CN115838712A - 具有肌肽水解酶功能的蛋白酶及其在l-肌肽合成中的应用 - Google Patents
具有肌肽水解酶功能的蛋白酶及其在l-肌肽合成中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本申请提供一种具有肌肽水解酶功能的蛋白酶及其在L‑肌肽合成中的应用。其中，所述具有肌肽水解酶功能的蛋白酶包括SEQ ID NO：6所示的序列。本申请的蛋白酶具有酶活性高、酶促反应水平高的优点。本申请采用生物酶法催化合成L‑肌肽，转化液中的L‑肌肽含量在100‑125g/L之间，以L‑组氨酸计，转化率＞65％，具有转化率高、重复性好、转化时间短的优点。
Description
技术领域
本申请属于生物技术领域，具体地，涉及一种具有肌肽水解酶功能的蛋白酶及其在L-肌肽合成中的应用。
背景技术
L-肌肽，是一种由β-丙氨酸和L-组氨酸组成的二肽，是目前发现的最广泛的生物活性肽之一。L-肌肽在哺乳动物的大脑、肌肉和其他组织中广泛存在。
研究表明，L-肌肽具有抗氧化性、清除胞内自由基、抗衰老等多种生物活性，并且对高血压、心脏病、老年性白内障、溃疡等都有治疗效果。由于其较强的抗氧化活性、低毒副作用，并有多种生理活性，该活性肽在医药、保健、卫生、化妆品等领域都具有良好的应用前景。
目前所报道的L-肌肽的合成方法主要为化学合成和生物酶法催化两种，其中酶法由于具有环保、制备成本低、合成时间短的优点，使其应用更为广泛。然而，目前在使用酶法合成L-肌肽时，还存在以下问题：一是酶活性低，导致合成过程中的底物转化率低，转化时间较长，需要6-10h。
专利申请CN 109468303 A公开了一种肌肽水解酶、基因、突变体及其应用，该方法涉及一种肌肽水解酶及其突变体，通过重组表达、酶的制备、酶的固定化，使用该重组酶通过逆水解反应制备L-肌肽，但该专利申请的肌肽产量仅为约17g/L，在工业生产上还需要进一步提高肌肽的产量。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本申请提供一种具有肌肽水解酶功能的蛋白酶及其在L-肌肽合成中的应用。
具体来说，本申请涉及如下方面：
1.一种具有肌肽水解酶功能的蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶包含如SEQ IDNO:6所示的氨基酸序列。
2.根据项1所述的蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶为在SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白。
3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：
B1)编码项1所述蛋白酶的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
4.根据项3所述的生物材料，其特征在于，所述的核酸分子包含如SEQ ID NO:1所示的核酸序列。
5.下述任一种材料在制备项1所述的蛋白酶、对微生物中项1所述的蛋白酶产量进行调控中的用途：
C1)对编码所述蛋白酶的基因表达进行调控的物质；
C2)调控所述蛋白酶的活性或含量的物质。
6.根据项5所述的用途，其特征在于，通过使用下述任一种或两种以上来实现：
D1)编码项1所述蛋白质酶的核酸分子；
D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物。
7.一种对微生物进行重组的方法，所述方法包括：
向所述微生物中导入用于表达项1所述蛋白酶的编码基因；
任选对用于表达项1所述蛋白酶的编码基因进行调控以提高所述蛋白酶的活性或产量。
8.根据项3或4所述的生物材料、项5所述的用途、项7所述的方法，其特征在于，所述微生物为如下任一种：大肠杆菌；枯草芽孢杆菌；酿酒酵母。
9.一种制备L-肌肽的方法，其特征在于，所述方法包括利用项1或2所述的蛋白酶或项3或4所述的生物材料或项7所述方法制备得到的重组微生物生产L-肌肽。
10.根据项9所述的方法，其中，所述底物为β-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-组氨酸。
与现有技术相比，本申请具有以下有益效果：
1、使用本申请提供的重组载体制备的蛋白酶酶液中，可溶性蛋白含量＞80％，且蛋白酶酶活在110-130U/mL之间；表明该蛋白酶具有酶活性高、酶促反应水平高的优点。
2、本申请采用生物酶法催化合成L-肌肽，转化液中的L-肌肽含量在100-125g/L之间，以L-组氨酸计，转化率＞65％，具有转化率高、重复性好、转化时间短的优点。
附图说明
图1为实施例2中破壁后的可溶性蛋白SDS-PAGE电泳图。
图2为浓度为50mg/L的对照品溶液HPLC图谱。
图3为对照品的标准曲线图。
图4为实施例2样品溶液的HPLC图谱。
图5为实施例3样品溶液的HPLC图谱。
图6为实施例4样品溶液的HPLC图谱。
图7为实施例5获得的转化液的HPLC图谱。
图8为实施例10获得的L-肌肽成品的HPLC图谱。
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明本申请，应当理解，实施例仅用于进一步说明和阐释本申请，并非用于限制本申请。
除非另外定义，本说明书中有关技术的和科学的术语与本领域内的技术人员所通常理解的意思相同。虽然在实验或实际应用中可以应用与此间所述相似或相同的方法和材料，本文还是在下文中对材料和方法做了描述。在相冲突的情况下，以本说明书包括其中定义为准，另外，材料、方法和例子仅供说明，而不具限制性。以下结合具体实施例对本申请作进一步的说明，但不用来限制本申请的范围。
在本文中，术语“多核苷酸”、“核苷酸序列”和“核酸分子”可互换使用。它们是指任何长度的核苷酸的聚合形式，可以是脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或其类似物，所述核酸分子可以是DNA，如cDNA、基因组DNA或重组DNA；所述核酸分子也可以是RNA，如gRNA、mRNA、siRNA、shRNA、sgRNA、miRNA或反义RNA。
