灰色圆圈：半乳糖；菱形：N-乙酰神经氨酸；三角形：岩藻糖。

图4示出了对于以IVIg开始的反应，IgG-Fc聚糖图谱的代表性示例的反应产物。左图是用以将IgG转化为hsIgG的酶促唾液酸化反应的示意图；右图是起始IVIg和hsIgG的IgGFc聚糖图谱。从左至右的条形分别对应于IgG1、IgG2/3和IgG3/4。

图5示出了在各种pH下在各种缓冲液的情况下，由于唾液酸化含Fc的蛋白质而形成A2F的水平。

图6示出了在各种pH下在各种缓冲液的情况下，由于唾液酸化含Fc的蛋白质而形成1,6-A1F的水平。

图7A示出了高MnCl₂浓度对半乳糖基化和唾液酸化IVIg的影响。从左至右的条：G1F+NeuAc；G1+NeuAc。

图7B示出了高MnCl₂浓度对半乳糖基化和唾液酸化IVIg的影响。从左至右的条：5mM；10mM；20mM；40mM；61mM。

图8示出了高MnCl₂浓度对二唾液酸化IVIg的影响。

图9示出了≤10mM MnCl₂浓度对半乳糖基化IVIg的影响(按MnCl₂浓度分组)。

图10示出了≤10mM MnCl₂浓度对半乳糖基化IVIg的影响，按时间分组。

图11示出了通过糖肽LCMS确定的盐对IgG1半乳糖基化的影响。

图12示出了通过糖肽LCMS确定的盐对IgG1唾液酸化的影响。

图13示出了通过糖肽LCMS确定的盐对IgG2/3半乳糖基化的影响。

图14示出了通过糖肽LCMS确定的盐对IgG2/3唾液酸化的影响。

图15示出了通过糖肽LCMS确定的盐对IgG3/4半乳糖基化的影响。

图16示出了通过糖肽LCMS确定的盐对IgG3/4唾液酸化的影响。

图17示出了用于将UDP-Gal转化成UMP和UDP的方案。

图18展示出可在IVIg的半乳糖基化中检测到UDP-Gal的非特异性降解。

图19展示出可在IVIg的半乳糖基化中检测到UDP-Gal的非特异性降解。

具体实施方式

抗体在其重链恒定区中和Fab结构域上的保守位置处被糖基化。例如，人IgG抗体在CH2结构域的Asn297处具有单个N连接的糖基化位点。每种抗体同种型在恒定区中具有不同种类的N-连接的碳水化合物结构。对于人IgG，核心低聚糖通常由具有不同数目的外部残基的GlcNAc₂Man₃GlcNAc组成。各个IgG之间的差异可经由半乳糖和/或半乳糖-唾液酸在一个或两个末端GlcNAc处的连接或经由第三GlcNAc臂的连接(平分GlcNAc)而发生。

本公开部分地涵盖用于制备具有Fc区的免疫球蛋白的方法，该Fc区具有特定水平的支链聚糖，支链聚糖在支链聚糖的两个臂上被唾液酸化(例如，通过NeuAc-α2,6-Gal末端键)。水平可基于单个Fc区测量(例如，在Fc区中的支链聚糖的α1,3臂、α1,6臂或两者上唾液酸化的支链聚糖数目)，或基于多肽制剂的总体组成测量(例如，在多肽制剂的Fc区中的支链聚糖的α1,3臂、α1,6臂或两者上唾液酸化的支链聚糖的数目或百分比)。

可以用于制备高唾液酸化IgG的天然来源的多肽包括例如人血清中的IgG(特别是混合自超过1,000个供体的人血清)、静脉内免疫球蛋白(IVIg)和源自IVIg的多肽(例如，从IVIg纯化的多肽(例如，富集唾液酸化IgG)或经修饰的IVIg(例如，酶促唾液酸化IVIgIgG))。

将N连接的低聚糖链添加到内质网的内腔中的蛋白质。具体地，将初始低聚糖(通常为14-糖)添加至Asn-X-Ser/Thr的靶共有序列内包含的天冬酰胺残基的侧链上的氨基，其中X可以是除脯氨酸之外的任何氨基酸。该初始低聚糖的结构是大多数真核生物共有的，并且含有三个葡萄糖残基、九个甘露糖残基和两个N-乙酰葡糖胺残基。该初始低聚糖链可被内质网中的特定糖苷酶修剪，从而得到由两个N-乙酰葡糖胺残基和三个甘露糖残基构成的短支链核心低聚糖。分支之一在本领域中被称为“α1,3臂”，并且第二分支被称为“α1,6臂”，如图1所示。

N-聚糖可细分成被称为“高甘露糖型”、“杂合型”和“复杂型”的三个不同组，其中在所有三个组中出现共同的五糖核心(Man(α1,6)-(Man(α1,3))-Man(β1,4)-GlcpNAc(β1,4)-GlcpNAc(β1,N)-Asn)。

IVIg中存在的更常见的Fc聚糖示于图2中。

除此之外或另选地，可将N-乙酰葡糖胺的一个或多个单糖单元添加至核心甘露糖亚基以形成“复杂聚糖”。可将半乳糖添加至N-乙酰葡糖胺亚基，并且可将唾液酸亚基添加至半乳糖亚基，从而得到以唾液酸、半乳糖或N-乙酰葡糖胺残基中的任一者封端的链。另外，可将岩藻糖残基添加至核心低聚糖的N-乙酰葡糖胺残基。这些添加中的每一者均由特定糖基转移酶催化。

“杂合聚糖”包含高甘露糖和复杂聚糖两者的特征。例如，杂合聚糖的一个分支可主要包含或仅包含甘露糖残基，而另一个分支可包含N-乙酰葡糖胺、唾液酸、半乳糖和/或岩藻糖。

唾液酸是具有杂环结构的9碳单糖家族。它们经由连接到环的羧酸基团以及包括N-乙酰基和N-乙醇酰基基团在内的其他化学修饰而带有负电荷。存在于哺乳动物表达***中产生的多肽中的两种主要类型的唾液酸残基是N-乙酰神经氨酸(NeuAc)和N-羟乙酰神经氨酸(NeuGc)。它们通常作为在N-连接的聚糖和O-连接的聚糖两者的非还原末端处附接到半乳糖(Gal)残基的末端结构出现。这些唾液酸基团的糖苷键构型可为α2,3或α2,6。

Fc区在保守的N连接糖基化位点处被糖基化。例如，IgG抗体的每条重链在CH2结构域的Asn297处具有单个N连接的糖基化位点。IgA抗体在CH2和CH3结构域内具有N连接的糖基化位点，IgE抗体在CH3结构域内具有N连接的糖基化位点，并且IgM抗体在CH1、CH2、CH3和CH4结构域内具有N连接的糖基化位点。

每种抗体同种型在恒定区中具有不同种类的N-连接的碳水化合物结构。例如，IgG在Fc区的每个Fc多肽中在CH2结构域的Asn297处具有单个N连接的双触角碳水化合物，其还包含C1q和FcγR的结合位点。对于人IgG，核心低聚糖通常由具有不同数目的外部残基的GlcNAc2Man3GlcNAc组成。各个IgG之间的差异可经由半乳糖和/或半乳糖-唾液酸在一个或两个末端GlcNAc处的连接或经由第三GlcNAc臂的连接(平分GlcNAc)而发生。

免疫球蛋白(例如IgG抗体)可以通过进行半乳糖基化步骤，接着进行唾液酸化步骤而被唾液酸化。β-1,4-半乳糖基转移酶1(B4GalT)是II型高尔基体膜结合糖蛋白，其将半乳糖从尿苷5'-二磷酸半乳糖([[(2R,3S,4R,5R)-5-(2,4-二氧代嘧啶-1-基)-3,4二羟基氧杂环戊烷-2-基]甲氧基-羟基磷酰基][(2R,3R,4S,5R,6R)-3,4,5-三羟基-6-(羟甲基)环氧乙烷-2-基]磷酸氢盐；UDP-Gal)转移到GlcNAc作为β-1,4键。α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6)是II型高尔基体膜结合糖蛋白，其将唾液酸从胞苷5'-单磷酸-N乙酰神经氨酸((2R,4S,5R,6R)-5-乙酰胺基-2-[[(2R,3S,4R,5R)-5-(4-氨基-2-氧代嘧啶-1-基)-3,4-二羟基氧杂环戊烷-2-基]甲氧基-羟基磷酰基]氧基-4-羟基-6-(1,2,3-三羟基丙基)环氧乙烷-2-羧酸；CMP-NANA或CMP-唾液酸)转移到Gal作为α-2,6键。示意性地，反应如图3所示进行。

多肽的聚糖可使用本领域已知的任何方法进行评估。例如，聚糖组合物的唾液酸化(例如，在α1,3分支和/或α1,6分支上唾液酸化的支链聚糖的水平)可使用WO2014/179601中所述的方法来表征。

在通过本文所述的方法制备的hsIgG组合物的一些实施方案中，Fc结构域上的支链聚糖的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％在α1,3臂和α1,6臂两者上具有通过NeuAc-α2,6-Gal末端键连接的唾液酸。此外，在一些实施方案中，Fab结构域上的支链聚糖的至少40％、50％、60％、65％、70％、75％、80％或85％在α1,3臂和α1,6臂两者上具有通过NeuAc-α2,6-Gal末端键连接的唾液酸。总的来说，在一些实施方案中，支链聚糖的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％或90％在α1,3臂和α1,6臂两者上具有通过NeuAc-α2,6-Gal末端键连接的唾液酸。

在一些实施方案中，由本文所述的方法制备的hsIgG组合物构成Fc结构域上的支链聚糖的至少50％、55％、60％、65％、70％或75％，其在α1,3分支和α1,6分支两者上具有唾液酸。

酶

酶活性

如本文所述，1 U B4GlaT B4GalT等于每分钟通过将Gal从UDP-Gal转移至GlcNAc而形成1nmol Gal-GlcNAc(也称为LacNAc)。酶

如本文所述，1 U ST6Gal1等于每分钟通过将NeuAc从CMP-NANA转移至Gal-GlcNAc(LacNAc)而形成1nmol NeuAc-Gal-GlcNAc(也称为Sa-LacNAc)。

半乳糖基化酶

β-1,4-半乳糖基转移酶(B4GalT)(例如人B4GalT，例如人B4Galt1)以及其直系同源物、突变体和变体，包括β-1,4-半乳糖基转移酶(B4GalT)(例如人B4GalT，例如人B4Galt1)以及其直系同源物、突变体和变体的酶活性部分，连同包含它们的融合蛋白和多肽适合用于本文所述的方法。β-1,4-半乳糖基转移酶1(B4GalT)是II型高尔基体膜结合糖蛋白，其将半乳糖从尿苷5'-二磷酸半乳糖(UDP-Gal)转移到GlcNAc作为aβ-1,4键。B4Galt1是七种β-1,4-半乳糖基转移酶(β4GalT)基因之一，每个基因编码似乎对供体底物UDP-半乳糖具有排他特异性的II型膜结合糖蛋白；将β1,4键中的半乳糖全部转移到类似的受体糖：GlcNAc、Glc和Xyl。B4Galt1将半乳糖添加到为单糖或糖蛋白碳水化合物链的非还原末端的N-乙酰氨基葡萄糖残基上。B4GalT1也称为GGTB2。编码B4GALT1的四种同工型的四种替代转录物(NCBI基因ID 2683)在表1中有所描述。

