CN115851946B - CaMK I作为治疗靶点在制备胰腺癌治疗药物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了CaMK I作为治疗靶点在制备胰腺癌治疗药物中的应用。本发明研究显示CaMK I表达水平上调能抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭，敲低CaMK I能促进胰腺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭；CaMK I表达上调能显著抑制胰腺癌细胞株裸鼠皮下瘤的发生发展，表明CaMK I可作为胰腺癌治疗药物的作用靶点，用于制备或筛选胰腺癌治疗药物。

Description

CaMK I作为治疗靶点在制备胰腺癌治疗药物中的应用

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，更具体地，涉及CaMK I作为治疗靶点在制备胰腺癌治疗药物中的应用。

背景技术

胰腺癌发病率和死亡率较高，因胰腺癌起病隐匿、进展迅速、易发生早期转移等特点，绝大部分患者确诊后即失去最佳的根治手术时机。据2016年美国癌症协会统计胰腺癌患者的平均5年生存率低于10％，局部晚期或者出现转移的胰腺癌患者的平均5年生存率则低于3％。根据病理类型胰腺导管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)约占胰腺癌病理类型的90％以上。根治性手术切除仍然是PDAC患者治愈的首要选择，然而值得注意的是，PDAC患者手术切除后的复发率仍高达85％。对于这部分患者，吉西他滨联合白蛋白紫杉醇或FOLFIRINOX综合化疗方案是除了根治性切除手术之外的“金标准”。随着对胰腺癌分子生物学特性以及相关机制的不断研究，发掘导致胰腺癌发生发展的关键驱动基因并针对这些驱动基因进行分子靶向治疗或许能为胰腺癌患者带来新的曙光。截止到目前，美国食品和药物管理局(Food and Drug Administration，FDA)批准上市的分子靶向药物已经在乳腺癌、白血病、结直肠癌、肺癌以及卵巢癌中取得了显著的临床效果，这些研究也为胰腺癌分子靶向治疗提供更多参考价值。

钙/钙调蛋白依赖性蛋白激酶I(calcium/calmodulin-dependent proteinkinase I，CaMK I)在细胞中广泛表达，在Ca²⁺信号通路中发挥关键作用，目前已知CaMK I的四种亚型分别是CaMK Iα，CaMK Iβ，CaMK Iγ和CaMK Iδ。与CaMKK类似，这四种CaMK I亚型具有相同的催化结构域，该结构域与自动调节结构域相邻，包含与钙调蛋白(calmodulin，CaM)结合区域重叠的自抑制区域。由于自抑制区域的存在，CaMK I常处于无活性状态。CaM与Ca²⁺结合形成复合物能够与CaMK I结合减轻自抑制区域的自抑制作用从而激活CaMK I。在体内，CaMK I参与多种生物学过程。例如，部分因营养物质缺乏以及药物诱导的自噬过程能够通过调控CaMK I促进自噬体膜的形成；中国专利CN112972447A公开了CaMK II抑制剂在制备预防和/或治疗急性胰腺炎的药物中的应用，蒋文等公开了CaMK II在小鼠重症急性胰腺炎胰腺损伤中的作用(蒋文,吴俊,曽佳容,等.CaMK II在小鼠重症急性胰腺炎胰腺损伤中的作用[J].南方医科大学学报,2022,42(2):7.)，但是关于CaMK I在胰腺癌治疗中的作用还未知。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术中存在的上述缺陷和不足，提供CaMK I作为治疗靶点在制备胰腺癌治疗药物中的应用。

本发明的上述目的是通过以下技术方案给予实现的：

本发明通过分别构建CaMK I过表达及CaMK I敲减稳转细胞株，再通过细胞增殖和克隆形成实验、细胞迁移实验和细胞划痕实验、细胞侵袭实验，结果显示CaMK I表达水平上调能抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭，敲低CaMK I能促进胰腺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭。通过胰腺癌细胞株裸鼠皮下瘤实验显示，CaMK I表达上调能显著抑制胰腺癌细胞株裸鼠皮下瘤的发生发展。表明CaMK I可作为胰腺癌治疗药物的作用靶点。因此本发明提供关于CaMK I在胰腺癌治疗中的以下应用：

CaMK I作为治疗靶点在制备或筛选治疗胰腺癌的药物中的应用。

CaMK I作为治疗靶点在制备或筛选抑制胰腺癌增殖、侵袭和/或迁移的药物中的应用。

促进CaMK I表达的制剂在制备治疗胰腺癌的药物中的应用。

促进CaMK I表达的制剂在制备抑制胰腺癌增殖、侵袭和/或迁移的药物中的应用。

优选地，所述促进CaMK I表达的制剂为CaMK I过表达质粒。

本发明还提供一种治疗胰腺癌的药物，包括CaMK I和/或促进CaMK I表达的制剂。可通过直接施用CaMK I蛋白或施用促进CaMK I表达的制剂来提高患者机体中CaMK I蛋白表达量，或者两者同时施用。

