CN115845137A - 一种用于组织修复的改性sis膜、其制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及一种用于组织修复的改性SIS膜、其制备方法及应用。具体来说，本公开涉及一种组合物，所述组合物含有融合多肽修饰的SIS膜和细胞外囊泡，以及所述组合物的制备方法和应用。本公开证实了融合多肽介导的SIS膜以及含有前述SIS膜和细胞外囊泡的组合物具有优异的生物功能，为治疗骨缺损或促进组织愈合或骨再生提供了广阔的前景。

Description

一种用于组织修复的改性SIS膜、其制备方法及应用
技术领域
本公开属于生物医用材料领域，具体涉及一种用于组织修复的改性SIS膜、其制备方法及应用。
背景技术
疾病或外伤引起的组织损伤会导致患者疼痛、功能缺陷以及审美和心理问题。适当的治疗通过提供有利于伤口愈合的环境来促进细胞增殖和迁移，从而诱导组织再生。聚丙烯(PP)、聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)、聚偏二氟乙烯(PVDF)等传统补片材料由于不可降解且不能提供适合组织修复的微环境，容易引起慢性疼痛、严重感染等并发症。据我们所知，伤口周围的局部微环境有助于组织再生的过程，该局部微环境包括细胞间通讯、细胞与细胞外基质的相互作用、信号分子、氧气和营养。因此，迫切需要一种新型仿生补片，它不仅可以降解，而且可以为组织再生建立适当的局部微环境。
小肠粘膜下层(SIS)膜因其来源广泛和极好的可降解性，是治疗心血管疾病、疝气修复、颈椎手术、气管鼓膜修复(tracheal tympanic membrane repair)等软组织损伤中应用最广泛的细胞外基质(ECM)材料之一。胶原蛋白的天然成分和丰富的生物活性因子，包括转化生长因子-β(TGF-β)、糖蛋白和纤连蛋白，为细胞粘附和扩散提供了具有三维空间结构的SIS膜，并且具有优异的生物相容性。
事实上，膜植入主要是依靠内源性组织再生的模式来完成连续动态的重塑，这需要多种化学物质和细胞因子。因此，微环境中生物活性成分的存在对于这个复杂的过程至关重要。考虑到生物补片是外源性生物材料，SIS材料诱导的修复过程极其依赖于细胞状态(如干细胞的募集和分化)和材料本身的潜在免疫原性，所以SIS膜在微环境模拟和组织诱导方面还存在不足。因此，在SIS材料上装载更多的生物活性物质有利于伤口的再生治疗。
间充质干细胞(MSCs)作为有效应用于组织工程的种子细胞，可以通过调节细胞因子和生长因子的表达来增加细胞间通讯。然而，动脉内注射MSCs已被证明会导致狗的心肌微梗塞(myocardial microinfarction)，这表面存在免疫排斥和栓塞的风险。
源自脐带间充质干细胞(ucMSCs)的细胞外囊泡可以调节伤口愈合过程中的细胞免疫反应、血运重建和组织重建。此外，ucMSC-EVs的细胞外囊泡miR-1263直接靶向受体细胞中的Mob1以抑制细胞凋亡并实现细胞快速增殖，最终获得更好的组织诱导特性。然而，传统的细胞外囊泡加载方法，如直接吸收和化学包被，存在加载效率低、体内突然释放和细胞外囊泡结构破坏等缺点，可能会影响治疗效果，限制其广泛应用。
日常生活中经常发生的组织损伤，在临床医学中仍然具有挑战性。开发一种能够在伤口周围提供理想微环境和体内平衡的新型生物材料，对于实际的组织再生医学来说是非常理想的。
发明内容
发明要解决的问题
基于现有技术存在的缺陷，本公开提供了一种嵌合肽修饰的SIS膜、以及含有前述嵌合肽修饰的SIS膜和细胞外囊泡的组合物具有促进软组织愈合和骨再生的功能。本公开证明了嵌合肽修饰的SIS膜、以及含有前述嵌合肽修饰的SIS膜和细胞外囊泡的组合物可以用于骨缺损的临床治疗。
用于解决问题的方案
本公开涉及的技术方案如下。
(1)一种组合物，其中，所述组合物含有融合多肽修饰的SIS膜和细胞外囊泡，所述融合多肽的序列包含由如下序列所示的序列组成的组中的至少一种：
(i)如SEQ ID NO：5所示的序列、如SEQ ID NO：6所示的序列、如SEQ ID NO：7所示的序列、如SEQ ID NO：8所示的序列组成的组；
(ii)和(i)所示的序列相比，存在一个、两个、三个、四个或五个保守置换的序列。
(2)根据(1)所述的组合物，其中，所述融合多肽的序列由如下序列组成的组中的至少一种组成：
(i)如SEQ ID NO：5所示的序列、如SEQ ID NO：6所示的序列、如SEQ ID NO：7所示的序列、如SEQ ID NO：8所示的序列组成的组；
(ii)和(i)所示的序列相比，存在一个、两个、三个、四个或五个保守置换的序列；
在一个具体的实施方式中，所述融合多肽的序列为和如SEQ ID NO：5所示的序列、如SEQ ID NO：6所示的序列、如SEQ ID NO：7所示的序列、如SEQ ID NO：8所示的序列相比，存在一个或两个保守置换的序列，并且含有所述融合多肽修饰的SIS膜的组合物仍然具有如下(a)-(c)至少一种用途：
(a)作为或制备成骨的生物材料；(b)作为或制备促进组织愈合的生物材料；(c)作为或制备治疗骨缺损的生物材料。
(3)根据(1)-(2)任一项所述的组合物，其中，所述含有融合多肽修饰的SIS膜上的融合多肽的序列为SEQ ID NO：5所示的序列和如SEQ ID NO：6所示的序列。
在一个具体的实施方式中，所述融合多肽的序列为和如SEQ ID NO：5所示的序列、如SEQ ID NO：6所示的序列相比，存在一个或两个保守置换的序列，并且含有所述融合多肽修饰的SIS膜的组合物仍然具有如下(a)-(c)至少一种用途：
(a)作为或制备成骨的生物材料；(b)作为或制备促进组织愈合的生物材料；(c)作为或制备治疗骨缺损的生物材料。
(4)根据(1)-(3)任一项所述的组合物，其中，所述细胞外囊泡源自间充质干细胞；优选的，所述细胞外囊泡为源自脐带间充质干细胞的细胞外囊泡。
(5)根据(1)-(4)任一项所述的组合物，其中，所述组合物通过所述融合多肽修饰的SIS膜和所述细胞外囊泡孵育得到。
(6)一种根据(1)-(5)任一项所述的组合物的制备方法，其中，所述修饰的方法包括以下步骤(a)-(d)或者(i)-(iv)：
(a)将所述融合多肽溶解至溶剂中，得到含有融合多肽的溶解液；
(b)将步骤(a)得到的溶解液和细胞外囊泡混合孵育，得到孵育溶液；
(c)将步骤(b)得到的孵育溶液施加至所述SIS膜的表面；优选的，将所述SIS膜浸入步骤(b)得到的孵育溶液中；
(d)干燥表面带有所述孵育溶液的所述SIS膜以得到所述组合物；或者
(i)将所述融合多肽溶解至溶剂中，得到含有融合多肽的溶解液；
(ii)将步骤(i)得到的溶解液施加至所述SIS膜的表面；优选的，将所述SIS膜浸入步骤(i)得到的溶解液中；
(iii)将细胞外囊泡施加至步骤(ii)得到的所述SIS膜的表面；
(iv)干燥步骤(iii)得到的所述SIS膜，以得到所述组合物。
(7)根据(6)所述的制备方法，其中，所述细胞外囊泡为源自间充质干细胞的细胞外囊泡；优选的，所述细胞外囊泡为源自脐带间充质干细胞的细胞外囊泡。
