CN115851720A - 基因敲入方法及其在构建内源性融合基因和原代细胞基因敲入中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种基因敲入方法及其在构建内源性融合基因和原代细胞基因敲入中的应用，涉及基因工程的技术领域。该基因敲入方法包括将Cas核酸酶与sgRNA形成的核糖核蛋白复合物和供体DNA同时递送到受体细胞；其中供体DNA为双链寡核苷酸，双链寡核苷酸中各链的5’端经磷酸化修饰；且各链的5’端和3’端起始1～3个连接键为硫代磷酸键；递送采用电转染的方式。该基因敲入方法提升了在原代细胞中进行精确的基因片段***和整合的效率，并可应用于原代细胞及其他细胞系中添加多种内源性标记。

Description

基因敲入方法及其在构建内源性融合基因和原代细胞基因敲 入中的应用

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其是涉及一种基因敲入方法及其在构建内源性融合基因和原代细胞基因敲入中的应用。

背景技术

直接在活细胞内的基因上添加内源性荧光标记或标签标记形成融合表达蛋白，对于在细胞生理或病理背景下研究基因的内源性功能至关重要。簇状规则间隔短回文重复序列(CRISPR)-Cas核酸酶基因编辑***是在基因组特定位点进行高效基因敲入或敲除的强大工具。

传统的基因敲入方法主要利用同源重组(HDR)，其基本原理为针对***位点两端的特异性序列设计带有同源臂的重组载体，两段含有同源序列的DNA分子之间会重新组合。然而，由于HDR修复途径在静止(不进行有丝***)的细胞中效率较低，并且，大规模合成或克隆HDR修复所需的同源模板，提高了经济成本与劳动成本，极大地限制了该方法的应用范围。

因此，如何改进基因敲入的方法，提高受体细胞的内源标记效率，尤其是适用于在原代细胞中进行有效的内源标记，是目前有待解决的问题。

有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基因敲入方法，该基因敲入方法能够实现高效的构建内源性融合基因，以及实现在原代细胞进行精确高效基因敲入，缓解了现有技术中存在的难于向细胞中添加内源性标签，以及难于对原代细胞进行基因敲入的技术问题。

为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种基因敲入方法，包括：将Cas核酸酶与sgRNA形成的核糖核蛋白复合物和供体DNA同时递送到受体细胞；

所述供体DNA为双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸中各链的5’端经磷酸化修饰；所述双链寡核苷酸中各链的5’端和3’端起始1～3个连接键为硫代磷酸键；

所述递送采用电转染的方式。

优选地，所述供体DNA末端的2个连接键为硫代磷酸键；

优选地，所述供体DNA的末端为粘性末端或平末端；

优选地，所述供体DNA由两条单链寡核苷酸退火合成，所述单链寡核苷酸的5’端经磷酸化修饰；所述单链寡核苷酸中的5’端和3’端起始1-3个连接键为硫代磷酸键，优选为5’端和3’端起始2-3个连接键为硫代磷酸键，更优选为5’端和3’端起始2个连接键为硫代磷酸键；

优选地，所述供体DNA由含化学修饰的PCR引物扩增相应的目的片段得到，所述含化学修饰的PCR引物的5’端经磷酸化修饰；所述PCR引物的5’端起始1～3个连接键为硫代磷酸键，优选为5’端起始2-3个连接键为硫代磷酸键，更优选为5’端起始2个连接键为硫代磷酸键；

优选地，供体DNA的核苷酸序列来源于蛋白标签、荧光素酶或荧光蛋白；

优选地，所述蛋白标签选自Flag标签、His标签、GST标签、HA标签、Sumo标签、Avi标签或C-Myc标签；

优选地，所述蛋白标签为表位标签；

优选地，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白EGFP、绿色荧光蛋白mNeonGreen、黄色荧光蛋白YFP、红色荧光蛋白mCherry、红色荧光蛋白tdTomato、橙色荧光蛋白mOrange或蓝色荧光蛋白BFP。

优选地，用于电转染的***采用真核细胞电转染***；

优选地，所述真核细胞电转染***采用Lonza 4D-Nucleofector电转染***。

优选地，所述受体细胞包括真核细胞；

优选地，所述受体细胞包括哺乳动物细胞系或原代细胞。

优选地，所述sgRNA引导Cas核酸酶产生的切口距离靶基因的终止密码子第一个碱基上游20bp以内；

优选地，所述sgRNA经化学修饰；

优选地，所述化学修饰包括甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰中的一种多种；

优选地，所述化学修饰为甲基化修饰和硫代修饰；

优选地，所述sgRNA的5’端和3’端起始的2～4个碱基经甲基化修饰；且5’端和3’端起始2～4个连接键为硫代磷酸键；

优选地，所述sgRNA的5’端和3’端起始的3个碱基均经甲基化修饰，且5’端和3’端起始3个连接键为硫代磷酸键。

优选地，所述Cas核酸酶选自Cas9核酸酶或Cas12a核酸酶；

优选地，所述Cas9核酸酶的来源为肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌或嗜热链球菌；

优选地，Cas12a核酸酶为AsCas12a或LbCas12a。

优选地，所述基因敲入方法包括将Cas核酸酶与sgRNA共同孵育得到核糖核蛋白复合物，然后将核糖核蛋白复合物，供体DNA以及重悬有受体细胞的电转缓冲液混合，电转染后继续培养受体细胞4～5天。