表1.人B4GALT1同工型

表2.B4GALT1同工型1(SEQ ID NO:5)的拓扑结构

表3.B4GALT1同工型1(SEQ ID NO:5)的结合位点

/>

表4.B4GALT1同工型1(SEQ ID NO:5)的翻译后氨基酸修饰

B4GalT1的可溶形式通过蛋白水解加工从膜形式衍生而来。裂解位点位于B4GALT1同工型1(SEQ ID NO:5)的位置77-78处。

在一些实施方案中，对应于B4GALT1同工型1(SEQ ID NO:5)的氨基酸113、130、172、243、250、262、310、343或355的B4GalT1氨基酸中的一个或多个氨基酸与(SEQ ID NO:5)相比是保守的。

在一些实施方案中，酶是例如B4GalT1的酶活性部分。在一些实施方案中，酶是B4GALT1同工型1(SEQ ID NO:5)，或SEQ ID NO:5的直系同源物、突变体或变体的酶活性部分。在一些实施方案中，酶是B4GALT1同工型2(SEQ ID NO:6)，或SEQ ID NO:6的直系同源物、突变体或变体的酶活性部分。在一些实施方案中，酶是B4GALT1同工型3(SEQ ID NO:7)，或SEQ ID NO:7的直系同源物、突变体或变体的酶活性部分。在一些实施方案中，酶是B4GALT1同工型4(SEQ ID NO:8)，或SEQ ID NO:8的直系同源物、突变体或变体的酶活性部分。

在一些实施方案中，B4GalT1的酶活性部分不包含细胞质结构域，例如SEQ ID NO:9。在一些实施方案中，B4GalT1的酶活性部分不包含跨膜结构域，例如SEQ ID NO:10。在一些实施方案中，B4GalT1的酶活性部分不包含细胞质结构域，例如SEQ ID NO:9，或跨膜结构域，例如SEQ ID NO:10。

在一些实施方案中，B4GalT1的酶活性部分包含内腔结构域的全部或一部分，例如SEQ ID NO:11或其直系同源物、突变体或变体。

在一些实施方案中，B4GalT1的酶活性部分包含SEQ ID NO:5的氨基酸109-398或其直系同源物、突变体或变体。在一些实施方案中，B4GalT1的酶活性部分由SEQ ID NO:5或SEQ ID NO:5的直系同源物、突变体或变体组成。

B4GalT1的合适的功能部分可以包含与SEQ ID NO:12具有至少80％(85％、90％、95％、98％或100％)同一性的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。

也适用于本文所述的方法中的是包含与SEQ ID NO:13具有至少80％(85％、90％、95％、98％或100％)同一性的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的氨基酸序列。

唾液酸化酶

ST6，例如ST6Gal1(例如人ST6Gal1)以及其直系同源物、突变体和变体包括ST6Gal1(例如人ST6Gal1)以及其直系同源物、突变体和变体的酶活性部分，连同包含它们的融合蛋白和多肽适合用于本文所述的方法。α-2,6-唾液酸转移酶1(ST6)是II型高尔基体膜结合糖蛋白，其将唾液酸从胞苷5'-单磷酸-N-乙酰神经氨酸(CMP-NANA)转移到Gal作为α-2,6键。ST6Gal1也称为ST6N或SIAT1。编码ST6GAL1的两种同工型的四种替代转录物(NCBI基因ID 6480)在表1中有所描述。

表1.人ST6GAL1同工型

表2.ST6Gal1同工型a(SEQ ID NO:14)的拓扑结构

/>

表3.ST6Gal1同工型a(SEQ ID NO:14)的结合位点

表4.ST6Gal1同工型a(SEQ ID NO:14)的翻译后氨基酸修饰

ST6Gal1的可溶形式通过蛋白水解加工从膜形式衍生而来。

在一些实施方案中，对应于ST6Gal1同工型a(SEQ ID NO:14)的氨基酸142、149、161、184、189、212、233、335、353、354、364、365、369、370、376或406的ST6Gal1的氨基酸中的一个或多个氨基酸与SEQ ID NO:14相比是保守的。

本文还提供了例如ST6Gal1的酶活性部分。在一些实施方案中，酶是ST6Gal1同工型a(SEQ ID NO:14)，或SEQ ID NO:14的直系同源物、突变体或变体的酶活性部分。在一些实施方案中，酶是ST6Gal1同工型b(SEQ ID NO:15)，或SEQ ID NO:15的直系同源物、突变体或变体的酶活性部分。

在一些实施方案中，ST6Gal1的酶活性部分不包含细胞质结构域，例如SEQ ID NO:16。在一些实施方案中，ST6Gal1的酶活性部分不包含跨膜结构域，例如SEQ ID NO:17。在一些实施方案中，ST6Gal1的酶活性部分不包含细胞质结构域，例如SEQ ID NO:16，或跨膜结构域，例如SEQ ID NO:17。

在一些实施方案中，ST6Gal1的酶活性部分包含内腔结构域的全部或一部分，例如SEQ ID NO:18或其直系同源物、突变体或变体。

在一些实施方案中，ST6Gal1的酶活性部分包含SEQ ID NO:14的氨基酸87-406(SEQ ID NO:19)或其直系同源物、突变体或变体。在一些实施方案中，ST6Gal1的酶活性部分由SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:19的直系同源物、突变体或变体组成。

ST6Gal1的合适的功能部分可以包含与SEQ ID NO:19具有至少80％(85％、90％、95％、98％或100％)同一性的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成。

在一些实施方案中，ST6Gal1包含以下或由以下组成：SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:19的氨基酸4至320的部分或SEQ ID NO:19的氨基酸5至320的部分。

也适用于本文所述的方法中的是包含与SEQ ID NO:20具有至少80％(85％、90％、95％、98％或100％)同一性的氨基酸序列或由该氨基酸序列组成的氨基酸序列。

抗体

本文所述的方法包括抗体的半乳糖基化或唾液酸化。合适的抗体包括例如IgG抗体。可将抗体(例如IgG抗体)混合。例如，混合IgG抗体包括IVIg。

在一些实施方案中，本文所述的方法包括提供IgG抗体的混合物。在一些实施方案中，提供IgG抗体的混合物包括(a)提供来自至少1000个人类受试者的混合血浆；和(b)从该混合血浆中分离IgG抗体的混合物。在一些实施方案中，IgG抗体的混合物从静脉内免疫球蛋白中分离。在一些实施方案中，IgG抗体的混合物是静脉内免疫球蛋白。在一些实施方案中，从混合血浆分离IgG抗体的混合物的步骤包括乙醇沉淀或羊脂酸(也称为辛酸)沉淀。在一些实施方案中，从混合血浆分离IgG抗体混合物的步骤包括将IgG抗体结合到离子交换柱并从离子交换柱洗脱IgG抗体。

在一些实施方案中，抗体(例如本文所述的抗体，例如IgG，例如混合IgG，例如IVIg)作为溶液的一部分提供。在一些实施方案中，抗体(例如本文所述的抗体，例如混合IgG，例如IVIg)的浓度为100mg/mL至200mg/mL或为约100mg/mL至约200mg/mL。在一些实施方案中，抗体的浓度(is)为150mg/mL或约150mg/mL。

在一些实施方案中，溶液由以下组成或包含以下：抗体(例如本文所述的抗体，例如IgG，例如混合IgG，例如IVIg)，以及缓冲液。在一些实施方案中，缓冲液选自由以下组成的组：BIS-TRIS、MOPS、MES、PIPES、BES、MOPSO、TEA、POPSO、EPPS、以及它们的组合。

在一些实施方案中，溶液由以下组成或包含以下：抗体(例如本文所述的抗体，例如IgG，例如混合IgG，例如IVIg)，以及BIS-TRIS缓冲液。在一些实施方案中，溶液由以下组成或包含以下：抗体的50mM BIS-TRIS缓冲液溶液。

在一些实施方案中，溶液由以下组成或包含以下：抗体(例如本文所述的抗体，例如IgG，例如混合IgG，例如IVIg)，以及BIS-TRIS缓冲液(例如50mM BIS-TRIS缓冲液，为pH6.8至pH 7.4或为约pH 6.8至约pH 7.4)。在一些实施方案中，溶液由以下组成或包含以下：抗体(例如本文所述的抗体，例如IgG，例如混合IgG，例如IVIg)，以及BIS-TRIS缓冲液(例如50mM BIS-TRIS缓冲液，为pH 6.8至pH 7.3或为约pH 6.8至约pH 7.3、为pH 6.8至pH 7.2或为约pH 6.8至约pH 7.2、为pH 6.8至pH 7.1或为约pH 6.8至约pH 7.1、为pH 6.8至pH 7.0或为约pH 6.8至约pH 7.0、为pH 6.8至pH 6.9或为约pH 6.8至约pH 6.9、为pH 6.9至pH7.4或为约pH 6.9至约pH 7.4、为pH 7.3至pH 7.2或为约pH 7.3至约pH 7.2、为pH 6.9至pH7.1或为约pH 6.9至约pH 7.1、为pH 6.9至pH 7.0或为约pH 6.9至约pH 7.0、为pH 7.0至pH7.4或为约pH 7.0至约pH 7.4、为pH 7.0至pH 7.3或为约pH 7.0至约pH 7.3、为pH 7.0至pH7.2或为约pH 7.0至约pH 7.2、为pH 7.0至pH 7.1或为约pH 7.0至约pH 7.1、为pH 7.1至pH7.4或为约pH 7.1至约pH 7.4、为pH 7.1至pH 7.3或为约pH 7.1至约pH 7.3、为pH 7.1至pH7.2或为约pH 7.1至约pH 7.2、为pH 7.2至pH 7.4或为约pH 7.2至约pH 7.4、为pH 7.3至pH7.4或为约pH 7.3至约pH 7.4。在一些实施方案中，溶液由以下组成或包含以下：抗体(例如本文所述的抗体，例如IgG，例如混合IgG，例如IVIg)，以及BIS-TRIS缓冲液(例如50mM BIS-TRIS缓冲液，为pH 7.3或为约pH 7.3)。

酶促半乳糖基化和唾液酸化

本文所述的方法可包括半乳糖基化步骤。图3中示出了示例性半乳糖基化反应。本文还提供了一种用于通过提供包含以下的组合物(例如半乳糖基化混合物)来半乳糖基化抗体(例如本文所述的抗体)的方法：抗体，例如本文所述的抗体；半乳糖基化酶，例如本文所述的半乳糖基化酶，例如B4GalT或其酶活性部分或变体；UDP-gal或其盐；缓冲液，例如本文所述的缓冲液，例如BIS-TRIS缓冲液；和任选地MnCl₂，以及在有效用于半乳糖基化抗体(例如如本文所述的)条件下，温育该组合物，从而制备半乳糖基化抗体。

