CN115838742B - 南方根结线虫去甲基化酶Mi-NMAD-1/2基因及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明属于植物基因工程领域，提供了一种南方根结线虫去甲基化酶基因，其为Mi‑NMAD‑1或Mi‑NMAD‑2，所述Mi‑NMAD‑1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述Mi‑NMAD‑2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明获得的基因是首次在根结线虫中发现的编码去甲基化酶的基因，利用该基因可以进行转基因育种防治植物寄生线虫。另外，本发明通过构建转基因烟草提高了植物对线虫的抗性，同时阐述了转基因烟草的抗性机制。

Description

南方根结线虫去甲基化酶Mi-NMAD-1/2基因及其应用

技术领域

本发明属于植物基因工程领域，具体而言，涉及两个同源的南方根结线虫去甲基化酶相关基因Mi-NMAD-1/2，尤其涉及两个可以通过植物基因工程技术来增强植物对植物寄生线虫抗性的基因的应用。

背景技术

线虫可以几乎存在于所有的生态环境中，是动物界最大的门之一。其中，植物寄生线虫是一类分布在世界各地，宿主范围广的病原体，造成农作物平均产量下降12％-23％，严重时甚至绝收，每年给全球农业造成800-1570亿美元的经济损失。

植物寄生线虫与其他自由生活线虫最显著的差异在于，为了适应寄生生活而进化出的刺吸式、中空的可伸缩矛状口器——口针，是其穿透植物外部屏障，破坏细胞壁，注射effector，取食植物细胞营养物质的重要器官。植物寄生线虫能成功的寄生植物很大一部分原因来自于其分泌的effector，多种effector可以协同发挥作用帮助线虫侵染。在进入植物体内之前，线虫会分泌大量酶类，包括纤维素酶，β-1，4-木聚糖酶，果胶裂解酶等用于降解植物细胞壁，帮助线虫进入；在进入植物体内后，线虫首先会面临植物体的免疫反应，植物寄生线虫又会分泌一系列的effector去抑制植物体的免疫反应，帮助线虫寄生。由于根结线虫广泛的分布和宿主范围，以及分泌不同的effector发挥作用，使得其防治具有困难性，因此植物的抗性育种被认为是经济的、行之有效的防治手段。然而抗性育种时间长，效果不显著，所以研究者同时将注意力转到了构建转基因植物抵御植物寄生线虫上，例如针对线虫的必需基因或者effector设计dsRNA并在植物体表达使植物最终通过RNAi的方式防治线虫，即利用植物基因工程开发抗性品种。

植物寄生线虫造成严重的经济损失，使作物产量减少，品质下降。目前植物寄生线虫的防治较困难，亟需找到一些安全有效的防治方式。通过利用线虫自身必需基因设计dsRNA，在植物体内表达从而影响线虫正常的生长发育，提高植物抗性，同时发掘克隆这些基因，不仅可以研究其在线虫中的功能，也可以为抗性转基因作物的培育提供更多的基因资源。

发明内容

本发明人通过基因发掘、克隆以及功能分析，发现了两个线虫抗性相关基因Mi-NMAD-1/2，该基因来源于南方根结线虫，通过构建表达minmad-1/2dsRNA的转基因烟草，发现植株对于根结线虫抗性明显增加。

因此，本发明的第一个目的在于提供两个同源的南方根结线虫相关基因Mi-NMAD-1/2，该基因编码去甲基化酶。

具体地，本发明的目的是按照如下技术方案实现的：一种南方根结线虫去甲基化酶基因，其为Mi-NMAD-1或Mi-NMAD-2，所述Mi-NMAD-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述Mi-NMAD-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

其次，本发明第二个目的在于提供一种重组载体，该重组载体包含上述的南方根结线虫去甲基化酶基因。同时，本发明还提供了一种工程菌，该工程菌包含上述的重组载体。

第三，通过利用本发明基因Mi-NMAD-1/2构建不同的重组表达载体，进而可制备工程菌应用于转基因育种来提高植物对根结线虫的抗性。因此，本发明的第三个目的在于提供一系列用途，包括如下几个方面：