(8)根据(1)-(5)任一项所述的组合物或根据权利要求6-7任一项所述的制备方法得到的组合物在如下(a)-(c)至少一种中的用途：
(a)作为或制备成骨的生物材料；
(b)作为或制备促进组织愈合的生物材料；
(c)作为或制备治疗骨缺损的生物材料。
(9)一种治疗骨缺损或促进组织愈合或骨再生的方法，其中，所述方法包括向受试者施用根据(1)-(5)任一项所述的组合物或根据(6)-(7)任一项所述的制备方法得到的组合物的步骤。
发明的效果
小肠粘膜下层(SIS)膜具有精确的空间结构和良好的生物相容性。细胞外囊泡以通过创造令人满意的微环境，在几乎没有免疫反应的情况下实现快速的细胞增殖和迁移。
在一个具体的实施方式中，所述细胞外囊泡为源自脐带间充质干细胞(ucMSCs)的细胞外囊泡。
在本公开中，融合多肽介导的SIS膜和细胞外囊泡(fusion peptide-mediatedEV)能够通过特定组合改性SIS膜的表面。体外研究证明，改性的SIS膜可以促进细胞迁移和扩散。通过构建大鼠腹壁缺损模型，我们进一步证明了改性的SIS膜更有利于组织再生。
在一个具体的实施方式中，本公开设计了一系列融合多肽，通过将LHERHLNNN和KELNLVY与CP05连接起来，使用或不使用柔性连接肽(GGGGS)来实现细胞外囊泡在SIS膜上的特定组合和亲和力加载。这种修饰赋予SIS膜更好的组织再生效果。
本公开证实了融合多肽介导的SIS膜以及含有前述SIS膜和细胞外囊泡的组合物具有优异的生物功能，为治疗骨缺损或促进组织愈合或骨再生提供了广阔的前景。
附图说明
图1示出了融合肽介导的细胞外囊泡修饰的SIS膜示意图。
图2示出了细胞外囊泡的表征。其中，图2中的A示出了细胞外囊泡的透射电子显微镜(TEM)图像(×20k)；图2中的B示出了Nanosight得到的细胞外囊泡的粒径分布；图2中的C示出了细胞外囊泡的强度和大小分布；图2中的D示出了蛋白质印迹分析结果，以确定细胞外囊泡中Alix、CD63、CD9和细胞色素C的表达。
图3示出了SIS、SIS-EVs、SIS-Pep1&2-EVs和SIS-Pep3&4-EVs膜的表征。其中，图3中的A示出了SEM图像以观察表面形态，箭头表示融合肽和细胞外囊泡(×500)；图3中的B示出了SIS-EVs组、SIS-Pep1&2-EVs组和SIS-Pep3&4-EVs组疏松层的CLSM图像。Pep1或Pep3用AlexaFluor405标记，Pep2或Pep4用FITC标记，细胞外囊泡用DiI标记。箭头表示与融合肽共定位的细胞外囊泡；图3中的C示出了在PBS中浸泡1、3和5天后融合肽和细胞外囊泡的释放。
图4示出了SIS、SIS-Pep1&2-EVs和SIS-Pep3&4-EVs组的细胞生物学行为和生物安全性评估结果。其中，图4中的A示出了细胞在12小时、24小时和48小时摄取细胞外囊泡的CLSM。图4中的B示出了在培养1、2、3、4、5、6和7天后每个样品上接种的NIH3T3细胞的CCK-8生长曲线。图4中的C示出了细胞迁移的定量分析。单因素方差分析用于统计分析。数据表示为平均值±SD，n＝3，*P<0.05。图4中的D示出了Transwell图像，用于评估5组培养的NIH3T3细胞的迁移。图4中的E示出了细胞培养a)6和b)24小时后的荧光染色显示细胞的形态特征。
图5示出了促进组织再生的机制研究结果。其中，图5中的A示出了通过RNAseq分析筛选出每组中差异表达的基因。图5中的B示出了相关基因聚类分析的热图。图5中的C示出了第3天每组Vgll3、TEAD1、CYR61和BIRC5表达水平的qRT-PCR分析。单因素方差分析用于统计分析。数据表示为平均值±SD，n＝3，*P<0.05。图5中的D示出了在第3天获得在不同组上生长的NIH3T3细胞中TEAD1、CYR61和BIRC5的蛋白质印迹。GAPDH用作标准化对照。图5中的E示出了蛋白质印迹分析的定量分析。单因素方差分析用于统计分析。数据表示为平均值±SD，n＝3，*P<0.05。图5中的F示出了CYR61的免疫荧光图像。
图6示出了修饰的SIS膜各组间ALT、AST、BUN和Crea的血清分析结果。
图7示出了利用修饰的SIS膜对需要修复的部位进行修复后的形态学观察结果。
图8示出了组织学分析结果。其中，图8中的A示出了SIS、SIS-EVs和SIS-Pep1&2-EVs组在7天和14天的HE染色结果。图8中的B示出了SIS、SIS-EVs和SIS-Pep1&2-EVs组在7天和14天的Masson三色染色(SIS膜用单向箭头标记)。图8中的C示出了不同组的炎症细胞和胶原沉积结果。所有数据均显示为平均值±SD，n＝6，*P<0.05。使用单因素方差分析来分析结果。
图9示出了在7天和14天时，SIS、SIS-EVs和SIS-Pep1&2-EVs组操作区中TGF-β1和CD34的代表性免疫组织化学图像。其中，图9中的A示出了7天时的结果，图9中的B示出了14天时的结果。图9中的C示出了TGF-β1阳性细胞和CD34阳性细胞的统计分析。所有数据均显示为平均值±SD，n＝6，*P<0.05。使用单因素方差分析来分析结果。
具体实施方式
定义
当在权利要求和/或说明书中与术语“包含”联用时，词语“一(a)”或“一(an)”可以指“一个”，但也可以指“一个或多个”、“至少一个”以及“一个或多于一个”。
如在权利要求和说明书中所使用的，词语“包含”、“具有”、“包括”或“含有”是指包括在内的或开放式的，并不排除额外的、未引述的元件或方法步骤。
在整个申请文件中，术语“约”表示：一个值包括测定该值所使用的装置或方法的误差的标准偏差。
虽然所公开的内容支持术语“或”的定义仅为替代物以及“和/或”，但除非明确表示仅为替代物或替代物之间相互排斥外，权利要求中的术语“或”是指“和/或”。
如本公开所使用的，术语“氨基酸突变”或“核苷酸突变”，包括“取代、重复、缺失或添加一个或多个氨基酸或核苷酸”。在本公开中，术语“突变”是指核苷酸序列或者氨基酸序列的改变。在一些实施方案中，本公开的“突变”可以选自“保守突变”、“半保守突变”、“非保守突变”。在本公开中，术语“非保守突变”或“半保守突变”可以是引起蛋白功能丧失或部分丧失的突变。术语“保守突变”是指可正常维持蛋白质的功能的突变。保守突变的代表性例子为保守置换。
如本公开所使用的，“保守置换”通常在蛋白质的一个或多个位点上交换一种氨基酸。这种取代可以是保守的。作为被视作保守置换的置换，具体而言，可以举出Ala向Ser或Thr的置换、Arg向Gln、His或Lys的置换、Asn向Glu、Gln、Lys、His或Asp的置换、Asp向Asn、Glu或Gln的置换、Cys向Ser或Ala的置换、Gln向Asn、Glu、Lys、His、Asp或Arg的置换、Glu向Gly、Asn、Gln、Lys或Asp的置换、Gly向Pro的置换、His向Asn、Lys、Gln、Arg或Tyr的置换、Ile向Leu、Met、Val或Phe的置换、Leu向Ile、Met、Val或Phe的置换、Lys向Asn、Glu、Gln、His或Arg的置换、Met向Ile、Leu、Val或Phe的置换、Phe向Trp、Tyr、Met、Ile或Leu的置换、Ser向Thr或Ala的置换、Thr向Ser或Ala的置换、Trp向Phe或Tyr的置换、Tyr向His、Phe或Trp的置换、及Val向Met、Ile或Leu的置换。此外，保守突变还包括起因于基因所来源的个体差异、株、种的差异等天然产生的突变。