在本文中，术语“载体”用于描述可以被工程化以含有可以在宿主细胞中扩增的克隆的一种多核苷酸或多种多核苷酸的核酸分子。载体包括但不限于：单链，双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个游离末端，没有游离末端(例如环状)的核酸分子；包含DNA，RNA或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多核苷酸种类。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以***额外DNA片段的环状双链DNA环，例如通过标准分子克隆技术。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制(例如，具有细菌复制起点的细菌载体和游离型哺乳动物载体)。其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。
此外，某些载体能够指导它们可操作地连接的那些基因的表达。此类载体在本文中称为“重组表达载体”或“重组载体”。重组载体可以包含适于在宿主细胞中表达核酸的形式的本发明的核酸，这意味着重组表达载体包括一种或多种调节元件，其可以基于用于表达的、可以与待表达的核酸序列可操作地连接的宿主细胞来选择。
在本文中，术语“重组微生物”包括微生物(例如细菌、酵母、藻、真菌等)或微生物菌株，其已经被遗传改变、修饰或工程化(例如遗传工程化)以便其与其来源的天然发生微生物或“亲本”微生物相比显示改变的、修饰的或不同的基因型和/或表型(例如，当遗传修饰影响了微生物的编码核酸序列时)。
术语“表达盒”是指能够在微生物中表达本申请的具有肌肽水解酶功能的蛋白酶的DNA，该DNA不仅包括启动目的基因转录的启动子，还可包括终止目的基因转录的终止子。进一步，所述表达盒还可包括增强子序列。
术语“融合蛋白”是指包含至少第一蛋白质与至少第二蛋白质遗传连接的蛋白质。融合蛋白是通过连接两个或更多个最初编码不同蛋白质的基因而产生的。融合蛋白可以进一步包含不参与与靶结合的另外的结构域，诸如但不限于例如多聚化部分、多肽标签、多肽接头或与不同于PSMA的靶结合的部分。”所述蛋白标签可为Flag标签、His标签、MBP标签、HA标签、myc标签、GST标签和/或SUMO标签等。
本申请提供一种具有肌肽水解酶功能蛋白酶，所述蛋白酶的氨基酸序列包括SEQID NO：6所示的序列。
在一个具体的实施方式中，所述蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：6所示。
本领域技术人员可以理解，与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％的序列同一性，但是与SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列具有相似活性的多肽也属于本申请蛋白酶的范围之内。
在SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的基础上经过修饰、和/或一个或几个氨基酸的取代、和/或缺失和/或添加一个或几个氨基酸并与SEQ ID NO：6所示氨基酸序列具有95％或96％或97％或98％或99％同一性、且具有相同功能的多肽也在本申请蛋白酶的保护范围内。
在SEQ ID NO：6所示的氨基酸序列的基础上经过修饰、和/或一个或几个氨基酸的取代、和/或缺失和/或添加一个或几个或数十个氨基酸且具有相同功能的多肽也在本申请蛋白酶的保护范围内。
进一步地，在SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白也在本申请蛋白酶的保护范围之内。
本申请还提供一种生物材料，其中所述生物材料可以是下述任意一种：
B1)编码上述蛋白酶的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
进一步地，所述核酸分子的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列可以通过本领域已知的方式合成或筛选得到。
在一个具体的实施方式中，SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列通过宏基因组技术筛选得到。
其中，宏基因组学(Metagenomics)又叫微生物环境基因组学、元基因组学。它通过直接从环境样品中提取全部微生物的DNA,构建宏基因组文库，利用基因组学的研究策略研究环境样品所包含的全部微生物的遗传组成及其群落功能。它是在微生物基因组学的基础上发展起来的一种研究微生物多样性、开发新的生理活性物质(或获得新基因)的新理念和新方法。其主要含义是：对特定环境中全部微生物的总DNA(也称宏基因组，metagenomic)进行克隆，并通过构建宏基因组文库和筛选等手段获得新的生理活性物质；或者根据rDNA数据库设计引物，通过***学分析获得该环境中微生物的遗传多样性和分子生态学信息。
在一个具体的实施方式中，SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列通过宏基因组技术从土壤中筛选得到。
在一个具体的实施方式中，所述宏基因组技术筛选的过程为：选定NCBI中蛋白酶的保守基因序列为模板设计引物，其中，蛋白酶的保守基因序列如SEQ ID NO：3所示，引物F的基因序列如SEQ ID NO：4所示，引物R的基因序列如SEQ ID NO：5所示。
各种多核苷酸和控制序列可以连接在一起以产生重组载体，该重组载体可以包括一个或多个合宜的限制位点以允许在此类位点处***或取代编码变体的多核苷酸。可替代地，可以通过将多核苷酸或包含该多核苷酸的核酸构建体***用于表达的适当载体中而表达该多核苷酸。在产生表达载体时，编码序列如此位于载体中，使得编码序列与用于表达的适当控制序列可操作地连接。重组载体可以是方便地经受重组DNA程序并且可以引起多核苷酸表达的任何载体(例如，质粒或病毒)。
载体的选择将典型地取决于载体与待引入载体的宿主细胞的相容性。载体可以是直链或闭合环状质粒。载体可以是自主复制载体，即作为染色体外实体存在的载体，其复制独立于染色体复制，例如质粒、染色体外元件、微染色体或人工染色体。载体可以含有用于确保自我复制的任何手段。