(1)上述南方根结线虫去甲基化酶基因及其它根结线虫中的同源基因、重组载体或工程菌在抗寄生线虫或制备抗寄生线虫的产品中的应用。

(2)上述南方根结线虫去甲基化酶基因在构建抗寄生线虫转基因植物中的应用，所述的应用是在植物中过表达南方根结线虫去甲基化酶基因Mi-NMAD-1/2。

(3)上述重组载体在构建抗寄生线虫转基因植物中的应用，所述的应用是通过使用所述重组载体在植物中过表达所述南方根结线虫去甲基化酶基因Mi-NMAD-1/2。

(4)上述工程菌在构建抗寄生线虫转基因植物中的应用，所述的应用是通过使用所述工程菌在植物中过表达所述南方根结线虫去甲基化酶基因Mi-NMAD-1/2。

第四，本发明还提供了一种抗植物寄生线虫的方法，该方法包括如下几个方面：

(1)在植物中过表达上述南方根结线虫去甲基化酶基因Mi-NMAD-1/2。

(2)通过使用上述的重组载体，在植物中过表达所述南方根结线虫去甲基化酶基因Mi-NMAD-1/2。

(3)通过使用上述的工程菌，在植物中过表达所述南方根结线虫去甲基化酶基因Mi-NMAD-1/2。

与现有技术相比，本发明提供的南方根结线虫去甲基化酶相关基因Mi-NMAD-1/2具有如下有益效果：本发明获得的基因是首次在根结线虫中发现的编码去甲基化酶的基因，利用该基因可以进行转基因育种防治植物寄生线虫。另外，本发明首次鉴定了根结线虫去甲基化酶相关基因，并验证了其功能，并通过相关构建转基因烟草提高了植物对线虫的抗性，同时阐述了转基因烟草的抗性机制。最后，本发明发掘克隆的抗性基因Mi-NMAD-1/2不仅可以研究其在线虫中的功能，也可以为转基因作物的培育提供更多的基因资源。

附图说明

图1通过Pfam注释中找到同一基因三个拷贝的Mi_06562.1，Mi_43851.1，Mi_37285.1具有2OG_FeII结构域，即可能为潜在的去甲基化酶。

图2为三个同源基因与人类去甲基化酶ALKBH家族建立***发育树。

图3为通过质谱检测三个同源基因干扰后线虫体内的6mA含量的变化。

图4为构建表达minmad-1/2dsRNA的转基因烟草目的基因表达情况。

图5为与构建表达minmad-1/2dsRNA的转基因烟草线虫侵染40天后的根结情况，其中左图是minmad-1dsRNA转基因烟草根结情况，右图是minmad-2dsRNA转基因烟草根结情况)。

图6为表达minmad-1/2dsRNA的转基因烟草根结降低情况。

图7为表达minmad-1/2dsRNA转基因烟草抗线虫机制,下调effector基因的表达。

具体实施方式

下面通过具体实施方式对本发明作进一步详细说明，实施例中未注明具体技术操作步骤或条件者均为常规方法，可以按照本领域内的文献所描述的一般技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。本实验所用的烟草品种为普通烟草(Nicotiana tabacum，Nt)。

