CN115852025B

CN115852025B - 与冬瓜果肉质地主效qtl连锁的snp分子标记及其应用

Info

Publication number: CN115852025B
Application number: CN202211309944.8A
Authority: CN
Inventors: 薛舒丹; 谢大森; 钟玉娟; 刘玲; 徐颖超; 金庆敏; 张思程; 孟琦涛; 邱清娴
Original assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Current assignee: Vegetable Research Institute of Guangdong Academy of Agriculture Sciences
Priority date: 2022-10-25
Filing date: 2022-10-25
Publication date: 2023-09-12
Anticipated expiration: 2042-10-25
Also published as: CN115852025A

Abstract

本发明公开了一种与冬瓜果肉质地主效QTL连锁的SNP分子标记及其应用。该SNP分子标记位于冬瓜12号染色体665586bp的位置处，其多态性为G/C，软质地为G，硬质地为C。本发明的分子标记可利用冬瓜种子或子叶长出的早期阶段就可鉴定。而且可以对商品期的果实无需切开检测质地即可知表型，另外本发明是利用KASP技术，基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型及检测，试验准确度高，成本低、耗时短，可用于冬瓜分子标记辅助选择育种，加速冬瓜感官品质育种的进程。

Description

与冬瓜果肉质地主效QTL连锁的SNP分子标记及其应用

技术领域

本发明属于植物分子遗传育种领域，具体涉及与冬瓜果肉质地主效QTL连锁的SNP分子标记及其应用。

背景技术

冬瓜属于药食兼用的重要葫芦科作物，其口感好，无异味，是我国主要的蔬菜作物之一，年种植面积约33万公顷。其果肉质地是感官品质的重要评价指标，也是果实运输性、贮藏性和货架期的重要决定因素。冬瓜作为南菜北运和调节市场均衡供应的主要蔬菜品种，果肉质地软硬是冬瓜商品性评估的重要参数，影响消费者对商品的选择，以及供应商对于品种的选择。果实质地特性是指通过口腔、牙齿、舌等器官感受食物的状态，可以用来描述果实的纤维组织状况和品尝时的口感。质地不仅可以反应园艺产品的成熟度、特性、衰老度，并且还可以为果实的运输、贮藏和货架供应的时间长度制定评判标准。质地有一个重要的表征指标，那就是机械特性(硬度)。研究冬瓜果肉质地软硬的遗传及分子标记，对于选育符合市场需求的冬瓜新品种具有重要意义。因此，分离冬瓜果肉硬度调控基因，并开展其生物学功能研究对进一步探讨冬瓜果肉硬度形成机制及分子育种具有重要理论及实践意义。然而，截至目前有关冬瓜果肉质地硬度的基因及其分子标记开发的研究尚未见报道。

SLAF-Seq技术(特异性位点扩增片段测序)是基于二代高通量测序的一种简化基因组测序技术，其对特定酶切片段开展双端测序，得到大量遗传多态性标签序列，进而展现整个基因组序列特征，具有高分辨率的SNP位点识别和分型特点。SLAF-Seq技术结合了简化文库、特异性片段扩增方法和高通量测序技术，具有高通量、多态性标签开发效率高和准确度高、可自动避开重复序列、简化复杂基因组、无需参考基因组等优点被广泛应用于生命科学研究的各个领域，对大量多态性分子标记开发、高密度遗传连锁图谱构建、QTL基因精细定位、遗传多样性分析和辅助全基因组测序等方面的研究具有强大优势。

单核苷酸多态性(SNPs)，是继限制性酶切片断长度多态性、可变数量重复序列和微卫星多态性之后的新一代多态性遗传标记，KASP技术(竞争性等位基因特异性PCR)是国际上SNP分型的主流方法之一，可以对SNPs和特定位点上的InDels进行精准的双等位基因判断。这项技术是基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型以及检测InDels(***和缺失)。KASP技术用于大规模检测SNP标记基因分型，缩短标记验证时间，减少标记检测成本，是当前应用于植物分子标记定位和大群体扫描的重要方式。KASP分型技术基于自己独特的PCR原理，可以让所有的位点检测最终都使用通用荧光引物扩增，这大大降低了KASP的试剂成本，既有金标准的准确，又降低了使用成本，所以在医学、农学检测方面KASP都具有非常好的应用前景。

