CN115851611A - 一种分泌抗人Claudin 16蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种分泌抗人Claudin 16蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用，包括杂交瘤细胞株1F8E5，所述杂交瘤细胞株1F8E5的保藏号为CCTCC NO：C202298，保藏日期为2022年07月19日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心。本发明提供的单克隆抗体能与人Claudin 16蛋白特异结合，特异性地靶向细胞抗原表位，所述抗原表位包括对应于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第95‑150位的区段，效价高，亲和力好，能够特异检测人Claudin 16蛋白。本发明抗体能够识别卵巢癌细胞Claudin 16蛋白胞外段，具有开发用于卵巢癌临床样本检测、免疫组织化学病理诊断的潜在价值。

Description

一种分泌抗人Claudin 16蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及 应用

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种分泌抗人Claudin 16蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用。

背景技术

卵巢癌是发生在卵巢的恶性肿瘤性疾病，是女性生殖器官常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于子***和子宫体癌。卵巢癌以上皮癌最多见，其次是恶性生殖细胞肿瘤，其中卵巢上皮癌死亡率占各类妇科肿瘤的首位，对女性生命可造成严重威胁。卵巢癌早期多无症状，晚期可出现下腹不适、腹胀、食欲下降等消化道症状，主要的治疗方式包括手术切除、药物治疗和放射治疗，总体预后较差。近几年我国患卵巢癌女性人数明显增加，由于早期症状并不特异，而且临床筛查作用比较有限，所以早期诊断并不容易。目前，包括卵巢癌在内的肿瘤异质性问题得到广泛重视，即使在临床表现上或传统病理分型上类同的肿瘤，其发病的分子根源也不尽相同，这就要求从分子病理水平更深入地探究肿瘤，提高诊疗的精准度。现阶段，利用免疫学方法对肿瘤相关关键蛋白进行检测是关系到肿瘤精准诊疗的重要环节。本申请前期研究发现人Claudin蛋白家族成员Claudin 16的表达水平与卵巢癌的鉴别诊断相关，自主研发的抗人Claudin 16蛋白的单克隆抗体可以特异性识别人Claudin 16蛋白的胞外段，从而用于卵巢癌细胞的免疫荧光检测。

Claudin(CLDN)是人体正常组织中紧密连接最重要的一种蛋白质，具有4个跨膜结构域，是细胞紧密连接的重要分子，参与机体生理过程如细胞旁通透性和电导的调节，其构成了细胞旁屏障，控制着细胞间分子的流动。Claudin形成了一个完整的膜蛋白家族，对紧密连接(TJ)的形成和功能至关重要。Claudin 16属于Claudin蛋白家族，由23个完整的膜蛋白组成，也被称为Paracellin-1，是一种肾紧密连接蛋白，是细胞旁镁吸收所必需的。TJs结构和功能的调节已被证明与上皮肿瘤的发生有关。已有研究显示Claudin 3和Claudin 4是卵巢癌中上调率最高的基因之一。此外，Claudin 3和Claudin 4在卵巢癌细胞中的表达增加与侵袭性增加相关，提示其参与促进卵巢肿瘤的发生和转移。本发明申请研究显示，Claudin16可以作为一种新的卵巢癌特异性标记。为了阐明Claudin 16的在卵巢肿瘤发生中的作用，我们制备了Claudin 16蛋白胞外段的单克隆抗体，使用免疫荧光技术研究了Claudin 16在正常和恶性卵巢组织、卵巢癌细胞中的表达模式，结果表明，Claudin 16在大多数卵巢癌组织中都有高水平的表达，它主要分布在细胞膜上，也可见于细胞质中。免疫荧光显示Claudin 16在许多卵巢癌细胞中高度过表达。Claudin 16在Claudin阴性细胞中的表达，以及Claudin 16在Claudin阳性卵巢癌细胞中的敲除与表型改变相关，如细胞通透性和侵袭能力的改变。这些结果表明Claudin 16可能是卵巢癌鉴别诊断和治疗的一个潜在的靶点。

目前还未发现针对人Claudin 16蛋白胞外段的单克隆抗体及间接免疫荧光检测方法建立的相关专利。因此，一种分泌抗人Claudin 16蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用亟待提出。

发明内容

为解决现有技术存在的缺陷，本发明提供一种分泌抗人Claudin 16蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株及应用。本发明通过制备针对人Claudin 16蛋白胞外段的单克隆抗体，建立了检测人Claudin 16蛋白的间接免疫荧光检测实验方法，具有良好的特异性，可以更好的检测人Claudin 16蛋白在组织细胞中的分布情况，为卵巢癌细胞中Claudin 16蛋白的定位及动态分布提供有效的检测手段。

为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：

本发明的第一目的提供一种分泌抗人Claudin 16蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，包括杂交瘤细胞株1F8E5，所述杂交瘤细胞株1F8E5的保藏号为CCTCC NO：C202298，保藏日期为2022年07月19日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。