实施例1：南方根结线虫Mi-NMAD-1/2基因的鉴定

前人通过同源比对的方法找到了3个南方根结线虫的6mA甲基转移酶，但是未发现其对应的去甲基化酶。我们已知在已经报道的物种的去甲基化酶结构中均有2OG-FeII_Oxy_2结构域，该结构域属于加氧酶家族，是去甲基化过程中的关键结构。因此为了鉴定南方根结线虫中的去甲基化酶(Mi-NMAD-1)，我们通过低阈值的同源比对方式寻找与已报道的去甲基化酶同源的蛋白，同时通过pfam结构域扫描的方式全基因组范围内筛选具有2OG-FeII_Oxy_2结构域的潜在去甲基化酶基因。在blastp比对中，我们利用自己注释的Mi总蛋白构建数据库，发现在evalue设置-5时(默认值)比对结果没有同源蛋白，这也符合前人研究Mi中6mA甲基化的结论，当我们改变evalue值，使用宽松阈值，最终在设定evalue＝1时找到12个同源蛋白，但只有其中一个基因Mi_14752.1及其另外两个拷贝，具有潜在的去甲基化酶功能。另外，Pfam扫描也候选了Mi_45233.1与Mi_00010.1以及相应的分别两个同源基因具有2OG-FeII_Oxy_2结构域，如图1。为了进一步鉴定这些蛋白中是否存在潜在的DNA6mA去甲基化酶，通过与人类去甲基化酶ALKBH家族建立***发育树，发现这三个同源基因属于alkbh1、alkbh6和alkbh7家族，如图2。同时，我们还采用对靶标基因RNA干扰后检测线虫体内6mA水平的方式去验证，结果显示只有当基因Mi_14752.1和Mi_00010.1被干扰后6mA水平会显著升高，意味着这两个基因可能是潜在的6mA去甲基化酶。为了进一步确认这两个蛋白具有体外催化去甲基化功能，我们使用大肠杆菌异源表达并纯化了这两个蛋白，通过纯化的蛋白对南方根结线虫基因组DNA体外消化实验以及合成的含有6mA修饰的oliga DNA体外消化实验均证实这两个基因具有体外催化去甲基化的功能，如图3。因此，根据新发现的基因功能，我们分别将Mi_14752.1与Mi_00010.1命名为Mi-NMAD-1和Mi-NMAD-2基因，为南方根结线虫中的两个DNA 6mA去甲基化酶。

实施例2：Mi-NMAD-1/2dsRNA转基因烟草的构建

我们通过设计包含去甲基化酶结构域区域约300bp的DNA片段引物，分别正向与反向连接在pUCCRNAi载体上，在内含子的上臂和下臂分别选两个酶切位点。设计上下臂引物:以上臂为例，选择xhoⅠ和bglⅡ为上臂酶切位点，分别取基因上游和下游20bp左右，在前面添加相应的酶切位点，相应的保护碱基，同理设计下游的引物。以南方根结线虫的cDNA为模板，扩增上下臂，连接到pUCCRNAi载体上，转化到大肠杆菌DH5α，选择正确的目标条带，送相应的转化子进行测序，测序正确的抽质粒，再连接到穿梭载体pHW25上,并转化大肠杆菌DH5α，将正确的质粒通过冻融法转化到农杆菌EHA105感受态中，得到农杆菌Mi-NMAD-1/EHA105以及农杆菌Mi-NMAD-1/EHA105。之后再利用根癌农杆菌介导的烟草叶盘法遗传转化构建转基因烟草，经过共培养、愈伤培养、不定芽分化、生根培养等步骤最终各获得10株转基因烟草，并以烟草ACTIN为内参基因，通过qRT-PCR检测不同株系基因的表达量，发现Mi-NMAD-1dsRNA转基因烟草5#植株表达量最高，可以达到34倍；而Mi-NMAD-2dsRNA转基因烟草8#植株表达量最高，可以达到256倍，如图4。