优选地，Cas核酸酶与sgRNA共同孵育时摩尔比例为1:3～1:1，优选为1:2；

优选地，Cas核酸酶的用量为50～150pmol；

优选地，sgRNA的用量为200～400pmol；

优选地，供体DNA的用量为1～20pmol，优选为5～10pmol，更优选为8pmol；

优选地，受体细胞的量为1×10⁵～1×10⁶个，优选为5×10⁵～1×10⁶。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述基因敲入方法在构建内源性融合基因中的应用；

优选地，所述构建内源性融合基因用于实现细胞表达内源性标记；

优选地，所述内源性标记包括荧光蛋白或蛋白标签；

优选地，所述蛋白标签包括3×Flag蛋白标签；

优选地，所述荧光蛋白包括GFP。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述基因敲入方法在原代细胞基因敲入中的应用。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

本发明提供的基因敲入方法主要通过使用经化学修饰的供体DNA以及电转染的递送核糖核蛋白复合物和供体DNA的方式对受体细胞进行基因敲入。其中供体DNA为双链寡核苷酸(dsODN)，dsODN两条链的5’端采用磷酸化修饰，且5’端和3’端起始1～3个连接键为硫代磷酸键。磷酸化修饰能够促进非同源末端链接，硫代修饰可以稳定细胞中的寡核苷酸，减小毒性，促进供体DNA和靶向DNA双链断裂(DSB)之间的末端连接过程。

递送方式采用电转染***递送CRISPR-Cas RNP，将CRISPR-Cas RNP直接递送至细胞核内，电转染***不依赖于病毒感染、不依赖于细胞有丝***，可加快基因表达，通过核转染实现内源基因标记，与基于质粒的策略相比，这种方法更快、更可靠，更适合大规模应用。

本发明提供的基因敲入方法在基因组靶位点进行基因组切割以及修复的同时，能够将供体DNA片段精确高效***基因组靶位点的终止密码子前，在不影响靶位点基因表达的情况下形成内源性融合基因。本发明提供的基因敲入方法可以应用于许多其他细胞类型的内源基因标记，包括单核细胞、T细胞和自然杀伤细胞，这对探索基因功能特别有利；本发明具有简单和稳健的特性，有助于同时标记多个感兴趣的基因，这对于蛋白质-蛋白质共定位(或相互作用)分析具有重要意义。

基于本发明提供的基因敲入取得的上述技术效果，本发明将上述基因敲入方法应用于构建内源性融合基因和原代细胞基因敲入中，能够实现高效的内源性标签的构建，以及对难于基因敲入的原代细胞实现外源基因的引入。

附图说明

为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1为本发明实验设计方案的原理图；

图2为本发明实施例1中SLC25A6基因结构示意图以及sgRNA靶点、PAM序列和3‘端***dsODN的位置；

图3为本发明实施例1中靶向***的基因分型方法示意图；

图4和5A为本发明实施例1中K562细胞克隆在SLC25A6基因座中3×Flag编码序列***的基因分型；

图5B为为本发明对比例1中K562细胞克隆在SLC25A6基因座中3×Flag编码序列***的基因分型；

图6A为本发明实施例2中在电转染后，通过流式细胞术测定eGFP阳性CD34+hspc的百分比；

图6B为流式细胞分选(FACS)富集带有荧光标记物的细胞的机理图；

图7A为本发明实施例2中FACS富集前后eGFP阳性细胞的百分比；

图7B为本发明实施例2中FACS富集前后eGFP阳性细胞的荧光蛋白定位；

图8为本发明实施例3和对比例2中修饰和未修饰的3×Flag编码序列在CD34+hspc中的靶向***频率比较；

图9A为本发明实施例3中来自GATAD2A和SLC25A6基因的3×FLAG深度测序的定向***，左侧显示了排序的读数和占总比对的读数的百分比，图中显示了CRISPResso2生成的读数占总读数的0.5％以上的代表性变体；

图9B为本发明实施例3和对比例2中来自GATAD2A和SLC25A6基因的3×FLAG深度测序的定向***，左侧显示了排序的读数和占总比对的读数的百分比，图中显示了CRISPResso2生成的读数占总读数的0.5％以上的代表性变体；

图10为本发明实施例4中GATAD2a基因座改良dsODN 3×FLAG标记后***频率；

图11为本发明实施例4中GATAD2A基因结构示意图和sgRNA靶向位点、PAM序列和3’端附近***的dsODN的位置；

图12为本发明实施例4中K562细胞克隆在GATAD2A基因位点***3×Flag编码序列的基因分型；

图13为本发明实施例4和实施例5中AsCas12a核酸酶和spCas9核酸酶介导的基因标签在总***、正向***和无缝***百分比方面的比较。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。

需要说明的是：

本发明中，如果没有特别的说明，本文所提到的所有实施方式以及优选实施方法可以相互组合形成新的技术方案；所有技术特征以及优选特征可以相互组合形成新的技术方案；所涉及的各组分或其优选组分可以相互组合形成新的技术方案。

本发明中，除非有其他说明，数值范围“a～b”表示a到b之间的任意实数组合的缩略表示，其中a和b都是实数。本发明所公开的“范围”以下限和上限的形式，可以分别为一个或多个下限，和一个或多个上限。