本文所述的方法可包括唾液酸化步骤。图3中示出了示例性唾液酸化反应。因此，本文提供了一种用于通过提供包含以下的组合物来唾液酸化(例如，高唾液酸化)抗体(例如本文所述的抗体)的方法：半乳糖基化抗体，例如如本文所述；唾液酸化酶，例如本文所述的唾液酸化酶，例如ST6Gal1或其酶活性部分或变体；CMP-NANA或其盐；缓冲液，例如本文所述的缓冲液，例如BIS-TRIS缓冲液；和任选地MnCl₂；以及在有效用于唾液酸化抗体(例如如本文所述的)的条件下，温育该组合物。

在一些实施方案中，半乳糖基化步骤和唾液酸化步骤在相同的反应混合物中按顺序进行，即，半乳糖基化反应混合物在添加唾液酸化酶和CMP-NANA或其盐时变成唾液酸化反应混合物。在一些实施方案中，在唾液酸化步骤之前不将半乳糖基化反应混合物过滤、分馏或纯化。在一些实施方案中，半乳糖基化步骤和唾液酸化步骤单独进行，例如，提供预半乳糖基化抗体，尽管它们可在该唾液酸化步骤之前已被处理(例如，过滤、分馏或纯化)和/或储存。

因此，本文所述的方法还可包括顺序的半乳糖基化和唾液酸化步骤。图3中示出了示例性半乳糖基化和唾液酸化反应。因此，本文提供了一种用于通过以下步骤来半乳糖基化和唾液酸化(例如，高唾液酸化)抗体(例如本文所述的抗体)的方法：a)提供包含以下的组合物(半乳糖基化反应混合物)：抗体，例如如本文所述的；半乳糖基化酶，例如本文所述的半乳糖基化酶，例如B4GalT或其酶活性部分或变体；UDP-gal或其盐；缓冲液，例如本文所述的缓冲液，例如BIS-TRIS缓冲液；和任选地MnCl₂；以及b)在有效用于半乳糖基化抗体(例如如本文所述的)的条件下，温育该组合物；c)将唾液酸化酶(例如本文所述的唾液酸化酶，例如ST6Gal1或其酶活性部分或变体)以及CMP-NANA或其盐添加到半乳糖基化反应混合物中，从而制备唾液酸化反应混合物；以及d)在有效用于唾液酸化半乳糖基化抗体(例如如本文所述的)的条件下，温育该组合物。

本文还提供了一种用于通过提供包含以下的组合物来半乳糖基化和唾液酸化(例如，高唾液酸化)抗体(例如本文所述的抗体)的方法：抗体，例如如本文所述；半乳糖基化酶，例如本文所述的半乳糖基化酶，例如B4GalT或其酶活性部分或变体；UDP-gal或其盐；以及缓冲液，例如本文所述的缓冲液，例如BIS-TRIS缓冲液；唾液酸化酶，例如本文所述的唾液酸化酶，例如ST6Gal1或其酶活性部分或变体；CMP-NANA或其盐；和任选地MnCl₂；以及d)在有效用于半乳糖基化和唾液酸化抗体(例如如本文所述的)的条件下，温育该组合物。

在一些实施方案中，在温育期间补充一种或多种反应混合物的一种或多种组分。即，反应混合物可在反应开始时包含一定量的组分(其可在反应过程期间改变)，但在反应期间还用附加量的组分补充。

在一些实施方案中，半乳糖基化反应混合物包含50mg/mL至200mg/mL或约50mg/mL至约200mg/mL抗体(例如，本文所述的抗体，例如IgG，例如混合IgG，例如IVIg)。在一些实施方案中，半乳糖基化反应混合物包含50mg/mL至200mg/mL或约50mg/mL至约200mg/mL、50mg/mL至150mg/mL或约50mg/mL至约150mg/mL、50mg/mL至100mg/mL或约50mg/mL至约100mg/mL、100mg/mL至200mg/mL或约100mg/mL至约200mg/mL、100mg/mL至约200mg/mL或约100mg/mL至约200mg/mL、100mg/mL至约150mg/mL或约100mg/mL至约150mg/mL、或150mg/mL至200mg/mL或约150mg/mL至约200mg/mL抗体(例如本文所述的抗体，例如IgG，例如混合IgG，例如IVIg)。

在一些实施方案中，半乳糖基化反应混合物包含50mg/mL或更多、75mg/mL或更多、100mg/mL或更多、125mg/mL或更多、150mg/mL或更多、或200mg/mL或更多的抗体(例如本文所述的抗体，例如IgG，例如混合IgG，例如IVIg)。

在一些实施方案中，半乳糖基化反应混合物包含每克抗体6.0U至15.0U或约6.0U至约15.0U半乳糖基化酶。在一些实施方案中，半乳糖基化反应混合物包含每克抗体7.0U至9.0U或约7.0U至约9.0U半乳糖基化酶。在一些实施方案中，半乳糖基化反应混合物包含每克抗体7.2U至8.8U或约7.2U至约8.8U半乳糖基化酶。在一些实施方案中，半乳糖基化反应混合物包含每克抗体7.5U或约7.5U半乳糖基化酶。在一些实施方案中，半乳糖基化反应混合物包含每克抗体8.0U或约8.0U半乳糖基化酶。

在一些实施方案中，半乳糖基化反应混合物补充有每克抗体6.0U至15.0U或约6.0U至约15.0U半乳糖基化酶。在一些实施方案中，半乳糖基化反应混合物补充有每克抗体7.0U至9.0U或约7.0U至约9.0U半乳糖基化酶。在一些实施方案中，半乳糖基化反应混合物补充有每克抗体7.2U至8.8U或约7.2U至约8.8U半乳糖基化酶。在一些实施方案中，半乳糖基化反应混合物补充有每克抗体7.5U或约7.5U半乳糖基化酶。在一些实施方案中，半乳糖基化反应混合物补充有每克抗体8.0U或约8.0U半乳糖基化酶。

在一些实施方案中，半乳糖基化反应混合物包含每克抗体0.030mmol至0.050mmol或约0.030mmol至约0.050mmol UDP-gal或其盐。在一些实施方案中，半乳糖基化混合物包含每克抗体0.038mmol至0.046mmol或约0.038mmol至约0.046mmol UDP-gal或其盐。在一些实施方案中，半乳糖基化反应混合物包含每克抗体0.038mmol或约0.038mmol UDP-gal或其盐。在一些实施方案中，半乳糖基化反应混合物包含每克抗体0.042mmol或约0.042mmolUDP-gal或其盐。

在一些实施方案中，半乳糖基化反应混合物补充有每克抗体0.030mmol至0.050mmol或约0.030mmol至约0.050mmol UDP-gal或其盐。在一些实施方案中，半乳糖基化混合物补充有每克抗体0.038mmol至0.046mmol或约0.038mmol至约0.046mmol UDP-gal或其盐。在一些实施方案中，半乳糖基化混合物补充有每克抗体0.038mmol或约0.038mmolUDP-gal或其盐。在一些实施方案中，半乳糖基化反应混合物补充有每克抗体0.042mmol或约0.042mmol UDP-gal。

在一些实施方案中，唾液酸化反应混合物包含每克抗体14.0U至20.0U或约14.0U至约20.0U唾液酸化酶。在一些实施方案中，唾液酸化反应混合物包含每克抗体17.1U至18.9U或约17.1U至约18.9U唾液酸化酶。在一些实施方案中，唾液酸化反应混合物包含每克抗体15.8U或约15.8U唾液酸化酶。在一些实施方案中，唾液酸化反应混合物包含每克抗体18.0U或约18.0U唾液酸化酶。

在一些实施方案中，唾液酸化反应混合物补充有每克抗体14.0U至20.0U或约14.0U至约20.0U唾液酸化酶。在一些实施方案中，唾液酸化反应混合物补充有每克抗体17.1U至18.9U或约17.1U至约18.9U唾液酸化酶。在一些实施方案中，唾液酸化反应混合物补充有每克抗体15.8U或约15.8U唾液酸化酶。在一些实施方案中，唾液酸化反应混合物补充有每克抗体18.0U或约18.0U唾液酸化酶。

在一些实施方案中，唾液酸化反应混合物包含每克抗体0.1mmol至0.3mmol或约0.1mmol至约0.3mmol CMP-NANA或其盐。在一些实施方案中，唾液酸化反应混合物包含每克抗体0.1425mmol至0.1575mmol或约0.1425mmol至约0.1575mmol CMP-NANA或其盐。在一些实施方案中，唾液酸化反应混合物包含每克抗体为0.220mmol或约0.220mmol CMP-NANA或其盐。在一些实施方案中，唾液酸化反应混合物包含每克抗体为0.150mmol或约0.150mmolCMP-NANA或其盐。

在一些实施方案中，在反应开始时，将每克抗体约0.01mmol至0.3mmol或约0.01mmol至约0.3mmol CMP-NANA或其盐添加到唾液酸化反应混合物中。在一些实施方案中，在反应开始时，将每克抗体0.01425mmol至0.1575mmol或约0.01425mmol至约0.1575mmol CMP-NANA或其盐添加到唾液酸化反应混合物中。

在一些实施方案中，唾液酸化反应混合物补充有每克抗体0.01mmol至0.3mmol或约0.01mmol至约0.3mmol CMP-NANA或其盐。在一些实施方案中，唾液酸化反应混合物补充有每克抗体0.01425mmol至0.1575mmol或约0.01425mmol至约0.1575mmol CMP-NANA或其盐。

在一些实施方案中，添加到唾液酸化反应混合物中的CMP-NANA总量为每克抗体0.1mmol至0.3mmol或约0.1mmol至约0.3mmol CMP-NANA或其盐。在一些实施方案中，添加到唾液酸化反应混合物中的CMP-NANA总量为每克抗体0.1425mmol至0.1575mmol或约0.1425mmol至约0.1575mmol CMP-NANA或其盐。在一些实施方案中，添加到唾液酸化反应混合物中的CMP-NANA总量为每克抗体0.220mmol或约0.220mmol CMP-NANA或其盐。在一些实施方案中，添加到唾液酸化反应混合物中的CMP-NANA总量为每克抗体0.150mmol或约0.150mmol CMP-NANA或其盐。

在一些实施方案中，该唾液酸化反应混合物用CMP-NANA补充一次、两次、三次、四次、五次、六次、七次、八次、九次或十次。在一些实施方案中，唾液酸化混合物用CMP-NANA补充少于七次。

在一些实施方案中，半乳糖基化和/或唾液酸化反应混合物各自独立地包含1mM至20mM或约1mM至约20mM MnCl₂。在一些实施方案中，半乳糖基化和/或唾液酸化反应混合物各自独立地包含4.5mM至5.5mM或约4.5mM至约5.5mM MnCl₂。在一些实施方案中，半乳糖基化和/或唾液酸化反应混合物各自独立地包含7.5mM或约7.5mM MnCl₂。在一些实施方案中，半乳糖基化和/或唾液酸化反应混合物各自独立地包含5.0mM或约5.0mM MnCl₂。