本公开中的“序列同一性”和“同一性百分比”指两个或更多个多核苷酸或多肽之间相同(即同一)的核苷酸或氨基酸的百分比。两个或更多个多核苷酸或多肽之间的序列同一性可通过以下方法测定：将多核苷酸或多肽的核苷酸或氨基酸序列对准且对经对准的多核苷酸或多肽中含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行评分，且将其与经对准的多核苷酸或多肽中含有不同核苷酸或氨基酸残基的位置数目进行比较。多核苷酸可例如通过含有不同核苷酸(即取代或突变)或缺失核苷酸(即一个或两个多核苷酸中的核苷酸***或核苷酸缺失)而在一个位置处不同。多肽可例如通过含有不同氨基酸(即取代或突变)或缺失氨基酸(即一个或两个多肽中的氨基酸***或氨基酸缺失)而在一个位置处不同。序列同一性可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中氨基酸残基的总数来计算。举例而言，可通过用含有相同核苷酸或氨基酸残基的位置数目除以多核苷酸或多肽中核苷酸或氨基酸残基的总数且乘以100来计算同一性百分比。
示例性的，在本公开中，当使用序列比较算法或通过目视检查测量以最大的对应性进行比较和比对时，两个或多个序列或子序列具有至少40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％核苷酸或氨基酸残基的“序列同一性”或“同一性百分比”。“序列同一性”或“同一性百分比”的判断/计算可以基于序列任何合适的区域上。例如，长度至少约50个残基的区域、至少约100个残基的区域，至少约200个残基的区域，至少约400个残基的区域，或至少约500个残基的区域。在某些实施方案中，所述序列在任一或两个相比较的生物聚合物(就是核酸或多肽)的整个长度上基本相同。
如本公开所使用的，术语“反向互补序列”(Reverse Complementary Sequence)的含义为：和原始多核苷酸的序列的方向相反，并且与原始多核苷酸的序列也互补的序列。示例性的，如果原始多核苷酸序列为ACTGAAC，则其反向互补序列为GTTCAGT。
如本公开所使用的，术语“多核苷酸”指由核苷酸组成的聚合物。多核苷酸可以是单独片段的形式，也可以是更大的核苷酸序列结构的一个组成部分，其是从至少在数量或浓度上分离一次的核苷酸序列衍生而来的，能够通过标准分子生物学方法(例如，使用克隆载体)识别、操纵以及恢复序列及其组分核苷酸序列。当一个核苷酸序列通过一个DNA序列(即A、T、G、C)表示时，这也包括一个RNA序列(即A、U、G、C)，其中“U”取代“T”。换句话说，“多核苷酸”指从其他核苷酸(单独的片段或整个片段)中去除的核苷酸聚合物，或者可以是一个较大核苷酸结构的组成部分或成分，如表达载体或多顺反子序列。多核苷酸包括DNA、RNA和cDNA序列。“重组多核苷酸”、“重组核酸分子”属于“多核苷酸”中的一种。
如本公开所使用的，术语“重组核酸分子”指具有在自然界中不连接在一起的序列的多核苷酸。重组多核苷酸可包括在合适的载体中，且该载体可用于转化至合适的宿主细胞。然后多核苷酸在重组宿主细胞中表达以产生例如“重组多肽”“重组蛋白”“融合蛋白”等。
如本公开所使用的，术语“连接肽”和“linker”可以替换使用，其能够将相同或者不同的多肽或者氨基酸进行连接。
连接肽包括柔性连接肽和刚性连接肽。在本公开的实施例中，连接肽选用柔性连接肽。其中，优选地，柔性连接肽选择：(Gly Gly Gly Gly Ser)n，n＝1～6之间的整数；或者(Gly Gly Gly Gly Thr)n，n＝1～6之间的整数。更优选的，本公开中的柔性连接肽选自GlyGly Gly Gly Ser。
如本公开所使用的，“细胞外囊泡(Extracellular Vesicles，EVs)”是指细胞通过旁分泌途径产生的双层膜结构的囊泡状小体，直径从40nm到1000nm不等。细胞外囊泡广泛存在于细胞培养上清以及各种体液(血液、淋巴液、唾液、尿液、***、乳汁)中，携带有细胞来源相关的多种蛋白质、脂类等物质，参与细胞间通讯、细胞迁移、血管新生和免疫调节等过程。
如本公开所使用的，术语“高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE(saline sodium phosphate EDTA)、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在65℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
如本公开所使用的，术语“非常高严格条件”是指，对于长度为至少100个核苷酸的探针而言，遵循标准DNA印迹程序，在42℃处在5X SSPE(saline sodium phosphate EDTA)、0.3％SDS、200微克/ml剪切并变性的鲑精DNA和50％甲酰胺中预杂交和杂交12至24小时。最后在70℃处使用2X SSC、0.2％SDS将载体材料洗涤三次，每次15分钟。
在本公开中，除非特别强调，否则术语“融合多肽修饰的SIS膜”和“融合多肽介导的SIS膜”的含义相同，可以替换使用。
除非另外定义或由背景清楚指示，否则在本公开中的全部技术与科学术语具有如本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
技术方案
在本公开的技术方案中，说明书核苷酸和氨基酸序列表的编号所代表的含义如下所示：
SEQ ID NO：1示出了I型胶原结合肽(CBP1)(LHERHLNNN)的氨基酸序列；
SEQ ID NO：2示出了III型胶原结合肽(CBP2)(KELNLVY)的氨基酸序列；
SEQ ID NO：3示出了连接肽(Linker)(GGGGS)的氨基酸序列；
SEQ ID NO：4示出了CP05多肽(CRHSQMTVTSRL)的氨基酸序列；
SEQ ID NO：5示出了Pep1多肽(LHERHLNNNGGGGSCRHSQMTVTSRL)的氨基酸序列；
SEQ ID NO：6示出了Pep2多肽(KELNLVYGGGGSCRHSQMTVTSRL)的氨基酸序列；
SEQ ID NO：7示出了Pep3多肽(LHERHLNNNCRHSQMTVTSRL)的氨基酸序列；
SEQ ID NO：8示出了Pep4多肽(KELNLVYCRHSQMTVTSRL)的氨基酸序列。
SEQ ID NO：9示出了扩增Vgll3基因的正向引物序列；
SEQ ID NO：10示出了扩增Vgll3基因的反向引物序列；
SEQ ID NO：11示出了扩增TEAD1基因的正向引物序列；
