CN115851476B - 一株水稻根内生高地芽孢杆菌258r-7及其生物制剂与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株水稻根内生高地芽孢杆菌258R‑7及其生物制剂与应用，属于生物农药领域，其技术方案要点是：高地芽孢杆菌258R‑7的保藏编号为GDMCC No：62070；将高地芽孢杆菌258R‑7应用于防治稻瘟病；将高地芽孢杆菌258R‑7接种至LB液体培养基中培养，即获得生物制剂。本发明主要用于抑制稻瘟病菌，增强水稻离体叶片的稻瘟病抗性，具有优异的防治以上病害的潜在生防作用，且该生物来源环保无毒性，将其喷施到稻叶表面用于病害的防治，对生态环境影响小，对稻谷的食用及其加工产品来说更加安全可靠；培养条件要求低，具有很好的开发应用前景。

Description

一株水稻根内生高地芽孢杆菌258R-7及其生物制剂与应用

技术领域

本发明涉及生物农药领域，尤其涉及一株水稻根内生高地芽孢杆菌258R-7及其生物制剂与应用。

背景技术

水稻(Oryza sativa L.)作为世界三大主粮之一，是人类赖以生存和发展的重要保证。然而，每年世界各稻区遭受不同程度的病虫害是制约水稻生产的主要因素，其中由稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)引起的稻瘟病是水稻生产中最具毁灭性的病害。目前，水稻生产上仍以喷施化学农药结合田间水肥管理与选育抗病品种等为病害防治的主要方法。然而，长期使用单一化学药剂或复合型药剂易使水稻产生抗药性、残留农药而导致环境污染与食品安全等问题，选育抗病品种虽然不会出现以上弊端，但选育时间长且常出现因稻瘟病菌生理小种变化而易丧失抗病性等问题。因此，寻找一种既快速有效又安全的病害防治途径对实现水稻产业可持续发展具有重要意义。

生物防治是指利用有益生物和/或其代谢产物有效预防和控制作物病虫害的技术，因其高度选择(对人、动物等安全，对环境影响小，仅对病原物有强烈抑制作用)、不易产生抗性以及资源丰富易开发等优点而成为国际上农业病虫害防治研究领域的一大发展趋势。研究显示30％的有益生物和/或其代谢产物源于微生物及其相关产品，其中大部分微生物分离自土壤、海洋或空气等不同微环境，虽然这些微生物对许多病原菌也存在抑制作用，但因其难以在宿主植物中定殖和表达致使病害防治效果不佳。因此，挖掘植物组织内部对病原菌有抑制作用的微生物并研究其防病机制具有重大意义。

已有研究报道从各种微环境中分离筛选到对稻瘟病菌抑制效果最好的拮抗细菌是芽孢杆菌，例如，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)Bs916合成分泌的脂肽类化合物是水稻抵抗包括稻瘟病在内多种病害的关键因子；以巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)开发的菌剂对稻瘟病田间防效良好并得以大面积应用；坚强芽孢杆菌(Bacillusadamantium)B-332对稻瘟病的防治效果高达70％以上；印度温泉泥土中分离出的侧孢短芽孢杆菌(Bacillus brachyspora)BPM3的发酵滤液对稻瘟病的防治效果达30％-67％；地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)BS-3通过产生一种31kDa的抗真菌多肽而达到对稻瘟病菌高效抑制的效果。

目前，关于高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)作为生防菌研究与利用的报道多集中于其对水稻细菌性条斑病与根结线虫的防治，但是通过高地芽孢杆菌抑制稻瘟病菌还鲜有报道。

为了解决上述问题，在现有技术的基础上提供了一株水稻根内生高地芽孢杆菌258R-7及其生物制剂与应用。

发明内容

本发明的目的是提供一株水稻根内生高地芽孢杆菌258R-7及其生物制剂与应用，该菌株来源于水稻根内，能很好地在水稻组织中定殖；对稻瘟病菌有强烈的抑制作用，增强水稻离体叶片的稻瘟病抗性，具有优异的防治以上病害的潜在生防作用，且该生物来源环保无毒性，将其喷施到稻叶表面用于病害的防治，对生态环境影响小，对稻谷的食用及其加工产品来说更加安全可靠；培养条件要求低，具有很好的开发应用前景。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