在一些实施方案中，半乳糖基化和/或唾液酸化反应混合物包含BIS-TRIS缓冲液。在一些实施方案中，半乳糖基化和/或唾液酸化反应混合物各自独立地包含10mM或10mM至500mM或至约500mM BIS-TRIS缓冲液。在一些实施方案中，半乳糖基化和/或唾液酸化反应混合物各自独立地包含10mM至400mM或约10mM至约400mM、10mM至300mM或约10mM至约300mM、10mM至300mM或约10mM至约300mM、10mM至200mM或约10mM至约200mM、10mM至、100mM或约10mM至约100mM、10mM至50mM或约10mM至约50mM、50mM至500mM或约50mM至约500mM、50mM至400mM或约50mM至约400mM、50mM至300mM或约50mM至约300mM、50mM至200mM或约50mM至约200mM、50mM至100mM或约50mM至约100mM、100mM至500mM或约100mM至约500mM、100mM至400mM或约100mM至约400mM、100mM至300mM或约100mM至约300mM、100mM至200mM或约100mM至约200mM、200mM至500mM或约200mM至约500mM、200mM至400mM或约200mM至约400mM、200mM至300mM或约200mM至约300mM、300mM至500mM或约300mM至约500mM、300mM至400mM或约300mM至约400mM、400mM至500mM或约400mM至约500mM BIS-TRIS缓冲液。在一些实施方案中，半乳糖基化和/或唾液酸化反应混合物各自独立地包含10mM至100mM或约10mM至约100mM、10mM至90mM或约10mM至约90mM、10mM至80mM或约10mM至约80mM、10mM至70mM或约10mM至约70mM、10mM至60mM或约10mM至约60mM、10mM至50mM或约10mM至约50mM、10mM至40mM或约10mM至约40mM、10mM至30mM或约10mM至约30mM、10mM至20mM或约10mM至约20mM、20mM至100mM或约20mM至约100mM、20mM至90mM或约20mM至约90mM、20mM至80mM或约20mM至约80mM、20mM至70mM或约20mM至约70mM、20mM至60mM或约20mM至约60mM、20mM至50mM或约20mM至约50mM、20mM至40mM或约20mM至约40mM、20mM至30mM或约20mM至约30mM、30mM至100mM或约30mM至约100mM、30mM至90mM或约30mM至约90mM、30mM至80mM或约30mM至约80mM、30mM至70mM或约30mM至约70mM、30mM至60mM或约30mM至约60mM、30mM至50mM或约30mM至约50mM、30mM至40mM或约30mM至约40mM、40mM至100mM或约40mM至约100mM、40mM至90mM或约40mM至约90mM、40mM至80mM或约40mM至约80mM、40mM至70mM或约40mM至约70mM、40mM至60mM或约40mM至约60mM、40mM至50mM或约40mM至约50mM、50mM至100mM或约50mM至约100mM、50mM至90mM或约50mM至约90mM、50mM至80mM或约50mM至约80mM、50mM至70mM或约50mM至约70mM、50mM至60mM或约50mM至约60mM、60mM至100mM或约60mM至约100mM、60mM至90mM或约60mM至约90mM、60mM至80mM或约60mM至约80mM、60mM至70mM或约60mM至约70mM、70mM至100mM或约70mM至约100mM、70mM至90mM或约70mM至约90mM、70mM至80mM或约70mM至约80mM、80mM至100mM或约80mM至约100mM、80mM至90mM或约80mM至约90mM、90mM至100mM或约90mM至约100mM BIS-TRIS缓冲液。

在一些实施方案中，半乳糖基化和/或唾液酸化反应混合物各自独立地包含50mM或更少、100mM或更少、150mM或更少、30mM或更少、或不含氯化钠。

在一些实施方案中，半乳糖基化和/或唾液酸化反应混合物的缓冲液(例如，半乳糖基化和/或唾液酸化反应混合物的Bis-Tris缓冲液)各自独立地包含50mM或更少、100mM或更少、150mM或更少、30mM或更少、或不含氯化钠。

在一些实施方案中，半乳糖基化和/或唾液酸化步骤各自独立地在20℃至50℃或约20℃至约50℃下进行。在一些实施方案中，唾液酸化在20℃至45℃或约20℃至约45℃、在20℃至40℃或约20℃至约40℃、在20℃至35℃或约20℃至约35℃、在20℃至30℃或约20℃至约30℃、在20℃至25℃或约20℃至约25℃、在25℃至50℃或约25℃至约50℃、在25℃至45℃或约25℃至约45℃、在25℃至35℃或约25℃至约40℃、在25℃至35℃或约25℃至约35℃、在25℃至30℃或约25℃至约30℃、在30℃至50℃或约30℃至约50℃、在30℃至45℃或约30℃至约45℃、在30℃至40℃或约30℃至约40℃、在30℃至35℃或约30℃至约35℃、在35℃至50℃或约35℃至约50℃、在35℃至45℃或约35℃至约45℃、在35℃至40℃或约35℃至约40℃、在40℃至50℃或约40℃至约50℃、在40℃至45℃或约40℃至约45℃、在45℃至50℃或约45℃至约50℃下进行。在一些实施方案中，唾液酸化在37℃或约37℃下进行。

在一些实施方案中，半乳糖基化和/或唾液酸化步骤各自独立地在pH 5.8至pH7.2或约pH 5.8至约pH 7.2下独立地进行。在一些实施方案中，唾液酸化在pH 5.8至pH 7.1或约pH 5.8至约pH 7.1、在pH 5.8至pH 7.0或约pH 5.8至约pH 7.0、在pH 5.8至pH 6.9或约pH 5.8至约pH 6.9、在pH 5.8至pH 6.8或约pH 5.8至约pH 6.8、在pH 5.8至pH 6.7或约pH 5.8至约pH 6.7、在pH 5.8至pH 6.6或约pH 5.8至约pH 6.6、在pH 5.8至pH 6.5或约pH5.8至约pH 6.5、在pH 5.8至pH 6.4或约pH 5.8至约pH 6.4、在pH 5.8至pH 6.3或约pH 5.8至约pH 6.3、在pH 5.8至pH 6.2或约pH 5.8至约pH 6.2、在pH 5.8至pH 6.1或约pH 5.8至约pH 6.1、在pH 5.8至pH 6.0或约pH 5.8至约pH 6.0、在pH 5.8至pH 5.9或约pH 5.8至约pH 5.9、在pH 5.9至pH 7.2或约pH 5.9至约pH 7.2、在pH 5.9至pH 7.1或约pH 5.9至约pH7.1、在pH 5.9至pH 7.0或约pH 5.9至约pH 7.0、在pH 5.9至pH 6.9或约pH 5.9至约pH6.9、在pH 5.9至pH 6.8或约pH 5.9至约pH 6.8、在pH 5.9至pH 6.7或约pH 5.9至约pH6.7、在pH 5.9至pH 6.6或约pH 5.9至约pH 6.6、在pH 5.9至pH 6.5或约pH 5.9至约pH6.5、在pH 5.9至pH 6.4或约pH 5.9至约pH 6.4、在pH 5.9至pH 6.3或约pH 5.9至约pH6.3、在pH 5.9至pH 6.2或约pH 5.9至约pH 6.2、在pH 5.9至pH 6.0或约pH 5.9至约pH6.0、在pH 6.0至pH 7.2或约pH 6.0至约pH 7.2、在pH 6.0至pH 7.1或约pH 6.0至约pH7.1、在pH 6.0至pH 7.0或约pH 6.0至约pH 7.0、在pH 6.0至pH 6.9或约pH 6.0至约pH6.9、在pH 6.0至pH 6.8或约pH 6.0至约pH 6.8、在pH 6.0至pH 6.7或约pH 6.0至约pH6.7、在pH 6.0至pH 6.6或约pH 6.0至约pH 6.6、在pH 6.0至pH 6.5或约pH 6.0至约pH6.5、在pH 6.0至pH 6.4或约pH 6.0至约pH 6.4、在pH 6.0至pH 6.3或约pH 6.0至约pH6.3、在pH 6.0至pH 6.2或约pH 6.0至约pH 6.2、在pH 5.9至pH 6.1或约pH 5.9至约pH6.1、在pH 6.0至pH 7.2或约pH 6.0至约pH 7.2、在pH 6.0至pH 7.1或约pH 6.0至约pH7.1、在pH 6.0至pH 7.0或约pH 6.0至约pH 7.0、在pH 6.0至pH 6.9或约pH 6.0至约pH6.9、在pH 6.0至pH 6.8或约pH 6.0至约pH 6.8、在pH 6.0至pH 6.7或约pH 6.0至约pH6.7、在pH 6.0至pH 6.6或约pH 6.0至约pH 6.6、在pH 6.0至pH 6.5或约pH 6.0至约pH6.5、在pH 6.0至pH 6.4或约pH 6.0至约pH 6.4、在pH 6.0至pH 6.3或约pH 6.0至约pH6.3、在pH 6.0至pH 6.2或约pH 6.0至约pH 6.2、在pH 6.0至pH 6.1或约pH 6.0至约pH6.1、在pH 6.1至pH 7.2或约pH 6.1至约pH7.2、在pH 6.1至pH 7.1或约pH 6.1至约pH 7.1、在pH 6.1至pH 7.0或约pH 6.1至约pH 7.0、在pH 6.1至pH 6.9或约pH 6.1至约pH 6.9、在pH 6.1至pH 6.8或约pH 6.1至约pH 6.8、在pH 6.1至pH 6.7或约pH 6.1至约pH 6.7、在pH6.1至pH 6.6或约pH 6.1至约pH 6.6、在pH 6.1至pH 6.5或约pH 6.1至约pH 6.5、在pH 6.1至pH 6.4或约pH 6.1至约pH 6.4、在pH 6.1至pH 6.3或约pH 6.1至约pH 6.3、在pH 6.1至pH 6.2或约pH 6.1至约pH 6.2、在pH 6.2至pH 7.2或约pH 6.2至约pH 7.2、在pH 6.2至pH7.1或约pH 6.2至约pH 7.1、在pH 6.2至pH 7.0或约pH 6.2至约pH 7.0、在pH 6.2至pH 6.9或约pH 6.2至约pH 6.9、在pH 6.2至pH 6.9或约pH 6.2至约pH 6.8、在pH 6.2至pH 6.7或约pH 6.2至约pH 6.7、在pH 6.2至pH 6.6或约pH 6.2至约pH 6.6、在pH 6.2至pH 6.5或约pH 6.2至约pH 6.5、在pH 6.2至pH 6.4或约pH 6.2至约pH 6.4、在pH 6.2至pH 6.3或约pH6.2至约pH 6.3、在pH 6.3至pH 7.2或约pH 6.3至约pH 7.2、在pH 6.3至pH 7.1或约pH 6.3至约pH 7.1、在pH 6.3至pH 7.0或约pH 6.3至约pH 7.0、在pH 6.3至pH 6.9或约pH 6.3至约pH 6.9、在pH 6.3至pH 6.8或约pH 6.3至约pH 6.8、在pH 6.3至pH 6.7或约pH 6.3至约pH 6.7、在pH 6.3至pH 6.6或约pH 6.3至约pH 6.6、在pH 6.3至pH 6.5或约pH 6.3至约pH6.5、在pH 6.3至pH 6.4或约pH 6.3至约pH 6.4、在pH 6.4至pH 7.2或约pH 6.4至约pH7.2、在pH 6.4至pH 7.1或约pH 6.4至约pH 7.1、在pH 6.4至pH 7.0或约pH 6.4至约pH7.0、在pH 6.4至pH 6.9或约pH 6.4至约pH 6.9、在pH 6.4至pH 6.8或约pH 6.4至约pH6.8、在pH 6.4至pH 6.7或约pH 6.4至约pH 6.7、在pH 6.4至pH 6.6或约pH 6.4至约pH6.6、在pH 6.4至pH 6.5或约pH 6.4至约pH 6.5、在pH 6.5至pH 7.2或约pH 6.5至约pH7.2、在pH 6.5至pH 7.1或约pH 6.5至约pH 7.1、在pH 6.5至pH 7.0或约pH 6.5至约pH7.0、在pH 6.5至pH 6.9或约pH 6.5至约pH 6.9、在pH 6.5至pH 6.8或约pH 6.5至约pH6.8、在pH 6.5至pH 6.7或约pH 6.5至约pH 6.7、在pH 6.5至pH 6.6或约pH 6.5至约pH6.6、在pH 6.6至pH 7.2或约pH 6.6至约pH 7.2、在pH 6.6至pH 7.1或约pH 6.6至约pH7.1、在pH 6.6至pH 7.0或约pH 6.6至约pH 7.0、在pH 6.6至pH 6.9或约pH 6.6至约pH6.9、在pH 6.6至pH 6.8或约pH 6.6至约pH 6.8、在pH 6.6至pH 6.7或约pH 6.6至约pH6.7、在pH 6.7至pH 7.2或约pH 6.7至约pH 7.2、在pH 6.7至pH 7.1或约pH 6.7至约pH7.1、在pH 6.7至pH 7.0或约pH 6.7至约pH 7.0、在pH 6.7至pH 6.9或约pH 6.7至约pH6.9、在pH 6.7至pH 6.8或约pH 6.7至约pH 6.8、在pH 6.8至pH 7.2或约pH 6.8至约pH7.2、在pH 6.8至pH 7.1或约pH 6.8至约pH 7.1、在pH 6.8至pH 7.0或约pH 6.8至约pH7.0、在pH 6.8至pH 6.9或约pH 6.8至约pH 6.9、在pH 6.9至pH 7.2或约pH 6.9至约pH7.2、在pH 6.9至pH 7.1或约pH 6.9至约pH 7.1、在pH 6.9至pH 7.0或约pH 6.9至约pH7.0、在7.0至pH 7.2或约pH 7.0至约pH 7.2、在pH 7.0至pH 7.1或约pH 7.0至约pH 7.1、或在pH 7.1至pH 7.2或约pH 7.1至约pH 7.2下进行。