可替代地，载体可以是这样的载体，当它引入宿主细胞中时整合入基因组中并与其中已整合了它的一个或多个染色体一起复制。此外，可以使用单独的载体或质粒或两个或更多个载体或质粒，其共同含有待引入宿主细胞基因组的总DNA，或可以使用转座子。载体优选地含有允许方便地选择转化细胞、转染细胞、转导细胞等细胞的一个或多个选择性标记。选择性标记是一种基因，其产物提供了杀生物剂抗性或病毒抗性、对重金属抗性、对营养缺陷型的原养型等。在一个具体的实施方式中，所述重组载体是包含SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列的质粒。
在一个具体的实施方式中，所述重组载体为pET载体。其中，pET载体包括PET-3a、PET-5a、PET-9a、PET-11a、PET-12a、PET-14b、PET-15b、PET-16b、PET-17b、PET-17xb、PET-19b、PET-20b(+)、PET-21(+)、PET-21a(+)、PET-22b(+)、PET-23(+)、PET-23a(+)、PET-24(+)、PET-24a(+)、PET-25b(+)、PET-26b(+)、PET-27b(+)、PET-28a(+)、PET-29a(+)、PET-30EK/LIC、PET-30Xa/LIC、PET-30a(+)、PET-31b(+)、PET-32EK/LIC、PET-32Xa/LIC、PET-32a(+)、PET-33b(+)、PET-39b(+)、PET-40b(+)、PET-41EK/LIC、PET-41a(+)、PET-42a(+)、PET-43.1EK/LIC、PET-43.1a(+)、PET-44EK/LIC、PET-44a(+)、PET-45b(+)、PET-46EK/LIC、PET-47b(+)、PET-48b(+)、PET-49b(+)、PET-50b(+)、PETBlue-1、PETBlue-2、PETcoco-1、PETcoco-2、PETDuet-1。
在一个具体的实施方式中，所述重组载体为pET28a(+)载体。
在一个具体的实施方式中，所述重组载体通过将pET28a(+)载体的NcoI和HindIII两个酶切位点之间的片段替换为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列得到，其中，所述pET28a(+)载体的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。
本申请的生物材料还可以是包含任意一种上述的核酸分子、表达盒或重组载体的重组微生物。
将包含多核苷酸的构建体或载体引入微生物中，这样使得该构建体或载体作为染色体整合体或作为自主复制的染色体外载体维持。术语“微生物”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不相同的任何亲本细胞子代。微生物的选择在很大程度上将取决于编码变体的基因及其来源。
本申请的微生物可以是任何革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌、酵母菌、霉菌、变形虫、以及更普遍的单细胞生物体，其可以在实验室中进行操控和操作。***包括但不限于：芽孢杆菌属、梭菌属、肠球菌属、土芽孢杆菌属、乳杆菌属、乳球菌属、大洋芽孢杆菌属、葡萄球菌属、链球菌属以及链霉菌属。革兰氏阴性细菌包括但不限于：弯曲杆菌属、大肠杆菌、黄杆菌属、梭杆菌属、螺杆菌属、泥杆菌属、奈瑟氏菌属、假单胞菌属、沙门氏菌属、以及脲原体属。酵母菌包括但不限于：假丝酵母(Candida)、隐球菌(Cryptococcus)、酿酒酵母(Saccharomyces)和毛孢子菌(Trichosporo)。霉菌包括但不限于：曲霉菌(Aspergillus)、青霉菌(Penicillium)、分枝孢子菌(Cladosporium)。
在一个具体的实施方式中，所述微生物为大肠杆菌、枯草芽孢杆菌或酿酒酵母。
在一个具体的实施方式中，所述宿主细胞为大肠杆菌。作为大肠杆菌，可举出例如W3110株(ATCC 27325)和MG1655株(ATCC 47076)等大肠杆菌K-12株，大肠杆菌K5株(ATCC23506)，BL21(DE3)株等大肠杆菌B株，以及它们的衍生株。
本申请还提供下述任一种材料在制备上述蛋白酶、对微生物中上述蛋白酶产量进行调控中的用途：
C1)对编码所述蛋白酶的基因表达进行调控的物质；
C2)调控所述蛋白酶的活性或含量的物质。
其中，对编码所述蛋白酶的基因表达进行调控的物质是指可以调节和控制编码本申请的具有肌肽水解酶功能的蛋白酶的基因表达的物质，包括启动子、增强子、终止子、增加基因拷贝数、诱导表达、突变序列、融合蛋白表达等。
在本文中，术语“启动子”是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列，它含有RNA聚合酶特异性结合和转录起始所需的保守序列，多数位于结构基因转录起始点的上游,启动子本身不被转录。但有一些启动子(如tRNA启动子)位于转录起始点的下游,这些DNA序列可以被转录。启动子的特性最初是通过能增加或降低基因转录速率的突变而鉴定的。启动子一般位于转录起始位点的上游。
术语“增强子”是DNA上一小段可与蛋白质结合的区域，与蛋白质结合之后，基因的转录作用将会加强。增强子可能位于基因上游，也可能位于下游。且不一定接近所要作用的基因，这是因为染色质的缠绕结构，使序列上相隔很远的位置也有机会相互接触。
术语“终止子(terminator T)”是给予RNA聚合酶转录终止信号的DNA序列。在一个操纵元中至少在结构基因群最后一个基因的后面有一个终止子。术语“多拷贝基因”是特定基因自然状态下或者通过人工手段使特定基因发生大量重复。
术语“诱导表达”是指基因在诱导物(如代谢产物)的作用下，该基因的表达被启动或增强。
术语“突变”是指基因在结构上发生碱基对组成或排列顺序的改变。
调控所述蛋白酶的活性或含量的物质是指可以调节和控制编码本申请的具有肌肽水解酶功能的蛋白酶的活性或者含量的物质，包括启动子、增强子、终止子、增加基因拷贝数、诱导表达、突变序列、融合蛋白表达等。
上文中，所述调控可为上调或增强或提高，或，下调或减弱或降低。