SEQ ID NO：12示出了扩增TEAD1基因的反向引物序列；
SEQ ID NO：13示出了扩增CYR61基因的正向引物序列；
SEQ ID NO：14示出了扩增CYR61基因的反向引物序列；
SEQ ID NO：15示出了扩增BIRC5基因的正向引物序列；
SEQ ID NO：16示出了扩增BIRC5基因的反向引物序列；
SEQ ID NO：17示出了扩增GAPDH基因的正向引物序列；
SEQ ID NO：18示出了扩增GAPDH基因的反向引物序列。
表1 本公开中示出的融合多肽的序列
SEQ ID NO. 融合多肽组成 融合多肽序列
5 CBP1+Linker+CP05 LHERHLNNNGGGGSCRHSQMTVTSRL
6 CBP2+Linker+CP05 KELNLVYGGGGSCRHSQMTVTSRL
7 CBP1+CP05 LHERHLNNNCRHSQMTVTSRL
8 CBP2+CP05 KELNLVYCRHSQMTVTSRL
表2 本公开中采用的引物序列
Figure BDA0003277052760000061
除非另有强调，否则本公开的实施例中采用的以下通用实验方法(A)-(T)的步骤如下：
(A)融合多肽的设计和合成
本公开中的多肽是使用Fmoc(9-芴基甲氧羰基)方法商业合成的(吉尔生物化学有限公司，上海，中国)。本公开中的多肽的序列如本公开SEQ ID NO：1-8所示。每个肽的纯度至少为95％。本公开使用的融合多肽的分子结构由蛋白质分析网站Robetta预测和分析。结果由VMD软件显示。亲水性的预测是用DNAStar软件进行的。
(B)细胞培养
细胞培养：通过以10,000g离心8小时获得无细胞外囊泡的胎牛血清(FBS；Gibco，美国)。购自秦城生物科技有限公司(中国上海)的大鼠脐带间充质干细胞(rucMSCs)用Dulbecco's修饰Eagle's培养基(DMEM)(美国Gibco)培养，添加10％无细胞外囊泡FBS和1％青霉素和链霉素(Gibco，美国)。细胞在37℃、5％CO2条件下培养。当细胞达到80-85％的融合后，更换并收集培养基，然后在-80℃保存。
(C)细胞外囊泡的分离和表征
保存的细胞培养基以500g离心20分钟，然后在4℃下以3,000g离心20分钟和20,000g离心1小时。然后，收集上清液并通过0.22-μm过滤器(Millex，美国)过滤以去除细胞碎片和大细胞囊泡。随后，将样品以100,000g连续超速离心4小时。弃去上清液，用无菌的PBS重悬细胞外囊泡。通过在100,000g下再离心1小时获得细胞外囊泡。最后，将获得的细胞外囊泡溶解在50μl PBS中并储存在-80℃。通过Pierce BCA蛋白检测试剂盒(ThermoFisherScientific，USA)定量细胞外囊泡的总蛋白质浓度。
使用纳米粒度分析仪(Malvern，NS300，英国)测量获得的细胞外囊泡的尺寸分布。使用高分辨率透射电子显微镜(TEM，Hitachi，HT7700，日本)观察形态。最后，通过蛋白质印迹分析鉴定细胞外囊泡，使用细胞外囊泡特征标记物，包括Alix、CD63、CD9和阴性标记细胞色素C，以及相应的抗体(Abcam，英国)。
(D)与融合多肽结合后细胞外囊泡的形态和大小的测定
细胞外囊泡与Pep1&Pep2和Pep3&Pep4在4℃下孵育12～16小时。然后使用TEM和NTA来检查形态和粒径。
(E)多肽与细胞外囊泡的定量关系
FITC标记的Pep1&Pep2和Pep3&Pep4分别与1mg/mL的细胞外囊泡在4℃共孵育6小时。通过透析管去除未结合的肽。然后用分光光度计检测上清液。制作标准曲线以确定融合多肽的浓度。通过NTA获得细胞外囊泡的颗粒浓度。
(F)融合多肽介导的细胞外囊泡修饰的SIS膜的制备和表征
本公开中使用的SIS膜是通过脱细胞获得的脱细胞猪小肠粘膜下层，由北京博辉瑞进生物科技有限公司(中国北京)提供。四种融合多肽分别溶解在200μM肽溶液中。并在实验中使用相同量的肽溶液。Pep1和Pep2与细胞外囊泡进行孵育，例如在4℃下孵育6小时；然后转移到透析管，例如100kD透析管(美国密理博)中去除少量未结合的肽。Pep3和Pep4的操作同上。SIS膜被切成小块。一组SIS膜仅与细胞外囊泡一起孵育，另外两组SIS膜与Pep1&Pep2溶液和Pep3&Pep4溶液一起在旋转混合器上孵育，例如在4℃下孵育12～16小时。直接加载细胞外囊泡的SIS膜被标记为SIS-EVs。SIS膜结合Pep1和Pep2标记为SIS-Pep1&2-EVs，结合Pep3和Pep4标记为SIS-Pep3&4-EVs。通过扫描电子显微镜(SEM，ZEISS，Gemini 300，Germany)观察修饰SIS膜的微观结构。在观察之前，将不同组的SIS膜冷冻干燥并喷金。
也可以采用以下方法制备SIS-Pep1&2-EVs以及SIS-Pep3&4-EVs：四种融合多肽分别溶解在200μM肽溶液中。并在实验中使用相同量的肽溶液。Pep1和Pep2与切成的SIS膜被孵育，例如在4℃下孵育4～10小时，然后转移到透析装置中去除少量未结合的肽。Pep3和Pep4的操作同上。然后再将孵育后的SIS膜与细胞外囊泡一起孵育，得到SIS-Pep1&2-EVs以及SIS-Pep3&4-EVs。
(G)融合多肽介导的细胞外囊泡与SIS结合的测定
为了检测结合率，使用共聚焦激光扫描显微镜(Carl Zeiss，LSM900，德国)观察样品以获得图像。LHERHLNNN(I型胶原蛋白结合肽)用异硫氰酸荧光素(FITC)标记，KELNLVY(III型胶原蛋白结合肽)用Alexa Fluor 405标记。细胞外囊泡用DiI标记。
(H)修饰SIS膜的加载效率的确定
将200μL细胞外囊泡与融合多肽一起孵育以修饰各组SIS膜，并将这些样品在旋转混合器上4℃孵育12～16小时。然后用PBS冲洗两次。收集三组的上清液，通过NTA检测细胞外囊泡的含量，确定加载效率。
(I)融合多肽介导的细胞外囊泡的释放的观察
荧光标记的SIS-EVs、SIS-Pep1&2-EVs和SIS-Pep3&4-EVs浸入PBS中。1、3、5天后，除去PBS，用PBS轻轻洗涤细胞。通过CLSM观察到剩余的融合多肽和细胞外囊泡。
(J)细胞对细胞外囊泡的摄取的观察
将DiI标记的细胞外囊泡和NIH3T3细胞系共培养。将细胞接种在24孔板中(1×104个细胞/孔)，然后将细胞外囊泡加入培养基中并孵育12小时、24小时和48小时。细胞在室温下用4％多聚甲醛(Solarbio，China)固定10分钟，然后用0.5％Triton X-100透化10分钟。细胞核用DAPI(Thermo Fisher Scientific,USA)染色。样品通过CLSM进行可视化。
(K)细胞活力测定
本公开中使用了第4-6代的NIH3T3细胞。通过CCK-8测定法测量细胞的活力。简而言之，在灭菌后，SIS、SIS-EVs、SIS-Pep1&2-EVs和SIS-Pep3&4-EVs样品被切成直径为10mm的圆圈并放入96孔板中。随后，将NIH3T3细胞接种在96孔板中(2000、100μL/孔)。每组进行三个重复。1、2、3、4、5、6、7天后，每孔加入10μL CCK-8试剂(Solarbio，China)，37℃孵育2小时。在450nm吸光度处计算OD值。