在一些实施方案中，在半乳糖基化和/或唾液酸化期间调节反应混合物中一种或多种的pH，例如落入优选的范围内，例如，返回到起始pH或约起始pH。

在一些实施方案中，半乳糖基化步骤进行60小时或更短，例如50小时或更短、40小时或更短，或优选地20小时或更短或20小时或更短。

在一些实施方案中，半乳糖基化步骤进行至少8小时、12小时、18小时、24小时、30小时或40小时，但不超过60小时。

在一些实施方案中，半乳糖基化步骤进行8小时、12小时、18小时、24小时、30小时、40小时、50小时或60小时或约8小时、12小时、18小时、24小时、30小时、40小时、50小时或60小时。

在一些实施方案中，唾液酸化步骤进行70小时或更短，例如60小时或更短、50小时或更短，或优选地40小时或更短。

在一些实施方案中，唾液酸化步骤进行至少8小时、12小时、18小时、24小时、30小时、40小时或50小时，但不超过70小时。

在一些实施方案中，唾液酸化步骤进行8小时、12小时、18小时、24小时、30小时、40小时、50小时、60小时或70小时或约8小时、12小时、18小时、24小时、30小时、40小时、50小时、60小时或70小时。

在一些实施方案中，半乳糖基化和唾液酸化的总温育时间(例如，在相同反应混合物中按顺序进行)为130小时或更短，例如120小时或更短、110小时或更短、100小时或更短、90小时或更短、80小时或更短，优选地70小时或更短或60小时或更短。

在一些实施方案中，半乳糖基化和唾液酸化的总温育时间(例如，在相同反应混合物中按顺序进行)为至少8小时、12小时、18小时、24小时、30小时、40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时或120小时，但不超过130小时。

在一些实施方案中，半乳糖基化和唾液酸化的总温育时间(例如，在相同反应混合物中按顺序进行)为或为约为8小时、12小时、18小时、24小时、30小时、40小时、50小时、60小时、70小时、80小时、90小时、100小时或130小时。

在一些实施方案中，抗体(例如hsIgG)上的支链聚糖的至少或约60％、65％、70％、75％、80％或85％在α1,3分支和α1,6分支两者上具有唾液酸。

在一些实施方案中，抗体(例如hsIgG)上的支链Fc聚糖的约或至少60％、65％、70％、75％、80％或85％在α1,3分支和α1,6分支两者上具有唾液酸。

在一些实施方案中，抗体(例如hsIgG)的Fab结构域上的支链聚糖的约60％、65％、70％、75％、80％或85％或至少60％、65％、70％、75％、80％或85％在α1,3臂和α1,6臂两者上具有通过NeuAc-α2,6-Gal末端键连接的唾液酸。

在一些实施方案中，hsIgG上的支链Fc聚糖的约或至少80％在α1,3分支和α1,6分支两者上具有唾液酸。

在一些实施方案中，抗体(例如hsIgG)的Fab结构域上的支链聚糖的约60％、65％、70％或至少60％、65％、70％在α1,3臂和α1,6臂两者上具有通过NeuAc-α2,6-Gal末端键连接的唾液酸。

在一些实施方案中，抗体(例如hsIgG)上的支链Fc聚糖的约或至少85％在α1,3分支和α1,6分支两者上具有唾液酸。

在一些实施方案中，抗体(例如hsIgG)上的支链Fc聚糖的约或至少90％在α1,3分支和α1,6分支两者上具有唾液酸。

示例性半乳糖基化和唾液酸化反应示于下表中。

示例

在以下实施例中进一步描述本发明，实施例不限制权利要求中描述的本发明的范围。

实施例1：高唾液酸化IgG制剂

可以如下制备其中总支链聚糖的超过60％是二唾液酸化的IgG。

简言之，使IgG抗体的混合物暴露于使用β1,4半乳糖基转移酶1(B4GalT)和α2,6-唾液酸转移酶(ST6Gal1)的顺序酶促反应。不需要在添加ST6Gal1之前从反应中去除B4GalT，并且在酶促反应之间不需要产物的部分或完全纯化。

半乳糖基转移酶选择性地将半乳糖残基添加到预先存在的天冬酰胺连接的聚糖。所得的半乳糖基化聚糖用作唾液酸转移酶的底物，其选择性地添加唾液酸残基以封端连接到其上的天冬酰胺连接的聚糖结构。因此，总唾液酸化反应采用两种糖核苷酸(尿苷5'-二磷酸半乳糖(UDP-Gal)和胞苷-5'-单磷酸-N-乙酰神经氨酸(CMP-NANA))。定期补充后者以相对于单唾液酸化产物增加二唾液酸化产物。该反应包括辅因子氯化锰。

以IVIg开始的此类反应和反应产物的IgG-Fc聚糖图谱的代表性示例示于图4中。在图4中，左图是用以将IgG转化为hsIgG的酶促唾液酸化反应的示意图；右图是起始IVIg和hsIgG的IgG Fc聚糖图谱。在该研究中，经由糖肽质谱分析得出不同的IgG亚类的聚糖图谱。用于定量不同IgG亚类的糖肽的肽序列是：IgG1＝EEQYNSTYR(SEQ ID NO:1)、IgG2/3EEQFNSTFR(SEQ ID NO:2)、IgG3/4EEQYNSTFR(SEQ ID NO:3)和EEQFNSTYR(SEQ ID NO:4)。

聚糖数据按IgG亚类示出。来自IgG3和IgG4亚类的聚糖不能单独定量。如所示，对于IVIg，所有未唾液酸化聚糖的总和大于80％，并且所有唾液酸化聚糖的总和小于20％。对于反应产物，所有未唾液酸化聚糖的总和小于20％，并且所有唾液酸化聚糖的总和大于80％。糖图谱中列出的不同聚糖的命名使用N连接的聚糖的Oxford符号。

实施例2：唾液酸化反应的改善

对反应条件进行各种分析以试图进一步改善IgG抗体的二唾液酸化，包括Fc结构域分支聚糖的二唾液酸化。由ST6Ga1使用CMP-NANA作为底物驱动的唾液酸化反应具有对反应进行改善的特性，无论是通过二唾液酸化的总体水平，达到二唾液酸化的特定水平的时间，还是通过达到二唾液酸化的特定总体水平所需的酶和底物的量来评估，都具有挑战性。例如：(a)CMP-NANA是不完全稳定的并且即使在不存在任何酶的情况下也将自发地水解；(b)ST6Gal1被认为催化CMP-NANA的水解，但不有效加成到支链聚糖上的Gal；(c)胞苷单磷酸(CMP)(通过酶促加成或CMP-NANA水解产生的副产物)可充当ST6Gal1的竞争性抑制剂；(d)已经观察到CMP催化逆酶促反应以从新形成的聚糖中去除NeuAc。因此，随着时间的推移，副产物的水平将增加并且这可能导致期望的唾液酸化反应减慢或甚至逆转。

存在产生在Fc结构域分支聚糖上具有高水平二唾液酸化的IgG抗体或IVIg或混合免疫球蛋白的反应条件。例如，当该唾液酸化反应进行足够长的时间并且在唾液酸化反应过程中补充CMP-NANA时，在相对高的IgG抗体浓度(例如，高浓度的IVIg浓度(≥125mg/mL))下，在37℃下，用ST6Gal1的MOPS缓冲液溶液(pH 7.4)进行唾液酸化可提供支链聚糖(例如Fc结构域上的分支聚糖)的高水平二唾液酸化。此外，期望找到另选的替代方案，其减少底物的使用或浓度，减少反应时间或提供制备hsIgG的其他改善。

基于唾液酸化反应的性质，认为添加碱性磷酸酶以从CMP中去除磷酸盐并且将其转化为非抑制性胞苷是有前景的。然而，在所研究的条件下这种修饰仅提供了适度有益效果。在所研究的条件下MOPS缓冲液的pH值的变化看起来不提供有意义的有益效果。还探索了各种金属离子的添加，但在所研究的条件下看起来不提供有意义的有益效果。然而，在检查这些变化的过程中，观察到，添加TRIS缓冲液，即使作为辅助缓冲液，似乎也提供一些有益效果。此外，在一些条件下，观察到减小CMP-NANA浓度可能是有利的。