本发明中，除非另有说明，各个反应或操作步骤可以顺序进行，也可以不按照顺序进行。

除非另有说明，本文中所用的专业与科学术语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法或材料也可应用于本发明中。

根据本发明的一个方面，本发明提供了一种基因敲入方法，所述基因敲入方法包括将Cas核酸酶与sgRNA形成的核糖核蛋白复合物和供体DNA同时递送到受体细胞。

所述供体DNA为双链寡核苷酸(double-stranded oligodeoxynucleotide,dsODN)，即由碱基互补的两条单链寡核苷酸(ssDNA)组成。dsODN经化学修饰，双链寡核苷酸中各链的5’端经磷酸化修饰；且双链寡核苷酸中各链的5’端和3’端起始1～3个连接键为硫代磷酸键。以其中一条单链寡核苷酸为例，单链寡核苷酸的5’端经磷酸化修饰；同时，单链寡核苷酸5’端起始1～3个连接键为硫代磷酸键，例如可以为但不限于1、2或3个连接键为硫代磷酸键；并且，单链寡核苷酸的3’端起始1～3个连接键为硫代磷酸键，例如可以为但不限于1、2或3个连接键为硫代磷酸键；另一条单链寡核苷酸同上述修饰方式。

以dsODN两条链的5’端和3’端起始的2个连接键为硫代磷酸键为例，dsODN如式(Ⅰ)所示：

5′-P-G*A*T……AAGT*A*A

C*T*A……TTCA*T*T-P 5′ 式(Ⅰ)。

式(Ⅰ)中P表示磷酸化修饰，*表示硫代磷酸键。dsODN的5’端采用磷酸化修饰能够促进非同源末端链接(NHEJ)，在dsODN的两端设计连续的硫代磷酸键，可以稳定细胞中的寡核苷酸，减小毒性，并进一步促进供体DNA和靶向DNA双链断裂(DSB)之间的末端连接过程。供体DNA的末端可选地为粘性末端或平末端。

在一些可选的实施方式中，供体DNA末端(即5’端以及3’端)的2～3个连接键为硫代磷酸键，优选为2个连接键为硫代磷酸键。

本发明不限制作为供体DNA的dsODN的来源或具体的制备方式，可采用本领域任何可接受的方式合成。

在一些可选的实施方式中，一般较短的dsODN可选地采用单链退火合成，可选地实施方式包括将合成的含化学修饰的短片段的单链DNA(单链寡核苷酸，ssDNA)稀释后在退火缓冲液中进行退火，从而获得短片段的dsODN。以3×Flag标签为例，以序列分别如Seq_1和Seq_2所示的ssODN退火合成，得到的dsODN能够高效的敲入靶基因中。Seq_1和Seq_2所示的ssODN退火合成的dsODN与靶基因无重叠。

含化学修饰的ssODN为5’端经磷酸化修饰，同时5’端和3’端起始1～3个连接键为硫代磷酸键的ssODN，ssODN的5’端和3’端起始的硫代磷酸键个数例如可以为但不限于1、2或3个。

ssDNA在退火缓冲液中的浓度优选为80～120pmol/μL，例如可以为但不限于80、90、100、110或120pmol/μL。退火缓冲液优选采用含有氯化钠和乙二胺四乙酸的混合体系，其中氯化钠的浓度优选为50mM，乙二胺四乙酸的浓度优选为1mM。

在另一些可选的实施方式中，对于有合成难度的长片段或合成成本较高的dsODN，可采用将含化学修饰的PCR引物扩增相应的片段的编码序列，制备获得相应的dsODN，即通过PCR程序将PCR引物的修饰引入dsODN。有合成难度的长片段的dsODN例如可以为但不限于GFP荧光蛋白，其长度约714bp，较难通过直接合成获得。含化学修饰的PCR引物即5’端经磷酸化修饰，同时5’端起始1～3个连接键为硫代磷酸键的引物，引物5’端起始的硫代磷酸键个数例如可以为但不限于1、2或3个。以荧光蛋白GFP为例，由序列分别如Seq_9和Seq_10所示的引物PCR合成。

在一些可选的实施方式中，dsODN可选地与靶基因存在1bp的重叠，可选地通过单链退火合成方式在ssODN中引入重叠的1bp，或者在PCR引物中引入重叠的1bp。以靶基因为SLC25A6为例，与靶基因重叠1bp的dsODN由序列分别如Seq_3和Seq_4所示的ssODN退火合成，引入了与SLC25A6重叠的1bp。

本发明提供的基因敲入方法可用于构建内源性标记，因此dsODN的核苷酸序列来源于内源性标记的核苷酸序列。内源性标记例如可以为但不限于标签蛋白、荧光素酶，或荧光蛋白；标签蛋白例如可以为但不限于Flag标签、His标签、GST标签、HA标签、Sumo标签、Avi标签或C-Myc标签；蛋白标签优选为表位标签，以便被抗体捕获，方便研究的进行。荧光蛋白例如可以为但不限于绿色荧光蛋白EGFP、绿色荧光蛋白mNeonGreen、黄色荧光蛋白YFP、红色荧光蛋白mCherry、红色荧光蛋白tdTomato、橙色荧光蛋白mOrange或蓝色荧光蛋白BFP。