其中，上调或增强或提高所述蛋白质的编码基因的表达或所述蛋白质的活性或含量能够上调或增强或提高微生物具有肌肽水解酶功能的蛋白酶产量。
下调或减弱或降低所述蛋白质的编码基因的表达或所述蛋白质的活性或含量能够下调或减弱或降低微生物具有肌肽水解酶功能的蛋白酶产量。
上文中，调控所述蛋白质的编码基因(简称基因)的表达可为进行如下6种调控中的至少一种调控：1)在所述基因转录水平上进行的调控；2)在所述基因转录后进行的调控(也就是对所述基因的初级转录物的剪接或加工进行的调控)；3)对所述基因的RNA转运进行的调控(也就是对所述基因的mRNA由细胞核向细胞质转运进行的调控)；4)对所述基因的翻译进行的调控；5)对所述基因的mRNA降解进行的调控；6)对所述基因的翻译后的调控(也就是对所述基因翻译的蛋白质的活性进行调控)。
在一个具体的实施方式中，上述用途可以通过本申请的上述任意一种或两种以上的生物材料实现。
本申请还提供一种对微生物进行重组的方法，所述方法包括：
向微生物中导入用于表达本申请蛋白酶的编码基因。
进一步地，在将用于表达本申请蛋白酶的编码基因导入微生物时，可以对编码基因进行调控以提高所述蛋白酶的活性或产量。
本申请还提供利用上述任意一种生物材料制备蛋白酶的方法。
在一个具体的实施方式中，制备蛋白酶的方法包括以下步骤：
将所述宿主细胞在发酵培养基中于30-40℃培养至OD600为0.5-5，
加入0.1-1mM的IPTG在15-30℃下诱导培养8-14小时，得到发酵液，
将所述发酵液破碎，得到含有蛋白酶的粗酶液。
本领域技术人员可以理解，在制备蛋白酶的过程中，培养基的种类、具体发酵的温度、时间、以及诱导培养的条件等可以根据具体的实际情况进行调整。
进一步地，所述制备蛋白酶的方法可以进一步包括对粗酶液进行纯化。
在一个具体的实施方式中，制备蛋白酶的方法包括以下步骤：
将所述宿主细胞在发酵培养基中于30-40℃培养至OD600为0.5-5，
加入0.1-1mM的IPTG在15-30℃下诱导培养8-14小时，得到发酵液，
将所述发酵液破碎，得到含有蛋白酶的粗酶液，
将所述粗酶液纯化。
在一个具体的实施方式中，所述发酵培养基包括以下组分：
胰蛋白胨5-20g/L、酵母提取物1-10g/L、NaCl 4-15g/L。
在一个具体的实施方式中，通过上述制备方法制备得到的蛋白酶粗酶液中可溶性蛋白含量大于80％，且蛋白酶酶活大于等于110U/mL。
在一个具体的实施方式中，通过上述制备方法制备得到的蛋白酶粗酶液中可溶性蛋白含量大于80％，且蛋白酶酶活为110-130U/mL。
通过本申请的制备方法制备得到的蛋白酶的可溶性蛋白含量大于80％，减少了包涵体的表达，使蛋白酶酶活水平提高，提高了转化效率。
本申请还提供一种制备肌肽的方法，所述方法包括：利用上述蛋白酶、生物材料或重组微生物来生产L-肌肽。
在一个具体的实施方式中，制备肌肽的方法包括：
将β-丙氨酸甲酯盐酸盐、L-组氨酸和上述的蛋白酶，或上述核酸分子编码的蛋白酶，或上述重组载体表达的蛋白酶，或上述宿主细胞生产的蛋白酶在反应液中进行反应，得到L-肌肽。
其中，所述反应液中β-丙氨酸甲酯盐酸盐的浓度为75-110g/L，L-组氨酸的浓度为80-120g/L，所述蛋白酶的浓度为3000-6000U/L。
本领域技术人员可以理解，在制备肌肽的过程中，β-丙氨酸甲酯盐酸盐、L-组氨酸、蛋白酶的用量，反应所使用的反应体系(例如可以是纯化水，也可以是各种类型的缓冲液)、反应的温度、以及反应时间等条件都可以根据具体的需要进行调整。
在一个具体的实施方式中，所述反应液的pH为8-9。
在一个具体的实施方式中，所述反应的反应温度为15-25℃，反应时间为1小时以上。
本申请还提供通过上述制备肌肽的方法制备得到的肌肽组合物，所述肌肽组合物中L-肌肽的含量大于等于100g/L。
在一个具体的实施方式中，所述肌肽组合物中L-肌肽的含量大于等于100g/L。
本申请制备的蛋白酶酶液中，可溶性蛋白含量＞80％，且蛋白酶酶活在110-130U/mL之间，具有酶活性高、酶促反应水平高的优点。使用本申请的蛋白酶生产L-肌肽，产量可以高达123.36g/L。相比于现有技术中的17g/L，提高了约6.3倍，具有L-组氨酸转化率高，L-肌肽产量高的优点，为L-肌肽的工业生产提供了应用前景。
实施例
以下实施例中的方法，如无特殊说明，均为常规方法。实施例中所用的实验材料，如无特殊说明，均为常规生化试剂商店购买得到。
pET28a(+)载体：序列表的SEQ ID NO:2所示的环状质粒。
大肠杆菌BL21(DE3)：购买于上海捷瑞生物有限公司。
β-丙氨酸甲酯盐酸盐：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：3196-73-4。
L-组氨酸：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：72-00-1。
L-肌肽标准品：上海阿拉丁生化科技股份有限公司，货号：305-84-0。
实施例1制备重组载体
(1)称取土样0.5g，加入细菌DNA提取缓冲液，用DNA提取试剂盒(美国OMEGA生物科技公司)提取土样中宏基因组，获得提取液，具体操作按照试剂盒说明书进行。
(2)制备SEQ ID NO:1所示的DNA分子：采用宏基因组技术筛选，选定NCBI中蛋白酶的保守基因序列(SEQ ID NO:3所示)为模板设计引物，对提取液中的基因进行扩增，获得SEQ ID NO:1所示的DNA分子。
其中，扩增过程中的反应体系(25μL)包括1μL模板，2μL引物，2.5μL bμffer，2.5μLdNTPs(2mM)，0.3μl DNA聚合酶(5U/μL)，剩余用ddH2O补充；反应条件：95℃6min；94℃1min，50℃1min，72℃1min，35个循环；72℃10min。
引物F基因序列如SEQ ID NO:4所示，引物R的基因序列如SEQ ID NO:5所示；
(3)制备重组载体：将SEQ ID NO:2所示的pET28a(+)载体的NcoI和Hind III两个酶切位点之间的片段替换为SEQ ID NO:1所示的DNA分子，获得重组载体。
实施例2制备蛋白酶-1
(1)制备重组菌：将实施例1获得的重组载体转化至E·coli DE3感受态细胞，获得重组菌，将重组菌接种至抗性平板，筛选阳性转化子。
(2)种子培养：将步骤(1)所得的阳性转化子接种于LB液体培养基中，于37℃、200rpm条件下振荡培养过夜，获得种子液。
