CN115850424A - 一种up蛋白片段及其在人源包虫病中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种UP蛋白片段及其在人源包虫病中的应用。所述多肽包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的一种或多种。本发明还公开了所述的多肽或所述的标志物组合在制备抗包虫病抗体或在诊断细粒棘球蚴所致疾病的诊断剂中的应用。本发明的包虫新抗原UP可以用来制作ELISA试剂盒并用于临床检测人源包虫病；且可大量纯化，方便大规模筛选人源包虫病。

Description

一种UP蛋白片段及其在人源包虫病中的应用

技术领域

本发明涉及属于免疫医学领域，特别涉及一种多肽即人源包虫病新抗原UP蛋白片段、核酸序列及其在制备检测或治疗人源包虫病的药物中的应用。

背景技术

包虫病又名棘球蚴病，是一种人畜共患病，在中国中西部地区(西藏、青海、四川、新疆等地)感染尤其严重。人源包虫病主要分为囊型包虫病和泡型包虫病。影像学检测是最直观最常用的包虫病诊断方法，但是由于包虫病的潜伏期较长，并且只有在包虫病形成的包囊大到一定程度时才能够通过影像学检测到，所以血清学检测是影像学诊断包虫病的重要辅助手段之一。目前，可以被用来诊断包虫病的血清学诊断抗原主要有抗原B(AntigenB)和抗原5(Antigen 5)以及与这两种抗原相关的一些重组抗原。

从包虫病人术后分离的包虫囊中提取包虫蛋白并鉴定，本身是一个技术难点。如果鉴定到的包虫蛋白本身种类就很少，想从中选取可能作为包虫抗原的蛋白将更加困难。

其次，单一抗原种类少。目前最广泛应用的包虫病诊断抗原是AntigenB和Antigen5，许多研究表明这两种抗原在血清检测时会产生一定的假阳性或假阴性。

商品化包虫抗原是天然纯化抗原，分离纯化自细粒棘球蚴破碎后的可溶性抗原片段，是一种包含多种包虫蛋白的混合物。混合的蛋白越多越容易在血清检测时产生更多假阴性或假阳性的结果。

发明内容

为解决现有技术中包虫蛋白提取和鉴定困难、包虫抗原少等技术缺陷，本发明提供了一种多肽即人源包虫病新抗原UP蛋白片段、核酸序列及其在制备检测或治疗人源包虫病的药物中的应用。本发明通过寻找更多可以用来诊断包虫病的抗原，扩充包虫抗原数据库，使这些抗原或单一或组合都有可能提升实验室诊断包虫病的特异性和灵敏性。

本发明第一方面提供了一种多肽，其中，所述多肽包含如SEQ ID NO:1、SEQ IDNO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的一种或多种。

