CN115851727A - 一种靶向干扰新冠病毒s蛋白的小核酸rna干扰及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种靶向干扰新冠病毒S蛋白的小核酸RNA干扰及应用，本发明从SARS‑CoV‑2 Delta中提取了S蛋白基因的813nt片段作为shRNA靶点；813nt含有S蛋白基因RBD的大部分和的RBD之后部分下游区，基于这个813nt片段序列，设计、制备了shRNA688并进行了RNAi实验。本发明提供的shRNA其序列中有义序列为GGTGT TCTTA CTGAG TCTAA C，如SEQ ID NO.10所示，本发明的shRNA显著降低了S蛋白mRNA Est813转录物的浓度。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种RNAi疗法，具体涉及一种靶向干扰新冠病毒S蛋白的小核酸RNA干扰及应用。
背景技术
全球新冠病毒-19大流行是由严重急性呼吸综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)引起的。疫苗能显著减缓阳性病例和死亡人数的增加，然而，疫苗接种可能无法完全覆盖全球人口。此外，SARS-CoV-2变异株对先前的感染或疫苗接种而逃避免疫，这种变异株不断出现。Omicron变异体的出现表明SARS-CoV-2进化的速度有多快，其对当前主要针对高度突变的棘突(S)蛋白的，基于蛋白质干预(即疫苗、抗体或恢复期血浆)的潜在影响不容忽视。抗新冠病毒药物治疗中的一个新兴概念涉及基于核酸的疗法的开发，该疗法可以降解病毒基因组，并可以根据病毒突变而快速调整。基于核酸的疗法包括小干扰RNA(siRNAs)。这些约19～21个碱基对长的非编码RNA双链，能够通过介导靶向mRNA降解，以序列特异的方式击倒靶基因的表达。经细胞摄取后，siRNA双链被加载到RNA诱导沉默复合物(RISC)中。双链被加工成单链，与细胞质中存在的互补RNA具有高度特异性结合，导致其分离。正在进行的疫情大流行促使多个研究小组评估基于siRNA的新冠病毒治疗。虽然迄今为止发表的大多数研究都回顾了RNA干扰治疗新冠病毒的潜力，通过计算机预测研究进行了描述，也提供了初步的概念推理认证，即SARS-CoV-2可以被siRNA抑制。针对SARS-CoV-2RNA基因组的Orf1a/b区域设计的siRNA，编码非结构蛋白(nsp)，进行了测试。发现了一种高效抑制SARS-CoV-2复制的siRNA。对共同表达针对SARS-CoV-2RdRp和N基因的短发夹RNA(shRNAs)混合物的腺相关病毒载体进行了检测。结果表明，RNAi具有治疗干预的潜力和前景。深入了解有效抑制病毒复制是制定有效抗病毒策略的必要条件。
SARS-CoV-2是一种有外壳的单链大RNA病毒，具有5'端非翻译区(UTR)，ORF1a/bRNA编码非结构病毒蛋白，3'端段编码结构蛋白，例如与人宿主细胞上的人类血管紧张素转换酶2(hACE2)受体结合的S蛋白，以及参与病毒粒子组装的核衣壳N蛋白，和3'UTR。作为对新冠病毒大流行的全球应对措施，公共数据库中提供了大量SARS-CoV-2变体的基因组，包括SARS-CoV-2变体S蛋白基因和蛋白质序列(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/？Term＝SARS-CoV-2％2C+S+protein).S蛋白的动态特性，尤其是更易传播的Delta和Omicron变体已经发布了。Omicron S蛋白，包括RBD中积累了更多的突变。S蛋白受体结合域(RBD)的突变影响其与ACE2的亲和力。SARS-CoV-2具有较大的RNA基因组，但在人肺上皮细胞的细胞质中复制时，没有整合到人类基因组中。病毒的复制是一个连续的过程，而亚基因组mRNA的转录是一个不连续的过程。研究了腺苷类似物(SARS-CoV-2RNA依赖RNA聚合酶抑制的主要重组药物)的抗病毒效果。使用核酸反义寡核苷酸被描述为一种潜在的针对SARS-CoV-2RNA的新型治疗策略。与SARS-CoV-2的5′先导序列结合的反义寡核苷酸破坏了高度保守的干环结构，具有纳米级效力，可防止病毒在人类细胞中复制。
对于阻止SARS-CoV-2大流行新疫苗和药物的发明迫在眉睫。虽然目前已经研发制备了一些具有预防效果的疫苗和治疗性的中和抗体来针对已发现的SARS-CoV-2。但是，由于病毒正在不断变异，之前的成果已经不能满足对付病毒新的突变株。许多国家的科学家也都在争分夺秒地研制抗病毒的治疗药物。
基因(DNA)要制造出蛋白质，必须借助一个中介，这个中介就是单链的mRNA(核苷酸单链)。科学家发现短的双链RNA可以干扰单链mRNA，导致单链mRNA降解及失去作用，从而不能表达生成蛋白质，RNAi意思就是核苷酸干扰的意思，i是英文interfere的首字母。2006年的诺贝尔医学奖，就颁发给2位发现RNAi的科学家。
正在进行的疫情大流行促使多个研究小组评估基于siRNA的新冠病毒治疗，基于核酸的疗法包括小干扰RNA(siRNAs)。这些约19～21个碱基对长的非编码RNA双链，能够通过介导靶向mRNA降解，以序列特异的方式击倒靶基因的表达。经细胞摄取后，siRNA双链被加载到RNA诱导沉默复合物(RISC)中。双链被加工成单链，与细胞质中存在的互补RNA具有高度特异性结合，导致其分离。虽然迄今为止发表的大多数研究都回顾了RNA干扰治疗新冠病毒的潜力，通过计算机预测研究进行了描述，也提供了初步的概念推理认证，即SARS-CoV-2可以被siRNA抑制。针对SARS-CoV-2RNA基因组的Orf1a/b区域设计的siRNA，编码非结构蛋白(nsp)，进行了测试。发现了一种高效抑制SARS-CoV-2复制的siRNA。对共同表达针对SARS-CoV-2RdRp和N基因的短发夹RNA(shRNAs)混合物的腺相关病毒载体进行了检测。结果表明，RNAi具有治疗干预的潜力和前景。深入了解有效抑制病毒复制是制定有效抗病毒策略的必要条件。