发明内容

本发明的目的在于提供一种与冬瓜果肉质地主效QTL连锁的SNP分子标记以及利用该SNP分子标记快速、简便鉴别冬瓜果肉质地的方法。

本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一方面，提供与冬瓜果肉质地主效QTL连锁的SNP分子标记，命名为FH_SNP1，该SNP分子标记位于冬瓜12号染色体665586bp的位置处，其多态性为G/C。软质地为G，硬质地为C。

在本发明的一些实施方式中，所述分子标记位于SEQ ID NO.1所示序列自5’端起第20位碱基。

本发明利用SLAF-Seq法，高效快速的找到与性状相关的分子标记，以便分子标记辅助育种体系的建立以及快速、高通量地应用于育种实践。

本发明的第二方面，提供一种试剂盒，所述试剂盒用于检测分型本发明第一方面所述的SNP分子标记。

在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒包括KASP引物对。

在本发明的一些实施方式中，所述的KASP引物对包括两条正向引物和一条反向引物，正向引物序列为：

正向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTAAGGCCAGCCCTGAGAGG-3’；

和

正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTAAGGCCAGCCCTGAGAGC-3’；

所述反向引物的序列为：5’-CCAGCAAGCCTGTATCACCA-3’。

所述两条正向引物的5’末端分别连接有FAM，HEX基团的不同荧光标签序列(即正向引物的第1-21碱基是检测接头序列)，3’末端碱基为差异SNP位点。其中荧光基团可使用本领域常用的荧光基团进行替换，本发明并不做特殊限定。

本发明的第三方面，提供本发明第一方面所述SNP分子标记或本发明第二方面所述试剂盒在冬瓜果肉质地鉴定和/或制备冬瓜果肉质地鉴定的产品中的应用。

本发明的第四方面，提供本发明第一方面所述SNP分子标记或本发明第二方面所述试剂盒在冬瓜分子标记辅助育种和/或制备冬瓜分子标记辅助育种的产品中的应用。

本发明的第五方面，提供本发明第一方面所述SNP分子标记或本发明第二方面所述试剂盒在冬瓜种质资源改良和/或制备冬瓜种质资源改良的产品中的应用。

本发明的第六方面，提供一种鉴定冬瓜果肉质地的方法，包括以下步骤：提取待测冬瓜核酸样本，使用本发明第二方面所述试剂盒进行检测，根据SNP分子标记的基因型判断冬瓜的果肉质地。

在本发明的一些实施方式中，若待测冬瓜的SNP分子标记的基因型为GG，则判断为极端质地软的冬瓜；若待测冬瓜的SNP分子标记的基因型为CC，则判断为极端质地硬的冬瓜；待测冬瓜的SNP分子标记的基因型为GC，则判断为硬度居中的冬瓜。

在本发明的一些实施方式中，所述检测的反应程序包括：94℃热启动激活15min；94℃(20sec)，65-57℃(60sec)，每个循环降0.8℃，10个循环；94℃(20sec)，57℃(60sec)，32个循环。反应结束后由TECAN infinite M1000酶标仪读取荧光信号，然后利用在线软件snpdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder/)解析转换荧光信号以图表的形式呈现出来，根据颜色不同，输出基因型结果，判断冬瓜的果肉质地。

本发明的有益效果是：

本发明发现了一个与冬瓜果肉质地主效QTL连锁的SNP分子标记，该SNP分子标记位于冬瓜12号染色体665586bp的位置处，其多态性为G/C。软质地为G，硬质地为C。冬瓜果肉质地硬度性状是在果实商品成熟期基于有损检测即硬度计检测才可明确的品质性状，本发明的分子标记可利用冬瓜种子或子叶长出的早期阶段就可鉴定。而且可以对商品期的果实无需切开检测质地即可知表型，另外本发明是利用KASP技术，基于引物末端碱基的特异匹配来对SNP分型及检测，试验准确度高，成本低、耗时短，可用于冬瓜分子标记辅助选择育种，加速冬瓜感官品质育种的进程。