本发明第二方面提供了一种分离的核酸，其中，所述分离的核酸编码如本发明第一方面所述的多肽。

本发明第三方面提供了一种重组表达载体，其中，所述重组表达载体包含如本发明第二方面所述的分离的核酸。

本发明第四方面提供了一种转化体，其包含如本发明第二方面所述的分离的核酸或本发明第三方面所述的重组表达载体，其中，所述转化体为细菌或真核细胞。

在一些优选的实施方式中，所述细菌为E.coli BL21。

本发明第五方面提供了一种用于检测包虫病的试剂盒，其中，所述试剂盒包括本发明第一方面所述的多肽。

在一些优选的实施方式中，所述试剂盒为间接ELISA检测试剂盒。

在一些更优选的实施方式中，所述间接ELISA检测试剂盒还包括第二抗体、包被液、洗液、显色液、终止液和稀释液。

本发明第六方面提供了一种标志物组合，其中，所述标志物组合包括如本发明第一方面所述的多肽。

在一些优选的实施方式中，所述标志物组合还包括Egr、抗原B和抗原5中的一种或多种。

本发明第七方面提供了一种抗包虫病的siRNA或mRNA疫苗，其中，所述siRNA或mRNA疫苗包含与编码本发明第一方面所述的多肽的核苷酸序列互补的RNA序列。

本发明第八方面提供了一种生产本发明第一方面所述的多肽的方法，其中，所述方法包括以下步骤：将本发明第四方面所述的转化体培养于适合其发酵的条件下，使其表达所述多肽。

本发明第九方面提供了一种本发明第一方面所述的多肽或本发明第六方面所述的标志物组合在制备抗包虫病抗体或在诊断细粒棘球蚴所致疾病的诊断剂中的应用。

在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实例。

本发明所用试剂和原料均市售可得。

本发明的积极进步效果在于：

(1)提供了一个包虫新抗原UP，其可用来制作ELISA试剂盒并用于临床检测人源包虫病；并可以与Egr抗原作为相互补充，对包虫病进行更灵敏的检测。

(2)所述包虫新抗原可大量纯化，方便大规模筛选人源包虫病。

附图说明

图1为五个囊液组分提取到的全蛋白的SDS-PAGE和Western blotting结果展示。左图是以No.1病人血清作为一抗、五个囊液组分作为抗原的WB结果展示。中图是以正常西***血清作为一抗、五个囊液组分作为抗原的WB结果展示。右图是五个囊液组分的蛋白凝胶结果展示。

图2为UP重组蛋白的纯化结果展示。图中所示为UP重组蛋白的梯度洗脱结果，每个泳道上样量均为10μl。每个泳道依次分别指的是超声后菌体全蛋白、镍柱上样后的流穿、20mM咪唑至1M咪唑洗脱梯度。

图3为纯化后UP重组蛋白的WB验证实验结果展示。数字1-9指9个在进行包虫囊摘除术前取的病人血清。Control指未患病的正常西***血清。Egr_SDS-PAGE是指商品化抗原Egr的蛋白凝胶结果展示,箭头所指蛋白条带为Antigen B。

图4为ELISA实验结果展示。UP_OD(+)和Egr_OD(+)指的是607例B超阳性血浆的OD值，UP_OD(-)和Egr_OD(-)指的是636例正常人血浆的OD值。

图5为UP重组蛋白和商品化抗原Egr的ROC曲线。左图为UP的ROC曲线，Criterion是指UP对血清检测时，大于0.6是阳性(患包虫病)，小于等于0.6是阴性(未患包虫病)。右图为Egr的ROC曲线，Criterion是指Egr对血清检测时，大于0.99是阳性(患包虫病)，小于等于0.99是阴性(未患包虫病)。

具体实施方式

下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

实施例1：包虫病人术后分离的包虫囊鉴定到更多包虫蛋白的过程

(1)首先将10个包虫病人术后分离的包虫囊根据其组织结构分为四部分提取蛋白，由内向外分别是原头蚴、囊液、生发层和角皮层；又根据其是否处于活性期，将10个包虫囊分为活性包虫囊组和非活性包虫囊组。

(2)每个包虫囊的四个组分均进行了蛋白提取，并将提取的蛋白进行液态酶解，随后使用QE质谱仪进行LC-MS/MS鉴定；

(3)QE下机的原始数据使用maxquant蛋白鉴定软件，使用人和包虫蛋白数据库合集，进行包虫蛋白质鉴定，统计鉴定结果并确定包虫蛋白含量多的包虫囊部分，结果如表1和表2所示；

(4)由表1和表2可知，有两点基本结论：一是鉴定到包虫蛋白更多的组织部分是囊液和原头蚴这两个部分；二是只有活性包虫囊组的囊液和原头蚴部分提取的蛋白中包含有更多的包虫蛋白。

表1活性包虫囊组的蛋白质鉴定结果

_1表示原头蚴；_2表示囊液；_3表示生发层；_4表示角皮层。

表2非活性包虫囊组的蛋白质鉴定结果

_1表示原头蚴；_2表示囊液；_3表示生发层；_4表示角皮层。

实施例2：Western Blot验证、切胶酶解并质谱鉴定(GeLC-MS/MS)

(1)接下来，根据10个样本的囊液和原头蚴的QE鉴定结果，我们选取No.1-No.5五个活性包虫囊组的原头蚴和囊液组分分别进行与病人血清的WB实验，以便验证包虫病人和正常西***血清与提取的全蛋白之间是否有免疫反应。

(2)因部分样本的原头蚴组分提取到的蛋白总量很少，故主要进行了囊液组分蛋白的Western Blotting实验，结果如图1所示，以No.1病人血清为例展示，包虫病人和正常西***血清与5个囊液组分蛋白的免疫反应图谱。其他病人血清和正常西***血清对5个样本蛋白的免疫反应图谱均与No.1病人相似。

(3)又根据这5个囊液组分的SDS-PAGE图谱，我们对照WB的免疫条带对SDS-PAGE胶进行了切胶酶解，以期能够通过切胶分离鉴定到相应分子量区段里的更多包虫蛋白，增加找到与血清发生免疫反应的包虫抗原的几率。另外，这样可以减少高丰度蛋白对鉴定的影响。