发明内容
本发明的目的是克服现有技术的缺点与不足，提供一种靶向干扰新冠病毒S蛋白的小核酸RNA干扰及应用。
在本研究，设计了shRNA，靶向作用于在聚类分析后选出的S蛋白基因(Delta)的813bp Est。分析公共数据库中SARS-CoV-2变异体基因组中S蛋白基因的保守区和突变区。将编码S蛋白RBD的大部分和RBD部分下游的813bp片段克隆到上游红色荧光蛋白基因(RFP)成为融合基因，构建成作为RNAi的潜在靶基因表达的pCMV-S-蛋白RBD-Est-RFP质粒。编码shRNA688的双链DNA构建在质粒的人类H1启动子下游，该质粒也可以表达绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因。EGFP和shRNA在质粒中的双重表达可以方便地了解基因转染效率。这两种构建的质粒通过Lipofectamine 2000共转染到HEK293T。通过分析基因转染细胞的图像和用靶向SARS-CoV-2S蛋白基因的特异探针进行荧光定量逆转录聚合酶链反应(RT qPCR)，分析经RNAi处理的转染HEK293T细胞中表达的SARS-CoV-2S蛋白质基因转录物的降解情况。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
第一方面：
本发明提供一种shRNA，其序列中有义序列为GGTGT TCTTA CTGAG TCTAA C，如SEQID NO.10所示。
进一步，所述的shRNA，其包含如下序列：
AGCTTGGTGTTCTTACTGAGTCTAACTTCAAGAGCGTTAGACTCAGTAAGAACACCTTTTTTG，如SEQID NO.8所示。
进一步，所述的shRNA，其包含如下寡核苷酸组合：
shRNA F:
AGCTTGGTGTTCTTACTGAGTCTAACTTCAAGAGCGTTAGACTCAGTAAGAACACCTTTTTTG，如SEQID NO.8所示；
shRNA R:
AATTCAAAAAAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACGCTCTTGAAGTTAGACTCAGTAAGAACACCA，如SEQID NO.9所示。
第二方面：
本发明提供一种包含如上所述的shRNA的重组质粒。
所述重组质粒还包括用于驱动shRNA表达的人H1启动子、用于驱动绿色荧光蛋白EGFP基因表达的pCMV启动子。
第三方面：
本发明还提供一种重组质粒的构建方法，包括如下步骤：
S1、以含有基因转染标记的pCMV-EGFP基因的pSIL-EGFP载体为基本载体；
S2、将人类RNA聚合酶III型启动子H1启动子通过XhoI CTCGAG和HindIII AAGCTT酶切位点构建于pCMV-EGFP区域的上游；
S3、将shRNA通过HindIII AAGCTT和EcoRI GAATTC构建位点整合在H1启动子下游。
第四方面：
本发明提供包含如上所述的shRNA或重组质粒的新冠病毒S蛋白抑制剂。
第五方面：
本发明还提供包含如上所述的shRNA或重组质粒的试剂盒。
第六方面：
所述的shRNA在制备治疗新冠病毒的药物中的应用也属于本发明的保护范围。
所述shRNA在靶向干扰SARS-CoV-2中的应用也属于本发明的保护范围。
进一步，本发明还提供一种靶向干扰新冠病毒S蛋白的特异性shRNA的筛选方法，包括如下步骤：
从SARS-CoV-2提取S蛋白基因的813nt片段作为shRNA靶点，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示，其包括S蛋白质基因的RBD区域部分和RBD之后的高度保守的部分下游区域。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1、本发明将编码shRNA的双链DNA构建于质粒的人类H1启动子下游，其pCMV启动子驱动增强的绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因表达，靶向S蛋白基因保守区的shRNA688能够有效地降低S蛋白基因。
2、本发明为广谱小核酸RNAi抗SARS-CoV-2药物或其他危害人类疾病病毒的RNAi药物的研发提供了细胞模型和技术支持。
3、本发明采用了由H1启动子驱动shRNA的技术，通过RNA干扰的原理来降解新冠病毒S蛋白质基因。如果采用该现有抗新冠病毒S蛋白质抗体专利，则会产生随着新冠病毒的突变，而部分或完全的丢失抗病毒的功能的缺陷。
4、所构建的shRNA688靶向SARS-CoV-2的S蛋白基因的高度保守区域
在本研究中，我们从SARS-CoV-2Delta中提取了S蛋白基因的813nt片段作为shRNA靶点。813nt含有S蛋白基因RBD的大部分和的RBD之后部分下游区。基于这个813nt片段序列，我们设计、制备了shRNA688并进行了RNAi实验。我们的研究结果表明，shRNA688显著降低了S蛋白mRNAEst813转录物的浓度。