作为MOPS的补充或另选的替代方案，探索了与TRIS具有一些结构相似性并具有各种pKa的多种缓冲液。测试的缓冲液是下表5中所示的那些。用ST6Gal1和CMP-NANA对含Fc的蛋白质进行唾液酸化。

表5.测试的缓冲液

如图5中可见，缓冲液的性质影响A2F的水平(71％-85％)。

在所检查的条件下，1,6-A1F的形成在缓冲液中变化程度较小，如图6所示。

在BIS-TRIS pH 6.9、TEA pH 7.5、TEA pH 8.0和TRIS pH 8.0中研究IVIg的唾液酸化。此外，因为可能期望将相同的缓冲液用于半乳糖基化和唾液酸化两者，例如，以提供单釜反应，所以还研究了各种缓冲液对半乳糖基化的影响。观察到，看起来对唾液酸化有利的某些缓冲液对半乳糖基化有害。

选择BIS-TRIS以用于进一步研究。因为上述研究中的一些研究似乎指示，在一些条件下，减少CMP-NANA可能是有利的，因此使用IVIg作为底物对酶和糖核苷酸过量和给药方案进行了广泛检查。作为这些研究的一部分，检查了BIS-TRIS缓冲液对半乳糖基化的影响。

在IVIg在BIS-TRIS pH 6.9中的半乳糖基化中，发现可以使用比使用MOPS pH 7.4时少50％的B4GalT酶。如果使用相同量的UDP-Gal，则半乳糖基化在15小时或更短时间内完成。对于后续唾液酸化反应BIS-TRIS pH 6.9，发现可以将CMP-NANA的总量减少50％并且显著减少反应时间(从72+小时减少至32小时-33小时)。下表6和表7提供了在BIS-TRIS缓冲液中观察到的改善的示例。

表6.IVIg的半乳糖基化，将MOPS与BIS-TRIS进行比较

表7.IVIg的唾液酸化，将MOPS与BIS-TRIS进行比较

总的来说，发现通过将MOPS pH 7.4改变为BIS-TRIS pH 6.9，可能使用较少的酶和/或较少的糖核苷酸，但在显著更短的时间内实现高水平的唾液酸化。因此，在50mM BIS-TRIS pH 6.9中的合适反应条件包括：IgG抗体的半乳糖基化(例如，混合IgG抗体、混合免疫球蛋白或IVIg)如下：7.4mM MnCl₂；38μmol UDP-Gal/g IgG抗体；和7.5个单位的B4GalT/gIgG抗体，在37℃下温育16小时-24小时，之后在7.4mM MnCl₂中进行唾液酸化；220μmolCMP-NANA/g IgG抗体(添加两次：反应开始时添加一半和反应9小时-10小时后添加一半)；和15个单位的ST6Gal1/g IgG抗体，在37°下温育30小时-33小时。可通过将ST6Gal1和CMP-NANA添加到半乳糖基化反应中来进行该反应。另选地，可以在开始时将所有反应物组合并补充CMP-NANA。

实施例3：用于在高浓度IVIg或IgG抗体中制备hsIgG的酶促半乳糖基化和唾液酸化

在50mM MOPS缓冲液pH 7.4中，使用UDP-Gal和CMP-NANA以两种顺序酶促反应步骤完成唾液酸化。半乳糖基化通过IVIg(约135mg/ml)与8至15个单位的B4GalT/g IVIg和0.038–0.042mmol UDP-Gal/g IVIg在50mM MOPS缓冲液(pH 7.4)中的溶液以及5mM至8mMMnCl₂反应来进行。使反应在37℃下进行46小时至50小时。接下来，将15.8至18个单位的ST6Gal/g IVIg和CMP-NANA添加到该反应中，并且用50mM MOPS缓冲液(pH 7.4)将IVIg的浓度调节至约120mg/ml。在唾液酸化反应开始时添加CMP-NANA，并在37℃下在总共70小时-74小时的反应时间内以8小时至12小时的时间间隔添加另外5次。添加的CMP-NANA的量为400μmol CMP-NANA/g IVIg。因此，每次添加为总添加量的1/6。

然后将反应冷却至环境温度并用5X磷酸钠缓冲液(PBS)1:1v/v稀释。

评估总聚糖的唾液酸化。大于97％的聚糖被唾液酸化并且大于90％的聚糖被二唾液酸化。

实施例4：反应条件

制备hsIgG时的半乳糖基化反应是相对简单的。然而，唾液酸化反应具有若干挑战。首先，CMP-NANA是不稳定的并且即使在不存在任何酶的情况下也将自发地水解。此外，ST6Gal1被认为还催化CMP-NANA的水解，但不有效加成到聚糖受体上。胞苷单磷酸(CMP)是通过酶促加成或CMP-NANA水解产生的副产物。CMP充当ST6的竞争性抑制剂。此外，已经观察到CMP催化逆酶促反应以从新形成的聚糖中去除NeuAc。因此，随着时间的推移，CMP-NANA的浓度降低，然而随着副产物积聚，唾液酸化反应减慢并反转。然而，当与MOPS作为缓冲液相比时，在BIS-TRIS作为缓冲液的情况下，该逆反应看起来远没有那么有利。

当前，M254通过在MOPS pH 7.4缓冲液中对IVIg药物产品的Fc和Fab聚糖进行酶促唾液酸化产生，所有步骤均在37℃下进行，并且使用非常高的IVIg浓度(～150mg/mL)，其中高蛋白质浓度改善反应动力学。半乳糖基化步骤在48小时内使用温育。为了补偿上文讨论唾液酸化问题，单次添加ST6之后是在72小时内每天两次添加CMP-NANA(总共六次)。这已被称为方法2.0。

期望切换到在标称pH 6.90的BIS-TRIS缓冲液中进行的另选方法，其已被称为方法3.0.0。方法3.0.0使用更少的B4GalT酶、更少的CMP-NANA以及两个步骤的更短总反应时间(56小时相对于120小时)。因此，方法3.0.0产生更低的材料成本和更低的生产成本。

使用方法3.0.0在BIS-TRIS缓冲液中唾液酸化IVIg分别在两个不同设施中的每一个处以实验室规模(≤2g)和较大规模(在50g和250g)两者进行。使用BIS-TRIS缓冲液(方法3.0.0)以较大规模获得的二唾液酸化程度低于在实验室规模下观察到的二唾液酸化程度，并且还低于在同一设施中在MOPS缓冲液(方法2.0)中进行的反应，但其仍满足≥80％二唾液酸化的规格(表8)。因此，进行了研究以尝试和理解哪些反应条件最影响这种差异。尽管半乳糖基化步骤被示为接近理想，但是建议UDP-Gal和B4GalT两者的量增加10％以提供缓冲从而确保最佳结果。

另外，示出相对于最初使用的BIS-TRIS条件，少30％的CMP-NANA和多10％的ST6可产生更高的唾液酸化，并且材料成本的总增加最小。

表8.在CMO下通过TP-01167测量M254的二唾液酸化

¹五次GMP运行的平均值

IVIg溶液

IVIg溶液使用交换到BIS-TRIS缓冲液中的Privigen IVIg药物产品缓冲液来制备。使用用BIS-TRIS pH 6.9缓冲液平衡的G25脱盐柱，之后使用10kDa Vivaspin Turbo 15装置浓缩IVIg流通级分，将一批IVIg进行缓冲液交换。通过切向流过滤(TFF)将三批次5gPrivigen IVIg缓冲液交换到pH6.67、6.93和7.11的50mM BIS-TRIS中。通过切向流过滤(TFF)将一批IVIg缓冲液交换到pH 6.9的50mM BIS-TRIS中，之后使用10kDa VivaspinTurbo 15装置进行浓缩。

使用的IVIg批次、缓冲液交换的方法、缓冲液交换的pH和浓缩后测量的最终pH示于表9中。

表9.使用的IVIg溶液

如果在缓冲液交换和浓缩之后，IVIg溶液的pH位于优选的范围之外，例如，7.2至7.4，优选地约7.3，则应对其进行调节。

通用反应描述

一般来讲，早晨第一件事开始半乳糖基化。在将试剂(IVIg、UDP-Gal、B4GalT酶和MnCl₂)温和混合之后，反应在不搅拌或搅动的情况下于37℃下进行温育。反应不进行无菌过滤。继续温育不同时间。在不同时间下取出两个5uL等分试样，然后冷冻直至分析。在实验结束时，将本体反应材料置于4℃下。

通过添加ST6酶和1/2所需CMP-NANA，引发唾液酸化步骤(通常在24小时半乳糖基化之后)。在一些情况下，首先将半乳糖基化材料分成较小体积以运行多次唾液酸化反应。在9小时时添加第二1/2CMP-NANA。继续温育不同时间。在不同时间下取出两个5uL等分试样，然后冷冻直至分析。在实验结束时，将本体反应材料置于4℃下。

半乳糖基化的程度

通过LCMS量化Fc糖肽上的糖基化程度。表10示出通过LCMS量化的Fc糖肽上的聚糖。完全半乳糖基化涵盖具有两个半乳糖残基(无论是否唾液酸化)的所有聚糖。二唾液酸化被定义为A2F、A2F+平分型GlcNAc、以及A2的总和。

表10.通过LCMS量化的Fc糖肽上的聚糖。

量化的聚糖	完全半乳糖基化中包括的	二唾液酸化中包括的
			G0F	-	-
G1F	-	-
			G2F	G2F	-
1,3-A1F	1,3-A1F	-
			1,6-A1F	1,6-A1F	-
A2F	A2F	A2F
			G1F+NeuAc	-	-
G0F+平分型GlcNAc	-	-
			G1F+平分型GlcNAc	-	-
G2F+平分型GlcNAc	G2F+平分型GlcNAc	-
			A1F+平分型GlcNAc	A1F+平分型GlcNAc	-
A2F+平分型GlcNAc	A2F+平分型GlcNAc	A2F+平分型GlcNAc
			G0	-	-
G1	-	-
			G2	-	-
1,3-A1	G2	-
			1,6-A1	1,3-A1	-
A2	A2	A2
			G1+NeuAc	-

MnCl₂浓度

在该工作开始之前，在MnCl₂的量在宽范围内变化的情况下进行IVIg唾液酸化实验(图3)¹⁰。这清楚地指示，高含量MnCl₂是有害的，并且还提示即使在方法3.0.0中使用7.5mM左右，也可能存在不同的效果。

图7A示出G1F+NeuAc和G1+NeuAc的量随着MnCl₂增加而增加。这些物质得自不完全的半乳糖基化。图7B示出G0F、G1F和G2F的量随着MnCl₂增加而增加。这示出，除了较差的半乳糖基化外，唾液酸化也受到影响，即，在较高MnCl₂的情况下，非唾液酸化物种的量也较高。图8重复这些结果，从而示出二唾液酸化水平。