本发明提供的基因敲入方法，递送方式采用电转染的方式，通过电转染Cas核酸酶和单链向导RNA(sgRNA)核糖核蛋白(RNP)复合体，可以通过瞬时电脉冲将基因组编辑材料传递到受体细胞。用于电转染的***优选采用真核细胞电转染***，更优选采用Lonza 4D-Nucleofector电转染***。Lonza 4D-Nucleofector电转染***结合电穿孔技术和细胞特异性转染液，通过***内置优化的转染程序，将外源基因高效导入目标细胞的细胞质中，并可直接入核。Lonza 4D-Nucleofector电转染***不依赖于病毒感染、不依赖于细胞有丝***，以不整合基因组的方式对靶基因进行编辑，安全高效。Lonza 4D-Nucleofector电转染***的程序选择可依据本领域参考文献、商品手册或者官方指导，本发明对此不做限制。

本发明不限制受体细胞的来源，受体细胞的来源例如可以为但不限于小鼠、大鼠、豚鼠、仓鼠、兔、雪貂、猫、狗、山羊、绵羊、奶牛、猪、马、猴或人。受体细胞优选为真核细胞，且受体细胞可选地为原代细胞或经传代培养得到的细胞系。对于细胞系，本领域一般使用的商品化的细胞系，或经传代培养得到的细胞系均可作为受体细胞，本发明对此不做限制。以哺乳动物细胞系为例，其中，哺乳动物悬浮细胞例如可以为但不限于K562、KM-H2或J558L；哺乳动物贴壁细胞例如可以为但不限于HEK293T、IHH、C6或CHO-K1；原代细胞例如可以为但不限于免疫细胞、干细胞、神经细胞或内皮细胞，更具体的实例例如可以为但不限于B细胞、T细胞、NK细胞、单核细胞、CD34⁺HSPC细胞、成纤维细胞、间充质干细胞或胚胎干细胞。

在一些优选的实施方式中，向导RNA(sgRNA)靶向基因组靶基因的主要转录本终止密码子上游序列，sgRNA引导Cas核酸酶产生的切口距离终止密码子第一个碱基上游20bp以内。

在一些优选的实施方式中，sgRNA包括碱基的化学修饰；所述化学修饰例如可以为但不限于甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰中的一种或任意几种。优选地，sgRNA的5’端和3’端起始2～4个连接键为硫代磷酸键，优选起始3个连接键为硫代磷酸键。优选地，sgRNA的5’端和3’端起始的2～4个碱基由甲基化修饰，优选为3个碱基为甲基化修饰。

在一些可选的实施方式中，以靶基因为SLC25A6为例，Cas9核酸酶对应的sgRNA序列可选自Seq_11或Seq_12；以靶基因为GATAD2A为例，Cas9核酸酶对应的sgRNA序列可选自Seq_13；Cas12a核酸酶对应的sgRNA序列可选自Seq_14。

本发明提供的基因敲入方法中，Cas核酸酶可选自Cas9核酸酶或Cas12a核酸酶中的一种。

Cas9核酸酶的来源例如可以为但不限于肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌或嗜热链球菌中的一种；且所述的Cas9核酸酶优选至少一端包括NLS序列。

CRISPR/Cas12a是一种单效应子核酸酶，与CRISPR/Cas9一样，由于其产生靶向DNA双链断裂(DSBs)的能力，已被用于基因组编辑。与Cas9生成的钝端DSB不同，Cas12a产生粘性端DSB，具有5’端突出部的交错切割，从而实现了具有互补3’端突出部的DNA片段的高效无缝***，可能有助于精确的基因组编辑。Cas12a核酸酶优选为AsCas12a或LbCas12a。

本发明不限制Cas核酸酶的来源或具体的制备方式，可采用本领域任何可接受的方式获得Cas核酸酶。

在一些可选的实施方式中，将整合有Cas核酸酶的重组质粒转化到感受态细胞中，用异丙基β-d-1硫代半乳糖苷和氯化镁诱导细胞表达Cas核酸酶，然后纯化得到Cas核酸酶蛋白。感受态细胞优选RIPL-BL21(DE3)细胞，异丙基β-d-1硫代半乳糖苷的工作浓度优选为1mM，氯化镁浓度优选为10mM，纯化后的Cas核酸酶蛋白优选在20mM HEPES pH 7.3、150mMNaCl和10％甘油缓冲液中浓缩。

在一些可选的实施方式中，所述基因敲入方法包括将Cas核酸酶与sgRNA共同孵育得到核糖核蛋白复合物，然后将核糖核蛋白复合物，供体DNA以及重悬有受体细胞的电转缓冲液混合，电转染后继续培养受体细胞4～5天。

在一些可选的实施方式中，Cas核酸酶与sgRNA共同孵育时摩尔比例为1:3～1:1，例如可以为但不限于1:3、1:2或1:1。优选地，Cas核酸酶与sgRNA摩尔比例为1:2。Cas核酸酶的用量优选为50～150pmol，例如可以为但不限于50、80、100、120或150pmol；sgRNA的用量优选为200～400pmol，例如可以为但不限于200、250、300、350或400pmol。

在一些可选的实施方式中，每1×10⁵～1×10⁶个受体细胞转入1～20pmol的dsODN，受体细胞的量例如可以为但不限于1、2、3、4、5、6、7、8、9或10×10⁵，优选为5×10⁵～1×10⁶；dsODN的量例如可以为但不限于1、2、5、8、10、12、15、18或20pmol，优选为5～10pmol，更优选为8pmol。