我们分析了不同类型的S蛋白CDS和蛋白亚型。结果表明，shRNA688靶向区在所有SARS-CoV-2变体中高度保守，包括最近两年引起新冠病毒的Delta、Omicron BA.1、OmiclonBA.5.1.3和Omicronn BA.5.2.1。因此，在我们的研究中，shRNA688不仅降解了SARS-CoV-2Delta的S蛋白mRNA Est，而且理论上还对迄今为止发现的所有现有SARS-CoV-2变体具有RNAi功能，因为shRNA688的靶区在SARS-CoV-2变体的所有S蛋白基因中都是共享的。
5、shRNA和EGFP表达质粒，S蛋白基因片段和RFP融合基因质粒在人细胞系中的的共转染，为RNAi研究提供了一个有用的细胞实验模型。
考虑到实验室生物安全性，我们构建了含有pCMV-S蛋白RBD EST-RFP融合基因的质粒，并将S蛋白基因片段送入实验细胞。我们仔细挑选片段并将其作为融合基因与RFP基因连接，该融合基因不产生任何融合蛋白，而是产生野生型RFP基因作为基因转染标记。
如果转染细胞表达了构建的含有S蛋白RBD EST-RFP融合基因的，则细胞呈红色荧光。考虑到shRNA对RNAi的传递效率，我们构建了pCMV-EGFP-pH1-shRNA质粒。在一个结构中，pCMV衍生的EGFP表达，人类H1启动子驱动shRNA表达。我们使用LipofectAMINE2000将含有EST-RFP融合基因质粒和pCMV-EGFP-pH1-shRNA质粒的pCMV-S蛋白RBD介导到培养细胞中。在荧光显微镜下很容易观察到基因转染率。通过对红色荧光和绿色荧光的图像融合分析，可以观察到共转染效率。共转染细胞的平均黄色约为20-30％，进一步进行RT-qPCR，以确定目标S蛋白Est融合基因转录物的mRNA浓度，以测试shRNA的RNAi效应。在这里，我们在本研究中报告的shRNA688，因为我们已经观察到shRNA68的RNAi结果，所以我们没有试图通过流式细胞术(FASC)对红色或绿色荧光基因表达的细胞进行分类。
6、shRNA688可能是治疗SARS-CoV-2的潜在药物
SARS-CoV-2是RNA基因组病毒。当SARS-CoV-2感染人类肺上皮细胞时，病毒基因RNA侵入受感染的细胞。病毒的S蛋白是由S蛋白RNA基因翻译而来。在本研究中，我们使用shRNA688在细胞模型中成功降解含有EST-RFP融合基因的S蛋白RBD的转录物。众所周知，SARS-CoV-2的几种变体已经存在。疫苗和中和抗体是研究热点。我们需要花费大量的精力和时间来制备和更新疫苗或识别新的中和抗体，以避免研制的中和抗体逃逸到SARS-CoV-2新变体S蛋白的新突变抗原。如今，SARS-CoV-2的一种新变种可以完全测序和分析。如果目标RNA序列中存在任何病毒突变体，也可以轻松、快速地设计和制备RNAi元件，以测试其对SARS-CoV-2潜在新突变体的RNAi功能。
目前，食品和药物管理局(FDA)已经发布了一些抗病毒药物使用的紧急批准。基于RNAi的治疗为抗病毒治疗提供了一个可控制的靶点。使用纳米颗粒作为载体，将siRNAs传递到人体特定细胞，可能在SARS-CoV-2感染的特异性治疗中发挥关键作用。对于实际临床应用，气溶胶吸入器将考虑最佳纳米材料或介质。吸入siRNA有望开发呼吸道疾病的抗病毒疗法。由SARS-CoV-2病毒引起的新冠病毒是一种快速出现的疾病，其后果甚至致命。肺***尤其是肺部最容易受到SARS-CoV-2感染的损害，这种感染在肺组织中留下破坏性足迹，使其无法进行呼吸功能，导致严重的急性呼吸道疾病和生命损失。RNAi可用于开发针对病毒的治疗方法。这种方法允许使用shRNA分子特异性结合和沉默治疗靶点。通过吸入途径提供有希望的治疗方法的可行性，并期望该途径将提供阻止病毒传播的有效干预措施之一。shRNA的短双链将被考虑代替质粒。此外，应该与生物安全实验室的研究小组合作测试伪病毒上的RNAi药物功能，甚至SARS-CoV-2。一旦建立了siRNA设计和输送到呼吸道的管道，基于RNAi的治疗适应新靶点就相当简单。因此，它可以在SARS-CoV-2等影响呼吸道的新出现病原体引起的紧急情况下相对快速地开发抗病毒药物。因此RNAi能够发展成为治疗SARS-CoV-2的有效药物之一，以挽救患者的生命。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为SARS-CoV-2变异体S蛋白RBD区域及之后的部分下游区域的聚类分析；
图2为靶向SARS-CoV-2Delta的S蛋白基因的shRNA250、shRNA463、shRNA544、和shRNA688的位置；
图3为靶向SARS-CoV-2s S蛋白基因RBD之后的下游部分的shRNA688的位置；
图4为pCMV-EGFP-pH1-shRNA688质粒的构建示意图；
图5为pCMV-SARS-CoV-2-RBD-EST-RFP质粒的构建示意图；
图6为SARS-CoV-2Delta S蛋白的RBD和RBD之后的部分下游区域(813nt)***物(基因序列用粗下划线表示)与RFP基因的连接示意图；
图7为S蛋白RBD-RFP融合基因、shRNA250和EGFP基因转染细胞的萤光图像分析(10X物镜，徕卡)，其中；(A).共转染后(在日光下)细胞生长；(B).细胞表达RFP有绿色荧光；(C).细胞表达EGFP基因有红色荧光；(D).当用两种质粒转染培养物中的细胞时，一些细胞同时具有红色和绿色荧光，在图像合并后最终显示为黄色。
图8为S蛋白RBD-RFP融合基因、shRNA544和EGFP基因转染细胞的萤光图像分析(10X物镜，徕卡)；其中；(A).共转染后(在日光下)细胞生长；(B).细胞表达RFP有绿色荧光；(C).细胞表达EGFP基因有红色荧光；(D).当用两种质粒转染培养物中的细胞时，一些细胞同时具有红色和绿色荧光，在图像合并后最终显示为黄色。