这些结果促使附加的实验来研究2.5mM至10mM的MnCl₂浓度下限¹¹。这组反应使用IVIg，其使用G25脱盐和Vivaspin浓缩器进行缓冲液交换。

进行半乳糖酰化(使用B4GalT和UDP-Gal，表11)，并且在20小时、24小时、28小时和44小时之后取出样品以进行糖肽分析。然后将44小时样品用CMP-NANA和ST6处理另外48小时，其中获取的样品在28小时、32小时、36小时和48小时下进行分析，这将被称为实验系列A。单独地，将一组样品半乳糖基化24小时，然后唾液酸化另外48小时，采用定时的等分试样，这将被称为实验系列B。LCMS糖肽数据使用Qual Browser进行分析。

表11.用于MnCl₂浓度研究JS1169中的试剂

图9示出对于所有条件，IgG1的半乳糖基化在20小时和44小时之间增加(按MnCl₂浓度分组)。对于其他IgG亚类，观察到类似的结果。

图10示出相同数据，但按时间分组。在此可以看出，在任一时间下，半乳糖基化程度从2.5mM MnCl₂增加至5.0mM，然后下降至7.5mM下降，然后下降至10mM。这清楚地展示出，用5.0mM MnCl₂的半乳糖基化优由于方法3.0.0中使用的7.5mM MnCl₂。

盐浓度

在存在MnCl₂的情况下，在37℃温度下，分别使用UDP-Gal/B4GalT和CMP-NANA/ST6对IVIg的pH 6.9缓冲液溶液进行半乳糖基化和唾液酸化反应。添加各种浓度氯化钠的BIS-TRIS缓冲液溶液以获得0mM、50mM、100mM、150mM和300mM氯化钠的最终反应浓度。在半乳糖基化和唾液酸化反应结束时通过糖肽LCMS获取样品以用于聚糖分析。

如图11、图12、图13、图14、图15和图16所示，将氯化钠添加到半乳糖基化和唾液酸化反应以盐浓度依赖性方式对反应程度具有不利影响。对于所有IgG亚类均观察到该影响，并且对于唾液酸化步骤最明显。取决于IgG亚类，50mM氯化钠的存在可使唾液酸化程度下降4％-9％。

UDP-Gal稳定性

发现UDP-Gal在存在MnCl₂的情况下是不稳定的，从而提供不同于酶催化转移产物(UDP)的分解产物(UMP且推测为1,2-磷酸半乳糖1)。该机制被认为是遵循图17中所示的方案。

UDP-Gal、UDP和UMP的量通过离子对HPLC在Supelcosil LC-18-T柱上进行评估，其使用0.1M磷酸钾、4mM四丁基硫酸氢铵、pH 6.0流动相和254nm紫外检测。通过UV仅检测到含有尿苷的组分，并且不能检测到不与尿苷结合的糖。将产物与已知标准进行比较。

在存在0mM、5mM、10mM或20mM MnCl₂的情况下在37℃下，将UDP-Gal的BIS-TRIS pH6.9缓冲液溶液加热8小时，然后通过离子对HPLC进行评估。在该实验中不包括B4Galt。UDP-Gal的损失量是MnCl₂依赖性的并且随着MnCl₂浓度增加而增加。观察到的唯一其他产物是UMP。在不存在MnCl₂的情况下，几乎看不到UMP。

如图18和图19所示，可在IVIg的半乳糖基化中检测到UDP-Gal的这种非特异性降解。IVIg使用UDP-Gal、B4GalT和5mM MnCl₂的BIS-TRIS缓冲液溶液在三种不同pH下(6.7、6.9和7.1)进行半乳糖基化24小时。使用500MWCO旋转单元将较高分子量的IgG蛋白与低分子量糖核苷酸分离，并将含有核苷酸的级分进样到离子对HPLC上。UMP(峰1)和UDP(峰3)两者的形成是可见的，UMP来自非特异性降解且UDP来自对IgG的聚糖的酶催化转移。随着pH从6.7变为6.9至7.1，UMP的形成增加。UDP的形成看起来不受此处检查的pH范围的影响。

实施例5：高唾液酸化IgG制剂

在另一示例中，使用BIS-TRIS pH 7.3制备hsIgG。因此，在50mM BIS-TRIS pH 7.3中的合适反应条件包括：IgG抗体的半乳糖基化(例如，混合IgG抗体、混合免疫球蛋白或IVIg)如下：5.0mM MnCl₂；42μmol UDP-Gal/g IgG抗体；和8.0个单位的B4GalT/g IgG抗体，在37℃下温育16小时-24小时，之后在5.0mM MnCl₂中进行唾液酸化；110μmol CMP-NANA/gIgG抗体(添加两次：反应开始时添加一半和反应9小时-10小时后再添加一半)；和18个单位的ST6Gal1/g IgG抗体，在37°下温育30小时-33小时。可通过将ST6Gal1和CMP-NANA添加到半乳糖基化反应中来进行该反应。

该方法在21g规模下进行，通过糖肽LCMS实现99％全IgG1半乳糖基化，通过糖肽LCMS实现96％二唾液酸化IgG1，通过N-聚糖释放实现94％二唾液酸化(利用的Agilent的InstantPC试剂盒进行的AdvanceBio Gly-X N-聚糖处理)。这产生N-聚糖的整体释放，从而允许IgG1、IgG2、IgG3、IgG4 Fc聚糖的定量总和以及IVIg中存在～15-25％Fab糖基化。

序列

SEQ ID NO:1(IgG1)

EEQYNSTYR

SEQ ID NO:2(IgG2/3)

EEQFNSTFR

SEQ ID NO:3(IgG3/4)

EEQYNSTFR

SEQ ID NO:4(IgG3/4)

EEQFNSTYR

SEQ ID NO:5(NP_001488.2B4GALT1[生物体＝智人][基因ID＝2683][同工型＝1]

MRLREPLLSGSAAMPGASLQRACRLLVAVCALHLGVTLVYYLAGRDLSRLPQLVGVSTPLQGGSNSAAAIGQSSGELRTGGARPPPPLGASSQPRPGGDSSPVVDSGPGPASNLTSVPVPHTTALSLPACPEESPLLVGPMLIEFNMPVDLELVAKQNPNVKMGGRYAPRDCVSPHKVAIIIPFRNRQEHLKYWLYYLHPVLQRQQLDYGIYVINQAGDTIFNRAKLLNVGFQEALKDYDYTCFVFSDVDLIPMNDHNAYRCFSQPRHISVAMDKFGFSLPYVQYFGGVSALSKQQFLTINGFPNNYWGWGGEDDDIFNRLVFRGMSISRPNAVVGRCRMIRHSRDKKNEPNPQRFDRIAHTKETMLSDGLNSLTYQVLDVQRYPLYTQITVDIGTPS

SEQ ID NO:6(NP_001365424.1B4GALT1[生物体＝智人][基因ID＝2683][同工型＝2]

MPGASLQRACRLLVAVCALHLGVTLVYYLAGRDLSRLPQLVGVSTPLQGGSNSAAAIGQSSGELRTGGARPPPPLGASSQPRPGGDSSPVVDSGPGPASNLTSVPVPHTTALSLPACPEESPLLVGPMLIEFNMPVDLELVAKQNPNVKMGGRYAPRDCVSPHKVAIIIPFRNRQEHLKYWLYYLHPVLQRQQLDYGIYVINQAGDTIFNRAKLLNVGFQEALKDYDYTCFVFSDVDLIPMNDHNAYRCFSQPRHISVAMDKFGFSLPYVQYFGGVSALSKQQFLTINGFPNNYWGWGGEDDDIFNRLVFRGMSISRPNAVVGRCRMIRHSRDKKNEPNPQRFDRIAHTKETMLSDGLNSLTYQVLDVQRYPLYTQITVDIGTPS

SEQ ID NO:7(NP_001365425.1B4GALT1[生物体＝智人][基因ID＝2683][同工型＝3]

MRLREPLLSGSAAMPGASLQRACRLLVAVCALHLGVTLVYYLAGRDLSRLPQLVGVSTPLQGGSNSAAAIGQSSGELRTGGARPPPPLGASSQPRPGGDSSPVVDSGPGPASNLTSVPVPHTTALSLPACPEESPLLVGPMLIEFNMPVDLELVAKQNPNVKMGGRYAPRDCVSPHKVAIIIPFRNRQEHLKYWLYYLHPVLQRQQLDYGIYVINQAGDTIFNRAKLLNVGFQEALKDYDYTCFVFSDVDLIPMNDHNAYRCFSQPRHISVAMDKFGFRLVFRGMSISRPNAVVGRCRMIRHSRDKKNEPNPQRFDRIAHTKETMLSDGLNSLTYQVLDVQRYPLYTQITVDIGTPS

SEQ ID NO:8(NP_001365426.1B4GALT1[生物体＝智人][基因ID＝2683][同工型＝4]

MRLREPLLSGSAAMPGASLQRACRLLVAVCALHLGVTLVYYLAGRDLSRLPQLVGVSTPLQGGSNSAAAIGQSSGELRTGGARPPPPLGASSQPRPGGDSSPVVDSGPGPASNLTSVPVPHTTALSLPACPEESPLLVGPMLIEFNMPVDLELVAKQNPNVKMGGRYAPRDCVSPHKVAIIIPFRNRQEHLKYWLYYLHPVLQRQQLDYGIYVINQYEKIRRLLW

SEQ ID NO:9

MRLREPLLSGSAAMPGASLQRACR

SEQ ID NO:10

LLVAVCALHLGVTLVYYLAG

SEQ ID NO:11

RDLSRLPQLVGVSTPLQGGSNSAAAIGQSSGELRTGGARPPPPLGASSQPRPGGDSSPVVDSGPGPASNLTSVPVPHTTALSLPACPEESPLLVGPMLIEFNMPVDLELVAKQNPNVKMGGRYAPRDCVSPHKVAIIIPFRNRQEHLKYWLYYLHPVLQRQQLDYGIYVINQAGDTIFNRAKLLNVGFQEALKDYDYTCFVFSDVDLIPMNDHNAYRCFSQPRHISVAMDKFGFSLPYVQYFGGVSALSKQQFLTINGFPNNYWGWGGEDDDIFNRLVFRGMSISRPNAVVGRCRMIRHSRDKKNEPNPQRFDRIAHTKETMLSDGLNSLTYQVLDVQRYPLYTQITVDIGTPS

SEQ ID NO:12(B4GalT)

GPASNLTSVPVPHTTALSLPACPEESPLLVGPMLIEFNMPVDLELVAKQNPNVKMGGRYAPRDCVSPHKVAIIIPFRNRQEHLKYWLYYLHPVLQRQQLDYGIYVINQAGDTIFNRAKLLNVGFQEALKDYDYTCFVFSDVDLIPMNDHNAYRCFSQPRHISVAMDKFGFSLPYVQYFGGVSALSKQQFLTINGFPNNYWGWGGEDDDIFNRLVFRGMSISRPNAVVGRCRMIRHSRDKKNEPNPQRFDRIAHTKETMLSDGLNSLTYQVLDVQRYPLYTQITVDIGTPS