一株水稻根内生高地芽孢杆菌258R-7，所述高地芽孢杆菌258R-7于2021年11月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼广东省微生物研究所，所述高地芽孢杆菌258R-7的保藏编号为GDMCC No：62070。

进一步地，将所述高地芽孢杆菌258R-7应用于防治稻瘟病。

进一步地，所述稻瘟病的致病菌株包括稻瘟病菌Guy11、稻瘟病菌B157、稻瘟病菌Y7、稻瘟病菌98-06、稻瘟病菌Y34、稻瘟病菌70-15。

通过上述技术方案，高地芽孢杆菌258R-7是从水稻根内分离纯化得到的，且水稻根内生高地芽孢杆菌258R-7在LB培养基上28～30℃培养24h，菌落呈白色，表面干燥，粗糙不透明，有芽孢，芽孢椭圆形，中生或偏端生。

本发明还提供了一种生物制剂，所述生物制剂基于高地芽孢杆菌258R-7制备得到。

进一步地，所述生物制剂由高地芽孢杆菌258R-7经液体发酵制备得到。

进一步地，将所述高地芽孢杆菌258R-7接种至LB液体培养基中培养，即获得所述生物制剂。

进一步地，所述LB液体培养基的pH值为7.0。

进一步地，所述培养是在温度为28～30℃、且摇床震荡速率为180～200rpm的条件下培养24h。

进一步地，将所述生物制剂应用于防治稻瘟病。

进一步地，所述稻瘟病的致病菌株包括稻瘟病菌Guy11、稻瘟病菌B157、稻瘟病菌Y7、稻瘟病菌98-06、稻瘟病菌Y34、稻瘟病菌70-15。

综上所述，本发明具有以下有益效果：

1.本发明得到的高地芽孢杆菌258R-7来源于水稻根内，能很好地在水稻组织内(或表面)定殖；另外本发明从水稻根内筛选到的拮抗内生菌，将其用于稻瘟病的防治，仅仅表现为特定种群间某种微生物数量的增长或消减，并未改变水稻组织内部和外部微生物种群的类别从而影响种群的稳定性，另外由于其与水稻长期共存，互惠共生，形成了一系列与其相似的生存机制，将其喷施到水稻组织表面用于病害的防治，对稻谷的食用及其加工产品来说更加安全可靠。

2.本发明的高地芽孢杆菌对多个稻瘟病菌菌株具有强烈的抑制作用，具有优异的防治稻瘟病的作用，而且该生物来源环保无毒性，对生态环境影响小。

3.本发明得到的高地芽孢杆菌，培养条件要求低，具有很好的开发应用前景。

附图说明

图1为本发明实施例1的高地芽孢杆菌258R-7在LB培养基上的单菌落图；

图2为本发明实施例2的不同形式的高地芽孢杆菌258R-7及其生物制剂(菌体、发酵液、上清滤液)后对多个稻瘟病菌菌株(70-15、Guy11、B157、98-06、Y7、Y34)的抑制作用效果图以及对照组(空白对照与LB对照)图；

图3为本发明实施例3的高地芽孢杆菌258R-7基于水稻离体叶片对稻瘟病菌Guy11的防治效果图，“-”表示处理未接种，“+”表示已接种。

具体实施方式

下面结合附图和实施方式对本发明作进一步的详细说明：

实施例1：一株水稻根内生高地芽孢杆菌258R-7的分离、纯化和保藏，其步骤如下：

(1)LB培养基的配置：称取胰蛋白胨(Tryptone，Oxoid LTD LP0042，England)10g，酵母提取物(Yeast extract，Oxoid LTD LP0021，England)5g，氯化钠(NaCl，国药集团化学试剂有限公司，10019318)10g，加水1000mL搅拌均匀，制备固体培养基时再加15g琼脂，充分加热溶解后分装，121℃灭菌20min后贮存备用。

(2)水稻根内生高地芽孢杆菌的分离、纯化：

用于内生微生物分离的水稻根系采自广东省广州市从化区吕田镇莲麻村。

内生细菌的分离方法具体操作如下：将抗稻瘟病的水稻根系用自来水冲洗干净，晾干水分后称取根组织10g，用体积百分数为70％的酒精浸泡2min，再用2.5％次氯酸钠表面消毒10min，最后用无菌水冲洗4次，在无菌滤纸上吸干水分后将样品转入无菌研钵中，加入10mL无菌水碾碎后，静止放置15min，取100μL涂LB平板，试验处理设3个重复，28℃培养48～72h后，观察结果。