(4)为了减少损失和减轻工作量，我们统一将5个囊液组分蛋白根据WB免疫条带分成了10个组分，随后各组分分别进行了胶内酶解。

(5)经过QE-HF-X质谱仪的LC-MS/MS分析后，maxquant软件使用与2.2.1中相同的数据库进行了蛋白搜库鉴定。结果如表3所示。

(6)通过数据分析可知，1_2、2_2和5_2这三个样本切胶分离所鉴定到的包虫蛋白包含了其余四个样本所鉴定到的包虫蛋白，所以，后续包虫抗原的候选从这三个样本各组分共同鉴定到的包虫蛋白中寻找。

表3五个囊液组分切胶酶解的蛋白质鉴定结果

括号中的数字表示总鉴定出的蛋白质，而括号外的数字表示每个组分中的包虫蛋白。_2表示囊液。

实施例3：筛选作为候选抗原的包虫蛋白

(1)同一组分在三个样本中鉴定到的共同蛋白作为候选抗原库，最终10个组分一共产生了93个唯一蛋白。

(2)这93个蛋白首先与人的蛋白数据库进行同源比对，删除同源性特别高的蛋白和已经被选为包虫抗原的那些蛋白后，剩余的蛋白进行B细胞抗原表位的预测。

实施例4：抗原表位预测以及重组质粒构建

(1)抗原表位预测使用了一个在线预测工具http://tools.iedb.org/bcell/，将蛋白质序列导入，选择Bepipred Linear Epitope Prediction 2.0预测方法，即可得到关于此蛋白可能成为抗原表位的序列列表。

(2)我们根据每一个候选蛋白的抗原表位列表，选取包含一个或多个表位的序列片段组成重组蛋白的序列，并且将此序列导入比对工具中与人的蛋白质数据库进行比对，只有与人的蛋白相似度<＝20％的序列片段才被选为构建重组蛋白。

(3)最终14个蛋白序列片段通过分子克隆技术***到pET-30a(+)质粒中构建重组质粒，并通过测序确认片段已被***。

实施例5：重组蛋白的表达与纯化

(1)重组质粒转入BL21(DE3)中进行小量试表达，确认蛋白可以表达且分子量正确后，再进行扩培。

(2)收集的菌液经过超声提取蛋白后，再通过质粒携带的His-tag进行镍柱纯化，图2展示了本发明UP片段构建的重组蛋白的纯化结果。

实施例6：UP重组蛋白的Western Blotting验证

(1)14个重组蛋白中有8个表达成功，因此纯化后的8种重组蛋白均分别与9个术后病人血清进行了Western Blotting实验，结果显示只有4个重组蛋白与病人血清免疫反应较大，其中包含UP重组蛋白，后续使用UP重组蛋白作为包虫抗原候选进行更多病人血清的ELISA验证试验。

(2)图1实验证明，囊液全蛋白对病人血清存在强烈的免疫反应，而对正常西***血清基本无反应，且绝大部分引起免疫反应的蛋白条带不是高丰度蛋白条带；图3展示了UP重组蛋白和商品化抗原Egr与9个病人血清的WB实验结果，UP重组蛋白的免疫反应率为56％，商品化抗原的免疫反应率为67％(只统计43KD和34KD之间有明显条带的样本)。4展示了这种重组蛋白的B细胞抗原表位、核苷酸序列和氨基酸序列。

表4UP重组蛋白的B细胞抗原表位、核苷酸序列和氨基酸序列

实施例7：重组抗原UP重组蛋白的ELISA实验

所检测的对象为607例B超阳性血浆(含疑似)和636例正常人血浆(确定为阴性)，按照间接ELISA的标准操作步骤进行实施，结果显示UP重组蛋白阳性检出率为90％，阴性检出率为77％；而用商品化抗原Egr(产品名称：包虫纯化抗原Echinococcus granulosus，货号：YM-VI08，供应商：杭州亿米诺生物科技有限公司)检测相同的血浆时阳性检出率为86％，阴性检出率为92％。

1、ELISA实验具体操作步骤

(1)抗原定量：每种抗原在包被前均使用移液枪吹匀，并使用微量紫外分光光度计给抗原定量，以确保蛋白未降解。在A280处无吸收峰，则说明抗原量很低不宜用于包被；若蛋白析出或有不溶，则滴加8M尿素后吹匀，离心取上清测浓度。