(3)发酵：按1％的接种量将种子液转接于装有200mL发酵培养基的三角烧瓶中，于37℃、200rpm条件下振荡培养至OD600＝0.6，然后加入终浓度为0.1mM的IPTG作为诱导剂，在25℃条件下诱导10h，得到发酵液。
其中，发酵培养基主要成分及其含量为:胰蛋白胨10g/L，酵母提取物5g/L，NaCl10g/L，pH7.0。
(4)将重组菌破碎，得含有蛋白酶的粗酶液，蛋白酶的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示。
检测1
采用SDS-PAGE电泳对实施例2中步骤(4)的上清液(蛋白酶酶液)和沉淀(包涵体)检测，以Marker为对比，确定目的蛋白分子量，结果见图1。图1中，从左向右的色带依次是沉淀色带、上清液色带和Marker色带，结合图1可以看出，蛋白酶(重组蛋白)在上清液中的含量占80％以上；也就是说，通过本发明重组菌表达获得的蛋白中，80％以上为可溶性蛋白，减少了包涵体的表达，使蛋白酶酶活水平提高，提高了转化效率。
实施例3制备蛋白酶-2
(1)制备重组菌：同实施例2；
(2)种子培养：同实施例2；
(3)发酵：按1％的接种量将种子液转接于装有200mL发酵培养基的三角烧瓶中，于30℃、300rpm条件下振荡培养至OD600＝4，然后加入终浓度为0.5mM的IPTG作为诱导剂，在15℃条件下诱导10h，得到发酵液；
其中，发酵培养基主要成分及其含量为:胰蛋白胨5g/L，酵母提取物8g/L，NaCl4g/L，pH7.0；
(4)将重组菌破碎，得含有蛋白酶的粗酶液。
实施例4制备蛋白酶-3
(1)制备重组菌：同实施例2；
(2)种子培养：同实施例2；
(3)发酵：按1％的接种量将种子液转接于装有200mL发酵培养基的三角烧瓶中，于40℃、400rpm条件下振荡培养至OD600＝0.5，然后加入终浓度为1mM的IPTG作为诱导剂，在25℃条件下诱导10h，得到发酵液；
其中，发酵培养基主要成分及其含量为:胰蛋白胨20g/L，酵母提取物1g/L，NaCl15g/L，pH7.0；
(4)将重组菌破碎，得含有蛋白酶的粗酶液。
检测2
对实施例2-4制备的蛋白酶酶活检测，方法为：
(1)制备对照品溶液：分别配制含量为10mg/L、25mg/L、40mg/L、80mg/L、100mg/L的L-肌肽标准品，作为对照品溶液，待用。
(2)制备反应液：取蛋白酶酶液加到含有50mMβ-丙氨酸甲酯盐酸盐和100mM L-组氨酸的缓冲溶液中，催化β-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-组氨酸合成L-肌肽；缓冲溶液的pH在6-10之间；在25℃反应10min后，用1M盐酸调节反应液的pH在3-4之间，终止反应，获得反应液。
(3)制备样品溶液：反应液定容后，取1mL用流动相稀释100倍，待用；
(4)采用下述的高效液相色谱法对对照品溶液和样品溶液测定，制作L-肌肽标准曲线，并计算样品溶液中L-肌肽的含量；以每分钟生成1μmol的L-肌肽视为一个酶活力单位，计算蛋白酶活力。
高效液相色谱法检测条件如下：
固定相：NH2色谱柱(Shim-pack GIST,5μm，4.6*500mm)；
流动相：50mM磷酸二氢钾水溶液(用磷酸调至pH＝4.0):乙腈＝35:65；
流速：0.7ml/min；
进样量：20μL；
紫外检测波长：215nm；
(5)检测图谱见图2-图4；
图2为浓度为50mg/L的对照品溶液HPLC图谱；
图3为对照品的标准曲线图；
图4为实施例2样品溶液的HPLC图谱；
图5为实施例3样品溶液的HPLC图谱；
图6为实施例4样品溶液的HPLC图谱；
根据图2可知，L-肌肽的出峰时间为20.767min。
结合图3-图6，计算实施例2、实施例3和实施例4中L-肌肽的含量，并计算蛋白酶酶活力；实施例2中，L肌肽的产量为28.06g/L，蛋白酶酶活力为124.05U/mL；实施例3中，L肌肽的产量为25.77g/L，蛋白酶酶活力为113.92U/mL；实施例4中，L肌肽的产量为26.75g/L，蛋白酶酶活力为118.26U/mL。
实施例2-4中各发酵条件和相应的蛋白酶酶活如表1所示。
表1
可见，本发明方法制备的蛋白酶，酶活力在110-130U/mL之间，且获得的蛋白酶酶液中，可溶性蛋白含量＞80％。其中，可溶性蛋白的含量通过凝胶电泳进行分析，实施例2制备的蛋白酶酶活性最高。
实施例5使用实施例2的蛋白酶转化制备转化液-1
在纯化水中加入L-组氨酸100g、β-丙氨酸甲酯盐酸盐95g、蛋白酶粗酶液70mL，使得总反应体系为1L，pH为8.0，100rpm缓慢搅拌，控制温度为20℃；转化时间为110min。
检测3
对实施例5获得的转化液进行L-肌肽含量检测，检测方法为检测2中的HPLC法，样品制备过程为：取1mL转化液，用流动性稀释1000倍，混匀，即可；以L-组氨酸计算转化率；检测图谱见图7。经检测，实施例5的转化液中L-肌肽的含量为98.42g/L，L-组氨酸转化率67.5％。
实施例6使用实施例2的蛋白酶转化制备转化液-2
在纯化水中加入L-组氨酸120g、β-丙氨酸甲酯盐酸盐110g、蛋白酶粗酶液50mL，使得总反应体系为1L，pH为8.5，150rpm缓慢搅拌，控制温度为15℃；转化时间为80min。
经检测3的HPLC法检测，转化液中L-肌肽的含量为123.36g/L，L-组氨酸的转化率为70.5％。
实施例7使用实施例2的蛋白酶转化制备转化液-3
在纯化水中加入L-组氨酸80g、β-丙氨酸甲酯盐酸盐75g、蛋白酶150mL，使得总反应体系为1L，pH为9.0，200rpm缓慢搅拌，控制温度为25℃；转化时间为170min。
经检测3的HPLC法检测，转化液中L-肌肽的含量为87.92g/L，L-组氨酸的转化率为75.3％。
结合实施例5-实施例7可以看出，使用实施例2提供的肌肽转化酶制备的转化液中，L-肌肽含量在85-125g/L之间，转化率＞65％；可见，使用本发明的方法转化L-肌肽，转化过程稳定，能够获得稳定性高的转化液，表明本发明的转化过程重复性好。
实施例8使用实施例3的蛋白酶转化制备转化液
与实施例5的区别在于，使用的蛋白酶为实施例3提供的蛋白酶，酶活总量和实施例3所使用的酶活总量一样。