在一些可选的实施方式中，电转染造血干细胞使用Lonza 4D Nucleofector中的EO-100脉冲参数；电转染K562细胞使用FF-120脉冲参数。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述基因敲入方法在构建内源性融合基因中的应用，通过构建融合基因，上述基因敲入方法能够向细胞中引入内源性标记，从而实现向细胞中引入内源标签、内源荧光蛋白以及其他内源表达的蛋白或多肽，并且提高了内源标记效率。

根据本发明的另一个方面，本发明还提供了上述基因敲入方法在原代细胞基因敲入中的应用。上述基因敲入方法另一个特点是能够高效的对原代细胞进行基因敲入，为对原代细胞进行基因敲入，引入内源标记基因提供了更多的可能。

下面结合优选实施例进一步说明本发明的技术方案和有益效果。

下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》(黄培堂等译，北京：科学出版社，2002年)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。

下述实施例实验设计方案的原理如图1所示，将Cas核酸酶和sgRNA形成的核糖核蛋白复合物，以及供体DNA(dsODN)电转染至受体细胞(K562或CD34+HSPC)，sgRNA引导Cas核酸酶在基因组靶位点进行基因组切割，供体DNA片段***切割位点和靶向DNA双链断裂(DSB)之间末端连接，实现外源基因敲入。

1.实验材料：

(1)试剂：DMEM，RPMI-1640，0.25％Trypsin-EDTA，青霉素-链霉素(100×)溶液购自Thermo Fisher Scientific公司；胎牛血清购自Omega Science公司；1×StemSpan CD34+扩增补充剂的SFEM培养液购自STEMCELL Technologies；TA克隆载体pEasy购自TransGenBiotech；基因组DNA提取试剂盒和DNA产物快速回收试剂盒购自天根公司。

(2)细胞系：K562细胞购自ATCC，人CD34⁺HSPC购自华盛顿州西雅图福瑞德·哈金森癌症研究中心。所有细胞均在37℃、5％CO₂条件下培养。

2.实验方法：

(1)Indel效率分析：电转染4天后测定编辑效率。提取基因组DNA，并扩增sgRNA靶点周围的基因组片段。应用Sanger测序和TIDE(http://tide.nki.nl/)来确定距离所预测的编辑位点30bp内的主要诱导突变。用于TIDE分析的引物如表4所示。为了进行扩增子深度测序，用聚合酶链式反应构建扩增子文库(从200～500bp不等)。对扩增产物进行测序后，用CRISPResso2软件对原始测序数据进行分析。

(2)克隆细胞培养的基因分型：为了确定每个克隆细胞系的靶向***事件，对每个样本使用三对引物。用位于靶点两侧的两对引物(F+R)检测靶向***事件，用另外两对含有供体特异的引物(F2+Donor-R和F2+Donor-F)来确定供体***的方向。成功的***将导致较大的扩增片段(***3×Flag序列的扩增片段约为69bp，***EGFP的扩增片段约为732bp)，并且使用这些供体特异的引物还将产生一个聚合酶链式反应扩增片段。为了获得每个***的准确序列，然后将PCR片段克隆到TA克隆载体PYSY中，然后进行Sanger测序。

(3)细胞存活率分析：电转染48h后，用Hoechst 33342染料溶液染色，用CountBright绝对计数磁珠(美国ThermoFisher Science)进行流式细胞仪计数。每组活细胞总数除以0pmoldsODN电转染组的活细胞总数。

(4)流式细胞仪分析：流式细胞仪检测GFP⁺细胞百分率。1×10⁶细胞在PBS中洗两次，悬浮在PBS中，然后用流式细胞仪进行分析。FACSAria Fusion II流式细胞仪(BDBioscience)分选GFP⁺阳性细胞后，用Cytospin(Thermo Science Cytospin 4Centrifuge)直接转到涂有多聚赖氨酸的玻片上，4％多聚甲醛染色，4′,6-二氨基-2-苯基吲哚(DAPI，Invitgen)复染，PBS清洗。经上述染色的固定和染色的玻片直接置于共聚焦荧光显微镜(Zeiss)上观察荧光蛋白表达与细胞内定位。

(5)蛋白质提取和蛋白质印迹：用RIPA缓冲液从编辑细胞中提取蛋白质。经SDS-PAGE分离后，将蛋白质转移到NC膜上，用抗Flag抗体(Sigma，1：1000稀释度)和HRP偶联二抗(Sangon Biotech，中国)进行检测。

3.3×NLS-SpCas9蛋白的制备：

(1)3×SpCas9蛋白表达：将3×NLS-SpCas9质粒转化RIPL-BL21(DE3)感受态细胞后，接种到TB(Terrific broth)培养基中，先在37℃培养使OD600达0.2左右，然后切换到18℃继续培养直到OD600达到1.6～1.8左右。培养过程用终浓度为1mM异丙基β-d-1硫代半乳糖苷(IPTG)和10mM MgCl₂诱导3×NLS-SpCas9蛋白表达，共诱导培养16～20h左右。