(2)包被：对比抗原管壁浓度及测量值，就低取值；包被量为2μg/ml、10ml/板，按照实际使用量配制包被抗原量；包被的ELISA板上标记：抗原编号、名称、标签、包被日期及板子编号等，若包被浓度不是2μg/ml则需要标明包被浓度。标记完ELISA板后，加入包被抗原，100μl/孔，4℃包被过夜或37℃包被2h。

(3)洗板：包被完的板子，用洗板机洗板1次，于吸水纸上拍干。50X洗液配方为：Tris 154.4g，NaCl 149.0g，Tween 20 24.0ml，纯水800ml，约45ml浓盐酸调pH7.2，纯水定容到1000ml。4℃保存。

(4)封闭：2％脱脂奶粉作为封闭液进行封闭，200μl/孔，4℃封闭过夜或37℃封闭2h。

(5)洗板：封闭完的板子，用洗板机洗板1次，于吸水纸上拍干。

(6)加一抗：加入相应一抗，使用PBS按照比例1：500稀释血浆，37℃孵育1h。

(7)洗板：用洗板机洗板3次以上，于吸水纸上拍干。

(8)加二抗(厂商：碧云天；货号：A0201)：因一抗来源为人的血浆，故二抗使用山羊抗人1：500加入，37℃孵育1h。

(9)洗板：用洗板机洗板3次以上，于吸水纸上拍干。洗板同时，配制好显色液(TMB)。

(10)显色：准备好终止液后，加入显色液100μl/孔，可以晃动板子加速显色过程并注意密切观察。

(11)TMB显色：显色到一定程度时(一般不能让空白和阴性显色太高)，加入50μl/孔终止液，加入终止液后需要静置10min以上，使终止彻底、颜色均一(可以晃动板子加速终止过程)，终止后读数

(12)读数：酶标仪必须预热30min以上；TMB显色检测波长为：450nm。打开相应的酶标仪测量软件,读数。将数据存储到指定位置并完善数据。

(13)注意事项：

96孔板用枪加样时，注意避免产生气泡，并且避免所加样品挂壁。

加完样，整板观察，要求孔底无气泡；发现气泡时，震荡板子或用枪头去除气泡。

洗板时需密切关注，确保洗板完全、彻底。

显色时需密切关注，结合阴性、空白、阳性对照的显色情况，及时终止。

(14)各种试剂配方

包被液：碳酸钠-碳酸氢钠缓冲液，pH9.6：Na₂CO₃ 1.59g，NaHCO₃ 2.93g，纯水定容至1000ml；最后用pH试纸检测pH值。4℃保存。

2、ELISA结果分析

(1)阴阳性判断标准：选取阴性血清样本的平均值(X)，标准差(SD),其置信区间上限cut-off值为X+2SD。待测样本在450nm处的OD值大于等于X+2SD可判为阳性，小于X+2SD可判为阴性。

(2)ROC曲线：使用MedCalc软件(版本19.4.0)绘制ROC曲线(Receiver OperatingCharacteristic curve)评估抗原的最优检测效力。

(3)通过计算，使用本发明的包虫抗原免疫607例B超阳性血浆(含疑似)和636例正常人血浆(确定为阴性)，其敏感性为90％，特异性为77％；而用商品化抗原检测相同的血浆时敏感性为86％，特异性为92％。图4展示了UP重组蛋白和商品化抗原Egr的ROC曲线以及检测OD值的箱型图。

(4)虽然UP重组蛋白的特异性低于商品化抗原的特异性，但是UP重组蛋白敏感性高于商品化抗原，且经过MedCalc软件的逻辑回归模拟UP重组抗原和商品化抗原Egr的双特征ROC曲线得知，两种抗原一起的检测效力非常好。说明UP重组抗原很可能可以作为商品化抗原的补充检测对未被商品化抗原检测出阳性的样本进行再检测，所以UP重组蛋白可以作为包虫新抗原候选。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳华大生命科学研究院