SEQ ID NO:13(B4GalT)

gssplldmGPASNLTSVPVPHTTALSLPACPEESPLLVGPMLIEFNMPVDLELVAKQNPNVKMGGRYAPRDCVSPHKVAIIIPFRNRQEHLKYWLYYLHPVLQRQQLDYGIYVINQAGDTIFNRAKLLNVGFQEALKDYDYTCFVFSDVDLIPMNDHNAYRCFSQPRHISVAMDKFGFSLPYVQYFGGVSALSKQQFLTINGFPNNYWGWGGEDDDIFNRLVFRGMSISRPNAVVGRCRMIRHSRDKKNEPNPQRFDRIAHTKETMLSDGLNSLTYQVLDVQRYPLYTQITVDIGTPSprdhhhhhhh

SEQ ID NO:14(NP_001340845.1(NP_003023.1,NP_775323.1)ST6GAL1[生物体＝智人][基因ID＝6480][同工型＝a]

MIHTNLKKKFSCCVLVFLLFAVICVWKEKKKGSYYDSFKLQTKEFQVLKSLGKLAMGSDSQSVSSSSTQDPHRGRQTLGSLRGLAKAKPEASFQVWNKDSSSKNLIPRLQKIWKNYLSMNKYKVSYKGPGPGIKFSAEALRCHLRDHVNVSMVEVTDFPFNTSEWEGYLPKESIRTKAGPWGRCAVVSSAGSLKSSQLGREIDDHDAVLRFNGAPTANFQQDVGTKTTIRLMNSQLVTTEKRFLKDSLYNEGILIVWDPSVYHSDIPKWYQNPDYNFFNNYKTYRKLHPNQPFYILKPQMPWELWDILQEISPEEIQPNPPSSGMLGIIIMMTLCDQVDIYEFLPSKRKTDVCYYYQKFFDSACTMGAYHPLLYEKNLVKHLNQGTDEDIYLLGKATLPGFRTIHC

SEQ ID NO:15(NP_775324.1ST6GAL1[生物体＝智人][基因ID＝6480][同工型＝b]

MNSQLVTTEKRFLKDSLYNEGILIVWDPSVYHSDIPKWYQNPDYNFFNNYKTYRKLHPNQPFYILKPQMPWELWDILQEISPEEIQPNPPSSGMLGIIIMMTLCDQVDIYEFLPSKRKTDVCYYYQKFFDSACTMGAYHPLLYEKNLVKHLNQGTDEDIYLLGKATLPGFRTIHC

SEQ ID NO:16

MIHTNLKKK

SEQ ID NO:17

FSCCVLVFLLFAVICVW

SEQ ID NO:18

KEKKKGSYYDSFKLQTKEFQVLKSLGKLAMGSDSQSVSSSSTQDPHRGRQTLGSLRGLAKAKPEASFQVWNKDSSSKNLIPRLQKIWKNYLSMNKYKVSYKGPGPGIKFSAEALRCHLRDHVNVSMVEVTDFPFNTSEWEGYLPKESIRTKAGPWGRCAVVSSAGSLKSSQLGREIDDHDAVLRFNGAPTANFQQDVGTKTTIRLMNSQLVTTEKRFLKDSLYNEGILIVWDPSVYHSDIPKWYQNPDYNFFNNYKTYRKLHPNQPFYILKPQMPWELWDILQEISPEEIQPNPPSSGMLGIIIMMTLCDQVDIYEFLPSKRKTDVCYYYQKFFDSACTMGAYHPLLYEKNLVKHLNQGTDEDIYLLGKATLPGFRTIHC

SEQ ID NO:19(ST6Gal1)

AKPEASFQVWNKDSSSKNLIPRLQKIWKNYLSMNKYKVSYKGPGPGIKFSAEALRCHLRDHVNVSMVEVTDFPFNTSEWEGYLPKESIRTKAGPWGRCAVVSSAGSLKSSQLGREIDDHDAVLRFNGAPTANFQQDVGTKTTIRLMNSQLVTTEKRFLKDSLYNEGILIVWDPSVYHSDIPKWYQNPDYNFFNNYKTYRKLHPNQPFYILKPQMPWELWDILQEISPEEIQPNPPSSGMLGIIIMMTLCDQVDIYEFLPSKRKTDVCYYYQKFFDSACTMGAYHPLLYEKNLVKHLNQGTDEDIYLLGKATLPGFRTIHC

SEQ ID NO:20(ST6Gal1)

gssplldmlehhhhhhhhmAKPEASFQVWNKDSSSKNLIPRLQKIWKNYLSMNKYKVSYKGPGPGIKFSAEALRCHLRDHVNVSMVEVTDFPFNTSEWEGYLPKESIRTKAGPWGRCAVVSSAGSLKSSQLGREIDDHDAVLRFNGAPTANFQQDVGTKTTIRLMNSQLVTTEKRFLKDSLYNEGILIVWDPSVYHSDIPKWYQNPDYNFFNNYKTYRKLHPNQPFYILKPQMPWELWDILQEISPEEIQPNPPSSGMLGIIIMMTLCDQVDIYEFLPSKRKTDVCYYYQKFFDSACTMGAYHPLLYEKNLVKHLNQGTDEDIYLLGKATLPGFRTIHC

Claims

1.一种制备高唾液酸化IgG(hsIgG)的方法，所述方法包括：

(a)提供混合IgG抗体；

(b)将所述混合IgG抗体在包含β1,4-半乳糖基转移酶(B4GalT)或其酶活性部分、UDP-Gal或其盐、双(2-羟乙基)氨基三(羟甲基)甲烷(BIS-TRIS)缓冲液和MnCl₂的反应混合物中温育，从而制备半乳糖基化IgG抗体；以及

(c)将所述半乳糖基化IgG抗体在包含ST6Gal或其酶活性部分、CMP-NANA或其盐、双(2-羟乙基)氨基三(羟甲基)甲烷(BIS-TRIS)缓冲液和MnCl₂的反应混合物中温育，

从而制备hsIgG。

2.一种制备高唾液酸化IgG(hsIgG)的方法，所述方法包括：

(a)提供混合IgG抗体；

(b)将所述混合IgG抗体在包含β1,4-半乳糖基转移酶(B4GalT)或其酶活性部分、UDP-Gal或其盐、ST6Gal或其酶活性部分、CMP-NANA或其盐、双(2-羟乙基)氨基三(羟甲基)甲烷(BIS-TRIS)缓冲液和MnCl₂的反应混合物中温育，从而形成hsIgG制剂。

3.一种制备高唾液酸化IgG(hsIgG)的方法，所述方法包括：

(a)提供混合IgG抗体；

(b)将所述混合IgG抗体在包含β1,4-半乳糖基转移酶(B4GalT)或其酶活性部分、UDP-Gal或其盐、双(2-羟乙基)氨基三(羟甲基)甲烷(BIS-TRIS)缓冲液和MnCl₂的半乳糖基化反应混合物中温育，从而制备半乳糖基化IgG抗体；

(c)将ST6Gal或其酶活性部分和CMP-NANA或其盐添加到所述半乳糖基化反应混合物中以制备唾液酸化反应混合物；以及

(d)温育所述唾液酸化反应混合物，

从而制备hsIgG。

4.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述B4GalT或其酶活性部分与SEQ IDNO:13具有至少85％的同一性。

5.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述ST6Gal1或其酶活性部分包含与SEQ ID NO:19具有至少90％同一性的氨基酸序列。

6.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中总温育时间小于72小时。

7.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含ST6Gal或其酶活性部分的所述反应混合物的温育时间小于40小时。

8.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应混合物中的每一种各自独立地包含约10mM至约500mM和约pH 5.5至约pH 8.5的BIS-TRIS。

9.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应混合物各自独立地包含约50mM和约pH 7.3的BIS-TRIS缓冲液。

10.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述混合IgG抗体以组合物形式提供，所述组合物还包含约pH 7.2的BIS-TRIS缓冲液。

11.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应混合物中的每一种各自独立地包含约1mM至约20mM的MnCl₂。

12.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应混合物中的每一种各自独立地包含约4.5mM至约5.5mM的MnCl₂。

13.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含每克混合IgG抗体约0.038至约0.046UDP-Gal或其盐。

14.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述反应混合物包含每克IgG抗体约0.1425至约0.1575CMP-NANA或其盐。

15.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中在温育期间用附加的CMP-NANA或其盐补充包含CMP-NANA的所述反应混合物。

16.根据权利要求15所述的方法，其中添加到包含CMP-NANA的所述反应混合物的CMP-NANA或其盐的总量为约0.1425至约0.1575。

17.根据权利要求16所述的方法，其中以少于7份将CMP-NANA的总量添加到所述唾液酸化反应混合物中。

18.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含B4GalT或其酶活性部分的所述反应混合物包含每克混合IgG约7.2U至约8.8U B4GalT或其酶活性部分。

19.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中包含ST6Gal或其酶活性部分的所述反应混合物包含每克混合IgG约17.1U至约18.9UST6Gal1或其酶活性部分。

20.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述温育在约20℃至约50℃下进行。

21.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述温育在约37℃下进行。

22.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述IgG抗体包括从至少1000个供体中分离的IgG抗体。

23.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述IgG抗体的至少50重量/重量％、55重量/重量％、60重量/重量％、65重量/重量％或70重量/重量％为IgG1抗体。

24.根据权利要求23所述的方法，其中所述供体受试者的至少90％已经暴露于病毒。

25.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述hsIgG上的支链聚糖的约60％、65％、70％、75％、80％或85％在α1,3分支和α1,6分支两者上具有唾液酸。

26.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述hsIgG上的支链Fc聚糖的约60％、65％、70％、75％、80％或85％在α1,3分支和α1,6分支两者上具有唾液酸。

27.根据前述权利要求中任一项所述的方法，其中所述hsIgG的Fab结构域上的支链聚糖的至少60％、65％、70％、75％、80％或85％在α1,3臂和α1,6臂两者上具有通过NeuAc-α2,6-Gal末端键连接的唾液酸。

28.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述hsIgG上的支链Fc聚糖的至少80％在α1,3分支和α1,6分支两者上具有唾液酸。

29.根据权利要求28所述的方法，其中所述hsIgG的Fab结构域上的支链聚糖的至少60％、65％、70％在α1,3臂和α1,6臂两者上具有通过NeuAc-α2,6-Gal末端键连接的唾液酸。

30.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述hsIgG上的支链Fc聚糖的至少85％在α1,3分支和α1,6分支两者上具有唾液酸。

31.根据权利要求30所述的方法，其中所述hsIgG的Fab结构域上的支链聚糖的至少60％、65％、70％在α1,3臂和α1,6臂两者上具有通过NeuAc-α2,6-Gal末端键连接的唾液酸。

32.根据权利要求1-24中任一项所述的方法，其中所述hsIgG上的支链Fc聚糖的至少90％在α1,3分支和α1,6分支两者上具有唾液酸。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述hsIgG的Fab结构域上的支链聚糖的至少60％、65％、70％在α1,3臂和α1,6臂两者上具有通过NeuAc-α2,6-Gal末端键连接的唾液酸。