(2)3×SpCas9蛋白的纯化：培养结束，收集所有工程菌。使用高压细胞破碎仪(20000psi)将工程菌匀质化，并充分溶于含500mM NaCl及无EDTA的蛋白酶抑制剂的DPBS缓冲液中。收集细菌裂解液，18000g离心40分钟。随后依次使用镍离子亲和层析柱，阳离子交换层析柱，Superdex 200凝胶过滤分离柱纯化浓缩蛋白。将纯化的蛋白溶于含20mM HEPESpH7.3，150mM NaCl的10％甘油缓冲液中，分装后保存于-80℃。

4.序列信息如表1～表4所示：

表1供体DNA序列信息

P表示磷酸化修饰，*表示硫代磷酸键。

表2 sgRNA序列信息

m表示甲基化修饰，*表示硫代磷酸键。

表3用于单克隆细胞中***片段验证的引物

名称	序列(5′-3′)	ID
			SLC25A6-F1	GTGTCTTGAAGAGCTTGG	Seq_15
SLC25A6-R1	GATTCTACGTGGTTCTCTTG	Seq_16
			GATAD2A-F1	ACCCTTGCGTTTGTCAG	Seq_17
GATAD2A-R1	TGCAGTGGGTCCTTCTA	Seq_18
			Flag-F	TAGTCGATATCATGATCCTTATA	Seq_19
Flag-R	GATGGTGATTATAAGGATCATG	Seq_20

表4用于TIDE分析的引物

实施例1

本实施例提供了一种基因敲入方法，目的是向K562细胞中添加内源性标签3×Flag，目的基因为SLC25A6，核酸酶采用SpCas9；

dsODN的两条链如表1中Seq_3和Seq_4所示；

sgRNA如表2中Seq_11所示。

本实施例的步骤如下：

步骤(a):3×Flag编码序列供体DNA的制备。

(1)合成线性化的5’端磷酸化修饰和硫代磷酸键修饰的单链寡核苷酸(ssODN)，序列分别如Seq_1和Seq_2所示，美国IDT公司合成。

(2)将合成的ssODN Seq_1和Seq_2稀释至100pmol/μL，在退火缓冲液中退火制得dsODN；退火缓冲液为氯化钠浓度为50mM，乙二胺四乙酸浓度为1mM的缓冲液。

步骤(b):基因组靶位点sgRNA的制备。

根据Cas9的protospacer adjacent motif(PAM)序列规则设计基因组靶位点的sgRNA，序列如Seq_11所示，本实施例使用的sgRNA带有化学修饰，具体的为sgRNA的5’端和3’端的3个碱基由甲基化修饰；以及，5’端的第一～第四个碱基之间均由硫代磷酸键连接，3’端的第一～第四个碱基之间均由硫代磷酸键连接，如表2所示。化学修饰的sgRNAs由Synthego公司合成，用无RNA酶水稀释为100pmol/μl后保存于-80℃。按照此规则设计的sgRNA靶向基因组产生***缺失基因型的比例(Indel％)约为97.2％。

步骤(c)CRISPR-Cas RNP电转染进行基因编辑：

将3×NLS-Spcas9与针对SLC25A6编码区终止密码子之前最近的sgRNA按100pmol:300pmol的摩尔比混合形成RNP复合物，随后在RNP复合物中加入8pmol步骤(a)制备得到的3×Flag dsODN，随后加入用Lonza电转缓冲液重悬的5×10⁵K562编辑细胞中，并立即进行电转，电转染采用Lonza 4D Nucleofector中的FF-120脉冲参数。电转染结束后的细胞使用PBS清洗后，放置在37℃5％CO₂细胞培养箱中继续培养4～5天。

对比例1

本对比例提供了一种基因敲入方法，与实施例1的区别仅在于，dsODN未经任何修饰，组成dsODN的两条ssODN的序列如Seq_5和Seq_6所示。基因编辑的操作步骤与实施例1的步骤相同，只需要在相应步骤替换本例使用的dsODN。

效果例1

SLC25A6基因结构示意图以及sgRNA靶点、PAM序列和3’端***dsODN的位置如图2所示，首先，sgRNA引导CRISPR-Cas9在PAM序列前3到4位之间产生双链切割，然后线形dsODN通过非同源末端连接(NHEJ)或微同源介导的末端连接(MMEJ)过程***电转的靶细胞。

3×Flag编码序列可能正向或反向***SLC25A6基因3’端的终止密码子前，通过如图3所示的方法鉴定靶向***序列的基因型。简单来说，就是先采用有限稀释法获得电转后的单细胞克隆，并用三组PCR反应和Sanger测序分析***序列基因型。

用覆盖了SLC25A6 sgRNA靶点上下游100bp以上的一对引物SLC25A6-F1(序列如Seq_15所示)和SLC25A6 R1(序列如Seq_16所示)检测靶位点是否有***序列，另外两对引物SLC25A6-F1(序列如Seq_15所示)和Flag-F(序列如Seq_19所示)，以及，SLC25A6-F1(序列如Seq_15所示)和Flag-R(序列如Seq_20所示)用于确定3×Flag***的方向。三对引物的预期扩增片段如表5所示：

表5三对引物的预期扩增片段

基因分型结果如图4、图5A和图5B所示，使用修饰的3×Flag dsODN时(实施例1)，30个细胞克隆中有15个(50.0％)被鉴定为靶向***(图5B)，而在使用未经修饰的dsODN的对照组中，从30个细胞克隆中仅鉴定出3个(10.0％)Flag***的细胞克隆(图5A)。