本发明的第二目的提供一种单克隆抗体，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株1F8E5所分泌，所述单克隆抗体能够特异性识别人Claudin 16蛋白胞外段，所述识别位点的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

优选的，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

本发明的第三目的提供一种检测试剂盒，所述检测试剂盒中包括检测抗体和荧光二抗，所述检测抗体为上述的单克隆抗体，所述荧光二抗为FITC标记的山羊抗小鼠IgG。

优选的，还包括固定液、洗涤液、封闭液、稀释液中的一种或多种。

本发明的第四目的提供一种单克隆抗体在制备用于卵巢癌细胞免疫荧光检测试剂中的应用。

本发明相较于现有技术，具有以下有益效果：

本发明提供的单克隆抗体能与人Claudin 16蛋白特异结合，所述的单克隆抗体特异性地靶向一抗原表位，所述的抗原表位为对应于SEQ ID NO：1所示氨基酸序列的第95-150位的区段，且效价高，亲和力好，能够用于特异检测人Claudin16蛋白，并用于卵巢癌细胞的免疫荧光检测。本发明提供的抗体可以特异性检测细胞表面Claudin 16蛋白，即Claudin 16蛋白胞外段，能很好地检测卵巢癌组织细胞中Claudin 16蛋白的表达量和表达位置，便于直接判读Claudin 16蛋白在卵巢癌组织细胞中的定位和表达情况，并以此为依据判别卵巢癌的个体化异质性及生存预后。

细胞保藏：

本发明提供一种分泌抗人Claudin 16蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，包括杂交瘤细胞株1F8E5，所述杂交瘤细胞株1F8E5是本发明的发明人自行筛选得到的，所述杂交瘤细胞株1F8E5的保藏号为CCTCC NO：C202298，保藏日期为2022年07月19日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。

附图说明

图1是本发明实施例1中SDS-PAGE结果示意图；

图2是本发明实施例1中Western Blotting分析结果示意图；

图3是本发明实施例2中SDS-PAGE结果示意图；

图4是本发明实施例2中Western Blotting结果示意图；

图5是本发明实施例3中单克隆抗体1F8E5验证卵巢细胞中Claudin 16表达示意图；

图6是本发明实施例5中Claudin 16在不同卵巢癌细胞表面表达的示意图。

具体实施方式

以下结合附图对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。

本发明中基因Claudin 16的GeneBank国际通用序列编号为：NC_000003.12，基因Claudin 16编码蛋白的GeneBank国际通用序列编号为：NP_006571.2。

实施例1：人Claudin 16的重组蛋白表达、纯化及鉴定。

从卵巢癌细胞OVCA R3中利用RT-PCR的方法，利用Claudin 16-F、Claudin16-R为引物克隆Claudin 16基因(其中，Claudin 16-F的基因序列如SEQ ID NO：5所示，Claudin16-R的基因序列如SEQ ID NO：6所示，Claudin 16基因的基因序列如SEQ ID NO：7所示)，然后将克隆得到的Claudin 16基因片段连接含有His标签的pc DNA3.1载体上，得到pcDNA3.1-Claudin 16重组片段。然后将pc DNA3.1-Claudin 16转化DH5α，挑取阳性克隆，将挑取的阳性克隆扩大培养后，提取重组质粒pc DNA3.1-Claudin 16，然后以Hind III、BamHI进行酶切分析，结果显示得到了与预期大小相符的酶切片段。将酶切条带正确的重组质粒pc DNA3.1-Claudin 16经测序确认基因正确后利用PEI转染293悬浮细胞，利用293无血清培养基(37℃，8％CO2)培养6天，中途添加补液，收集培养上清并用镍柱纯化，细胞表达产物经SDS-PAGE分析，结果如图1所示。结果显示，发现在25KD左右有特异表达条带，与基因序列预测Claudin 16胞外段重组蛋白的大小吻合。用Anti-6x His抗体进行Western Blotting分析，结果如图2所示，仅有一条特异性条带，表明蛋白为目的蛋白。

通过上述转染方式扩大培养细胞，纯化蛋白。具体方法为收集细胞培养液，1200rpm离心分离细胞，收集上清，并利用0.45um滤器过滤上清液。将滤液上样到5ml Ni-NTA柱上，经5倍柱体积10mM咪唑溶液清洗，然后用300mM咪唑洗脱，收集各管洗脱蛋白溶液。SDS-PAGE鉴定蛋白纯度并定量，获得的蛋白纯度达到95％，浓缩后浓度为5.86mg/ml。