优选地，所述促进CaMK I表达的制剂为CaMK I过表达质粒。

优选地，还包括药学上可添加的辅料。

进一步优选地，所述辅料包括稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体或润滑剂中的一种或多种。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供了CaMK I作为治疗靶点在制备胰腺癌治疗药物中的应用。本发明研究显示CaMK I表达水平上调抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭，敲低CaMK I能促进胰腺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭；CaMK I表达上调能显著抑制胰腺癌细胞株裸鼠皮下瘤的发生发展，表明CaMK I可作为胰腺癌治疗药物的作用靶点，用于制备或筛选胰腺癌治疗药物。

附图说明

图1为CaMK I过表达及CaMK I敲减稳转细胞株中CaMK I的表达情况。(A)qRT-PCR结果；(B)Western Blot结果。

图2为CCK-8细胞增殖实验结果。

图3为克隆形成实验结果

图4为Transwell细胞迁移实验结果。

图5为细胞划痕实验结果。

图6为Transwell细胞侵袭实验结果。

图7为胰腺癌细胞株裸鼠皮下瘤实验结果。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

下述实施例中所用雄性BALB/c裸鼠(4-6w)购自上海斯莱克实验动物有限公司，饲养于SPF级动物实验中心，饲养条件为普通饲料喂养，保证实验鼠自由进食，水源充足，提供的光照时间为12小时，保证实验鼠睡眠充足，实验饲养温度为18～28℃，日温差≤3℃，相对湿度适宜。实验过程严格遵照动物福利伦理，实验设计方案经动物实验伦理委员会批准。

通过以下实施例研究CaMK I在胰腺癌中的生物学作用，结果表明CaMK I表达水平上调抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭，敲低CaMK I能促进胰腺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭。CaMK I表达上调能显著抑制胰腺癌细胞株裸鼠皮下瘤的发生发展。

实施例1CaMK I过表达及敲除细胞系的构建

1、方法

(1)过表达质粒及敲除载体的构建

为了探讨CaMK I对胰腺癌细胞的影响，分别使用靶向CaMK I的过表达以及干扰慢病毒，在PANC-1及BXPC3细胞系(由复旦大学附属中山医院胰腺外科提供)中过表达和敲减CaMK I的表达。以上胰腺癌细胞实验前均进行了STR鉴定，无支原体污染。具体构建方法如下：CaMK I过表达质粒构建采用GV492载体，元件顺序为：Ubi-MCS-3FLAG-CBh-gcGFP-IRES-puromycin，BamHI/AgeI酶切；CaMK I的shRNA(Short hairpin RNA)构建至用GV493载体，元件顺序为：hU6-MCS-CBh-gcGFP-IRES-puronmycin，AgeI/EcoRI酶切。以上均由上海吉凯生物科技有限公司合成，分别得到过表达CaMK I质粒(CaMK I)及对照(Vector)质粒，表达NC-shCaMK I的敲除载体(Control)，表达shCaMK I-1的敲除载体。靶向CaMK I的shRNA序列为：ccAGTCGGTGAGTGAGCAGAT。

(2)慢病毒包装

慢病毒包装由上海吉凯生物科技有限公司完成，具体包装过程按照上海吉凯生物科技有限公司说明书进行，具体过程如下：采用携带目的基因或靶点序列的工具载体质粒、病毒包装辅助质粒Helper 1.0以及病毒包装辅助质粒Helper 2.0，将这三质粒共转染293T细胞，在转染完成后的48-72h进行病毒收获(即未纯化的细胞上清液)，根据不同的实验需求，确定采用相应的浓缩纯化方式得到高滴度的慢病毒保存液，最后根据严格的质量标准测定慢病毒的各项指标。

(3)慢病毒感染

将生长状态良好的PANC-1及BXPC3细胞系消化离心后接种于六孔板中，待细胞融合度达30％进入生长对数期时开始进行转染实验，按照吉凯附带的说明书根据细胞感染复数(multiplicity of infection，MOI)确定转染所需病毒体积(每孔添加病毒体积＝MOI×细胞数目/病毒滴度)。