图9为S蛋白RBD-RFP融合基因、shRNA463和EGFP基因转染细胞的萤光图像分析(10X物镜，徕卡)；其中；(A).共转染后(在日光下)细胞生长；(B).细胞表达RFP有绿色荧光；(C).细胞表达EGFP基因有红色荧光；(D).当用两种质粒转染培养物中的细胞时，一些细胞同时具有红色和绿色荧光，在图像合并后最终显示为黄色。
图10为S蛋白RBD-RFP融合基因、shRNA688和EGFP基因转染细胞的萤光图像分析(10X物镜，徕卡)；其中；(A).共转染后(在日光下)细胞生长；(B).细胞表达RFP有绿色荧光；(C).细胞表达EGFP基因有红色荧光；(D).当用两种质粒转染培养物中的细胞时，一些细胞同时具有红色和绿色荧光，在图像合并后最终显示为黄色。
图11为S蛋白RBD-RFP融合基因、shRNA空白对照和EGFP基因转染细胞的萤光图像分析(10X物镜，徕卡)；其中；(A).共转染后(在日光下)细胞生长；(B).细胞表达RFP有绿色荧光；(C).细胞表达EGFP基因有红色荧光；(D).当用两种质粒转染培养物中的细胞时，一些细胞同时具有红色和绿色荧光，在图像合并后最终显示为黄色。
图12为shRNA688对新冠病毒S蛋白质EST的降解效率。
图13为靶向SARS-CoV-2δ的S蛋白基因的shRNA688。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明进行详细说明。以下实例在本发明技术方案的前提下进行实施，提供了详细的实施方式和具体的操作过程，将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明。需要指出的是，本发明的保护范围不限于下述实施例，在本发明的构思前提下做出的若干调整和改进，都属于本发明的保护范围。
实施例1目的基因的确定
SARS-CoV-2变体、α、β、γ、δ和奥密克戎的多基因组和S蛋白序列从genbank获得(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/？term＝SARS-CoV-2)。通过UCSC基因组浏览器的在线工具(http://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgBlat)，和分析***(Clustal Omega)(https://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)对SRAS-CoV-2进行聚类比较。根据SRAS-CoV-2的S蛋白基因的序列选择保守区。
本发明通过分析SARS-CoV-2突变体的保守和突变序列来选择RNAi靶点。对SARS-CoV-2突变体的全RNA基因组及其S蛋白基因进行了聚类分析。S蛋白基因可以定位在它们的RNA基因组中鉴定出来。在SARS-CoV-2δ突变体基因组中，S蛋白基因(3816nt)从21517nt开始，终止于25332nt。基因组(OL903477.1)的S蛋白(1271aa)编码区的RBD(317-539aa)序列，起始于22465nt，终止于23133nt。
描述为sp|P0DTC2|SPIKE_SARS2中的序列)从22465nt开始，到23133nt结束(如图1)。图1为SARS-CoV-2变异体S蛋白RBD区域的聚类分析：每个RBD区域至少有一个肽水平突变，如两个区块(粗实线框)所示。在这些区块中，肽序列的突变(空白背景)来自SARS-CoV-2变异体的不同S蛋白RBD亚型，包括虚线框内的Omicron变异体。在最后一行中，含有RBD和RBD之后的部分下游的序列来自Delta，其813nt cDNA被选为整合到RFP基因过表达质粒作为本发明的shRNA靶点。RBD之后的下游(灰色框)的肽区域在所有变体中高度保守，没有任何突变。
尽管SARS-CoV-2S蛋白的RBD存在不同类型的突变，但编码SARS-CoV-2Delta S蛋白质基因的RBD区域部分和RBD之后的高度保守的部分下游区域的813nt cDNA序列(SEQ IDNo.1)被选为潜在的shRNA靶点，其中
SARS-CoV-2变异体S蛋白RBD的突变和保守区确认：一个已发表的SARS-CoV-2Spike蛋白(S蛋白，表面糖蛋白亚型，YP_009724390)由1273个氨基酸组成。其中，223个氨基酸(319-541)用于受体结合域(RBD)。RBD用于结合人类ACE2(https://www.uniprot.org/uniprotkb/P0DTC2)。以该S蛋白及其RBD的cDNA和蛋白序列为参考，对SARS-CoV-2变异体的S蛋白基因及其翻译蛋白亚型的序列进行聚类分析。结果表明，S蛋白亚型的每个RBD至少有一个氨基酸突变。Omicrons BA BA.1,BA5.1.3,BA.5.2.1有几个突变。然而，在RBD下游存在着没有突变的保守区域。在本研究中，我们选择了编码SARS-CoV-2Delta S蛋白大部分RBD区域和RBD之后的部分下游的813nt cDNA序列(图1)。该cDNA序列及其反向互补序列被合成并退火为片段，与RFP cDNA整合为pCMV RFP表达质粒中的融合基因。
实施例2 shRNA的设计
基于RNAi原理，设计了4个shRNA序列。在本研究，shRNA是基于Delta的813nt(SEQID No.1)***序列设计的(如图2、表1)。