(L)迁移和细胞形态观察
为了评估NIH3T3细胞的迁移能力，将1×104个细胞/孔接种在Transwell 24孔板(康宁，纽约，美国)的上腔室中，其中含有5％无细胞外囊泡的FBS。然后，将含有10％FBS的完全培养基添加到补充有灭菌SIS、SIS-EVs、SIS-Pep1&2-EVs和SIS-Pep3&4-EVs的下室。24小时后，取出Transwell小室并用PBS洗涤两次。轻轻擦拭未迁移的细胞。然后，将细胞用4％多聚甲醛固定30分钟，并用0.1％结晶紫(Sigma-Aldrich，美国)染色30分钟。用PBS洗涤细胞3次。用光学显微镜(Olympus，IX71，日本)观察细胞迁移图像。
为了观察不同组细胞的细胞骨架，用NIH3T3(1×104个细胞/孔)接种细胞膜。共同培养6小时和24小时后，细胞在4％多聚甲醛中固定30分钟，然后在0.5％Triton X-100中渗透10分钟。通过罗丹明B鬼笔环肽(Cytoskeleton,Inc.,USA)染色获得细胞骨架观察结果。细胞核用DAPI染色。CLSM***观察细胞形态。使用ImageJ软件量化平均细胞面积和周长。
(M)RNA-seq分析
进行高通量测序以检测不同样本中miRNAs的表达改变和组织再生中的富集途径。将NIH3T3细胞接种到带有SIS、SIS-EVs、SIS-Pep1&2-EVs和SIS-Pep3&4-EVs的6孔板中。没有膜的空白板用作对照。3天后，刮取并收集细胞，然后送到公司(Novogene Co.,Ltd.,Beijing,China)进行RNA-seq分析。
(N)定量实时PCR
收集的细胞在不同的组中培养。总RNA用TRIzol Reagent(Invitrogen,USA)提取。使用GoScript Reverse Transcription Mix(Promega，美国)完成cDNA的合成。然后，用LightCycler 480II***(Roche，LC480Ⅱ，瑞士)进行qRT-PCR分析。采用相对标准曲线法(2-△△CT)定量检测Vgll3、TEAD1、CYR61和BIRC5的mRNA表达变化。GAPDH用作对照。本公开中使用的PCR引物序列列于表2中。
(O)Western Blot
收集各组细胞，用RIPA(Solarbio，China)裂解提取蛋白质。通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)从培养的细胞中分离蛋白质并转移到聚偏二氟乙烯膜(Immobilon P，Millipore，Billerica，USA)。在室温下用5％牛血清白蛋白(BSA，Sigma-Aldrich，美国)封闭1小时后，将膜与一抗在4℃下孵育过夜，然后与辣根过氧化物酶偶联的二抗(Abcam，美国)在37℃下保持1小时。一抗包括抗YAP1、抗TEAD1、抗CYR61和抗GAPDH抗体(Abcam，美国)。添加ECL底物(Thermo Fisher Scientific，美国)后，使用ChemiDoc XRSPlus发光图像分析仪(Bio-Rad，美国)对最终条带进行可视化。用ImageJ软件对条带强度进行光密度定量，将目标蛋白的相对表达水平归一化为GAPDH的条带强度。
(P)免疫荧光染色
培养3天后，不同组培养的细胞用4％多聚甲醛固定，0.5％Triton X-100透化，室温密封。将细胞与CYR61一抗以1:200稀释度在4℃下孵育过夜。然后，将Alexa Fluor 488偶联的抗兔二抗(Abcam，美国)加入样品中，并在室温下孵育1小时。细胞核用DAPI染色。CLSM用于获取图像。
(Q)大鼠腹壁缺损模型的建立和修复
本公开使用6-8周龄(200-2250g)雄性斯普拉格-杜勒鼠(SD)。动物实验经天津医科大学动物民族委员会批准。将大鼠分为三组：SIS、SIS-EVs和SIS-Pep1&2-EVs组。每组使用六个重复。通过吸入异氟醚麻醉大鼠。绝育后，在腹部侧壁做直径1cm的圆形全层缺损。然后通过修补固定SIS、SIS-EVs或SIS-Pep1&2-EVs来修复缺陷。然后将手术区逐层缝合。
(R)体内毒性研究
为了确定修饰SIS膜的体内毒性，从大鼠的角静脉收集血液并将样品置于EP管中。通过以3000rpm离心15分钟收集血清。在临床实验室(天津医科大学朱宪彝纪念医院，天津，中国)中分析了ALT、AST、BUN和Crea的水平。
(S)形态学观察及病理分析
各组于术后7、14、30天处死，收集种植体及周围组织。记录手术区周围组织的形态。样品经石蜡包埋，乙醇脱水，制成5μm厚切片。进行苏木精和伊红染色(HE)和马森三色染色(Solarbio，China)以评估组织再生。炎症细胞数量和胶原沉积百分比由ImageJ计算。
对于免疫组织化学分析，切片在4℃下与抗TGF-β1和CD34的一抗(Abcam，美国)以1:200稀释度孵育过夜。然后，将切片与二抗在室温下孵育1小时。随后，将切片与DAB底物一起温育以观察抗体结合。苏木精复染后，用全景观成像定量分析***(PerkinElmer，VectraPolaris，USA)观察图像。ImageJ测量TGF-β1阳性细胞数和CD34阳性细胞数。
(T)统计方法
所有结果均采用SPSS v.21.0软件进行统计分析。单因素方差分析用于比较数据的平均值。所有数据均表示为至少三个重复实验的平均值±标准偏差(SD)。P<0.05的值被认为具有统计学意义。
(*p<0.05)
实施例
本公开的其他目的、特征和优点将从以下详细描述中变得明显。但是，应当理解的是，详细描述和具体实施例(虽然表示本公开的具体实施方式)仅为解释性目的而给出，因为在阅读该详细说明后，在本公开的精神和范围内所作出的各种改变和修饰，对于本领域技术人员来说将变得显而易见。
本实施例中所用到的实验技术与实验方法，如无特殊说明均为常规技术方法，例如下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过正规商业渠道获得。
实施例1：多肽的结构和亲水性预测
本公开研究了由不同组分CP05(CRHSQMTVTSRL)和CBP(LHERHLNNN或KELNLVY)组成的四种肽，带有连接肽(GGGGS)的两种多肽，命名为Pep1和Pep2，以及不带有连接肽(GGGGS)的两种多肽，命名为Pep3和Pep4。
本公开中使用了胶原蛋白结合肽LHERHLNNN和KELNLVY，因为它们依赖于非特异性静电相互作用或特异性相互作用来结合胶原蛋白。另一种功能肽CP05负责锚定细胞外囊泡。同时，最初选择柔性连接肽GGGGS来提供结构灵活性并保持两个功能域之间的距离，从而增强CP05捕获细胞外囊泡的能力。
图1为本公开中融合肽介导的细胞外囊泡修饰的SIS膜示意图。
实施例2：细胞外囊泡表征
通过超速离心从脐带间充质干细胞(ucMSCs)的培养基中纯化细胞外囊泡。