实施例2

本实施例提供了一种基因敲入方法，目标是向CD34⁺HSPC细胞中添加内源性标签GFP，目的基因分别为SLC25A6和GATAD2A，核酸酶采用SpCas9；

dsODN由PCR合成，PCR两条引物如表1中Seq_9和Seq_10所示；

SLC25A6基因的sgRNA的序列如Seq_11所示，GATAD2A基因的sgRNA的序列如Seq_13所示。

(1)对CD34+HSPC细胞的SLC25A6基因进行基因编辑，操作步骤与实施例1的区别仅在于电转染使用Lonza 4D Nucleofector中的EO-100脉冲参数，以及使用PCR扩增得到dsODN替代退火合成，并在相应步骤替换以Seq_9和Seq_10为引物合成的dsODN和序列Seq_11所示的sgRNA。

(2)对CD34+HSPC细胞的GATAD2A基因进行基因编辑，与(1)中步骤的区别仅在于在相应步骤替换序列Seq_13所示的sgRNA。

用荧光标记物标记内源基因允许通过流式细胞分选(FACS)富集带有荧光标记物的细胞进行后续实验，如图6B所示。结果如图6A所示，在FACS分选前，高达1.8％(SLC25A6)和1.3％(GATAD2A)的CD34+HSPC为GFP阳性。经过FACS的富集后，GFP阳性细胞均增加到90％以上(SLC25A6和GATAD2A)，结果如图7A所示。使用荧光显微镜分析细胞中的蛋白质定位，结果如图7B所示，对SLC25A6观察到明亮和明显的细胞质染色。

实施例1和实施例2数据表本发明提供的方法可以对K562及其他哺乳动物细胞系中以及原代细胞的内源基因进行高效精确的标记，这些标记物包括但不限于3×Flag(短序列)和eGFP(长序列)标记，从而能够在细胞系以及原代细胞中开展内源基因的定位以及其他功能研究。

实施例3

本实施例提供了一种基因敲入方法，目的是向CD34+HSPC细胞中添加内源性标签3×Flag，目的基因分别为SLC25A6和GATAD2A，核酸酶采用SpCas9；

dsODN的两条链如表1中Seq_1和Seq_2所示；

SLC25A6基因的sgRNA的序列如Seq_11所示，GATAD2A基因的sgRNA的序列如Seq_13所示。

(1)对CD34⁺HSPC细胞的SLC25A6基因进行基因编辑，操作步骤与实施例1的区别仅在于电转染使用Lonza 4D Nucleofector中的EO-100脉冲参数；以及，在20μl的单个电转染脉冲中使用2pmoL的修饰dsODN用于基因标记；并在相应步骤替换本实施例使用的dsODN和序列如Seq_11所示的sgRNA。

(2)对CD34+HSPC细胞的GATAD2A基因进行基因编辑，与本实施例(1)中的步骤区别仅在于在相应步骤替换序列Seq_13所示的sgRNA。

对比例2

本对比例提供了一种基因敲入方法，与实施例3的区别仅在于，dsODN未经任何修饰，组成dsODN的两条ssODN的序列如Seq_5和Seq_6所示。基因编辑的操作步骤与实施例3的步骤相同，只需要在相应步骤替换本例使用的dsODN。

效果例2

比较实施例3和对比例2，靶向***3×Flag有望产生比没有***更大的扩增子，然后使用下一代测序(NGS)进行测序。结果如图8、图9A和图9B，以及表6所示。

表6***结果统计

检测到3×Flag序列的靶向***，SLC25A6基因的总***百分比为17.8％，GATAD2A基因的总***百分比为19.6％。尽管CD34+hspc中修饰的dsODN***的效率低于K562细胞系，但SLC25A6和GATAD2A基因座分别有6.02％和3.54％的3×Flag序列***是无缝的，这表明在CD34+hspc中使用修饰的供体DNA进行有效的靶向***是可行的；并且使用修饰的dsODN作为供体DNA，***效率显著的提高。

实施例4

本实施例提供了一种基因敲入方法，目的是向K562细胞中添加内源性标签3×Flag，目的基因为GATAD2A，核酸酶采用AsCas12a(Cpf1)；

dsODN的两条链如表1中Seq_7和Seq_8所示；

sgRNA如表2中Seq_14所示。

本实施例基因编辑的操作步骤与实施例1的区别仅在于本实施例核酸酶采用AsCas12a(Cpf1)，本实施例AsCas12a核酸酶购自IDT公司(美国)。

实施例5

本实施例提供了一种基因敲入方法，目的是向K562细胞中添加内源性标签3×Flag，目的基因为GATAD2A，核酸酶采用spCas9；

dsODN的两条链如表1中Seq_1和Seq_2所示；

sgRNA如表2中Seq_13所示。

本实施例基因编辑的操作步骤与实施例1的步骤相同，只需要在相应步骤替换本实施例使用的dsODN和sgRNA。

效果例3

比较实施例4和实施例5，与SpCas9在相同位置切割DNA链，留下平端不同，Cas12a产生具有5’突出端的交错切割，这可能特别有利于促进基于NEHJ的外源DNA***。GATAD2a基因座改良dsODN 3×FLAG标记后***频率如图10所示。为了确保外源dsODN的精确***，合成的3×Flag dsODN配有粘性末端，其与AsCas12a产生的内源靶位点的粘性末端互补，如图11所示。