附图说明

图1为冬瓜果肉硬度的检测结果；图1A，图1B是亲本冬瓜外观图和横切图，*号标注的位置就是横切面测量冬瓜硬度的位置，图1C是冬瓜果肉质地硬度的F₂群体频率分布图。

图2是基于SLAF-seq测序数据以及表型数据对果肉质地QTL定位图，图2A是lod值分布曲线图，图2B是和图2A位置对应的加性效应和显性效应曲线图。

图3为标记FH_SNP1和KASP标记在F₂代群体验证结果；图3A和3B是标记FH_SNP1在F₂代群体验证结果，图中所示，极端质地软的个体聚团在靠近X轴的位置(纯合GG，蓝点)，极端质地硬的个体聚团在靠近Y轴的位置(纯合CC，绿点)，硬度居中的个体聚集在靠近对角线的位置(杂合GC，红点)；图3C是KASP标记基因型在F₂群体的频率分布。

图4是标记FH_SNP1在果肉极端软硬质地的20份遗传背景较远的冬瓜材料中的筛选效果图。

具体实施方式

以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。

若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。

实施例1与冬瓜果肉质地主效QTL连锁的SNP分子标记的获得

1、遗传群体的构建及遗传分析

1.1材料与试剂

以冬瓜重组自交系BNH367(质地软)为母本，B606(质地硬)为父本，获得其杂交F1代，然后F1自交得到F2代群体。共包含198个F2株系，于2021年春季种植于广东省农业科学院蔬菜研究所基地试验田内。

引物由上海生工生物合成，均为PAGE级纯化。

1.2冬瓜果肉质地性状的遗传规律分析

冬瓜果肉硬度的检测采用硬度计，使用带有锥形探针(尖端直径12毫米，高度10毫米)的KM-5硬度计(Takemura Electric Works Co.，Ltd.，Takemura Electric Works Co.，Ltd.，Tokyo，Japan)测量果肉硬度。测量部位：在冬瓜果实中部横切，横切面果皮与心室***的连线中点处(即横切面果肉的中部)，对每个单株果实进行三次重复读数，最后算均值。测量位置如图1所示。对F₂植株果实果肉质地开展表型分析，发现性状频率分布如图2所示，呈单峰正态分布，为典型的数量性状，初步判断存在主效基因。

2、冬瓜遗传图谱构建和果肉质地硬度性状的QTL定位

2.1基因DNA的提取

采用改良十六烷基三甲基溴化铵法(cetyltrimethylammonium bromide,CTAB法)提取冬瓜亲本和F2代的基因组的DNA。2％琼脂糖凝胶电泳检测冬瓜DNA的质量与浓度，将其稀释至50～100ng/μL待用。

2.2SLAF-seq测序数据分析

通过冬瓜基因组进行方案预测，选择HaeIII+Hpy166II酶切组合进行酶切，SLAF标签长度选择在364-414bp，预测到130480个SLAF标签，SLAF标签在基因组各染色体上分布基本均匀，酶切方案可行。利用Illumina HiSeq 2500平台进行测序，测序共获得621.69Mbp数据，测序平均Q30为94.55％，平均GC含量为40.26％，样本GC分布正常。共获得617,440个SLAF标签，其中多态性SLAF标签有79,535个，可以用于遗传图谱构建的标签有20,493个，亲本的有效多态性为3.32％。共构建12个连锁群，上图4,096个Marker，遗传图总图距为1,944.26cM，平均图距0.48cM，上图标记完整度为99.66％，发生双交换的比例为0.01，亲本测序深度为22.115x，子代为11.65x。