图2所示为靶向SARS-CoV-2Delta的S蛋白基因的shRNA250、shRNA463、shRNA544、和shRNA688。指出了SARS-CoV-2Delta的S蛋白基因及其编码蛋白的位置。
表1.构建shRNA表达质粒的寡核苷酸序列
考虑到shRNA不仅针对Delta，而且针对Omicrons和其他变种，我们最终在靠近S蛋白基因RBD之后的下游部分，但高度保守区域选择了shRNA688(图3)。
图3.所示为靶向SARS-CoV-2s S蛋白基因RBD之后的下游部分的shRNA688。shRNA688的有义序列为“GGT GTT CTT ACT GAG TCT AAC”，如SEQ ID NO.10，这是SARS-CoV-2变异体S蛋白基因的所有RBD之后下游是完全一致性(粗实线框内，上区)内。如果将shRNA688的有义序列翻译为肽序列作为参考，则为“GVLTESN”(淡色框，下区)，它与S蛋白亚型的所有比较肽序列相同，尽管SARS-CoV-2变异体S蛋白的RBD肽序列存在突变。
shRNA688，其有义序列为“GGTGT TCTTA CTGAG TCTAA C”，这是所有SARS-CoV-2变异体S蛋白基因RBD之后的下游，是完全一致的(图3和4)。
选取shRNA688的有义序列(21bp)，其SRAS-CoV-2的S蛋白基因的靶序列相同。在正向序列(21bp)之后，有一个带有“TTCAAGAC”的环状序列。之后，有一个反向互补(21bp)片段和一个poly(T)6片段。
shRNA 688的shRNA，不仅对Delta，而且对Omicrons和其他突变株中的S蛋白质mRNA保守区域都匹配。
实施例3质粒的构建
1、pCMV-EGFP-pH1-shRNA688表达载体的构建
本实施例提供pCMV-EGFP-pH1-shRNA688表达质粒的构建，包括如下步骤：
步骤1，基本载体选择：为构建shRNA表达质粒，以含有用于基因转染标记基因pCMV-EGFP基因的pSIL-EGFP载体为基本载体(https://www.addgene.org/52675/sequences/)。构建的pCMV-EGFP-pH1-shRNA688表达质粒是在含有pCMV启动子驱动的用于基因转染标记基因的增强的绿色荧光蛋白(EGFP)基因的pSIL-EGFP载体的基础上制备的。
2、pCMV-EGFP-pH1-shRNA688
2.1、H1启动子(108bp)是人类RNA聚合酶III型启动子之一；H1启动子(108bp)被***XhoI(1704)和HindIII(1725)限制位点，通过XhoI和HindIII酶切位点构建于pCMV-EGFP区域的上游。
shRNA688正向链的退火双链(显示4种元素)及其反向互补链与HindIII(1725)和EcoRI(1737)限制性粘端整合在H1启动子下游，并通过Sanger测序证实。
shRNA688 cDNA中含有4种元素。有义序列为“GGT GTT CTT ACT GAG TCT AAC”，环“TTC AAG AGC”，反义“GTT AGA CTC AGT AAG AAC ACC”，终止“TTT TTT”。Sanger测序证实了H1启动子和shRNA688。构建的质粒带有用于驱动EGFP标记基因表达的pCMV启动子，和用于驱动shRNA688表达的人H1启动子，shRNA688是为靶向SARS-CoV-2的S蛋白转录物而设计的。(图4)
shRNA 688的双链DNA构建在质粒的人H1启动子的下游，该质粒也可以同时表达增强的绿色荧光蛋白(EGFP)标记基因。通过荧光定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)加特异性探针来分析，RNAi治疗对共转染的HEK293T细胞中表达的SARS-CoV-2S蛋白质基因转录物mRNA的降解作用。结果表明，shRNA 688可以有效的减少SARS-CoV-2S蛋白基因转录子mRNA。设计的shRNA 688结构及其序列在列表中(表1)。
如图4.构建的EGFP标记基因和靶向SARS-CoV-2S蛋白质基因转录物的shRNA688共表达质粒，命名为pCMV-EGFP-pH1-shRNA688。pSIL EGFP表达质粒用作基本载体。人类H1启动子(108bp)被***XhoI和HindIII限制位点。shRNA688正向链(显示4种元素)及其反向互补链退火成双链，通过HindIII和EcoRI限制性粘端整合在下游H1启动子中，并通过Sanger测序被证实。
2、shRNA250、shRNA463、shRNA544相应质粒的构建
构建shRNA250、shRNA463、shRNA544质粒的方法与构建shRNA688的方法相同。
实施例4SARS-CoV-2S蛋白的含RBD片段与RFP融合基因表达质粒的构建
1、SARS-CoV-2S蛋白的含RBD片段与RFP的融合基因表达质粒(pCMV-SARS-CoV-2-RBD-EST-RFP)的构建
在pLVX-IRES mCherry RFP质粒基础上构建SARS-CoV-2Delta S蛋白的RBD EST和mCherry-红色荧光蛋白(RFP)融合基因。用于表达潜在靶点，以评估shRNA干扰的有效性。
1.1、SARS-CoV-2Delta S蛋白基因含RBD片段的选择及制备
一个已发表的SARS-CoV-2的表面糖蛋白亚型(YP_009724390)由1273个氨基酸组成。其中223个氨基酸(319-541)是属于受体结合结构域(RBD)。RBD用于与人ACE2的结合(https://www.uniprot.org/uniprotkb/P0DTC2/entry)。以该S蛋白基因序列，特别是其RBD的基因成分和蛋白序列为参考，对SARS-CoV-2多种变体的S蛋白基因序列及其蛋白质亚型进行了聚类分析。结果表明，S蛋白亚型的每个RBD中至少有一个氨基酸突变。在奥密克戎BA.1、BA5.1.3、BA.5.2.1突变株中有多个突变。然而，在RBD下游的保守区域中没有突变。