(4)转染效率评估

通过观察转染72h后细胞GFP的表达情况，RT-qPCR以及Western Blot结果，评估转染效果。RT-qPCR实验中所用的引物序列为：β-Actin内参引物为β-Actin-F和β-Actin-R，CaMK I的特异性引物为CaMK I-F和CaMK I-R。以上引物序列分别为：β-Actin-F：GAGACCTTCAACACCCC，β-Actin-R：GTGGTGGTGAAGCTGTAGCC，CaMK I-F：GGAAGCAGGCGGAAGACATTA，CaMK I-R：GTCCTCTGCCAGGATCACTT。Western Blot实验中内参抗体为β-Actin(Cell Signaling Rabbit mAb 4970)，CaMK I抗体为Abcam(ab68234)。

结果如图1所示，qRT-PCR结果显示，与Vector对照组相比，CaMK I表达水平在PANC-1及BXPC3转染的过表达稳转株中显著上调；与Control对照组(对照质粒NC-shRNA)相比，CaMK I的表达水平在PANC-1及BXPC3转染的敲减稳转株中(shCaMK I)显著下调(*P<0.05，***P<0.001)(图1A)。Western Blot结果显示，与Vector对照组相比，CaMK I蛋白表达量在PANC-1及BXPC3转染的过表达稳转株中上调；与Contro对照组相比，CaMK I蛋白表达量平在PANC-1及BXPC3转染的敲减稳转株中(shCaMK I)减少(图1B)。表明分别成功构建得到CaMK I过表达及CaMK I敲减稳转细胞株。

实施例2CCK-8细胞增殖和克隆形成实验

1、方法

CCK-8细胞增殖实验方法如下：将实施例1构建得到的长状态良好的稳转细胞株用胰酶消化重悬后调整细胞数量为(3-5)×10⁴/ml，然后在96孔板中每个孔加入100μL细胞悬液，添加完毕后放入37℃培养箱中培养。培养2h后在每个孔中加入10ul的CCK-8试剂(Dojindo ck-04)后继续放入培养箱中培养2h。为检测光密度值(optical density，OD)值，将酶标仪参数调整为450nm，后续按照实验需要调整添加CCK-8的时间间隔。

克隆形成实验方法如下：取对数期的稳转细胞株，胰酶消化计数后确保贴壁的胰腺癌细胞成为单个独立的个体，按照每一个孔内大约有500-1000个细胞的数量进行接种，接种结束后晃动六孔板保证细胞分布均匀，然后放入37℃培养箱培养15天。培养过程中密切观察细胞生长情况，待形成单个肉眼可见的克隆时弃去培养基，然后用PBS清洗后加入多聚甲醛室温固定30min，固定结束后弃去多聚甲醛加入1％的结晶紫染液染色30min，染色结束后用自来水冲洗干净，倒置晾干。

2、结果

结果如图2-3所示，CCK-8细胞增殖实验结果显示，PANC-1及BXPC3细胞系中CaMK I过表达组的增殖能力较Vector对照组相比显著降低；同时PANC-1及BXPC3 CaMK I敲低组(shCaMK I)的细胞增殖能力较对照组Control显著增强(*P<0.05，***P<0.001)(图2)，表明过表达CaMK I能显著抑制胰腺癌细胞系PANC-1及BXPC3的增殖，敲低CaMK I表达则导致胰腺癌细胞系PANC-1及BXPC3增殖能力变强。克隆形成实验结果显示，过表达CaMK I能抑制胰腺癌细胞系PANC-1及BXPC3的克隆形成能力，敲低CaMK I表达则导致胰腺癌细胞系PANC-1克隆形成能力增强(*P<0.05，**P<0.01，ns：no significance)(图3)，表明过表达CaMK I能抑制胰腺癌细胞系PANC-1及BXPC3的克隆形成能力，敲低CaMK I表达则导致胰腺癌细胞系PANC-1克隆形成能力增强。

实施例3Transwell细胞迁移实验和细胞划痕实验

1、方法

Transwell细胞迁移实验方法如下：将生长状态良好的稳转细胞株用胰酶消化后，吹打重悬调整密度为2×10⁵/ml。向每个Transwell下层孔板中加入800μL完全培养基，加入培养基后将Transwell小室放入下层孔板中，检查并确认小室底层的膜与下层孔板中的培养基之间无气泡。在小室内加入调整好密度的细胞悬液200μL盖上盖子放进37℃培养箱内培养24h。从培养箱中取出Transwell小室，弃去孔内的培养液后加入800μL的多聚甲醛固室温固定30min。固定结束后用无菌PBS清洗，清洗结束后弃去PBS加入1％的结晶紫水溶液染色30min，染色结束后用ddH₂O冲洗干净，自然晾干后显微镜下计数并统计。