实验结果如图2中的A所示，TEM观察到的形态显示出典型的圆形或杯形。如图2中的B和图2中的C所示，粒径分析表明，提取的载体的直径范围约为50至200nm，细胞外囊泡的平均粒径约为141.9±1.2nm，与TEM结果一致。一些出现在200nm以上的峰可能是由细胞外囊泡或杂质聚集引起的。
此外，作为细胞外囊泡鉴定的主要依据，蛋白质印迹分析表明特征表面标记CD63、CD9和Alix为阳性，而细胞色素C(Cytochrome)为阴性(如图2中的D所示)。这些结果表明细胞外囊泡被成功分离。
为了鉴定与融合肽结合后细胞外囊泡的大小和形态，进行了TEM和NTA(Nanoparticle Tracking Analysis)。结果表明细胞外囊泡的形态和粒径没有显着变化。融合肽与细胞外囊泡之间的定量关系通过标准曲线计算，计算结果表明与Pep1&Pep2共孵育时，一个细胞外囊泡上大约有1.26×10-14M融合肽，当与Pep3&Pep4共孵育时，大约有1.13×10-14M融合肽。
实施例3：修饰SIS膜的表征
我们进行了浓度筛选预实验。CLSM图像显示：在200μM下，Pep1-Pep4与SIS膜可以获得良好的结合效果。
每组的表面形貌通过SEM图像进行表征。如图3中的A所示，未修饰的SIS膜具有不对称结构，包括致密层和疏松层。与SIS组相比，SIS-EVs、SIS-Pep1&2-EVs和SIS-Pep3&4-EVs组的表面可见细颗粒，SIS-Pep1&2-EVs组的颗粒数量最多。同时，SIS膜的修饰并没有改变其固有结构。
如图3中的B所示，一组典型的CLSM图像揭示了肽介导的细胞外囊泡与SIS膜疏松层的结合。具体而言，SIS-Pep1&2-EVs组上的颗粒更细、分布更均匀，表明SIS-Pep1&2-EVs组的靶向效率更高。而且，与SIS-Pep3&4-EVs相比，SIS-Pep1&2-EVs上有更多DiI染色的细胞外囊泡，而且SIS-EVs组显示出最少的荧光细胞外囊泡颗粒，表明Pep1&Pep2存在有效的锚定现象。同时，加载效率按SIS-EVs、SIS-Pep3&4-EVs和SIS-Pep1&2-EVs的顺序增加，显示出与CLSM相似的趋势。
与此同时，CLSM还观察到融合肽和细胞外囊泡的释放(如图3中的C所示)。氨基酸Cys和Met易发生氧化反应，可被空气中的氧气氧化，从而影响肽的稳定性。各组SIS膜上的融合肽和细胞外囊泡随着时间的推移逐渐减少，可能与这些活性物质的降解和释放以及胶原纤维的断裂有关。在整个过程中，SIS-Pep1&2-EVs显示出最多的融合肽和细胞外囊泡，表明Pep1&Pep 2的功能更强。这些图像表明GGGGS结构域可能会提高胶原蛋白结合肽的表达效率并提高生物活性。
综上所述，这些结果意味着成功获得了修饰的SIS膜。研究人员已报道，连接肽的柔韧性与蛋白质部分的协同功能有关，表明连接肽柔韧性在融合肽构建中的重要性。Pep1和Pep2对SIS膜更理想的修饰作用可能归因于GGGGS的存在，它作为被动连接肽实现胶原结合肽和CP05的适当的间隔，使融合肽产生令人满意的生物活性。因此，我们可以认为本研究中使用的GGGGS足以保持稳定性，并提供了合适的融合肽结构。我们将在体外实验中进一步讨论带有GGGGS的胶原结合肽和CP05构建的融合肽是否比没有连接肽的胶原结合肽和CP05构建的融合肽对细胞行为有更积极的影响。
实施例4：生物相容性测定和细胞行为
成纤维细胞的增殖和迁移是组织再生的重要步骤。越来越多的证据表明，uMSC-EVs可以通过刺激细胞增殖和迁移来调节组织修复过程。因此，CCK-8、Transwell和荧光检测被用于探索一系列体外细胞活性。
为了维持内环境稳态，细胞外囊泡需要被周围的细胞吸收。图4中的A示出了在培养12、24和48小时后细胞对外来体的摄取结果。结果表明，荧光强度随时间增加并在24小时达到峰值，表明细胞外囊泡可以转运至受体细胞以调节组织再生前期的细胞行为。在48h时，荧光强度略有下降，表明细胞外囊泡在细胞中被代谢。
与此同时，如图4中的B所示，本公开通过CCK-8细胞计数分析评估了修饰SIS膜的生物相容性。在SIS-Pep1&2-EVs样品的情况下，细胞在24小时后表现出最高的增殖活性。同时，各组细胞随时间增殖，6d达到平台期。SIS-EVs、SIS-Pep1&2-EVs和SIS-Pep3&4-EVs组细胞增殖能力高于空白组，表明经过修饰的SIS膜无细胞毒性。
进一步的，本公开进行了Transwell试验以确定与不同样品孵育的NIH3T3细胞的迁移能力。实验结果如本公开中图4中的C和图4中的D所示，对于SIS-Pep1&2-EVs和SIS-Pep3&4-EVs，通过膜的细胞数显着高于空白组、SIS和SIS-EVs组中通过膜的细胞数。这一发现表明，修饰的SIS膜可以引起细胞快速迁移到软组织缺损处，并可能以这种方式促进组织再生。SIS-Pep1&2-EVs组对细胞运动更有利，因为与SIS-Pep3&4-EVs组相比，SIS-Pep1&2-EVs组中有更多的细胞迁移通过膜。
更进一步的，本公开通过CLSM观察了接种在SIS、SIS-EVs、SIS-Pep1&2-EVs和SIS-Pep3&4-EVs上的成纤维细胞的形态。实验结果如本公开中图4中的E所示，共聚焦图像显示成纤维细胞粘附在SIS-Pep1&2-EVs和SIS-Pep3&4-EVs6小时后表现出更明显的星形表型，而粘附在SIS和SIS-EVs膜上的成纤维细胞呈球形或窄条形。培养24小时后，SIS-Pep1&2-EVs和SIS-Pep3&4-EVs组中的细胞具有伸展良好的肌动蛋白束。特别是在SIS-Pep1&2-EVs上，细胞表现出更好的伸展形态，平均细胞面积和周长最大，证实了细胞附着和细胞骨架发育的增强。
基于这些结果，修饰SIS膜对成纤维细胞具有理想的生物相容性和非细胞毒性，表明由于ECM模拟纳米纤维结构和细胞外囊泡的引入，它在细胞增殖、迁移和粘附中具有重要作用。此外，肽介导的细胞外囊泡修饰的SIS膜表现出更强的促进细胞活性的能力，这意味着肽特异性捕获的细胞外囊泡在材料修饰方面具有潜在应用。显然，在这项研究中，早期从修饰SIS膜释放的细胞外囊泡有助于调节细胞间通讯，改善微环境，最终激活细胞反应的级联反应。细胞外囊泡通过转导蛋白质、脂质、核酸和其他代谢物的机制影响多细胞生物的细胞和组织稳态。
因此，在这项研究中，细胞外囊泡可能控制影响信号分子转移的材料与细胞之间的交流，并最终影响微环境，从而调节受体细胞的命运。这些数据还确定了有连接肽GGGGS的融合肽具有更好的生物功能，这可以证明胶原结合肽和CP05之间的直接融合可能会导致错误折叠并对其功能产生很小的影响。
实施例5：细胞行为机制研究
为了研究SIS-Pep-EVs的再生机制，进行了RNA-seq和聚类分析来筛选差异基因表达。实验结果如图5中的A和图5中的B所示，与其他组相比，SIS-Pep1&2-EVs组显示出TEAD转录因子(TEAD1-4)的富集，这对发育、增殖、组织稳态和再生至关重要。在这些因素中，据报道TEAD1与细胞增殖、迁移和存活有关。通过进一步探索，还发现SIS-Pep1&2-EVs组中已知的TEAD转录共激活因子Vgll3增加。其他成分作为TEAD的靶基因，如CYR61和BIRC5，它们在SIS-Pep1&2-EVs组的细胞中上调。因此，我们使用qRT-PCR和蛋白质印迹来检测这些因子的表达。