其中，扩增Mi-NMAD-1全长引物为：

Mi-NMAD-1clone R：ATGCTTCTTTTATACAGAAAT

Mi-NMAD-1clone F：TTATTCTGATTGTGGAATTATT

扩增Mi-NMAD-2全长引物为：

Mi-NMAD-2clone R：ATGCAAAATAATAAAATTCAAAC

Mi-NMAD-2clone F：TCACTTGAAGTTCAATAAGCCT

其中Mi-NMAD-1连接到pUCCRNAi载体的上臂引物为：

Mi-NMAD-1up F:CCGCTCGAGCAAGAAATCGAACCTCATAT

Mi-NMAD-1up R:GAAGATCTAAGCCACATTCATGTAAATCT

其中Mi-NMAD-1连接到pUCCRNAi载体的下臂引物为：

Mi-NMAD-1down F:CGGGATCCAAGCCACATTCATGTAAATCT

Mi-NMAD-1down R:GCTCTAGACAAGAAATCGAACCTCATAT

其中Mi-NMAD-2连接到pUCCRNAi载体的上臂引物为：

Mi-NMAD-2up F:CGGAATTCGAGCTCGCCGATGTGGTTAGAAAATTGT

Mi-NMAD-2up R:CGGGATCCGAGCATGAGAGCCTAAAGTA

其中Mi-NMAD-2连接到pUCCRNAi载体的下臂引物为：

Mi-NMAD-2down F:GAAGATCTGAGCATGAGAGCCTAAAGTA

Mi-NMAD-2down R：GGACTAGTGCCGATGTGGTTAGAAAATTGT

其中穿梭载体pHW25通用引物为：

pHW25-F:GGCTATCATTCAAGATGCCT

pHW25-R:CGTCATGCATTACATGTTAA

Mi-NMDA-1qRT-PCR检测不同株系表达量的引物为：

qRT-Mi-NMDA-1F：GCTCTTCCTCCCATCGCATTCT

qRT-Mi-NMDA-1R：GCCAGACTTCATCTCGCAAGGT

Mi-NMDA-2qRT-PCR检测不同株系表达量的引物为：

qRT-Mi-NMDA-2F：TCCTGGTGATTTAACCTTTCTTCC

qRT-Mi-NMDA-2R：CCGTCTGTGTGAGGCAAA

烟草ACTIN引物为：

Nt-ACTIN-F：CCTGAGGTCCTTTTCCAACCA

Nt-ACTIN-R：GGATTCCGGCAGCTTCCATT

实施例3：Mi-NMAD-1/2dsRNA转基因烟草线虫抗性检测

通过盆栽实验验证转基因烟草对根结线虫的抗性，我们各挑选了5株表达量较高的mi-nmad-1/2dsRNA转基因烟草植株，在华中农业大学校园内温室中进行盆栽实验，温度范围为28℃左右，相对湿度为70％，光照时间为14小时。土壤为营养土与沙以1：2比例混合，在14×16花盆中加入约1kg灭菌土；选取长势一致，长出四片真叶的烟草植株，在每棵植株根部接种800头南方根结线虫J2幼虫，在21天后将植株根部完整取出，用水清洗干净后统计根部根结数。盆栽结果显示，与转入gfp dsRNA的对照组相比，线虫侵染21天后，转mi-nmad-1/2dsRNA的转基因烟草根结数量显著低于对照组，转mi-nmad-1dsRNA的转基因烟草可以使根结降低率达到76％，转mi-nmad-2dsRNA的转基因烟草可以使根结降低率达到71％，如图6；对照组存在许多大根结，说明线虫产生了复合感染，而mi-nmad-1/2组很少形成大根结，并且小根结也较少，如图5，说明表达mi-nmad-1/2dsRNA的转基因烟草植株可以提高对线虫的抗性。