基于对SARS-CoV-2变异体S蛋白序列的聚类分析，从SARS-CoV-2Delta变异体的S蛋白中选择了一个包含RBD序列(EST)的片段(813bp)。这是一个不仅包含了SARS-CoV-2Delta S蛋白质基因具有的特殊突变的区域，也包含了与Omicron B.1、B.5和其他SARS-CoV-2的S蛋白质基因所包含的共享的保守区域。
为了构建这个包含S蛋白RBD的EST表达质粒，合成了该片段序列(813bp)作为一条有义链，其反向互补作为一条反义链，两端添加少量核苷酸。在将正、反义链退火为具有重建粘端的双链DNA片段后，形成5’端XhoI粘端(C’TCGAG)和3’端KpnI(GGTAC’C)粘端。
选择了编码SARS-CoV-2δS蛋白大部分RBD区和RBD之后的部分下游的813nt cDNA序列。该cDNA序列及其反向互补序列被合成并退火为片段，该片段与mCherry红荧光蛋白(RFP)cDNA作为融合基因整合在pCMV RFP表达质粒中作为shRNA688潜在的靶标。
1.2SARS-CoV-2S蛋白的含RBD片段与RFP融合基因表达质粒的构建
pLVX IRES mCherry RFP载体(Takara Bio USA)包含CMV启动子、多克隆位点(MCS)、mCherry-红色荧光蛋白(RFP)基因和3’LTR等，用作表达SARS-CoV-2S蛋白基因的含RBD的EST的基本载体。
在该载体MCS中，存在XhoI(2809)和SacII(2834)的酶切位点。载体中有两个SacII(CCGCGG)和两个KpnI(GGTACC)酶切位点。他们的酶切位点为SacII(2834)、KpnI(3289)、SacII(4644)和KpnI(4869)。
我们选择使用了pLVX IRES mCherry RFP质粒作为基本载体。在pLVX IRESmCherry RFP质粒中，pCMV驱动mCherry RFP基因表达。我们移除了该质粒在XhoI(CTCGAG)和KpnI(GGTACC)之间的大部分IRES。把合成的含编码了S蛋白大部分的有义链(813nt)和其反向互补的链退火成双链的DNA片段。并把这一DNA片段成功整合到该质粒中。构建了SARS-CoV-2S蛋白基因成分和mCherry红荧光蛋白(RFP)融合基因表达的pCMV-SARS-CoV-2-RBD-EST-RFP质粒。该融合基因表达的转录子可以作为以测试shRNA的干扰的靶标(图5)。
如图5所示，SARS-CoV-2S蛋白和RFP融合基因质粒pCMV-RBD-EST的构建，命名为(pCMV-SARS-CoV-2-RBD-EST-RFP)。合成和退火双链的DNA片段在5’端具有XhoI粘端(C’TCGAG)，在3’端具有KpnI(GGTAC’C)粘端。DNA片段的有义链(813nt)编码SARS-CoV-2DeltaS蛋白的大部分RBD。3'LTR作为多聚腺苷酸化信号终止转录。
为了进行构建，使用酶XhoI和SacII对该空载体(Takara Bio USA)进行双重消化。
具体步骤如下：
环状的质粒pLVX IRES mCherry RFP首先用XhoI(C’TCGAG)打开。从0.8％琼脂糖凝胶中获取消化过的载体DNA；回收的DNA用Sac II(CCGC’GG)做进一步的消化。在1％琼脂糖凝胶(上海源业生物科技有限公司)上分离来自双消化载体的两个片段，即片段1(如SEQID No.20)和片段2(如SEQ ID No.21)。片段1(6337bp)在5'端具有SacII(CCGC’GG)粘端和在'3'端有XhoI(C’TCGAG)粘端；片段2(1810bp)两端都有SacII(CCGC’GG)粘端。对片段2采用KpnI(GGTAC’C)进一步消化，得到片段2.1(454bp，如SEQ ID No.22)和片段2.2(1356bp，如SEQ ID No.23)；其中片段2.2(1356bp)在5'端带有KpnI(GGTAC’C)粘端和在3'端有SacII(CCGC’GG)粘端；在1.5％琼脂糖凝胶上进一步分离片段2.2(1356bp)和片段2.1(454bp)。从凝胶中获取带有KpnI粘端(5')和SacII粘端(3')的片段2.2(1356bp)；然后，把三个片段，其中两个来自pLVX-IRES-mCherry载体的片段1(6337bp)和片段2.2(1356bp)，另外一个片段是编码SARS-CoV-2S蛋白大部分RBD和RBD之后的部分下游区域(共813bp,SEQ ID NO.1)，并带有XhoI(C’TCGAG)和KpnI(GGTAC’C)粘端的双链DNA片段(825bp)，用T4 DNA连接酶(5u/μL)(Thermo Fisher Scientific)连接和闭环成为表达质粒。构建好的质粒被称为pCMV-S蛋白RBD-EST-RFP(pCMV-SARS-CoV-2-RBD-EST-RFP)。质粒的***区经Sanger测序证实(图1)。
与RFP基因整合的813nt***物作为融合基因被Sanger测序证实。***物理论上编码SARS-CoV-2Delta S蛋白RBD的大部分和RBD后的部分下游区域813nt(SEQ ID No.1)，但813nt的***物是从S蛋白“M”编码起点“ATG”下游的位置开始。因此，813nt***RFP融合基因只能表达mRNA，而不能产生任何融合蛋白(图6)。