<120> 一种UP蛋白片段及其在人源包虫病中的应用

<130> P22012953C

<160> 11

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 37

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 表位1

<400> 1

Lys Pro Gln Lys Ile Thr Val Asp Thr Lys Ser Cys Gly Pro Leu Thr

1 5 10 15

Ala Tyr Leu His Gly Gly Arg Val Gly Lys Asp Val Ala Ala Leu Thr

20 25 30

Val His Asp Leu Gly

35

<210> 2

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 表位2

<400> 2

Phe Val Asn Asn Glu His Met Ser Gln Leu Thr Gln Arg

1 5 10

<210> 3

<211> 60

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 表位3

<400> 3

Val Pro Gly Gln Gly Asp Asn Met Pro Asp Leu Pro Ser Asp Trp Lys

1 5 10 15

Phe Pro Thr Met Gln Lys Ile Ser Glu Gly Ile Ser Glu Leu Cys Asp

20 25 30

Ser Leu Glu Leu Lys His Val Val Val Ile Gly Asp Gly Ala Gly Ala

35 40 45

Asn Ile Val Ala Arg Leu Ala Met Ala Arg Glu Asp

50 55 60

<210> 4

<211> 33

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 表位4

<400> 4

Leu Ile His Cys Thr Gly Thr Thr Ala Gly Phe Met Glu Ser Leu Arg

1 5 10 15

Asp Arg Val Asn Ser Trp Lys Leu Asn Thr Ile Gly Met His Pro Ser

20 25 30

Val

<210> 5

<211> 34

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 表位5

<400> 5

Gln Ser Leu Arg Glu Asn Ile Asn Pro Lys Asn Leu Asn Lys Phe Ile

1 5 10 15

Gln Ala Phe Met Val Arg Thr Asn Ile Thr Asp Ser Ile Gly Asn Leu

20 25 30

Lys Cys

<210> 6

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 表位6

<400> 6

Ile Thr Gly Ser Val Ala Ser Phe Asn His Thr Val Tyr Thr Leu Tyr

1 5 10 15

Asn Ala

<210> 7

<211> 13

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 表位7

<400> 7

Pro Ala Arg Lys Ala Asn Val Glu Ile Leu Glu Ile Asp

1 5 10

<210> 8

<211> 46

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 表位8

<400> 8

Glu Lys Val Ala Glu Ser Val Gln Asn Phe Met Gln Gly Leu Gly Val

1 5 10 15

Ala Ser Gly Ala Val Asn Arg Arg Leu Ser Ala Thr Gly Asn Val Pro

20 25 30

Lys Ile Arg Asn Arg Ser Ala Ser Met Asp Glu Tyr Asp Gln

35 40 45

<210> 9

<211> 20

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> 表位9

<400> 9

Ile Tyr Asp Asn Thr Arg Arg Tyr Ser Lys Ala Thr Asp Ile Pro Glu

1 5 10 15

Ile Ser Glu Val

20

<210> 10

<211> 358

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> UP

<400> 10

Met Ser Ser Gln Lys Pro Gln Lys Ile Thr Val Asp Thr Lys Ser Cys

1 5 10 15

Gly Pro Leu Thr Ala Tyr Leu His Gly Gly Arg Val Gly Lys Asp Val

20 25 30

Ala Ala Leu Thr Val His Asp Leu Gly Tyr Asn Glu Phe Phe Glu Phe

35 40 45

Val Asn Asn Glu His Met Ser Gln Leu Thr Gln Arg Val Phe Trp Ile

50 55 60

His Val Glu Val Pro Gly Gln Gly Asp Asn Met Pro Asp Leu Pro Ser

65 70 75 80

Asp Trp Lys Phe Pro Thr Met Gln Lys Ile Ser Glu Gly Ile Ser Glu

85 90 95

Leu Cys Asp Ser Leu Glu Leu Lys His Val Val Val Ile Gly Asp Gly

100 105 110

Ala Gly Ala Asn Ile Val Ala Arg Leu Ala Met Ala Arg Glu Asp Ile

115 120 125

Cys Leu Gly Ala Ile Leu Ile His Cys Thr Gly Thr Thr Ala Gly Phe

130 135 140

Met Glu Ser Leu Arg Asp Arg Val Asn Ser Trp Lys Leu Asn Thr Ile

145 150 155 160

Gly Met His Pro Ser Val Glu Asn Tyr Leu Val Leu His Arg Phe Gly

165 170 175