采取漂洗液检验法(Schulz et al.,1993.)进行检验组织表面的消毒效果，取200μL的最后一次漂洗消毒材料的漂洗液涂布于LB固体平板上进行培养，观察培养有无菌落长出，若无菌落出现，证明材料表面灭菌彻底，否则分离结果不能使用。

分离自广东省广州市从化区吕田镇莲麻村抗稻瘟病水稻根内的菌株的16S rRNA序列，与GenBank中登陆号为MH883312.1的Bacillus altitudinis 19RS3菌株16S rRNA序列的同源性达99.93％，结合该菌在LB培养基平板上的菌落形态特征与相关生理生化特征试验，证实其分类命名为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)，命名为高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)258R-7。序列片段如下：

CACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGAGCTAATACCGGATAGTTCCTTGAACCGCATGGTTCAAGGATGAAAGACGGTTTCGGCTGTCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCAAGAGTAACTGCTTGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTTCCCTTCGGGGACAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCTGCGAGACCGCAAGGTTTAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGCAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTT。

高地芽孢杆菌258R-7在LB培养基上28℃培养，培养24小时，菌落呈白色，表面干燥，粗糙不透明，有芽孢，芽孢椭圆形，中生或偏端生，如图1所示。

(3)高地芽孢杆菌258R-7的保藏：将该菌株于2021年11月17日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号GDMCC No：62070。

实施例2：对峙培养法测定高地芽孢杆菌258R-7的抑菌活性

(1)LB培养基的制备同实施例1；LB液体培养基的制备除不加琼脂，其他与LB固体培养基的配方相同，将称得的药剂充分溶解后分装于锥形瓶(每瓶100mL培养液)，加塞、包扎，121℃灭菌20min，冷却后贮存备用。

(2)CM培养基的制备：称取酵母提取物Yeast extract 6g，酶水解酪蛋白Casaminoacid 6g，蔗糖Sucrose 10g于量杯，定容至1000mL，充分加热溶解后分装于锥形瓶(每瓶100mL培养液)，加入1％琼脂粉，121℃灭菌20min，冷却后贮存备用。

(3)高地芽孢杆菌单菌落的制备：将高地芽孢杆菌划线接种至LB培养基平板上活化培养24h后，挑取单菌落进行划线保存。

(4)高地芽孢杆菌发酵液(生物制剂)和上清滤液的制备：取步骤(3)制备得到的高地芽孢杆菌单菌落接入步骤(1)制备得到的LB液体培养基锥形瓶中，置于28℃，摇床速率为200rpm下培养24h，即可得到高地芽孢杆菌发酵液；将获得的发酵液于12000rpm离心10min，取上清液，再用0.2μm的过滤器滤除去菌体，获得高地芽孢杆菌上清滤液。

(5)活性测定：

①高地芽孢杆菌对多株稻瘟病菌(70-15、Guy11、B157、98-06、Y7、Y34)生长的抑制作用测定：将直径9cm的滤纸对折，翻转90°对折再对折，定培养皿的四个点。将稻瘟病菌菌碟接种到一点上，4天后将步骤(3)制得的高地芽孢杆菌菌体划线接种于该点相对的点上。实验以不接种高地芽孢杆菌(图2第一列：空白对照)和接种LB液体培养基(图2第二列：LB对照)为对照，各设3个重复，置28℃下恒温培养。4天后观察稻瘟病菌生长情况，结果如图2第三列所示。

②高地芽孢杆菌发酵液对多株稻瘟病菌(70-15、Guy11、B157、98-06、Y7、Y34)生长的抑制作用测定：将步骤①中的高地芽孢杆菌菌体换成用牛津杯装着的200μL高地芽孢杆菌发酵液，其余步骤不变。发酵液的制备：将高地芽孢杆菌单菌落接种在5mL LB液体培养基中，置于28℃，摇床速率为200rpm下培养24h后放入4℃冰箱中备用，结果如图2第四列所示。

③高地芽孢杆菌上清滤液对多株稻瘟病菌(70-15、Guy11、B157、98-06、Y7、Y34)生长的抑制作用测定：将步骤②中的高地芽孢杆菌发酵液换成用牛津杯装着的200μL高地芽孢杆菌上清滤液，其余步骤不变。上清液的制备：将步骤②中的高地芽孢杆菌发酵液放入离心机中，12000rpm离心10min，吸取上清液并经0.2μm的过滤器滤除去菌体，即为上清滤液，结果如图2第五列所示。