图6所示为SARS-CoV-2Delta S蛋白的RBD和RBD之后的部分下游区域(813nt)***物(基因序列用粗下划线表示)与RFP基因连接。***物位于5’端限制位点，XhoI(CTCGAG，在813nt序列之前的方框内)和3’端限制位点KpnI(GGTACC，在813nt序列之后的方框内)之间。S蛋白Delta的RBD(带水波纹下划线)和之后的下游(RBD区域之后和KpnI限制位点(GGTACC，方框内)之前的***区域为理论编码。很清晰的是，在本研究所取的813nt，没有为形成潜在的融合蛋白质的“ATG”。因此，RFP蛋白是从其自身的“ATG”中翻译开始，RFP蛋白质为野生型(大方框内)。
2、不同shRNA干扰效果测试
2.1试验方法
人类细胞系HEK293T细胞(ATCC)在添加了10％胎牛血清(FBS)、1％抗生素(100μg/mL青霉素、100μg/mL链霉素)、2mM谷氨酰胺、和1.5mg/mL碳酸氢钠，37℃，置于含5％CO2的加湿培养箱中(所有试剂均来自赛默飞世尔科技公司)培养。将传代培养的HEK293T细胞用于瞬时转染实验。细胞悬浮液稀释至1×105个细胞/mL，接种在6孔板中。当细胞生长到70％时，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤。
根据转染试剂制造商建议，用脂质体与DNA的比例(1:3)介导脂质体2000将按照下表所述实验组共同转染HEK293T细胞。
2.2试验结果
(1)S蛋白RBD-RFP融合基因、shRNA和EGFP基因转染细胞的萤光图像分析
转基因表达在转染24小时后在荧光显微镜下进行检测和验证。用荧光显微镜***观察红色或绿色荧光细胞(10倍放大，德国莱卡DMIL LED)。观察培养细胞中(在正常光下)的荧光细胞(红色或/和绿色荧光)。拍摄图像。使用与显微镜图像匹配的软件，把拍摄的图像进行重叠，分析RFP和EGFP基因共表达细胞，以了解双转染效率。
共有3类转染细胞：
第一类，被转染了pCMV-S蛋白RBD-EST-RFP融合基因质粒
(pCMV-SARS-CoV-2-RBD-EST-RFP)的细胞，呈红色荧光；
第二类，被转染了pCMV-EGFP-pH1-shRNA250、pCMV-EGFP-pH1-shRNA463、pCMV-EGFP-pH1-shRNA544、pCMV-EGFP-pH1-shRNA688、pCMV-EGFP-pH1-shRNA空白Control(对照组)中的任意一中质粒的细胞，呈绿色荧光；
第三类，被转染的细胞同时接受两种质粒；这种转染的细胞同时表达红色和绿色荧光，在经过计算机图像叠加，共被共转染的细胞显示为黄色荧光(图7-11中的D)。
如图7-11.在转染1天后，在荧光显微镜下分别地用红色或绿色荧光滤光片(10X物镜，徕卡)观察转染的细胞。在测试中：图7(A)、图8(A)、图9(A)、图10(A)、图11(A)共转染后(在日光下)细胞生长。图7(B)、图8(B)、图9(B)、图10(B)、图11(B)细胞表达RFP有绿色荧光。图7(C)、图8(C)、图9(C)、图10(C)、图11(C)细胞表达EGFP基因有红色荧光。图7(D)、图8(D)、图9(D)、图10(D)、图11(D)当用两种质粒转染培养物中的细胞时，一些细胞同时具有红色和绿色荧光，在图像合并后最终显示为黄色。
(2)靶向降解作用测定
用于检测shRNA抑制SARS-CoV-2S蛋白RBD EST表达水平。
a、核酸提取和链特异性cDNA合成
被pCMV-EGFP-pH1-shRNA质粒和pCMV-S蛋白RBD-EST-RFP融合基因(pCMV-SARS-CoV-2-RBD-EST-RFP)质粒共转染的HEK293T细胞，同时呈现绿色和红色荧光。
进行qRT-PCR，并对数据进行统计分析。实验重复三次以上。对于定量RT-PCR，从转染24小时后，用FastPure细胞/组织总RNA分离试剂盒V2(Vazyme RC112，中国)提取转染细胞的总RNA。用试剂盒中的缓冲液溶解每个孔中的细胞。之后，根据制造商的说明执行后续步骤。用Nanodrop2000分光光度计(Thermo Scientific，Waltham，MA，USA)测量每个样品中洗脱的总RNA的质量和浓度；把A260/280比值在1.8和2.2之间的样品被考虑用于下一步。用HiScript III第1链cDNA合成试剂盒(+gDNA wiper)(Vazyme R312-01/02，中国)和寡核苷酸(dT)作为引物，在45℃下，从1μg总RNA制备cDNA。
b通过RT-qPCR定量靶向SARS-CoV-2转录物
用RT-qPCR定量转染培养细胞中SARS-CoV-2S蛋白RBD-EST和看家基因转录物。总RNA和cDNA的制备如上所述。使用AceQ Universal U+探针Master Mix V2(Vazyme Q513，中国)进行RT-qPCR。对于每个反应，10μL“2X AceQ Universal U+Probe Master Mix V2”、0.4μL sense primer(10μM)、0.4μL antisense primar(10μM)、靶向性S蛋白RBD特异性探针(10μM)和含有ddH2O的样本cDNA，总体积为20μL。
表2中列出了我们设计，并使用的引物和靶向S蛋白RBD特异性探针。RT-qPCR的循环条件为，37℃下的孵育2分钟，95℃下初始变性5分钟，然后使用Light Cycler480(瑞士巴塞尔罗氏)在95℃和60℃下进行45个扩增周期，分别为10秒和30秒。转录物的数量由GAPDH转录物的量做标准化。使用标准2-ΔCt定量法计算shRNA对RBD EST表达的靶向降解作用。