CYR61是TEAD的下游基因，对细胞增殖和迁移至关重要。BIRC5，也称为生存素，可以抑制细胞凋亡。qRT-PCR分析结果如图5中的C所示，3天后，SIS-Pep1&2-EVs组的Vgll3、TEAD1、CYR61和BIRC5的mRNA水平最高。一致地，如图5中的D和图5中的E所示，蛋白质印迹分析显示，在孵育3天后，与其他组相比，SIS-Pep1&2-EVs组中TEAD1、BIRC5和CYR61的表达最高。如图5中的F所示，CYR61的免疫荧光还显示SIS-Pep1&2-EVs组的荧光强度强于其他组，表明表达水平增加。
Hippo通路在器官大小调节、组织再生和致癌作用中发挥重要作用，近年来受到广泛关注。TEAD转录因子家族是Hippo通路的重要组成部分。综上所述，SIS-Pep1&2-EVs组中Vgll3和TEAD1上调，进而驱动下游因子转录调控细胞行为。此外，Vgll3和TEAD1之间的相互作用涉及肌肉再生。因此，我们假设再生的加速部分是由于Vgll3和TEAD1反应通过SIS-Pep1&2-EVs在Hippo途径中起作用。此外，一些研究表明，细胞外囊泡通过转移miR-21-3p加速皮肤伤口愈合，并且在内毒素损伤模型中，当外源性细胞外囊泡递送miR-146a时，炎症基因的表达降低。因此，我们认为细胞外囊泡中包含的miRNAs可能主要有助于软组织再生。
实施例6：体内伤口愈合试验
为了探索修饰SIS膜对重塑过程的愈合效果，将不同的样品应用于大鼠腹壁缺损模型。
考虑到本研究中使用的融合肽由胶原结合肽和CP05组成，因此进行了体内毒性实验以验证修饰SIS膜对身体是否有任何影响。实验结果如图6所示，结果显示，各组间ALT、AST、BUN和Crea的血清分析无显着差异，表明修饰SIS膜相对安全，无肝毒性和肾毒性。
修复部位的形态学观察结果如图7所示。结果显示，三组在术后7天均未完全愈合。SIS-Pep1&2-EVs组缺损面积最小，各组均可见轻度炎症反应。14天时观察到明显的***形成，缺损面积比例逐渐减少。30天后，修饰SIS膜几乎被再生组织替代，无明显异物反应。在SIS组中，也可以看到腹壁的修复，但重塑过程比SIS-Pep1&2-EVs组中的重塑过程长。
对手术区组织进行HE染色以观察SIS膜和植入后与身体的反应结果如图8所示。7天时各组均有炎症细胞出现。同时，SIS-Pep1&2-EVs组的炎症细胞比SIS组少，炎症细胞逐渐消退。在第7天，所有SIS膜开始生物降解，并且在第14天时被更多的纤维组织覆盖。在第30天，所有组中仅保留一小部分SIS膜。降解的膜被再生组织取代。此后，SIS-Pep1&2-EVs表现出更好的生物相容性，因为该组在新形成的组织中呈现较少的炎症细胞，这也表明SIS-Pep1&2-EVs可能具有更强的抗炎能力，提供有利于组织再生的微环境。
与此同时，如图8所示，通过马松三色染色观察胶原蛋白的形成。三组中的胶原含量随时间增加，而在SIS-Pep1&2-EVs组中观察到更早的新生血管形成和更多的胶原沉积。在第30天没有组织纤维化的SIS-Pep1&2-EVs组中可以看到更多排列类似于正常组织的胶原蛋白。这一现象表明SIS-Pep1&2-EVs可以减少并发症的发生，主要是腹壁顺应性降低。
免疫组化分析用于评估组织修复中相关调控因子的表达。CD34用于检测新生血管的密度。如图9所示，三组中CD34表达水平在SIS-Pep1&2-EVs组中最高，SIS组在7天和14天时最低，提示SIS-Pep1&2-EVs有利于血管的形成。此外，SIS-Pep1&2-EVs组在第7天和第14天有更多的TGF-β1阳性细胞，但在第28天缺陷区域周围的TGF-β1阳性细胞较少。同时，在SIS组中观察到相对较弱的TGF-β1阳性表达。SIS-EVs组TGF-β1和CD34的表达水平介于SIS和SIS-Pep1&2-EVs组TGF-β1和CD34的表达水平之间。TGF-β1可以调节炎症反应、血管生成以及胶原蛋白和***的合成。然而，长时间活跃会导致组织纤维化和疤痕。这些结果表明SIS-Pep1&2-EVs可能在组织再生的初始阶段促进TGF-β1的表达，并在最后阶段降低表达以防止纤维化形成。
体内实验表明SIS膜降解速度很快。因此，需要引入更多的活性物质，为组织再生提供更好的微环境。这些数据表明修饰SIS膜的有效性，并且SIS-Pep1&2-EVs有助于重塑的早期阶段，这与体外实验一致。SIS-Pep1&2-EVs释放的细胞外囊泡不断产生用于组织再生和愈合过程的改进的微环境。此外，细胞外囊泡的治疗特性归因于它们的免疫调节和免疫抑制活性。据报道，细胞外囊泡可抑制细胞因子的浓度，包括白细胞介素1β(IL-1β)和肿瘤坏死因子α(TNF-α)，同时增加转化生长因子β(TGF-β)的分泌，从而调节创口周围的免疫微环境。因此，微环境和细胞之间由肽介导的细胞外囊泡调节的相互影响有利于增强SIS膜的功能特性。修饰的SIS膜和细胞外囊泡的持续释放加速了初始愈合，有望促进组织重建并尽早恢复身体功能。
综上所述，在本公开中，SIS膜用由胶原结合肽和CP05组成的融合肽介导的细胞外囊泡处理。SIS-Pep1&2-EVs对细胞增殖和迁移的影响增强，因为细胞外囊泡从修饰的SIS膜释放，导致腹壁快速组织重建，因此，本公开中的SIS膜是一种很有前途的组织再生材料。
本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110> 北京博辉瑞进生物科技有限公司
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<210> 1
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<400> 1
Leu His Glu Arg His Leu Asn Asn Asn
1 5
<210> 2
<211> 7
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> III型胶原结合肽
<400> 2
Lys Glu Leu Asn Leu Val Tyr
1 5
<210> 3
<211> 5
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 连接肽
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser
1 5
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> CP05多肽
<400> 4
Cys Arg His Ser Gln Met Thr Val Thr Ser Arg Leu
1 5 10
<210> 5
<211> 26