实施例3：基于水稻离体叶片测定高低芽孢杆菌258R-7对稻瘟病菌Guy11的防治效果

(1)水稻幼苗的培育：选取健康饱满的水稻种子进行烘干处理以打破休眠，经次氯酸钠溶液浸泡消毒后用无菌去离子水冲洗干净，继续用无菌去离子水浸种催芽，待种子露白后，用灭菌的镊子转移种子于事先剪去底部的96孔PCR板中，先用无菌去离子水培养至至一叶一心期，后用1/4终浓度国际水稻所配方营养液培养至二叶一心期，再用1/2终浓度国际水稻所配方营养液培养至三叶一心期，最后用1×国际水稻所配方营养液培养幼苗至四叶一心期备用；

(2)稻瘟病菌菌碟的制备：活化培养稻瘟病菌Guy11于PA培养基，28℃黑暗培养3d后，光暗交替培养4天(光/暗＝12h/12h)，用直径8mm的打孔器在菌落边缘打孔备用；

(3)高地芽孢杆菌发酵液的制备：方法同实施例2(4)，使用前加入一滴吐温20；

(4)防效测定：

①待接种水稻叶片的准备：取双面胶分别粘在方形培养皿(边长13cm)两条对边，剪取培养时间一致且健康的水稻叶片(12片)排列放置于培养皿内(叶片首尾分别粘在双面胶上)并标记编号1-12，用无菌水浸湿脱脂棉压在叶片两端(双面胶粘合处)进行保湿。

②用毛笔刷蘸取无菌水(事先加入一滴吐温20)，均匀刷在编号1-6的水稻叶片表面，另外蘸取(3)制备的高地芽孢杆菌发酵液，均匀刷在编号7-12的水稻叶片表面，喷洒适量无菌水于培养皿盖，盖上皿盖，整皿至于托盘中，托盘中加入适量无菌水(不渗水进入培养皿即可)，用保鲜膜将托盘封住，置于28℃黑暗培养24h。

③取出已黑暗培养24h的托盘，撕去保鲜膜，打开培养皿盖，将稻瘟病菌菌碟倒扣(菌丝面贴于水稻叶片表面)接种于编号4-6和10-12的水稻叶片，以PA培养基块接种于编号1-3和7-9的水稻叶片作为空白对照，盖上皿盖，置于托盘内(保证适量无菌水以达到保湿效果)，用保鲜膜将托盘封住，置于28℃黑暗培养24h后，转移至光/暗交替各12h的培养箱中，28℃培养5天，结果如图3所示。

本具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。

Claims (7)

1.一株水稻根内生高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)258R-7，其特征是：所述高地芽孢杆菌(Bacillus altitudinis)258R-7的保藏编号为GDMCC No：62070；所述高地芽孢杆菌258R-7应用于防治稻瘟病；所述稻瘟病的致病菌株为稻瘟病菌Guy11、稻瘟病菌B157、稻瘟病菌Y7、稻瘟病菌98-06、稻瘟病菌Y34或稻瘟病菌70-15。

2.一种生物制剂，其特征是：所述生物制剂包含权利要求1中所述的高地芽孢杆菌258R-7，且基于权利要求1中所述的高地芽孢杆菌258R-7制备得到。

3.根据权利要求2所述的一种生物制剂，其特征是：所述生物制剂由高地芽孢杆菌258R-7经液体发酵制备得到。

4.根据权利要求2所述的一种生物制剂，其特征是，所述生物制剂的制备方法为：将所述高地芽孢杆菌258R-7接种至LB液体培养基中培养，即获得所述生物制剂。

5.根据权利要求4所述的一种生物制剂，其特征是：所述LB液体培养基的pH值为7.0。

6.根据权利要求4或5所述的一种生物制剂，其特征是：所述培养是在温度为28～30℃、且摇床震荡速率为180～200rpm的条件下培养24h。

7.根据权利要求2至5任意一项所述的一种生物制剂的应用，其特征是：将所述生物制剂应用于防治稻瘟病；所述稻瘟病的致病菌株为稻瘟病菌Guy11、稻瘟病菌B157、稻瘟病菌Y7、稻瘟病菌98-06、稻瘟病菌Y34或稻瘟病菌70-15。