实施例2：Claudin 16单克隆抗体的制备、纯化及鉴定。

用实施例1纯化的Claudin 16重组蛋白利用腹腔注射方法免疫BALB/c小鼠，每只小鼠每次免疫50ug抗原，免疫体积为100ul。首次免疫Claudin 16蛋白与弗氏完全佐剂1∶1混合，每隔两周免疫一次，Claudin 16蛋白与弗氏不完全佐剂1∶1混合，共免疫3次；最后采用Claudin 16蛋白(不含佐剂)腹腔加强免疫(30ug)，3天后取免疫小鼠的脾脏细胞，然后使用PEG-4000融合免疫小鼠脾脏细胞和小鼠的骨髓瘤细胞SP2/0，利用HAT选择培养基在384孔细胞培养板上选择杂交瘤细胞，并利用ELISA方法鉴定产生抗Claudin 16蛋白胞外段的细胞；分别为杂交瘤细胞株1F8E5、杂交瘤细胞株3H6F11、杂交瘤细胞株4F7D7、杂交瘤细胞株4F11G6和杂交瘤细胞株3E8G12，最后利用转瓶培养获得的杂交瘤细胞株，收集细胞培养上清，采用0.45um的滤器过滤溶液，将含有单克隆抗体的细胞上清液在AKTA纯化***上，以1ml/min流速上样到Protein A-Sepharose亲和层析柱中，用5个柱体积的结合缓冲液(50mMPBS pH7.0)清洗，然后用0.1M甘氨酸-盐酸溶液pH2.7洗脱抗体(每个收集管预先加入1M pH9.0 Tris缓冲液中和)，得到目的抗体。通过SDS-PAGE及Western Blotting鉴定分离纯化的单抗，并分别命名为1F8E5单克隆抗体、3H6F11单克隆抗体、4F7D7单克隆抗体、4F11G6单克隆抗体和3E8G12单克隆抗体。SDS-PAGE结果如图3所示，纯化后的单克隆抗体仅有50kd处的重链和25kd处的轻链，灰度分析显示，抗体纯度达到90％。Claudin 16重组蛋白5ug每孔上样，上述单克隆抗体1∶10000稀释，Western Blotting结果如图4所示，显示抗体特异性与重组蛋白反应。

实施例3：Claudin 16免疫荧光抗体筛选。

将卵巢细胞OVCA R3培养至90％的密度，用配好的固定液(固定液配方：甲醛和丙酮比例1∶1)加入细胞中，室温作用10min，PBS洗3遍，每次洗5min。加入封闭液封闭，封闭液为含1％BSA的PBST。37度静置作用1h。PBS洗3遍，每次洗5min。加入用含有1％BSA的PBST稀释液稀释的上述Claudin 16单克隆抗体，37度静置作用1h，PBST洗4遍，每次洗5min。稀释液1∶1000稀释FITC标记的羊抗小鼠IgG，37度静置作用1h。PBST洗4遍，每次洗5min。细胞核DAPI染色，室温作用10min，PBST洗3遍，每次洗5min。最后滴加缓冲甘油(含50％甘油的水溶液)，置荧光显微镜下拍照观察抗体作用情况。结果显示1F8E5单克隆抗体亲和力及特异性较高，与酶标抗体无特异***叉反应(如图5所示)。

实施例4：Claudin 16免疫荧光检测试剂盒。

试剂盒组分：试剂1：固定液；试剂2：封闭液；试剂3：鼠抗人Claudin 16单克隆抗体(1F8E5)；试剂4：FITC标记山羊抗鼠IgG；试剂5：洗涤液。

实施例5：Claudin 16免疫组化试剂盒检测卵巢癌细胞样本。

通过常规方式培养不同卵巢癌细胞，采用实施例4所述Claudin 16免疫荧光检测试剂盒进行检测(图6)。

荧光显微镜下结果：不同卵巢癌细胞中Claudin 16蛋白的表达量不同，采用本发明提供抗体为核心的免疫荧光检测方法，能很好地检测卵巢癌细胞中Claudin 16蛋白的表达量和表达位置，便于从免疫荧光图中直接判读Claudin 16蛋白在卵巢癌组织细胞中的定位和表达情况，并以此为依据判别卵巢癌的个体化异质性及用药指导。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (6)

1.一种分泌抗人Claudin 16蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞株，其特征在于，包括杂交瘤细胞株1F8E5，所述杂交瘤细胞株1F8E5的保藏号为CCTCC NO：C202298，保藏日期为2022年07月19日，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏单位地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内。

2.一种单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体由权利要求1所述的杂交瘤细胞株1F8E5所分泌，所述单克隆抗体能够特异性识别人Claudin 16蛋白胞外段，所述识别位点的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.根据权利要求2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO：4所示。

4.一种检测试剂盒，其特征在于，所述检测试剂盒中包括检测抗体和荧光二抗，所述检测抗体为如权利要求2或3所述的单克隆抗体，所述荧光二抗为FITC标记的山羊抗小鼠IgG。

5.根据权利要求4所述的检测试剂盒，其特征在于，还包括固定液、洗涤液、封闭液、稀释液中的一种或多种。

6.一种如权利要求2或3所述的单克隆抗体在制备用于卵巢癌细胞免疫荧光检测试剂中的应用。

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