基因分型结果，如图12、13所示，30个克隆细胞系中的11个(36.7％)被鉴定为靶向***克隆，其靶向效率与来自SpCas9介导的3×Flag dsODN***的靶向效率相当。

当使用AsCas12a和交错dsODN时，大多数3×Flag标志***是正向的(16.7％，以等位基因百分比计，下同)和精确的(13.3％)，远高于SpCas9介导的整合。这些结果表明AsCas12a可以促进高效和精确的靶向整合。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

Claims (10)

1.一种基因敲入方法，其特征在于，包括：将Cas核酸酶与sgRNA形成的核糖核蛋白复合物和供体DNA同时递送到受体细胞；

所述供体DNA为双链寡核苷酸，所述双链寡核苷酸中各链的5’端经磷酸化修饰；所述双链寡核苷酸中各链的5’端和3’端起始1～3个连接键为硫代磷酸键；

所述递送采用电转染的方式。

2.根据权利要求1所述的基因敲入方法，其特征在于，所述供体DNA末端的2～3个连接键为硫代磷酸键；

优选地，所述供体DNA末端的2个连接键为硫代磷酸键；

优选地，所述供体DNA的末端为粘性末端或平末端；

优选地，所述供体DNA由两条单链寡核苷酸退火合成，所述单链寡核苷酸的5’端经磷酸化修饰；所述单链寡核苷酸中的5’端和3’端起始1～3个连接键为硫代磷酸键，优选为5’端和3’端起始2～3个连接键为硫代磷酸键，更优选为5’端和3’端起始2个连接键为硫代磷酸键；

优选地，所述供体DNA由含化学修饰的PCR引物扩增相应的目的片段得到，所述含化学修饰的PCR引物的5’端经磷酸化修饰；所述PCR引物的5’端起始1～3个连接键为硫代磷酸键，优选为5’端起始2～3个连接键为硫代磷酸键，更优选为5’端起始2个连接键为硫代磷酸键；

优选地，供体DNA的核苷酸序列来源于蛋白标签、荧光素酶或荧光蛋白；

优选地，所述蛋白标签选自Flag标签、His标签、GST标签、HA标签、Sumo标签、Avi标签或C-Myc标签；

优选地，所述蛋白标签为表位标签；

优选地，所述荧光蛋白选自绿色荧光蛋白EGFP、绿色荧光蛋白mNeonGreen、黄色荧光蛋白YFP、红色荧光蛋白mCherry、红色荧光蛋白tdTomato、橙色荧光蛋白mOrange或蓝色荧光蛋白BFP。

3.根据权利要求1所述的基因敲入方法，其特征在于，用于电转染的***采用真核细胞电转染***；

优选地，所述真核细胞电转染***采用Lonza 4D-Nucleofector电转染***。

4.根据权利要求1所述的基因敲入方法，其特征在于，所述受体细胞包括真核细胞；

优选地，所述受体细胞包括哺乳动物细胞系或原代细胞。

5.根据权利要求1所述的基因敲入方法，其特征在于，所述sgRNA引导Cas核酸酶产生的切口距离靶基因的终止密码子第一个碱基上游20bp以内；

优选地，所述sgRNA经化学修饰；

优选地，所述化学修饰包括甲基化修饰、甲氧基修饰、氟化修饰或硫代修饰中的一种多种；

优选地，所述化学修饰为甲基化修饰和硫代修饰；

优选地，所述sgRNA的5’端和3’端起始的2～4个碱基经甲基化修饰；且5’端和3’端起始2～4个连接键为硫代磷酸键；

优选地，所述sgRNA的5’端和3’端起始的3个碱基均经甲基化修饰，且5’端和3’端起始3个连接键为硫代磷酸键。

6.根据权利要求1所述的基因敲入方法，其特征在于，所述Cas核酸酶选自Cas9核酸酶或Cas12a核酸酶；

优选地，所述Cas9核酸酶的来源为肺炎链球菌、金黄色葡萄球菌或嗜热链球菌；

优选地，Cas12a核酸酶为AsCas12a或LbCas12a。

7.根据权利要求1-6任一项所述的基因敲入方法，其特征在于，所述基因敲入方法包括将Cas核酸酶与sgRNA共同孵育得到核糖核蛋白复合物，然后将核糖核蛋白复合物，供体DNA以及重悬有受体细胞的电转缓冲液混合，电转染后继续培养受体细胞4～5天。

8.根据权利要求7所述的基因敲入方法，其特征在于，Cas核酸酶与sgRNA共同孵育时摩尔比例为1:3～1:1，优选为1:2；

优选地，Cas核酸酶的用量为50～150pmol；

优选地，sgRNA的用量为200～400pmol；

优选地，供体DNA的用量为1～20pmol，优选为5～10pmol，更优选为8pmol；

优选地，受体细胞的量为1×10⁵～1×10⁶个，优选为5×10⁵～1×10⁶。

9.权利要求1-8任一项所述的基因敲入方法在构建内源性融合基因中的应用；

优选地，所述构建内源性融合基因用于实现细胞表达内源性标记；

优选地，所述内源性标记包括荧光蛋白或蛋白标签；

优选地，所述蛋白标签包括3×Flag蛋白标签；

优选地，所述荧光蛋白包括GFP。

10.权利要求1-8任一项所述的基因敲入方法在原代细胞基因敲入中的应用。

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