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pep1多肽
<400> 5
Leu His Glu Arg His Leu Asn Asn Asn Gly Gly Gly Gly Ser Cys Arg
1 5 10 15
His Ser Gln Met Thr Val Thr Ser Arg Leu
20 25
<210> 6
<211> 24
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pep2多肽
<400> 6
Lys Glu Leu Asn Leu Val Tyr Gly Gly Gly Gly Ser Cys Arg His Ser
1 5 10 15
Gln Met Thr Val Thr Ser Arg Leu
20
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pep3多肽
<400> 7
Leu His Glu Arg His Leu Asn Asn Asn Cys Arg His Ser Gln Met Thr
1 5 10 15
Val Thr Ser Arg Leu
20
<210> 8
<211> 19
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Pep4多肽
<400> 8
Lys Glu Leu Asn Leu Val Tyr Cys Arg His Ser Gln Met Thr Val Thr
1 5 10 15
Ser Arg Leu
<210> 9
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 9
agttgtgcgg aggtgatgta t 21
<210> 10
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 10
ccggatgata gcaggctgta g 21
<210> 11
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 11
gagcgactcg gcagataagc 20
<210> 12
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 12
ccacacggcg gatagatagc 20
<210> 13
<211> 22
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 13
taaggtctgc gctaaacaac tc 22
<210> 14
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 14
cagatccctt tcagagcggt 20
<210> 15
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 15
gaggctggct tcatccactg 20
<210> 16
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 16
atgctcctct atcgggttgt c 21
<210> 17
<211> 21
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 17
aggtcggtgt gaacggattt g 21
<210> 18
<211> 19
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> 引物序列
<400> 18
ggggtcgttg atggcaaca 19

Claims (9)

1.一种组合物，其中，所述组合物含有融合多肽修饰的SIS膜和细胞外囊泡，所述融合多肽的序列包含由如下序列所示的序列组成的组中的至少一种：
(i)如SEQ ID NO：5所示的序列、如SEQ ID NO：6所示的序列、如SEQ ID NO：7所示的序列、如SEQ ID NO：8所示的序列组成的组；
(ii)和(i)所示的序列相比，存在一个、两个、三个、四个或五个保守置换的序列。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中，所述融合多肽的序列由如下序列组成的组中的至少一种组成：
(i)如SEQ ID NO：5所示的序列、如SEQ ID NO：6所示的序列、如SEQ ID NO：7所示的序列、如SEQ ID NO：8所示的序列组成的组；
(ii)和(i)所示的序列相比，存在一个、两个、三个、四个或五个保守置换的序列。
3.根据权利要求1-2任一项所述的组合物，其中，所述含有融合多肽修饰的SIS膜上的融合多肽的序列为SEQ ID NO：5所示的序列和如SEQ ID NO：6所示的序列。
4.根据权利要求1-3任一项所述的组合物，其中，所述细胞外囊泡源自间充质干细胞；优选的，所述细胞外囊泡为源自脐带间充质干细胞的细胞外囊泡。
5.根据权利要求1-4任一项所述的组合物，其中，所述组合物通过所述融合多肽修饰的SIS膜和所述细胞外囊泡孵育得到。
6.一种根据权利要求1-5任一项所述的组合物的制备方法，其中，所述修饰的方法包括以下步骤(a)-(d)或者(i)-(iv)：
(a)将所述融合多肽溶解至溶剂中，得到含有融合多肽的溶解液；
(b)将步骤(a)得到的溶解液和细胞外囊泡混合孵育，得到孵育溶液；
(c)将步骤(b)得到的孵育溶液施加至所述SIS膜的表面；优选的，将所述SIS膜浸入步骤(b)得到的孵育溶液中；
(d)干燥表面带有所述孵育溶液的所述SIS膜以得到所述组合物；或者
(i)将所述融合多肽溶解至溶剂中，得到含有融合多肽的溶解液；
(ii)将步骤(i)得到的溶解液施加至所述SIS膜的表面；优选的，将所述SIS膜浸入步骤(i)得到的溶解液中；
(iii)将细胞外囊泡施加至步骤(ii)得到的所述SIS膜的表面；
(iv)干燥步骤(iii)得到的所述SIS膜，以得到所述组合物。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其中，所述细胞外囊泡为源自间充质干细胞的细胞外囊泡；优选的，所述细胞外囊泡为源自脐带间充质干细胞的细胞外囊泡。
8.根据权利要求1-5任一项所述的组合物或根据权利要求6-7任一项所述的制备方法得到的组合物在如下(a)-(c)至少一种中的用途：
(a)作为或制备成骨的生物材料；
(b)作为或制备促进组织愈合的生物材料；
(c)作为或制备治疗骨缺损的生物材料。
9.一种治疗骨缺损或促进组织愈合或骨再生的方法，其中，所述方法包括向受试者施用根据权利要求1-5任一项所述的组合物或根据权利要求6-7任一项所述的制备方法得到的组合物的步骤。
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