Val Phe Ile Lys Ala Thr Thr Glu Ala Glu Leu Arg Gly Ala Ile Lys

180 185 190

Asn Phe Leu Gln Ser Leu Arg Glu Asn Ile Asn Pro Lys Asn Leu Asn

195 200 205

Lys Phe Ile Gln Ala Phe Met Val Arg Thr Asn Ile Thr Asp Ser Ile

210 215 220

Gly Asn Leu Lys Cys Pro Val Leu Phe Ile Thr Gly Ser Val Ala Ser

225 230 235 240

Phe Asn His Thr Val Tyr Thr Leu Tyr Asn Ala Leu Met Asn Ala Leu

245 250 255

Lys Asp Gln Pro Ala Arg Lys Ala Asn Val Glu Ile Leu Glu Ile Asp

260 265 270

Gly Val Ala Asn Val Met Arg Glu Arg Pro Glu Lys Val Ala Glu Ser

275 280 285

Val Gln Asn Phe Met Gln Gly Leu Gly Val Ala Ser Gly Ala Val Asn

290 295 300

Arg Arg Leu Ser Ala Thr Gly Asn Val Pro Lys Ile Arg Asn Arg Ser

305 310 315 320

Ala Ser Met Asp Glu Tyr Asp Gln Pro Val Gly Val Lys Asn Leu Ile

325 330 335

Tyr Asp Asn Thr Arg Arg Tyr Ser Lys Ala Thr Asp Ile Pro Glu Ile

340 345 350

Ser Glu Val Gly Asp His

355

<210> 11

<211> 1077

<212> DNA

<213> Artificial Sequence

<220>

<223> up

<400> 11

atgtcctccc agaaacctca gaaaattaca gtagatacta aatcatgcgg tcccctcact 60

gcatacctac acggaggtcg tgtaggaaaa gatgttgctg ctctcacagt tcatgatctc 120

ggatacaatg aattttttga atttgtaaat aacgagcaca tgagccagct cactcaacgc 180

gtattttgga ttcatgttga agtacctggg caaggggaca acatgcctga tctcccgtca 240

gactggaaat ttcctacaat gcaaaaaatc tcggagggta tctcagaact ttgtgatagc 300

cttgaattga aacatgtcgt tgttattggt gatggtgctg gcgcaaacat tgttgctcgg 360

cttgctatgg ctcgagaaga tatttgtctt ggagctattc ttattcactg cactggcaca 420

actgctggat tcatggagtc ccttcgggac cgtgtgaact catggaaact gaatacaatt 480

ggtatgcacc cgagtgtaga gaactatctg gtacttcatc gttttggtgt gtttataaaa 540

gctacaacag aagccgaact tcggggggct atcaagaatt tcctccaatc gctccgtgag 600

aacatcaatc ccaaaaatct caataagttt atccaagctt tcatggtgcg aacaaacatc 660

actgattcaa ttggaaactt gaaatgccca gtcctcttta tcacgggctc agttgcctcc 720

ttcaaccaca ccgtctacac gctctacaac gcccttatga atgctctgaa ggaccagccg 780

gcgcgtaagg ccaatgtgga gattcttgag attgacggag tcgccaatgt catgcgggaa 840

aggccggaga aagttgctga gtcggtgcag aacttcatgc agggattggg tgtagctagc 900

ggtgcggtca acagacgcct aagcgcaact ggaaacgttc caaagatccg caaccgctcg 960

gcatccatgg acgaatacga ccagccggtg ggagtaaaga atctcattta cgacaatacc 1020

cggcgctatt ccaaggccac tgacatacca gaaatctcgg aggtgggcga tcactaa 1077

Claims (10)

1.一种多肽，其特征在于，所述多肽包含如SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列的一种或多种。

2.一种分离的核酸，其特征在于，所述分离的核酸编码如权利要求1所述的多肽。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包含如权利要求2所述的分离的核酸。

4.一种转化体，其特征在于，其包含如权利要求2所述的分离的核酸或如权利要求3所述的重组表达载体，其中，所述转化体为细菌或真核细胞。

5.如权利要求4所述的转化体，其特征在于，所述细菌为E.coliBL21。

6.一种用于检测包虫病的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括如权利要求1所述的多肽；

优选地，所述试剂盒为间接ELISA检测试剂盒；

更优选地，所述间接ELISA检测试剂盒还包括第二抗体、包被液、洗液、显色液、终止液和稀释液。

7.一种标志物组合，其特征在于，所述标志物组合包括如权利要求1所述的多肽；优选地，所述标志物组合还包括Egr、抗原B和抗原5中的一种或多种。

8.一种抗包虫病的siRNA或mRNA疫苗，其特征在于，所述siRNA或mRNA疫苗包含与编码如权利要求1所述的多肽的核苷酸序列互补的RNA序列。

9.一种生产如权利要求1所述的多肽的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将如权利要求4所述的转化体培养于适合其发酵的条件下，使其表达所述多肽。

10.一种如权利要求1所述的多肽或权利要求7所述的标志物组合在制备抗包虫病抗体或在诊断细粒棘球蚴所致疾病的诊断剂中的应用。

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