2.3遗传图谱的构建及QTL初步定位

利用北京百迈客生物科技有限公司自主研发的SLAF-seq技术和HighMap软件对冬瓜F₂遗传分离群体(2个亲本和198个子代)开发高密度分子标签，进行遗传图谱构建和冬瓜果肉质地性状的QTL关联分析，获得与性状紧密关联的分子标签。利用QTL IciMapping软件，通过复合区间作图法(CIM)定位性状，对群体的表型数据和遗传图谱信息进行分析计算以获得性状相关的QTL，置换检验次数设为1000，QTL判断标准为：p值小于0.01时对应的LOD值作为筛选的阈值，图中以虚线表示。0.99置信度对应的LOD阈值6.54。超过阈值表示为目标基因的连锁定位区间。

FleshHardness检测到一个主效的QTL(FH12.1)，位于连锁群LG12上，遗传图上的起始位置终止位置为(4.26-4.52cM)，定位区间的大小为0.26cM，定位区间的标签数为6个，位于标记Marker5472900至Marker5325370之间，贡献率PVE为26.45％，LOD值为11.38。然而在连锁群LG1上，在遗传图上1.86cM位置也有一个标记位点Marker4569305，其对应的LOD值是8.96，贡献率为15.13％，但是它没有侧翼的其他连锁标记，于是项目基于亲本的深度重测序的数据，开发了此标记位点Marker4569305附近的多态SNP，但是都不与性状紧密连锁，所以连锁群LG12是接下来研究的重点。

连锁群LG12上的主效的QTL(FH12.1)区间，依据亲本的深度重测序数据，筛选此区段上的多态性的标记，最后筛选到位于基因编码区的多态性位点SNP_665586标记与性状连锁，将该SNP分子标记命名为FH_SNP1，该SNP分子标记位于冬瓜12号染色体665586bp的位置处，其多态性为G/C，该位点所在的一段核苷酸序列片段如SEQ ID NO.1所示，该序列第20位碱基S的多态性为G/C；

CTAAGGCCAGCCCTGAGAGSTGAAGCTCGAAAGCTGATTGGTGATACAGGCTTGCTGGACCATCTACTGAAGCATATGGCCGGAAAGGTAGCACCTGGT(SEQ ID NO.1)。软质地为G，硬质地为C。

实施例2 KASP技术用于冬瓜果肉质地软硬的基因分型

准备：两条末端碱基不同的等位基因正向引物与一条反向引物构成的PrimerMix，两条正向引物5’端分别连接有FAM，HEX基团的不同荧光标签序列(即正向引物的第1-21碱基是检测接头序列)；2×PARMS Master mix；DNA模板，H₂O。

KASP反应体系具体为：DNA(10-100ng)，2×PARMS Master mix(5μl)，primer mix(0.7μl)[F1(0.15μl)，F2(0.15μl)，R(0.4μl)]，H₂O(N/A)，Total reaction volume(10μl)。

KASP反应程序：94℃热启动激活15min；94℃(20sec)，65-57℃(60sec)，每个循环降0.8℃，10个循环；94℃(20sec)，57℃(60sec)，32个循环。

PCR反应I：变性模板与Primer Mix中相匹配的引物结合并退火，延伸后序列被加上了检测接头序列；

PCR反应II：等位基因特异性的末端序列的互补链合成；

PCR反应III：信号产生---特异序列对应的检测序列随PCR反应进行指数性增长，相应信号被检测。

本发明涉及的与冬瓜果肉质地主效QTL连锁的SNP分子标记KSAP引物分别为：

正向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTAAGGCCAGCCCTGAGAGG-3’(SEQ IDNO.2)，其中第1-21碱基是检测接头序列(FAM基团的荧光标签序列)，反向引物：5’-CCAGCAAGCCTGTATCACCA-3’(SEQ ID NO.3)；

正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTAAGGCCAGCCCTGAGAGC-3’(SEQ IDNO.4)，其中第1-21碱基是检测接头序列(HEX基团的荧光标签序列)，反向引物：5’-CCAGCAAGCCTGTATCACCA-3’(SEQ ID NO.3)。