表2.用于检测shRNA引起SARS-CoV-2S蛋白RBD-EST降解的RT-qPCR的引物和探针
(3)RT-qPCR检测shRNA250,shRNA463,shRNA544,shRNA688降解转染HEK293T基因的S蛋白Est效率
HEK293T细胞分别经pCMV-EGFP-pH1-shRNA250、pCMV-EGFP-pH1-shRNA463、pCMV-EGFP-pH1-shRNA544、pCMV-EGFP-pH1-shRNA688这4个质粒和含有EST-RFP融合基因质粒的pCMV-S蛋白RBD(pCMV-SARS-CoV-2-RBD-EST-RFP)共转染后，细胞具有绿色和红色荧光。分离每个转染的总RNA并制备cDNA。进行RT-qPCR，并对数据进行统计分析。
结果显示，pH1-shRNA688处理过的细胞，S蛋白质的EST的含量明显低于其他组，而其余的3个shRNA(shRNA250、shRNA463、和shRNA544)对S蛋白质的降解不显著(表3)。
表3.RT-qPCR检测不同shRNA对新冠病毒S蛋白质EST的降解效率
我们用pH1-shRNA688重复做三次实验，获得的结果都显示，与对照组相比，shRNA688处理后转染细胞中S蛋白mRNA Est(813bp)的转录浓度显著降低。虽然每个实验中S蛋白mRNA Est813的浓度不同，但它们的降解率处于相似的水平。三次实验的S蛋白mRNAEst813降解显示为A:0.465、B:0.531和C:0.462。其平均值和标准误差为0.486±0.039(表4，图12)，所选shRNA 688靶向靠近SARS-CoV-2δ变体S蛋白的RBD编码区之后的下游的保守区域(图13)。
表4.RT-qPCR重复检测shRNA688对新冠病毒S蛋白质EST的降解效率
如图12所示，虽然每个实验中S蛋白mRNA Est813的起始量不同，但降解率(D.R)处于相似水平。与对照组(浅色柱)相比，shRNA688处理后(深色柱)转染细胞中S蛋白mRNA Est(813bp)的转录浓度显著降低。这个区域是位于新冠病毒S蛋白质RBD之后的保守区域(图12)。
如图13，靶向SARS-CoV-2δ的S蛋白基因的shRNA688。
指出了SARS-CoV-2δ的S蛋白基因及其编码蛋白的位置。所选shRNA 688靶向靠近SARS-CoV-2δ变体S蛋白的RBD编码区之后的下游的保守区域。
以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影响本发明的实质内容。
Claims (11)
1.shRNA，其特征在于，其序列中有义序列为GGTGT TCTTA CTGAG TCTAA C，如SEQ IDNO.10所示。
2.根据权利要求1所述的shRNA，其特征在于，其包含如下序列：
AGCTTGGTGTTCTTACTGAGTCTAACTTCAAGAGCGTTAGACTCAGTAAGAACACCTTTTTTG，如SEQ IDNO.8所示。
3.根据权利要求1所述的shRNA，其特征在于，其包含如下寡核苷酸组合：
shRNAF:
AGCTTGGTGTTCTTACTGAGTCTAACTTCAAGAGCGTTAGACTCAGTAAGAACACCTTTTTTG，如SEQ IDNO.8所示；
shRNA R:
AATTCAAAAAAGGTGTTCTTACTGAGTCTAACGCTCTTGAAGTTAGACTCAGTAAGAACACCA，如SEQ IDNO.9所示。
4.一种重组质粒，其特征在于，包含如权利要求1-3中任一项所述的shRNA。
5.根据权利要求4所述的重组质粒，其特征在于，所述重组质粒还包括用于驱动shRNA表达的人H1启动子、用于驱动绿色荧光蛋白EGFP基因表达的pCMV启动子。
6.一种如权利要求4所述的重组质粒的构建方法，其特征在于，所述构建方法包括如下步骤：
S1、以含有基因转染标记的pCMV-EGFP基因的pSIL-EGFP载体为基本载体；
S2、人类RNA聚合酶III型启动子H1启动子通过XhoI和HindIII酶切位点构建于pCMV-EGFP区域的上游；
S3、shRNA通过HindIII和EcoRI构建位点整合在H1启动子下游。
7.一种新冠病毒S蛋白抑制剂，其特征在于，至少包含下述之一：
a、权利要求1或2所述shRNA；
b、权利要求3所述的重组质粒。
8.一种试剂盒，其特征在于，至少包含下述之一：
A、权利要求1或2所述shRNA；
B、权利要求3所述的重组质粒；
C、权利要求7所述的新冠病毒S蛋白基因抑制剂。
9.如权利要求1或2所述的shRNA在制备治疗新冠病毒的药物中的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于，所述shRNA在靶向干扰SARS-CoV-2中的应用。
11.一种靶向干扰新冠病毒S蛋白的特异性shRNA的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：
从SARS-CoV-2提取S蛋白基因的813nt片段作为shRNA靶点，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示，其包括S蛋白质基因的RBD区域部分和RBD之后的高度保守的部分下游区域。
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