经检测3的HPLC法检测，转化液中L-肌肽的含量为95.22g/L，L-组氨酸的转化率为65.3％。
实施例9使用实施例4的蛋白酶转化制备转化液
与实施例5的区别在于，使用的蛋白酶为实施例4提供的蛋白酶。酶活总量和实施例3所使用的酶活总量一样。
经检测3的HPLC法检测，转化液中L-肌肽的含量为100.17g/L，L-组氨酸的转化率为68.7％。
实施例5-实施例9的反应条件及产物如表2所示。
表2
结合实施例5、实施例8和实施例9可以看出，当蛋白酶的活性变化时，以L-组氨酸计，转化率＞65％，L-肌肽的含量大于87.92g/L，可以高达123.36g/L。相比于现有技术中的17g/L，提高了约6.3倍，表明本发明提供的蛋白酶，在以β-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-组氨酸为底物，催化合成L-肌肽的转化过程中，L-组氨酸转化率高的优点。
SEQ ID NO:1
ATGAAGCGCGCACGTCTGCGTGACTTAGGGATTACAATTGGGCGTTTGCCGACAGGACCGTATAACGCCATCACCGATGTCCCCGGAGTCCGCGTTGGGCATACCACAATTATCGAGGACGATCCCCATGTCGTCCGTACCGGTGTTACGGTTATTCTTCCACAGGATGGAGAGGTCTGGGAACACCATGTATTCGCTGGGTATCACTCCTTTAATGGCAATGGGGAGATGACTGGGCGCCATTGGTTGGAAGAATCTGGACTGTTGAGCTCGCCAATTGCTTTAACTTCTACCTACTCTGTAGGAGTCGTTCACGACGCGCTTGTAAAGTATGCGGCAGAACAAGACCCGACAGCACCGTTTACTTTGCCAGTCGTCGCAGAAACGTGGGACGGGTGGCTGTCTGATTCTGAAGCCTTCGCAGTCACGCCCGAGCATGTGCGTGAGGCCTTGGAGAACGCACGTAGCGGCCCCGTCGCCGAAGGAAATGTCGGCGGCGGCACGGGTATGATTTGTCACGAATTTAAGGGTGGGATCGGAACTAGTAGTCGTGTCGTAGAAGTGGAGGGAGAAGGGTATACAGTTGGGGCGTTGGTCCAAGCGAATTATGGCCGCCGTGAAGATCTGCGTATCAACGGCGTGCCCGTTGGCCGTCTGATTCCAGCGGACCAAGTTCCAGTCCCCTGGGAGGAGCCACCGCGTGAGGACGGCTCAATCATCGTCATTATCGCTACCGATGCACCGCTTCTTCCCCATCAATGCAAACGTCTTGCACGTCGTGCGACGTTGGGATTAGGGCGTACCGGAGGCTTTGGACATAACGGAAGTGGCGACTTCTTTCTTGCCTTCTCTACTGGTAACCGTCTTCCACGTCAGCCAGAAGAGCCGGTTTATGGACTGAAAATGTTGCCCAATGAAGAAATGGACCCATTGTTTCAGGGTGCAGTAGAGGCTACCGAGGAGGCGATTCTGAACTCTCTGTGCATGGCCGAAACAATGACTGGTCGCAAGGGGCGCACGGTTCACGCGCTGCCCCTTGATCGCTTAA AGGAGATTCTGAAGCGCCCCGGGCGTCGTTAA
SEQ ID NO:2
atccggatatagttcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggcagcagccaactcagcttcctttcgggctttgttagcagccggatctcagtggtggtggtggtggtgctcgagtgcggccgcaagcttgtcgacggagctcgaattcggatccgcgacccatttgctgtccaccagtcatgctagccatatggctgccgcgcggcaccaggccgctgctgtgatgatgatgatgatggctgctgcccatggtatatctccttcttaaagttaaacaaaattatttctagaggggaattgttatccgctcacaattcccctatagtgagtcgtattaatttcgcgggatcgagatctcgatcctctacgccggacgcatcgtggccggcatcaccggcgccacaggtgcggttgctggcgcctatatcgccgacatcaccgatggggaagatcgggctcgccacttcgggctcatgagcgcttgtttcggcgtgggtatggtggcaggccccgtggccgggggactgttgggcgccatctccttgcatgcaccattccttgcggcggcggtgctcaacggcctcaacctactactgggctgcttcctaatgcaggagtcgcataagggagagcgtcgagatcccggacaccatcgaatggcgcaaaacctttcgcggtatggcatgatagcgcccggaagagagtcaattcagggtggtgaatgtgaaaccagtaacgttatacgatgtcgcagagtatgccggtgtctcttatcagaccgtttcccgcgtggtgaaccaggccagccacgtttctgcgaaaacgcgggaaaaagtggaagcggcgatggcggagctgaattacattcccaaccgcgtggcacaacaactggcgggcaaacagtcgttgctgattggcgttgccacctccagtctggccctgcacgcgccgtcgcaaattgtcgcggcgattaaatctcgcgccgatcaactgggtgccagcgtggtggtgtcgatggtagaacgaagcggcgtcgaagcctgtaaagcggcggtgcacaatcttctcgcgcaacgcgtcagtgggctgatcattaactatccgctggatgaccaggatgccattgctgtggaagctgcctgcactaatgttccggcgttatttcttgatgtctctgaccagacacccatcaacagtattattttctcccatgaagacggtacgcgactgggcgtggagcatctggtcgcattgggtcaccagcaaatcgcgctgttagcgggcccattaagttctgtctcggcgcgtctgcgtctggctggctggcataaatatctcactcgcaatcaaattcagccgatagcggaacgggaaggcgactggagtgccatgtccggttttcaacaaaccatgcaaatgctgaatgagggcatcgttcccactgcgatgctggttgccaacgatcagatggcgctgggcgcaatgcgcgccattaccgagtccgggctgcgcgttggtgcggatatctcggtagtgggatacgacgataccgaagacagctcatgttatatcccgccgttaaccaccatcaaacaggattttcgcctgctggggcaaaccagcgtggaccgcttgctgcaactctctcagggccaggcggtgaagggcaatcagctgttgcccgtctcactggtgaaaagaaaaaccaccctggcgcccaatacgcaaaccgcctctccccgcgcgttggccgattcattaatgcagctggcacgacaggtttcccgactggaaagcgggcagtgagcgcaacgcaattaatgtaagttagctcactcattaggcaccgggatctcgaccgatgcccttgagagccttcaacccagtcagctccttccggtgggcgcggggcatgactatcgtcgccgcacttatgactgtcttctttatcatgcaactcgtaggacaggtgccggcagcgctctgggtcattttcggcgaggaccgctttcgctggagcgcgacgatgatcggcctgtcgcttgcggtattcggaatcttgcacgccctcgctcaagccttcgtc actggtcccgccaccaaacgtttcggcgagaagcaggccattatcgccggcatggcggccccacgggtgcgcatgatcgtgctcctgtcgttgaggacccggctaggctggcggggttgccttactggttagcagaatgaatcaccgatacgcgagcgaacgtgaagcgactgctgctgcaaaacgtctgcgacctgagcaacaacatgaatggtcttcggtttccgtgtttcgtaaagtctggaaacgcggaagtcagcgccctgcaccattatgttccggatctgcatcgcaggatgctgctggctaccctgtggaacacctacatctgtattaacgaagcgctggcattgaccctgagtgatttttctctggtcccgccgcatccataccgccagttgtttaccctcacaacgttccagtaaccgggcatgttcatcatcagtaacccgtatcgtgagcatcctctctcgtttcatcggtatcattacccccatgaacagaaatcccccttacacggaggcatcagtgaccaaacaggaaaaaaccgcccttaacatggcccgctttatcagaagccagacattaacgcttctggagaaactcaacgagctggacgcggatgaacaggcagacatctgtgaatcgcttcacgaccacgctgatgagctttaccgcagctgcctcgcgcgtttcggtgatgacggtgaaaacctctgacacatgcagctcccggagacggtcacagcttgtctgtaagcggatgccgggagcagacaagcccgtcagggcgcgtcagcgggtgttggcgggtgtcggggcgcagccatgacccagtcacgtagcgatagcggagtgtatactggcttaactatgcggcatcagagcagattgtactgagagtgcaccatatatgcggtgtgaaataccgcacagatgcgtaaggagaaaataccgcatcaggcgctcttccgcttcctcgctcactgactcgctgcgctcggtcgttcggctgcggcgagcggtatcagctcactcaaaggcggtaatacggttatccacagaatcaggggataacgcaggaaagaacatgtgagcaaaaggccagcaaaaggccaggaaccgtaaaaaggccgcgttgctggcgtttttccataggctccgcccccctgacgagcatcacaaaaatcgacgctcaagtcagaggtggcgaaacccgacaggactataaagataccaggcgtttccccctggaagctccctcgtgcgctctcctgttccgaccctgccgcttaccggatacctgtccgcctttctcccttcgggaagcgtggcgctttctcatagctcacgctgtaggtatctcagttcggtgtaggtcgttcgctccaagctgggctgtgtgcacgaaccccccgttcagcccgaccgctgcgccttatccggtaactatcgtcttgagtccaacccggtaagacacgacttatcgccactggcagcagccactggtaacaggattagcagagcgaggtatgtaggcggtgctacagagttcttgaagtggtggcctaactacggctacactagaaggacagtatttggtatctgcgctctgctgaagccagttaccttcggaaaaagagttggtagctcttgatccggcaaacaaaccaccgctggtagcggtggtttttttgtttgcaagcagcagattacgcgcagaaaaaaaggatctcaagaagatcctttgatcttttctacggggtctgacgctcagtggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcatgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgcgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgattgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgcctcttccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatccccgggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatattgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgatcgcgtatttcgtctcgctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaaca agtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaattaataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaagaattaattcatgagcggatacatatttgaatgtatttagaaaaataaacaaataggggttccgcgcacatttccccgaaaagtgccacctgaaattgtaaacgttaatattttgttaaaattcgcgttaaatttttgttaaatcagctcattttttaaccaataggccgaaatcggcaaaatcccttataaatcaaaagaatagaccgagatagggttgagtgttgttccagtttggaacaagagtccactattaaagaacgtggactccaacgtcaaagggcgaaaaaccgtctatcagggcgatggcccactacgtgaaccatcaccctaatcaagttttttggggtcgaggtgccgtaaagcactaaatcggaaccctaaagggagcccccgatttagagcttgacggggaaagccggcgaacgtggcgagaaaggaagggaagaaagcgaaaggagcgggcgctagggcgctggcaagtgtagcggtcacgctgcgcgtaaccaccacacccgccgcgcttaatgcgccgctacagggcgcgtcccattcgcca
SEQ ID NO:3
ggcagcattattgtggtgattgcgaccgatctgccgatggcg
SEQ ID NO:4
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG
SEQ ID NO:5
GGTTACCTTGTTACGACTT
SEQ ID NO:6
MKRARLRDLGITIGRLPTGPYNAITDVPGVRVGHTTIIEDDPHVVRTGVTVILPQDGEVWEHHVFAGYHSFNGNGEMTGRHWLEESGLLSSPIALTSTYSVGVVHDALVKYAAEQDPTAPFTLPVVAETWDGWLSDSEAFAVTPEHVREALENARSGPVAEGNVGGGTGMICHEFKGGIGTSSRVVEVEGEGYTVGALVQANYGRREDLRINGVPVGRLIPADQVPVPWEEPPREDGSIIVIIATDAPLLPHQCKRLARRATLGLGRTGGFGHNGSGDFFLAFSTGNRLPRQPEEPVYGLKMLPNEEMDPLFQGAVEATEEAILNSLCMAETMTGRKGRTVHALPLDRLKEILKRPGRR
Claims (10)
1.一种具有肌肽水解酶功能的蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶包含如SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的蛋白酶，其特征在于，所述蛋白酶为在SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白。
3.生物材料，其特征在于，所述生物材料为下述任一种：
B1)编码权利要求1所述蛋白酶的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物。
4.根据权利要求3所述的生物材料，其特征在于，所述的核酸分子包含如SEQ ID NO:1所示的核酸序列。
5.下述任一种材料在制备权利要求1所述的蛋白酶、对微生物中权利要求1所述的蛋白酶产量进行调控中的用途：
C1)对编码所述蛋白酶的基因表达进行调控的物质；
C2)调控所述蛋白酶的活性或含量的物质。
6.根据权利要求5所述的用途，其特征在于，通过使用下述任一种或两种以上来实现：
D1)编码权利要求1所述蛋白质酶的核酸分子；
D2)含有D1)所述核酸分子的表达盒；
D3)含有D1)所述核酸分子的重组载体、或含有D2)所述表达盒的重组载体；
D4)含有D1)所述核酸分子的重组微生物、或含有D2)所述表达盒的重组微生物、或含有D3)所述重组载体的重组微生物。
7.一种对微生物进行重组的方法，所述方法包括：
向所述微生物中导入用于表达权利要求1所述蛋白酶的编码基因；
任选对用于表达权利要求1所述蛋白酶的编码基因进行调控以提高所述蛋白酶的活性或产量。
8.根据权利要求3或4所述的生物材料、权利要求5所述的用途、权利要求7所述的方法，其特征在于，所述微生物为如下任一种：大肠杆菌；枯草芽孢杆菌；酿酒酵母。
9.一种制备L-肌肽的方法，其特征在于，所述方法包括利用权利要求1或2所述的蛋白酶或权利要求3或4所述的生物材料或权利要求7所述方法制备得到的重组微生物生产L-肌肽。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述底物为β-丙氨酸甲酯盐酸盐和L-组氨酸。
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| GR01 | Patent grant |