PCR完成后，使用TECAN infinite M1000酶标仪读取荧光信号，然后利用在线软件snpdecoder(http://www.snpway.com/snpdecoder/)解析转换荧光信号，得到清晰直观的分型图，并根据颜色不同，输出基因型结果。图表分为X，Y轴，每一个数据点代表一个独立的DNA样品，相同基因型的样品会聚堆在一起呈现相同的颜色。靠近X，Y轴的是纯合基因型(蓝点FAM，绿点HEX表示)，靠近对角线位置的是杂合基因型(红点FAMHEX表示)。软质地(母本)的基因型为G，在靠近X轴的位置(蓝点FAM)，硬质地(父本)的基因型为C，在靠近Y轴的位置(绿点HEX)，群体分型结果显示：极端质地软的个体聚团在靠近X轴的位置(纯合GG，蓝点)，极端质地硬的个体聚团在靠近Y轴的位置(纯合CC，绿点)。大多果肉硬度指标处于中间水平的都聚集在靠近对角线的位置(杂合GC，红点)，证明此标记与性状连锁。

在F₂代群体验证结果如图3所示，其中3A和图3B是标记FH_SNP1在F₂代群体验证结果，图中所示，极端质地软的个体聚团在靠近X轴的位置(纯合GG，蓝点)，极端质地硬的个体聚团在靠近Y轴的位置(纯合CC，绿点)，硬度居中的个体聚集在靠近对角线的位置(杂合GC，红点)；图3C是KASP标记基因型在F₂群体的频率分布。

实施例3连锁SNP标记在自然群体中的验证

选取田间果肉极端软硬质地的40份遗传背景较远的冬瓜材料，其中果肉质地硬度低于2.1kg/cm²的有10份材料，高于2.8kg/cm²的有10份材料，通过群体验证来确定实施例1的SNP标记用于分子标记辅助选择的准确性。这些材料果肉硬度不同，基于带有锥形探针(尖端直径12毫米，高度10毫米)的KM-5硬度计测量果肉硬度。测量部位：在冬瓜果实中部横切，横切面果皮与心室***的连线中点处(即横切面果肉的中部)，对每个单株果实进行三次重复读数，最后算均值。对连锁标记SNP_665586进行验证，自然群体分型结果图4显示：质地软的个体都聚团在靠近X轴的位置(纯合GG，蓝点)，质地硬的个体都聚团在靠近Y轴的位置(纯合CC，绿点)。证明此标记与性状紧密连锁。

上述具体实施方式对本发明作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims

1.试剂盒在冬瓜果肉质地硬度鉴定和/或制备冬瓜果肉质地硬度鉴定的产品中的应用，其特征在于，所述试剂盒用于检测SNP分子标记，所述SNP分子标记位于冬瓜12号染色体665586 bp的位置处，其多态性为G/C；所述SNP分子标记位于SEQ ID NO.1所示序列5’端起第20位碱基。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂盒包括用于检测所述SNP分子标记的KASP引物对。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述KASP引物对包括两条正向引物和一条反向引物，所述正向引物的序列为：

正向引物1：5’-GAAGGTGACCAAGTTCATGCTCTAAGGCCAGCCCTGAGAGG-3’；

和

正向引物2：5’-GAAGGTCGGAGTCAACGGATTCTAAGGCCAGCCCTGAGAGC-3’；

所述反向引物的序列为：5’- CCAGCAAGCCTGTATCACCA-3’。

4.一种鉴定冬瓜果肉质地硬度的方法，包括以下步骤：提取待测冬瓜的核酸样本，使用权利要求1～3任一项中所述的试剂盒进行检测，根据所述SNP分子标记的基因型判断待测冬瓜的果肉质地硬度。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，若待测冬瓜的SNP分子标记的基因型为GG，则判断为极端质地软的冬瓜；若待测冬瓜的SNP分子标记的基因型为CC，则判断为极端质地硬的冬瓜；若待测冬瓜的SNP分子标记的基因型为GC，则判断为硬度居中的冬瓜。