实施例4：Mi-NMAD-1/2dsRNA转基因烟草抗线虫机制

上述结果中我们已经发现mi-nmad-1/2dsRNA转基因植株能显著的增加烟草对南方根结线虫的抗性，然而我们并不知道其中的抗线虫机制是什么。因为线虫侵染植物完成生活史最重要的武器是其在侵染各个阶段分泌的effector，南方根结线虫有多个研究清楚的effector，例如与降解植物细胞壁相关的effector Mi-XYl1，促进取食位点建立相关的effector MiPFN3，Mi8D05，16D10以及MiIDL1，抑制植物免疫相关的effector Mi-CRT及MiSGCR1等。为了研究在去甲基化酶被干扰的线虫中这些effector基因的表达情况，我们以mi-nmad-1dsRNA转基因烟草为例，通过在mi-nmad-1dsRNA转基因烟草根部接种南方根结线虫，侵染40天后收集侵染mi-nmad-1dsRNA转基因烟草的南方根结线虫虫卵，通过研磨仪破碎虫卵，再利用trizol法提取RNA，并以ACTIN作为内参基因，设计引物进行qRT-PCR分析各个effector的表达情况。其中各个effector的引物为：Mi-XYl1(F:CGTGTCGGAATTGTTGATTTATGT；R:TTGTGCTGTTAATGCTTCTTGTC)MiPFN3(F:GGAACTGGCCATGTTTCAAAGGC；R:GTCCATTCGCTGCAGCATTTGC)Mi8D05(F:TTCCACCACAACAGCCACCTT；R:GACTGCCAGCAAGACCTCCTC)16D10(F:GCCTTTAATGGTTACTTTAATGC；R:TCAATTATTTCCTCCAGGATTTGG)MiIDL1(F:GCTTTTATCTGTCTCAATTGTGG；R:CGGCCGGGACCTGGAACTTT)Mi-CRT(F:GATGCTCGCTTCTATAGTATTTC；R:GAGGCCATGAGCTAAATTGATTC)MiSGCR1(F:GGAATCGGTGGCTTTGGT；R:CTCCTCCGCATCCTCCATA)Mi-ACTIN(F：GTTATTCTTTCACCGCAACCG；R:GAATACCAGCAGATTCCATCCC)

为了研究在去甲基化酶被干扰的线虫中这些effector基因的表达情结果显示，南方根结线虫中所有研究的effector均有不同程度的下调表达，其中Mi-CRT下调倍数最多，达126倍。说明表达mi-nmad-1dsRNA转基因烟草可以通过下调南方根结线虫的effector基因的表达来降低线虫的侵染，从而提高植株对线虫的抗性，如图7。

Claims (10)

1.一种南方根结线虫去甲基化酶基因，其为Mi-NMAD-1或Mi-NMAD-2，所述Mi-NMAD-1的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述Mi-NMAD-2的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述的南方根结线虫去甲基化酶基因。

3.一种工程菌，其特征在于，包含权利要求2所述的重组载体。

4.权利要求1所述南方根结线虫去甲基化酶基因、权利要求2所述重组载体或权利要求3所述工程菌在抗植物寄生线虫南方根结线虫或制备抗植物寄生线虫南方根结线虫的产品中的应用。

5.权利要求1所述南方根结线虫去甲基化酶基因在构建抗植物寄生线虫南方根结线虫转基因植物中的应用，所述的应用是在植物中过表达权利要求1所述的南方根结线虫去甲基化酶基因。

6.权利要求2所述重组载体在构建抗植物寄生线虫南方根结线虫转基因植物中的应用，所述的应用是通过使用所述重组载体在植物中过表达所述南方根结线虫去甲基化酶基因。

7.权利要求3所述工程菌在构建抗植物寄生线虫南方根结线虫转基因植物中的应用，所述的应用是通过使用所述工程菌在植物中过表达所述南方根结线虫去甲基化酶基因。

8.一种抗植物寄生线虫南方根结线虫的方法，其特征在于，该方法包括在植物中过表达权利要求1所述南方根结线虫去甲基化酶基因。

9.一种抗植物寄生线虫南方根结线虫的方法，其特征在于，该方法包括：通过使用权利要求2所述的重组载体，在植物中过表达权利要求1所述南方根结线虫去甲基化酶基因。

10.一种抗植物寄生线虫南方根结线虫的方法，其特征在于，该方法包括：通过使用权利要求3所述的工程菌，在植物中过表达权利要求1所述南方根结线虫去甲基化酶基因。