细胞划痕实验方法如下：将生长状态良好的稳转细胞用胰酶消化后接种于六孔板中，轻轻晃动使细胞分布均匀，然后放入培养箱中培养。待镜下观察细胞融合度达90％时则用无菌200μL移液枪头沿着直线方向划痕。使用无菌PBS清洗去除划下的多余漂浮细胞，然后加入不含血清的培养基进行培养。划痕后(0h)在倒置显微镜下观察细胞迁移的最初间隔，间隔24h后记录细胞的迁移状态。按照(0h细胞划痕间隔-24h细胞迁移间隔)/0h细胞划痕间隔计算细胞迁移率。

2、结果

结果如图4-5所示：Transwell细胞迁移实验结果表明，过表达CaMK I能显著抑制胰腺癌细胞系PANC-1及BXPC3的迁移，敲低CaMK I表达则导致胰腺癌细胞系PANC-1及BXPC3迁移能力增强(图4)。细胞划痕实验结果也表明过表达CaMK I能显著抑制胰腺癌细胞系PANC-1及BXPC3的迁移，敲低CaMK I表达则导致胰腺癌细胞系PANC-1及BXPC3迁移能力增强(图5)。以上统计检验方法为t检验。*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。

实施例4Transwell细胞侵袭实验

1、方法

Transwell细胞迁移实验方法如下：实验开始24h前将Matrigel基质胶放入4℃冰箱融化，将融化的Matrigel基质胶与无血清的培养液按照1：8的比例稀释混匀，然后在每个Transwell小室内添加50μL配好的基质胶稀释液，均匀铺开后盖上盖子放回培养箱约2h使基质胶凝固取生长状态良好的细胞，用胰酶消化后用无血清的培养液重悬后调整细胞密度为4×10⁵/ml的细胞悬液。取出添加过基质胶的Transwell小室，在每个孔板内加入800μL添加过血清的培养液，在每个小室内加入200μL细胞悬液，保证小室底部的膜与下层孔板之间没有气泡。放入培养箱中培养24h，后续固定、结晶紫染色步骤同上。

2、结果

结果如图6所示，Transwell细胞侵袭实验结果表明，过表达CaMK I能显著抑制胰腺癌细胞系PANC-1及BXPC3的侵袭，敲低CaMK I表达则导致胰腺癌细胞系PANC-1及BXPC3侵袭能力增强。统计检验方法为t检验。*P<0.05；

**P<0.01；***P<0.001。

实施例5胰腺癌细胞株裸鼠皮下瘤实验

选择雄性BALB/c裸鼠(4-6w，体重：16～20g)，所有裸鼠均饲养在SPF环境中。待PANC-1稳转细胞株融合度达到90％时用胰酶消化后离心并用无菌PBS重悬，调整细胞密度为2×10⁶个细胞/100μL后放在冰盒里准备后续操作。将BALB/c裸鼠分为两组，每组8只，分别是接种CaMK I过表达细胞组(CaMK I)及接种Vector对照组细胞组(Vector)。用一次性微量注射器吸取100μL细胞悬液后缓慢注射到裸鼠腋部皮下，注射过程应该缓慢轻柔防止裸鼠挣扎导致漏液、渗液。注射后按压穿刺点1min，然后每日观察裸鼠的状况，并以一周两次的频率用游标卡尺记录瘤体的最长径和最短径，计算肿瘤体积(皮下肿瘤体积的计算按照V＝(a×b²)/2计算，其中a为皮下肿瘤长径距离，b为皮下肿瘤短径距离，根据测量值绘制肿瘤体积生长曲线)。接种大概6周后观察肿瘤最大直径是否超过伦理要求，遵照动物伦理要求用颈椎脱臼法处死裸鼠，取出皮下肿瘤称重、拍照。

结果如图7所示，CaMK I过表达组的肿瘤生长曲线较Vector对照组平缓，肿瘤生长速度缓慢；CaMK I过表达组小鼠的肿瘤体积和肿瘤质量较Vector对照组明显减小(***P<0.001)；裸鼠皮下肿瘤生长曲线变化趋势以及肿瘤质量结果表明，CaMK I表达上调能显著抑制胰腺癌细胞株裸鼠皮下瘤的发生发展。***P<0.001。

以上结果显示，CaMK I表达水平上调能抑制胰腺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭，敲低CaMK I能促进胰腺癌细胞的增殖、迁移以及侵袭，CaMK I表达上调能显著抑制胰腺癌细胞株裸鼠皮下瘤的发生发展。表明CaMK I可作为治疗靶点在制备或筛选治疗胰腺癌的药物，制备或筛选抑制胰腺癌增殖、侵袭和/或迁移的药物。

Claims (1)

1.促进CaMK I表达的制剂在制备治疗胰腺癌的药物中的应用，其特征在于，所述制剂为CaMK I过表达质粒。